專利名稱：硫酸糖脂抗原、其制備方法及其抗結(jié)核病的用途的制作方法
硫酸糖脂抗原、其制備方法及其抗結(jié)核病的用途
本發(fā)明涉及新的硫酸糖脂(sulfoglycolipid)抗原，其制備方法及其 在治療或預(yù)防結(jié)核病中的用途。
每年，據(jù)估計(jì)結(jié)核病是導(dǎo)致3百萬人死亡的原因。導(dǎo)致該疾病的 致病試劑是細(xì)菌，結(jié)核分枝桿菌，全世界每三個(gè)人就有一個(gè)人被其感 染。被感染人群通過打噴噢或咳嗽使其穿過空氣傳播。細(xì)菌可能以非 活性狀態(tài)潛藏在被感染的人群中，而這種人群永遠(yuǎn)不會患上該疾病。 但是，在某些情況，例如老化或者免疫系統(tǒng)低弱時(shí)，細(xì)菌可能活化并 導(dǎo)致發(fā)作結(jié)核病。
分枝桿菌被膜似乎是分枝桿菌屬細(xì)菌毒力的重要部分。事實(shí)上， 分枝桿菌高達(dá)40%的干重是由脂類構(gòu)成的。在那些脂類中，其中的一 些似乎僅限于結(jié)核分枝桿菌，例如硫酸糖脂(Vergne I.和Daffe M.
5/仍c,Vwce (1998) 3: 865-876)。糖脂族的代表是在海藻糖 單元的2'位上具有硫酸酯取代基(即a-D-吡喃葡糖基-(l-l，)-a'-D-吡喃 葡糖苷)(A)。
<formula>formula see original document page 15</formula>A
該族成員彼此的區(qū)別在于在海藻糖單元上取代的脂肪酸的數(shù)量、 位置和類型不同。特別地，脂肪酸取代基包括棕櫚酸、硬脂酸、結(jié)核 菌酸(phthioceranoic acid)和羥基結(jié)核菌酸(hydroxyphthioceranoic acid)。后兩種脂肺酸代表了硫酸糖脂的特征。最廣泛的硫酸糖脂是SL-I (Goren等，5&c/iew/對^ (1976) 15: 2728-2735) (B)。
Hydroxyphthioceranoyl
O
II
0—C—CH-
CH,(CH2)q-0 Palmitoyl 0
Hydroxyphthioceranoyl OH
14 or 16
Phthioceranoyl
B
已證實(shí)SL-I能夠抑制巨噬細(xì)胞的抗菌活性和阻斷若干炎性試劑， 例如LPS、 IFN-y或TNF-ot對巨嗟細(xì)胞的作用(Vergne I.和Daffe M. jFVow^rs (1998) 3: 865-876)。
目前，有兩種抗擊結(jié)核病的方式抗生素療法和接種疫苗。 用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗由牛分枝桿菌屬的減活細(xì)菌構(gòu)成。20世紀(jì) 初，兩名科學(xué)家首先設(shè)計(jì)出了疫苗，之后其被命名為BCG,卡介苗。 除了其作為活疫苗而阻礙其被用在免疫抑制病人中的缺點(diǎn)之外，其對 抗結(jié)核病的保護(hù)作用也是有爭議的。因此，根據(jù)不同的研究，BCG在 成人中的保護(hù)效果為0%-80%，此外，其不能對抗成人中最普遍的 肺結(jié)核病。
而且在超過35個(gè)國家中都發(fā)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌的耐抗生素菌抹。 因此，本發(fā)明的目的是提供一種更有效的治療和/或預(yù)防結(jié)核病的 方式。
WO 2004/092192中公開了從結(jié)核分枝桿菌中提取的其它致免疫 的糖脂。但是，這些天然產(chǎn)品只能獲得有限的量；此外，其得自病原菌林，其制備過程可能有毒并且需要特定的安全設(shè)置。
因此，非常希望提供在工業(yè)規(guī)模和可實(shí)行的條件下獲得致免疫糖 脂的其它新的合成方法。
值得注意地，本發(fā)明提供新的合成的硫酸糖脂抗原，其顯示出在
體外能夠刺激CDl-限制性T淋巴細(xì)胞。 本發(fā)明涉及下列式(i)的化合物
其中
r2'、 r3'相同或不同，獨(dú)立地選自h、 S03H或S037M+，條件是 R2'、 R3'中的至少一個(gè)為S03H或S037M+;
優(yōu)選地，W為S03H或S(V/M+，且R3'為H。 - M+為金屬的陽離子，例如Na+、 K+。 R2、 RS相同或不同，獨(dú)立地選自
a) 脂肪?；?br> O
b) -S-X,其中X為任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的不飽和直鏈
或支鏈烴鏈；
其中R2、 Rs中的至少一個(gè)為b);
及其對映異構(gòu)體，非對映異構(gòu)體，其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽 或酯。
優(yōu)選地，X為式(b-l):
-crj=crj-Y (b畫l)其中
-Y為任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的飽和或不飽和、優(yōu)選飽和 的直鏈或支鏈烴鏈。
優(yōu)選地，Y為任選被l-10個(gè)，更優(yōu)選l-4個(gè)烷基，優(yōu)選甲基取 代的飽和直鏈烷基鏈。
更優(yōu)選地，所述曱基位于Y鏈的C-l、 C-3、 C-7或C-9位上。
更優(yōu)選地，被取代的碳原子顯示(S)構(gòu)型。
-R、 RJ相同或不同，獨(dú)立地選自H、烷基；優(yōu)選地，Ri為曱 基，且RJ為H。
Ri和RM吏所述構(gòu)型可為(E)或(Z)。
#4居優(yōu)選的方面，b)鏈為式(b-2):<formula>formula see original document page 18</formula>
其中
r為選自1、 2或3的整數(shù)；優(yōu)選1; l為選自0-IO的整數(shù)；優(yōu)選l、 2或3; q為0-50的整數(shù)；優(yōu)選5 - 50;更優(yōu)選10 - 20; 條件是l + q^l;
每個(gè)Ti相同或不同，獨(dú)立地選自烷基；優(yōu)選地，每個(gè)Ti為甲基。 f所連接的碳原子為不對稱的。優(yōu)選地，所述碳原子顯示(S)構(gòu)型。 f為烷基；優(yōu)選甲基。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選方面，W為如上定義的a)脂肪酰基，且R"為如 上定義的b)-C-O-X。
脂肪酰基衍生自脂肪酸基團(tuán)，其將2'-或3'-硫酸化海藻糖單元的2 位或3位上的羥基酯化。脂肪酸基團(tuán)為脂肪族羧酸，其可以為直鏈或支鏈的、飽和或不飽 和的、未取代的或被諸如羥基或酮取代。
優(yōu)選地，它們含有5-50,優(yōu)選15-50個(gè)碳原子，并且更尤其可 以選自
隱chH""CH，
(辛?；?
2 /l4 3
(棕櫚?；?
2 /l6 3
(硬脂?；?
2 /l8 3
(二十烷?；?
-CH2~trCH3
20
(二十二烷?；?
2 /22 -
(二十四烷?；?
H K
3
-CH廠CH十CH-
CH3 OH
-CH;
CH3 (羥基結(jié)核菌?；?
(hydroxyphthioceranoyl)
其中m為14或16且n為2-10的整數(shù)，
o II
隱C—CH-ch。
-CH2—CH-I
-CH2tCH3
(結(jié)核菌?；? (phthioceranoyl)
其中m為14或16且n為2-10的整數(shù)，
特別地，所述脂肪?；辨満惋柡偷闹觉；绺鶕?jù)式 .C-0-(CH2VCHs(其中k為14 - 50的整數(shù))的基團(tuán)。
cIc再更優(yōu)選地，脂肪?；x自棕櫚?；陀仓；?br> 本發(fā)明更尤其涉及式I的化合物，其中議2代表脂肪?；?，優(yōu)選棕
櫚?；蛴仓；襌S代表(b-2)鏈，即下式(II)的化合物
其中R"、 R3'、 r、 p、 1、 q、 T2、亡如上述定義，或其相應(yīng)的鹽， 及其對映異構(gòu)體，非對映異構(gòu)體，其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽 或酯。
本發(fā)明尤其涉及式II的化合物，其中
一 1=1，q =14且r =l;
一 1二2，q =14iLr =1;
_ 13,q =14JLr =1;
一 1=4,q =14iLr =1;
一 11,q =14JLr =2;
一 12,q =14iLr =2;
一 1=3,q =14JLr =2;
一 14,q =14JLr =2;
一 1=1,q =12且r =1;
一 12，q =12JLr =1;
- 13，q =12JLr =1;
一 1=4，q =12JLr =1;
H3C~(CH2)p
HO— R3'0- 1=1, q =12JLr = 2
一 1=2, q =12且r = 2
一 1=3,q =12iLr = 2
- 1=4,q =12JLr = 2
_ 1-l，q-16iLr = l
一 1=2， q =16_@Lr = l.
- 1=3，q =16iLr = l.
一 1=4， q =16JLr = l，
- 1=l，q =16JLr = 2;
_ 1=2,q =16JLr = 2
一 1=3，q =16JLr = 2;或者
_ 1=4， q =16JLr = 2;
其中p為6 _22，和f和Ti為甲基。<formula>formula see original document page 22</formula><formula>formula see original document page 23</formula>(n.io)
及其相應(yīng)的鹽，及其對映異構(gòu)體，非對映異構(gòu)體，其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽 或酯。
如本文中所用的，"藥學(xué)上可接受的鹽"指所公開的化合物的衍生 物，其中通過形成其酸或堿鹽而改變母體化合物。所述藥學(xué)上可接受 的鹽包括母體化合物與例如非毒性無機(jī)或有機(jī)酸形成的常規(guī)的非毒性 鹽或季銨鹽。例如，這種常規(guī)的非毒性鹽包括那些衍生自無機(jī)酸，例
如鹽酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的鹽；和由有機(jī)酸，例如乙 酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、甲 苯磺酸、草酸等制備的鹽。
本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽可以由含有堿性或酸性結(jié)構(gòu)部分的母 體化合物通過常規(guī)的化學(xué)方法合成。通常，這種鹽可以通過使游離酸 或堿形式的這些化合物與化學(xué)計(jì)量量的適當(dāng)?shù)膲A或酸在水或有機(jī)溶 劑，或者在二者的混合物中反應(yīng)而制得。通常，優(yōu)選非水介質(zhì)，例如 醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。適當(dāng)?shù)柠}系列在/^附^^OM iVtfl簡flcew,/o / 5Wewces, 17th ed.， Mack Publishing Company, Easton, PA， 1985， p. 1418中可以找到，其內(nèi)容據(jù)此結(jié)合進(jìn)來作為參考。
根據(jù)另 一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種包含至少兩種不同的諸如 上面定義的式I化合物的組合物。
本發(fā)明還涉及包含至少一種如上定義的化合物或者如上定義的組 合物，并結(jié)合有藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
藥學(xué)上可接受的載體尤其包括脂質(zhì)體。
所述組合物還可以包含疫苗助劑。用于人類個(gè)體或者動(dòng)物的疫苗 助劑對所屬領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說是公知的，這種鹽系列可以在例如 "A compendium of vaccine adjuvants and excipients，,，第2版，Vogel 等中找到。特別地，特定的疫苗助劑包括例如鋁鹽或M59。
本發(fā)明尤其涉及一種上面定義的藥物組合物，其特征在于提供的 藥物組合物為意圖用于口服或可注射途徑的形式。本發(fā)明更尤其涉及一種上面定義的藥物組合物，其特征在于其包
含一種或多種可用于治療或預(yù)防結(jié)核病的其它產(chǎn)品，例如BCG或分 枝桿菌蛋白。
BCG代表卡介苗，目前用于接種的BCG的不同菌林在Behr M.A. 等，5We"ce (1999) 284: 1520-1523中作了特別描述。
措詞"分枝桿菌蛋白"指由分枝桿菌屬細(xì)菌基因組，和特別地由結(jié) 核分枝桿菌基因組編碼的蛋白或其片段，有利地這種蛋白可以為重組 體。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述分枝桿菌蛋白為結(jié)核分枝桿菌抗原。
可用于治療或預(yù)防結(jié)核病的其它產(chǎn)品特別地包括免疫調(diào)節(jié)劑，例 如細(xì)胞因子、DNA片段編碼的結(jié)核分枝桿菌抗原、活結(jié)核分枝桿菌缺 失突變體，例如缺失了有毒基因的突變體，或者活重組BCG,例如 BCG表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌抗原。
如本文中所用的，結(jié)核病指由結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的人體內(nèi)的疾病， 還指在動(dòng)物體內(nèi)的相應(yīng)疾病。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含 -至少一種上面定義的化合物，和
-至少一種可用于治療或預(yù)防結(jié)核病的其它產(chǎn)品，例如BCG或 分枝桿菌蛋白
作為組合制劑同時(shí)、分別或依次用于治療或預(yù)防結(jié)核病。 本發(fā)明還涉及至少一種上面定義的化合物或上述組合物用于制備
意圖治療或預(yù)防結(jié)核病的藥物，特別是疫苗的用途。
任選地，所述疫苗可以包含疫苗助劑，例如上面描述的助劑。 本發(fā)明涉及至少一種上面定義的化合物或如上定義的組合物作為
免疫反應(yīng)活化劑，更尤其作為炎性反應(yīng)活化劑的用途。
"免疫反應(yīng)活化劑"意指在體外或體內(nèi)能夠活化免疫反應(yīng)的組分或
過程，尤其是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的化合物，所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞例如為T
淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、諸如樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞或粒
細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞(APC)。"炎性反應(yīng)活化劑，，意指在體外或體內(nèi)能夠活化炎性反應(yīng)的組分或 過程，例如血細(xì)胞滲出、毛細(xì)管滲透、巨噬細(xì)胞活化或發(fā)熱的化合物。
本發(fā)明還涉及至少一種如上定義的化合物或者如上定義的組合物
用于誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞，特別是CD1-限制性T淋巴細(xì)胞的用途。所述 活化作用可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。
可以通過若千種方法評價(jià)T淋巴細(xì)胞的活化，例如測量細(xì)胞增殖 或細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如IFN-y(干擾素-力、11^2(白介素-2)、 IL4(白 介素-4)或TNF-a (胂瘤壞死因子a)。
CDl-限制性T淋巴細(xì)胞是被CD1分子所提供的抗原活化的T淋 巴細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及至少一種如上定義的化合物或者如上定義的組合物 用于i秀導(dǎo)IFN-y、 TNF-a、 IL-4或顆粒溶素的產(chǎn)生的用途。
這種產(chǎn)生誘導(dǎo)可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。IFN-y、 TNF-a、 IL-4或顆 粒溶素的產(chǎn)生可以例如通過免疫分析法，例如ELISA (酶聯(lián)免疫吸附 測定)或EIA (酶免疫分析)來測量。
本發(fā)明還涉及至少一種如上定義的化合物或者上述組合物用于制 備用來診斷結(jié)核分枝桿菌感染的組合物的用途。
由于目前的試驗(yàn)(結(jié)核菌素或所謂的"PPD"試驗(yàn))不能從那些實(shí)際 上感染了潛伏結(jié)核病的PPD+病人中區(qū)分出接受了 BCG的那些PPD+ 個(gè)體，因此可以說明結(jié)核病的診斷4艮困難。
因此高度希望提供一種專用于結(jié)核分枝桿菌感染的試驗(yàn)。
現(xiàn)在本發(fā)明的化合物使其成為可能。
本發(fā)明的化合物對結(jié)核分枝桿菌屬具有高度特異性。其可以用于 將PPD+個(gè)體識別為接種了 BCG的個(gè)體和實(shí)際上被結(jié)核病感染的個(gè) 體。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明因此提供一種診斷結(jié)核分枝桿菌感染 的方法，其包括下列步驟—提供來自ppd+個(gè)體的生物試樣; -使所述試樣與式(X)化合物接觸
OR3
(X)
其中
r2'、 R3'相同或不同，獨(dú)立地選自H、 S03H或s037m+，條件是 r2'、 R3'中的至少一個(gè)為S03H或s037m+;
優(yōu)選地，r"為s03h或s037m+， R3'為h。 - m+為金屬陽離子，例如Na+、 k+。 r2、 rS相同或不同，獨(dú)立地選自
a) 脂肪?；?br> o
b) -^-X，其中X為任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的不飽和直鏈
或支鏈烴鏈；
及其對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽 或酯，
-評價(jià)T淋巴細(xì)胞的活化；和
-對比給藥所述化合物之前和之后的T淋巴細(xì)胞的活化。 T淋巴細(xì)胞被激活(ie)，例如給藥本發(fā)明的化合物后釋放的IFN-y 增加的那些個(gè)體感染了結(jié)核分枝桿菌。
本發(fā)明還提供一種診斷結(jié)核病的試劑盒，其包括 一式(X)的化合物； -樹突狀細(xì)胞；
-檢測T淋巴細(xì)胞的活化，例如IFN-y的釋放的裝置。
27通常，使用任意的人IFN-y ELISA檢測試劑盒(例如，購自BD Pharmingen)，測量用樹突狀細(xì)胞和硫酸糖脂刺激48小時(shí)后在上清液 中釋放出的IFN-y，從而檢測T細(xì)胞的硫酸糖脂活化作用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的化合物用于評價(jià)由重組結(jié)核分枝桿菌制備 的疫苗的效果的用途。已經(jīng)使用由結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG 獲得的重組活菌來研發(fā)疫苗，其可以例如過表達(dá)蛋白。非常希望評價(jià) 這種疫苗是否有效和是否對給藥的病人起保護(hù)作用。本發(fā)明的診斷方 法使評價(jià)成為可能。
本發(fā)明還涉及用于式(X)化合物的特定配體。
如本文中所意圖的，"特定的配體，，涉及能夠被制備或者誘導(dǎo)出的、 特異性結(jié)合在本發(fā)明化合物上的任何化合物。
特定的配體特別地包括抗體和適體(aptamer)。
術(shù)語"抗體"涉及全抗體，尤其是單克隆抗體，還涉及保留了特異 性結(jié)合到本發(fā)明化合物上的能力的抗體片段，例如Fab 、 Fab， 、 F(ab，)2 、 Fv或scFv片段。
抗體制劑是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，通過各種途徑，例 如肌肉內(nèi)、血管內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑將本發(fā)明的化合物的制劑給藥于動(dòng)物， 例如小鼠、大鼠、兔或山羊。為了提高抗體的產(chǎn)生，在第一次給藥之 后可以額外給藥。之后，抗體得自從動(dòng)物體取出的血液或者得自血液 衍生物，例如血清或血漿，并且任選使用例如親合色譜法進(jìn)行純化。 特別地可以按照Koller & Milstein (1975) iV"似"256: 495-499的描述 制備單克隆抗體。
"適體"可為肽型或?yàn)楹怂?例如，脫氧核糖核酸或核糖核酸)型。 特別地可使用公知的SELEX方法或按照Ellington & Szostak (19卯) AWwm 346: 818-22中的描述制備核酸適體。肽適體可按照Cohen等， (1998) /Vm. A^//. 95: 14272-7中的描述獲得。式(X)包括作為參考結(jié)合入本文的WO 2004/092192中公開的式 (I),以及本發(fā)明的式(I)和(II)的化合物。優(yōu)選地，式(X)化合物是式(I) 和(II)的那些物質(zhì)及上面公開的其優(yōu)選實(shí)施方案。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明還涉及如上定義的式(I)化合物的制備 方法。
本發(fā)明的化合物和方法可以以所屬領(lǐng)域那些熟練技術(shù)人員公知的 許多方式制備。所述化合物可以例如通過應(yīng)用或者改變下述方法，或 者按照熟練技術(shù)人員所能理解的變化形式來合成。適當(dāng)?shù)淖兓腿〈?是非常明顯和公知的或者所屬領(lǐng)域那些熟練技術(shù)人員從科技文獻(xiàn)中可 以很容易地獲得。
尤其，這種方法可以在RX. Larock， C^附/^/tcws/vc (7rgaw/c 7Vflws/<w7Wfl,,V7ws， VCH publishers, 1989中找到。
試劑和原料是可以商購獲得的，或者所屬領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人 員通過公知技術(shù)可以容易地合成。
在下文中描述的反應(yīng)中，可以保護(hù)希望存在于終產(chǎn)物中的反應(yīng)性 官能團(tuán)，例如羥基、氨基、亞氨基、硫醇基或羧基，以避免其不希望 地參與到反應(yīng)中。可以按照標(biāo)準(zhǔn)操作方法使用常規(guī)的保護(hù)基團(tuán)，例如 參見T.W. Green和P. G'. M. Wuts， /^We"/ve G>0"/w 6^"w/c C7ie附i'sfo;, John Wiley and Sons, 1991; J. F. W. McOmie， /V^"/ve G>ow/ s fVi Org"fi/c C7te附/s^， Plenum Press, 1973。
通常在適當(dāng)?shù)娜軇┲羞M(jìn)行反應(yīng)。可以使用各種溶劑，只要其對反 應(yīng)或涉及的試劑沒有不利作用。適當(dāng)?shù)娜軇┑睦影N，其可以 為芳香族、脂肪族或脂環(huán)族烴，例如己烷、環(huán)己烷、苯、曱苯和二甲 苯；酰胺，尤其是脂肪酰胺，例如二甲基甲酰胺；和醚，例如乙醚和 四氳吹喃。
反應(yīng)可以在寬泛的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。總的來說，我們發(fā)現(xiàn)方便的 是在約0°C -約150。C(更優(yōu)選約室溫-約10(TC)下進(jìn)行反應(yīng)。取決于 許多因素，特別地是反應(yīng)溫度和試劑的性質(zhì)，反應(yīng)所需的時(shí)間也可以
29變化很大。但是，只要反應(yīng)在上面列出的優(yōu)選條件下進(jìn)行，則約3小 時(shí)-約20小時(shí)的時(shí)間通常就足夠了 。
可以通過常規(guī)方式從反應(yīng)混合物中回收如此制備的化合物。例如， 可以通過從反應(yīng)混合物中蒸除溶劑而回收化合物，或者如果必要在從
反應(yīng)混合物中蒸除溶劑之后，將剩余物傾入水中，之后用水不溶性有 機(jī)溶劑萃取并從萃取物中蒸除溶劑。此外，如果希望可以通過各種公
知的技術(shù)，例如重結(jié)晶、再沉淀或者各種色鐠技術(shù)，特別是柱色i普或 制備性薄層色語進(jìn)行進(jìn)一步純化。
根據(jù)進(jìn)一步的目的，本發(fā)明提供一種制備如上定義的式(I)化合物 的方法，其包括下列步驟 -磺化5和
-用相應(yīng)的式(IV)和(IV，)化合物
<formula>formula see original document page 30</formula>
(IV) (IV') 其中112和RS如式(I)中所定義的，X和Y獨(dú)立地代表鹵素原子或
OH;
?；?III)化合物
其中，P4、 ps、 P4'、 ps'各自相同或不同，代表H或OH-保護(hù)基團(tuán)， 或者P"和pS和/或P"'和ps'—起形成環(huán)狀OH-保護(hù)基團(tuán)。
可能需要一個(gè)或兩個(gè)磺化或?；磻?yīng)。20 磺化和?；襟E可以按照任意順序連續(xù)或交替進(jìn)行。 如果適當(dāng)，在?；?或磺化步驟之前和/或之后可能需要一個(gè)或 多個(gè)保護(hù)和/或脫保護(hù)步驟。
這種保護(hù)基團(tuán)包括縮醛或縮酮，例如
2 , 。X。
或者二齒保護(hù)基團(tuán)，例如O 。
本發(fā)明的方法包括進(jìn)一步的水解所述保護(hù)基團(tuán)的步驟。該反應(yīng)通 常在酸性條件下進(jìn)行。
所述磺化反應(yīng)通常采用任意適當(dāng)?shù)幕腔噭┻M(jìn)行，例如吡啶-三氧 化硫配合物或者三甲胺-三氧化硫配合物。
所述的兩個(gè)必需的?；磻?yīng)可以在一個(gè)或兩個(gè)步驟中進(jìn)行。?；?br> 步驟通常采用偶聯(lián)試劑，例如DMAP和/或DCC來進(jìn)行。 本發(fā)明的方法還包括分離希望的化合物的最終步驟。
下列方案中說明了本發(fā)明的代表性方法
IIo-s
16-^
r
p<formula>formula see original document page 32</formula>
Z : r2' = s03-; R3' = h g : r2' = s03. ; R3' = H
^ : R2' = h ; R3' = s03. 21: R2' = h ; R3' = s03.
E : r2' = R3' = s03. §: : r2' = r3' = s03.
使用過量的磺化試劑可以獲得2',3'雙磺化化合物(D。 3，-磺化化
合物(2D作為磺化反應(yīng)的副產(chǎn)物而得到；通常，磺化反應(yīng)的選擇性約為
5/1?；衔?，Z1和I^經(jīng)色譜分離。 式(I v)化合物通常可以商購獲得。
優(yōu)選地，當(dāng)R"代表如上定義的b)鏈時(shí)，式(IV')化合物可以通過 應(yīng)用或者改變下列說明性方案而制得其中
R代表相應(yīng)的任選取代的不飽和直鏈或支鏈烴鏈，從而使得
對應(yīng)于X。
更準(zhǔn)確地，以可商購獲得的A為原料使步驟進(jìn)行至G，則其包括 一個(gè)帶有所需的(S)立體化學(xué)的額外曱基。之后將G還原為A，，得到 希望的B，，然后使C'依次皂化，得到希望的式(IV，)化合物。 尤其，通過維悌希(Wittig)反應(yīng)，使用式(VI)化合物以及隨后的皂化反 應(yīng)由相應(yīng)的式(V，)化合物得到具有下式(IV，-a)的式R3Y (IV，)的化合 物
一zr-1
T2T2 1(IV'-a)
33上述的制備式(IV，)化合物的方法特別有利，因?yàn)槠渖闪司哂邢?br> 望的立體化學(xué)的化合物。
可以通過應(yīng)用或者改變實(shí)施例中的試驗(yàn)條件和/或起始產(chǎn)品來進(jìn) 4亍所述方法。
附圖簡述


圖1和圖2
圖1和2代表T細(xì)胞克隆Z4B27響應(yīng)本發(fā)明化合物和對比化合物 的刺激(橫軸)而產(chǎn)生的IFN-y的量(Pg/mL，縱軸)。
實(shí)施例
實(shí)施例1:本發(fā)明的化合物的合成 A.》克脂的合成Z : R2' = S03-; R3' = H Z:: R2， - H ; R3, = S03-
g : R2' = S03- ; R3' = H §:: R2' - H ; R3' = S03-: R2' = R3' - S03-
1. a,a-海藻糖的亞爺基化
將a，a-海藻糖二水合物(l eq.)在絕對乙醇(0.4 M)中回流30分鐘以 脫水。之后將干燥的剩余物L(fēng)懸浮在干燥的N,N-二曱基甲酰胺(DMF， 0.4 M)中，將a,a-二曱氧基甲苯(DMT, 2 eq.)和IO-樟腦磺酸(CSA, 0.05 eq.)—起加入。在輕微真空下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上加熱混合物(60。C)1小時(shí) 以除去甲醇。之后加入更多的DMT (0.25 eq.)和CSA (0.01 eq.)，并將 混合物再次加至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，蒸發(fā)DMF。在碳酸氫鈉 水溶液(5%)中攪拌混合物過夜，得到結(jié)晶的二縮醛2。將產(chǎn)物溶解在 沸騰的乙醇中、加入熱水并緩慢冷卻以進(jìn)行重結(jié)晶。最后，過濾白色 結(jié)晶2，用水和石油醚洗滌并干燥(84%)。
2. 位置2的?；?br> 使二縮醛2(1 eq.)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP, 1 eq.)和酰氯(1.3 eq) 在干燥的吡咬(0.6M)中沸騰回流25小時(shí)。以45%的產(chǎn)率得到單-?；?化的產(chǎn)物2。
353. 位置2'和3'上的甲硅烷基化
向2 (1 eq.)在吡啶(O.l M)中的水冷溶液中加入1，3-二氯-1,1，3，3-四 異丙基二硅氧烷(1.2eq.)。室溫下攪拌2天后，將混合物傾入到水水中 并用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物。經(jīng)快速色鐠純化以58%的產(chǎn)率得到為糖漿狀
產(chǎn)物4。
4. 位置3的?；?br> 在干燥的曱苯(O.l M的酸)中，于微波下用酸性R3011 (從部分B 中獲得)(1 eq.)、 DMAP (1 eq.)和DCC (1.5 eq.)處理化合物4 (1,5 eq.) 15分鐘。最后，蒸發(fā)溶劑并用快速色譜純化二酰基化的產(chǎn)物f反應(yīng) 產(chǎn)率高度依賴于所用的酸的結(jié)構(gòu)(25 - 60%)。
5. 脫甲硅烷基化
在40。C的Bu4NF/THF溶液(l M,用三氟乙酸酸化使pH - 6, 40 eq.) 中加熱化合物3(1 eq.) 24小時(shí)。以90%的產(chǎn)率得到結(jié)晶產(chǎn)物f。
6. 硫酸化
向f (1 eq.)的吡啶(0.06 M)溶液中加入吡啶-三氧化硫配合物的 DMF(0.5M,3eq.)溶液，在室溫下攪拌混合物。2天后，蒸發(fā)混合物， 剩余物經(jīng)硅膠色鐠得到2(62%)、其3'-硫酸化異構(gòu)體二和2，,3，-二疏酸 化化合物2^。
7. 縮醛的水解
室溫下用氯仿/甲醇/1.7。/。H2S04 (60/40/8)溶液處理二亞芐基衍生 物2， Z!或2!！ 2天。用NaHC03溶液使反應(yīng)混合物呈中性。經(jīng)該脫保 護(hù)作用定量得到相應(yīng)的二酰基化硫酸糖脂g, §!或^:。
36B.酸的合成<formula>formula see original document page 37</formula>
1. 醇的氣化
室溫、氮?dú)庀拢瑢⒋糀(l eq.)加入到快速攪拌的溶于千燥的二氯 甲烷中的氯鉻酸吡啶総鹽(2 eq.)和乙酸鈉(5 eq.)中(0.4 M的4)。攪拌 1.5小時(shí)后加入乙醚并過濾混合物。粗產(chǎn)物i未經(jīng)進(jìn)一步純化。
2. 維悌希反應(yīng)
向B(l eq.)的干燥二氯甲烷(0.6 M)溶液中加入1-乙氧羰基亞乙基 三苯基膦(l誦carboethoxyethylidene tripheiiylphosphorane) (1.2 eq,)。
之后在室溫下攪拌混合物過夜，得到酯￡。由i得到的2個(gè)步驟的產(chǎn) 率為87%。
3. 氫化
在乙酸乙酯(0.4 M)中使用10%的鈀碳作為催化劑對共輒酯￡ (1 eq.)進(jìn)行氫化。以77%得到飽和酯2，其為1/1的C-2位上的對映異 構(gòu)體(非對映異構(gòu)體)混合物。
4. 鬼化
110。C下，在氬氧化鉀(12 eq.)的水/乙醇2/3 (0.2 M)溶液中將酯B(1 eq.)加熱過夜。該反應(yīng)定量得到相應(yīng)的酸g，其為C-2位上的外消 旋(1/1的非對映異構(gòu)體)混合物。
5.酰胺化
回流下將酸g(l eq.)與草酰氯一起加熱(10eq.) 1小時(shí)。減壓下除 去過量的試劑。將干燥的二氯甲烷(0.4M)和DMAP(1.2eq.)，以及隨 后的(R)-2-苯基甘氨醇(1.1 eq.)加入到粗酰氯中，在室溫下將反應(yīng)混合 物攪拌過夜。經(jīng)快速色譜使非對映異構(gòu)體得到分離。2S非對映異構(gòu)體 L是極性較小的化合物，其以36%的產(chǎn)率分離出。
在硫酸(3 N)溶于1/1 二氧己環(huán)/水混合物所得的溶液(0.02 M)中將 酰胺￡(1 eq.)回流過夜，定量釋放出2S-酸G。
7.還原
將酸￡(1 eq.)溶解在BH3的THF (1 M, 1.7 eq.)溶液中，在室溫下 攪拌該混合物過夜。加入乙醇，之后加入80%的含水乙酸，用NaHC03 使混合物呈中性。定量得到純物質(zhì)形式的醇。
重復(fù)整個(gè)反應(yīng)次序以在脂肪酸鏈上引入其它甲基支鏈。 按照上述方式急化不飽和酯￡，得到不飽和酸。
4
2'
C21 EUo〇2 M = 324.5474 g/mo1 (2E)-2-曱基二十碳-2-烯酸白色結(jié)晶
RMN & (250 MHz, CDCh)
S = 0.88 ppm (t， H-t, 3/= 6.5 Hz); 5 = 1-1.7 ppm (m， H脂肪族)； 8 = 1.84 ppm (d, H-2，， d, 4/2.3 = 1.5 Hz); 5 = 2.19 ppm (quad, H4， 3/4.3 =3/4-5 = 7 Hz); 3 = 6.9 ppm (tq, H-3,3/3-4 = 7 Hz和V32， = 1.5 Hz)
白色結(jié)晶
固N(yùn)H (250 MHz, CDCh)
6 = 0.87 ppm (t, H誦t, 3/= 6.5 Hz); 3 = 1.0 ppm (d， H-4，， 3/4，_4 = 6.5 Hz); S = 1.1-1.6 ppm (m，H脂肪族)；S = 1.84 ppm (d, H-2，， d， 4/2.3 = 1.5 Hz); & = 2.5 ppm (m， H-4); & = 6.65 ppm (dquad， H國3， = 10 Hz 和4/32， = 1.5 Hz)
白色結(jié)晶
RMN力(250 MHz, CDC")
6 = 0.88 ppm (t， H腸t，3/ = 6.5 Hz); 3 = 1.01 ppm (d， H-4,， 3/4，_4 = 6.5 Hz); 6 = 1.1-1.5 ppm (m， H脂肪族)；6 = 1.85 ppm (d, H-2，， d, V2.3=1.5 Hz); 3 = 2.5 ppm (m, H-4); 8 = 6.67 ppm (dquad， H-3， = 10 Hz和4/3 2， = 1.5 Hz);
白色結(jié)晶
[aD25 = + 13.8 (氯仿) RMN ^ (250 MHz, CDC1V)
8 = 0.82 ppm (d, H-6，， 3/6、6 = 6.5 Hz); 3 = 0.88 ppm (t, H畫t,3/ = 7 Hz); 8 = 0.99 ppm (d， H國4，， 3力，4 = 6.5 Hz); 6 = 1.05-1.4 ppm (m, H脂 肪族)；S = 1.85ppm(d，H-2，，4/2，.3 = 1.5Hz); S = 2.6 ppm (m, H畫4); 8 =6.66 ppm (d， H-3， 3 /3-4 = 10 Hz， 4/3-2， = 1.5 Hz)
RMN 13C (250 MHz, CDC")
d = 12.1 ppm， C-6，； 6 = 14.1 ppm， C畫t; 8 = 19-32 ppm, C月旨肪族 8 = 37.6 ppm, C-2，； 8 = 44.4 ppm, C-5; & = 125 ppm， C-2; 6 = 151.2 ppm, C-3。
C27 H52 O2 M 二 408.7087 g/mol (2E,4S,6S)-2,4,6-三甲基二十四碳-2-烯酸
(Phtienoic acid)
C28 H54 O2 M = 422.7356 g/mol "S,6S,8S)-2,4,6,8-四甲基二十四碳-2-烯酸
無色油aD25 = + 15 (氯仿)
RMN力(300 MHz, CDC1。
3 = 0.83 ppm (d， H國8，， 3J8.8 = 6.3 Hz); S = 0.85 ppm (d， H-6,, 3J6、6 =6.3 Hz); 5 = 0.9 ppm (t， H-t， 3J = 6.6 Hz); 6 = 1.01 ppm (d, H-4，， 3J4，_4 =6.6 Hz); 5 = 1.1-1.5 ppm (m，H脂肪族)；5 = 1.88 ppm (s， H-2，); S = 2.67 ppm (m, H-4); 5 = 6.69 ppm (d, H-3， 3J3" = 10.2 Hz)
無色油
[aD25 = + 53.2 (氯仿) RMN & (750 MHz. CDCh)
S = 0.86 ppm (d， H-6，， V6'_6 = 5,5 Hz); S = 0.88 ppm (t, H-8， 3 /8_7 = 7 Hz); S-1.03ppm(d，H-4,，3j4M-6，6Hz); 6 = 1.1-1.5 ppm (m, H誦5， H-6，H-7); 3 = 1.89ppm(s，H-2，)； 3 = 2.67 ppm (m， H-4); 5 = 6.7 ppm (d， H-3， 3/34 = 10 Hz);
RMN 13C (300 MHz, CDCh)
"11.2ppm, C-8; S = 12.1 ppm, C-2，； S = 19.0 ppm， C畫6，； S = 20.4 ppm， C國4，
8 二 30.0 ppm, C-7; 8 = 31.1 ppm, C-4; 3 = 32.3 ppm, C-6; S = 44.1 ppm， C-5
3 = 125.5 ppm, C-2; 8 = 151.1 ppm, C國3; 8 = 174.1 ppm, C-l。
采用上述步驟制備了本發(fā)明的下列化合物。
Cii H20 O2 M = 184.2786 g/mol "S,6S)-2,4,6-三甲基辛-2-烯酸C49 H89 016 S M = 989.2911 g/mol 2-0-十六烷?；?3-0-(2-甲基二十碳-2-烯?；?-2'-0-硫酸根
-a,a'-D-海藻糖 RMN & (250 MHz, CDCWMeOD 4/1)
3 = 0.89 ppm (t, 3H-t, 3H-t，， 3/= 7 Hz); S = 1-1.6 ppm (m， H脂肪 族)；6 = 1.81 ppm (d， (CH3)a，， V = 1 Hz); 3 = 2.2 ppm (m， 2H-a, 2H-y,); 6 = 3.3-4.7 ppm (m， H陽2，， H誦3'， H-4, H-4，， H-5， H-5，， H-6ax， H國6,ax， H畫6一 H國6、)； 8 = 4.95 ppm (dd， H-2,3 /21 = 4 Hz和3/2.3 = 10 Hz); 8 = 5.29 ppm (d， H國l, 3^.2 = 4 Hz); S = 5.45 ppm (t, H-3， 3/34 = 3/3_2 = 10 Hz); 8 = 5.52 ppm (d， H-l，, = 4 Hz); 6 = 6.8 ppm (tquad， H-p，， 2jp,Y， = 7.5 Hz， V = 1 Hz)。
MALDI-Tof (陰離子模式):M/Z = 965.75
化合物b:<formula>formula see original document page 42</formula>C52 H9S 016 S M = 1031.3717 g/mol
3-0-(2,4S-二甲基二十二碳-2-烯?；?-2-0-十六烷?；?2'-0-硫酸
RMN m (250 MHz, CDCWMeOD 4/1)
8 = 0.9 ppm (t, 3H-t， 3H畫t，， 3/= 6.5 Hz); S = 0.99 ppm (d, (CH3)Y，, 3 /=6.5Hz); S = 1.1-1.6 ppm (m，H脂肪族)；6 = 1.82 ppm (d， (CH3)a，， V=lHz); 5 = 2.22ppm(t, 2H-a,3/=7Hz); 3 = 2.46 ppm (m， H國y，)； S = 3.4-4.4 ppm (m， H-2，， H-3，， H國4， H-4，， H-5， H-5，， H-6ax, H-6，ax， H、, H-6、)； & = 4.87 ppm (dd， H-2, = 4 Hz和3/2-3 = 10 Hz); S = 5.29 ppm (d， H國l, 3/12 = 4 Hz); S = 5.44 ppm (t， H-3, V3.4 = 3/32 = 10 Hz); "5.51ppm(d，H-l，，3/r—2, = 4Hz); S = 6.57 ppm (dquad， H-p，, 3/p，Y， = 10 Hz,V-lHz)。
MALDI-Tof(7月離子模式):M/Z = 1007.59
化合物c:
C52 H95 016 S Na
M = 1031.3717 g/mol 3-0-(2,4S-二甲基二十二碳-2-烯?；?-2-0-十六烷?；?2，-0-硫酸
根-a,a'-D-海藻糖 RMN力(250 MHz, CDCWMeOD 4/1)
S = 0.89 ppm (t， 3H-t, 3H誦t，， 3/= 6.5 Hz); 3 = 0.99 ppm (d， (CH3)Y，，
根-a,a'-D-海藻糖
I OH3/= 6.5 Hz); 8 = 1-1.6 ppm (m， H脂肪族)；3 = 1.82 ppm (d， (CH3)a，， V =1 Hz); 6 = 2.21 ppm (t， 2H誦a， 3/ = 7.5 Hz); 8 = 2.5 ppm (m, H-y，)； &
=3.3-4.7 ppm (m， H畫2，， H-3，， H誦4， H畫4，， H-5， H-5'， H-6ax， H-6，ax, H-66q， H-6、); 8 = 4.95 ppm (dd, H畫2， 3/21 = 4 Hz和3/2_3 = 10 Hz); 8 = 5.29 ppm (d， H-l， 3/l2 = 4 Hz); 6 = 5.45 ppm (t， H國3， 3/34 = 3/3_2 = 10 Hz); 5 = 5.52 ppm (d, H-l,，= 4 Hz); 8 = 6.57 ppm (dquad， H-(T， 3/p，Y， =10Hz，4/=lHz)。
MALDI-Tof (7月離子模式):M/Z = 1007.49
化合物d:
2-0-十六烷酰基-2，-0-硫酸根-3-0-(E)-(4S,6S)-2,4,6-三甲基二十
RMN (500 MHz. CDCWMeOD 4/1)
8 = 0.86 ppm (d， (CH3)S，， 3/= 6.5 Hz); S = 0.88 ppm (t， 3H-t， 3H畫t， 3J = 7Hz); 3 = 0.97ppm(d, (CH3)Y，，V=6.5Hz); S = 1-1.6 ppm (m, H 脂肪族)；S = 1.82 ppm (d, (CH3)a，， V= 1.5 Hz); 8 = 2.22和2.26 ppm (2 個(gè)五重峰，211-(*,3/0^ = 8112,2/=161^); 6 = 2.62 ppm (m， H-y，)； s = 3.5-3.8 ppm (m， H-4， H-4，, H-5，, H-6， 2H-6，); 5 = 3.94 ppm (t， H-3，, 3/3，-2， = V3M， = 10 Hz); d = 3.97ppm (dd, H-6,2/= 12 Hz， V6—5 = 3 Hz); S = 4.23 ppm (m， H-2，， H-5); 6 = 4.97 ppm (dd， H-2， = 3.6 Hz和
》QH
CS5 H101 016 S Na M = 1073.4523 g/mol
四碳-2-烯酰基l-a,a，-D-海藻糖
44J/2.3 = 10 Hz); 6 = 5.25 ppm (d， H誦l， 1 = 3.6 Hz); S = 5.43 ppm (t， H畫3， 3 /3_4 = 3/3.2 = 10 Hz); 8 = 5.46 ppm (d， H-l ，， 3^.2, = 3.6 Hz); 8 = 6.54 ppm (dquad， H-卩，，3/p，_7， = 10 Hz， 4/= 1.5 Hz) MALDI-Tof (陰離子模式):M/Z = 1049.47
化合物e:
2，-0-硫酸根-2-0-十六烷?；?3-0-(4S,6S,8S)-2,4,6,8-四甲基二十
RMN XH (250 MHz, CDCl掘eOD 4/1、
8 = 0.89 ppm (t， 3H隱t， 3H-t,， 3/ = 6,5 Hz); S = 0.82; 0.84和0.97 ppm (3d， (CH3)Y，， (CH3)8，， (CH3)E); 6 = 1-1.6 ppm (m, H脂肪族)；3 = 1.84ppm(d，(CH3)tt，，4/=lHz); & = 2.24 ppm (m， 2H誦a); 8 = 2.6 ppm (m, H-y,); 3 = 3 -4.5 ppm (m， H-2,， H-3，， H-4, H誦4,, H畫5， H畫5，， 2H畫6， 2H-6，)； S = 4.96 ppm (dd， H-2， = 4 Hz和3/2_3 = 10 Hz); 6 = 5.27 ppm (d， H-l， 3^.2 = 4 Hz); & = 5.43 ppm (t， H-3， V3.4 = V3_2 = 10 Hz); & = 5.48 ppm (d, H-l'， = 4 Hz); S = 6.54 ppm (dq， H-|5，， 3/p'.Y，= 10.2 Hz，4/=1 Hz)。
MALDI-Tof (陰離子才莫式):M/Z = 1063.66
'4乂OH
C56 H103 016 S Na M = 1087.4792 g/mol
四碳-2-烯?；鵯-a,a'-D-海藻糖化合物f:<formula>formula see original document page 46</formula>
2-0-十六烷?；?3-0-(4S,6S,8S)-2,4,6,8-四甲基二十四碳-2-烯酰
RMN "H (250 MHz, CDCWMeOD 4/1、
S = 0.77 ppm (t， 3H-t， 3H-t，， V= 6,5 Hz); 3 = 0.7; 0.72和0.86 ppm (3d， (CH3)Y，， (CH3)S，， (CH3)E，)； S = 1-1.5 ppm (m， H脂肪族)；3 = 1.73 ppm (d, (CH3)tt，， V= 1.5 Hz); S = 2.13 ppm (m, 2H畫a); 3 = 2.5 ppm (m, H-y,); S = 3.2-3.9 ppm (m， H-2，， H-3，， H-4, H-4，， H-5, H-5，， 2H-6, 2H-6，)； 8 = 4.84 ppm (dd, H-2， = 4 Hz和3J23 = 10 Hz); & = 5.0 ppm (d， H-l, 3/12 = 4 Hz); 3 = 5.16 ppm (d, H-l，， 3/r.2'= 4 Hz); S = 5.36 ppm (t， H-3,3/3_4 = 3/3_2 = 10 Hz); 3 = 6.43 ppm (dq, H誦p，， 3/p，_Y，= 10.2 Hz,4J = lHz)。
MALDI-Tof f陰離子模式):M/Z = 1007.61
化合物g:<formula>formula see original document page 46</formula>C64 H119 016 S Na M = 1199.6943 g/mol 2'-0-疏酸根-2-0-二十四烷?；?3-0-(4y,65;85)-2,4,6,8-四甲基二
十四碳-2-烯酰基l-a,a，-D-海藻糖 RMN力(250 MHz. CDCWMeOD 4/1)
S = 0.6-0.9 ppm (m， 3H-t， 3H-t，， (CH3)Y，， (CH3)5，， (CH3)￡，)； 8 = 1-1.5 ppm (m， H脂肪族)；5 = 1.73 ppm (d， (CH3)tt，， V= 1 Hz); 6 = 2.1 ppm (m， 2H-a); 3 = 2.5 ppm (m， H誦y，)； 6 = 3.1-4.5 ppm (m, H-2，， H-3，， H國4， H-4，， H-5， H-5，， 2H畫6， 2H-6，)； 3 = 4.8 ppm (dd， H-2， 3J21 = 4 Hz 和V2-3 = 10 Hz); S = 5.16 ppm (d， H-l, = 4 Hz); S = 5.3 ppm (t， H-3: 3/3_4 = 3/3.2 = 10 Hz); 5 = 5.46 ppm (d， H-l，， 3/ir = 4 Hz); & = 6.43 ppm
(dq, H-p，， %，Y， = 10.2 Hz， 4/= 1 Hz)
MALDI-Tof (陰離子模式):M/Z = 1175.57
化合物h:
<formula>formula see original document page 47</formula>
C48 H87 016 S Na M = 975.2642 g/mol 2-0-辛?；?2，-0-硫酸根-3-0-(4S,6S,8S)-2,4,6,8-四甲基二十四碳
-2-烯?；?-01,01'~0-海藻糖 RMN力(250 MHz, CDCWMeOD 4/1)
S = 0,65 ppm (d, (CH3)5，， 3/= 7 Hz); 5 = 0.7 ppm (t， 3H國t， 3H-t，，3/ =7 Hz); S = 0.8ppm(d，(CH3)Y，，3/=7Hz); 8 = 1.1-1.5 ppm (m， H脂 肪族)；3 = 1.7 ppm (s， (CH3)a); 5 = 2.1 ppm (t， 2H謹(jǐn)a, 3/tt_p = 7 Hz); 8=2.5 ppm (m， H-y，)； 8 = 3.1-4.5 ppm (m， H-2,， H-3，， H-4， H-4，， H-5， H-5，， 2H畫6， 2H畫6，)； 8 = 4.8 ppm (dd， H-2,= 4 Hz和3/2國3 = 10 Hz); 6 = 5.15 ppm (d， H-l， 3/12 = 4 Hz); 5 = 5.3 ppm (t, H-3,3/3_4 = 3J3_2 = 10 Hz); 3 = 5.4 ppm (d， H-l ，，3/^2= 4 Hz); 5 = 6.4 ppm (d, H-|3，， 3/p'_Y，= 10.2 Hz)。
MALDI-Tof (陰離子模式):M/Z = 951.43 化合物i:
2-0-辛酰基-2，-0-硫酸根-3-0-〖(4S,6S)-2.4,6-三甲基辛-2-烯酰
RMN (600 MHz,冷凍探4十，MeOD)
S = 0.86 ppm (d， (CH3)&，，3/ = 6.6 Hz); 6 = 0.88 ppm (t， 3H-t，，3/ = 7.2 Hz); 6 = 0.9 ppm (t， 3H-t， V = 7.2 Hz); S - 0.99 ppm (d， (CH3)Y，，3/ =7.2 Hz); S = 1.1-1.6 ppm (m，H脂肪族)；d = 1.85 ppm (d, (CH3)a，， V =1.5 Hz); S = 2.27和2.3 ppm (2td, 2H-a, = 7.2 Hz, V = 14.4 Hz); 3 = 2.66 ppm (m， H-f); 3 = 3.41 ppm (t, H-4，， V4， 3， = 3/4,.s， = 9.3 Hz); S = 3.66 ppm (dd, 1H-6，， 3/6，.5' = 5.7和2/= 11.7 Hz); 6 = 3.68 ppm (t, H-4， 3/4_s = 3/4.3 = 10 Hz); S = 3.75 ppm (m, H-5，， H誦6， H-6，)； 8 = 3.91 ppm (dd, H-6， V = 12 Hz, 3/6.s = 2.4 Hz); 5 = 3.92 ppm (t, H-3,， 3/3，-2，= 3/3，_4, = 9.3 Hz); S = 4.19 ppm (dd， H畫2'， V2M, = 3.6 Hz, 3 /2，_3， = 9.3
C31 H53 016 S Na M = 736.8072 g/mol
基l-oua，-D-海藻糖
48Hz); 8 = 4.24 ppm (ddd, H-5, Vs_6 = 2.4 Hz, V5.6 = 4.2 Hz， 3/5_4 = 10 Hz); S = 4.98 ppm (dd， H畫2， = 3.6 Hz和3/2.3 二 10 Hz); 5 = 5.27 ppm (d, H-l, = 3.6 Hz); S = 5.50 ppm (d， H畫l，， = 3.6 Hz); S = 5.51 ppm (t， H-3, 3/3_4 = 3/3_2 = 10 Hz); 6 = 6.52 ppm (dquad， H-p，， 3/p，_Y, = 10.2 Hz, 4J= 1.5 Hz)
RMN 13C (600 MHz,冷凍探針，MeOD)
5 = 11.6ppm，C-t，； S = 12.8 ppm, (CH3)a，； S = 14.4 ppm， C畫t; S = 19.5 ppm, (CH3)8，； 5 = 20.8 ppm， (CH3)Y，； 3 = 23.7 ppm， C畫(t誦l); 6 = 26.0 ppm， C-p; 5 = 30; 30.1; 32.8 ppm， C辛酸；S = 31.1 ppm, C-(t-l)，； d = 32.1 ppm， Oy，； 3 = 33.6 ppm, C-d，； d = 35.0 ppm, C-a; 8 = 45.3 ppm, C-s,; 8 = 61.8 ppm, C國6; 3 = 62.5 ppm， C國6，； 3 = 69.9 ppm， C-4; 6 = 71.6ppm，C-4，； & = 72.0 ppm， C誦2; S = 72.8 ppm, C誦3，； 8 = 73.4 ppm, C-5; 3 = 74.1 ppm， C畫5，； 3 = 74.4 ppm， C-3; 6 = 78.4 ppm， C國2，； S = 93.5 ppm, C-l; 6 = 94.3 ppm, C國l,; 8 = 127.2 ppm， C-a，； 3 = 150.2 ppm，C國p，； S = 169.3 ppm, (C=0)3; 8 = 174.3 ppm， (C=0)2。
MALDI-ToH陰離子模式):M/Z = 713,15
以及下列化合物 化合物j:
<formula>formula see original document page 49</formula><formula>formula see original document page 50</formula>化合物o:
實(shí)施例2:結(jié)核分枝桿菌硫酸糖脂的離體(exvivo)試驗(yàn) 為了確定硫酸糖脂-抗原的免疫原性，測量用純化的硫酸糖脂刺激 之后IFN-y的釋放。在GM-CSF (500 u/mL)和IL-4 (5 ng/mL)存在下 培養(yǎng)2 x 10s PBMC每/孔4天。在此期間在10%的人血清中培養(yǎng)自體 效應(yīng)T-細(xì)胞。將硫酸糖脂(10ng/mL)加入到被照射的、CDl-表達(dá)的抗 原呈遞細(xì)胞中。最后，加入效應(yīng)細(xì)胞(2 x 105/孔)，18小時(shí)之后借助 ELISA測量IFN-y在上清液中的釋^t。在96-孔免疫吸附劑板上進(jìn)行 IFN-yELISA，該板上涂覆IFN-y捕獲抗體(2嗎/mL)并經(jīng)歷整夜。用 含有1%牛血清白蛋白的PBS阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將上清液稀釋 至1:1并加至終體積為100 pl。室溫下將板培養(yǎng)2小時(shí)并通過徹底洗 滌(3-4次)而除去板。最后，經(jīng)1小時(shí)加入生物素化抗-IFN-y抗體(2 pg/mL)。為了檢測免疫反應(yīng)性的IFN-y,經(jīng)30分鐘加入辣根-過氧化 物酶。最后加入顯色底物(TMB,Endogen,MA,USA)。經(jīng)20分鐘的培 養(yǎng)之后，加入硫酸(2%)終止反應(yīng)。在480 nm波長處用光度測量法確 定染色強(qiáng)度。為了估計(jì)上清液中的細(xì)胞因子濃度，所有試驗(yàn)都包括具 有已知濃度的IFN-y標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3:體內(nèi)研究
征集PPD+供體(結(jié)核菌素試驗(yàn)呈陽性)和PPD-供體(結(jié)核菌素試驗(yàn) 呈陰性)并給藥本發(fā)明的化合物。采用ELISA試驗(yàn)(15 pg/mL)在各組的各個(gè)病人中評價(jià)IFN-y的產(chǎn)生從而測量對硫酸糖脂的響應(yīng)。對比各 組的響應(yīng)情況。
實(shí)施例4:抗原呈遞試驗(yàn)
測量按照WO 2004/092192中公開的方法制備的T細(xì)胞克隆Z4B27 響應(yīng)本發(fā)明化合物的刺激所產(chǎn)生的IFN-y的釋放。
在加入T細(xì)胞(5xl0V孔， 一式三份)之前，在37。C下用以聲波處 理過的抗原(l - 10 ng/mL)預(yù)培養(yǎng)5 x 104細(xì)胞/孔的CD1+APC 2小時(shí)。 36小時(shí)后4吏用sandwich ELISA ^式劑盒(Instrumentation Laboratory) 測量釋放的TNF-a和IFN-y。數(shù)據(jù)凈皮表示為三份試才羊的平均ng/mL或 pg/mL±SD。所有試驗(yàn)至少重復(fù)2次。
圖1中顯示了本發(fā)明的化合物e (cpd e)的結(jié)果。其證明本發(fā)明的 化合物與相應(yīng)的未硫酸化的化合物(參見化合物f "cpd P)和WO 2004/092192中公開的基于下式的對比化合物的相應(yīng)的飽和化合物(參 見"comp,")相比顯示出更好的活性
圖2中示出的進(jìn)一步結(jié)杲顯示了化合物b和d (cpdb和cpd d)的活性。
權(quán)利要求
1.式(I)的化合物其中R2′、R3′相同或不同，獨(dú)立地選自H、SO3H或SO3-/M+，條件是R2′、R3′中的至少一個(gè)為SO3H或SO3-/M+；M+為金屬陽離子，例如Na+、K+；R2、R3相同或不同，獨(dú)立地選自a)脂肪?；琤) id="icf0002" file="A2008800060900002C2.tif" wi="14" he="10" top= "149" left = "37" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>其中X為任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的不飽和直鏈或支鏈烴鏈；其中R2、R3中的至少一個(gè)為b)；及其對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽或酯。
2. 式(II)的化合物，其中W為S03H或SCV/M+且W為H。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3的化合物，其中X為式(b-l):<formula>formula see original document page 2</formula>其中Y為任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的飽和或不飽和、直鏈或支鏈 烴鏈；Ri、 Rj相同或不同，獨(dú)立地選自H、烷基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中Ri為甲基且Ri為H。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4的化合物，其中Y為任選被1 - 10個(gè)烷基 取代的飽和直鏈烷基鏈。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述b)鏈為式 (b-2):其中r為選自1、 2或3的整數(shù)； l為選自0-10的整數(shù)； q為選自0-50的整數(shù)；條件是l + q^l; f為烷基；各個(gè)Ti相同或不同，獨(dú)立地選自烷基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的化合物，其中 r為1;1為1、 2或3;q為選自10-20的整數(shù)；12為甲基;各個(gè)Ti為甲基，并且與Ti相連的碳原子顯示出(S)構(gòu)型。(b-2)
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述脂肪酰基選 (辛?；?(棕櫚?；?(硬脂酰基)(二十烷?；?(二十二烷酰基)(二十四烷?；?'(pH十CH2—CH--CH--CHCH。CH3 OH(羥基結(jié)核菌?；?(結(jié)核菌酰基)其中m為14或16且n為2-10的整數(shù), <formula>formula see original document page 4</formula> 其中m為14或16且n為2-10的整數(shù)。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所定義的R2為a)脂肪?；襌3為b) -C-O-X。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其為式(II):其中R2'、 R3'、 r、 p、 1、 q、 T2、 1^如上面的定義， 或其相應(yīng)的鹽；及其對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽,
11.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中- 1 = 2， _ 1 = 3， —1 = 4,一 1 = 1，一 1 = 3，一 1 = 4,- 1 = 1，- 1 = 2， -1 = 3， —1 = 4,一 1 = 1，- 1 = 2， 一 1 = 3，q q q q q q q q q q q q q q q4且r 4且r 4且r 4且r 4且r 4且r 4且r 4且r 2且r 2且r 2且r 2且r 2且r 2且r 2且r=1=2 =2<formula>formula see original document page 6</formula>并且其中p為6-22且f和Ti為甲基。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其選自由下列化合物 組成的組(II.2)<formula>formula see original document page 7</formula>(11.10)及其相應(yīng)的鹽，及其對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽。
13. 藥物組合物，其包含至少一種如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所定 義的化合物，并結(jié)合有藥學(xué)上可接受的載體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物，其為意圖經(jīng)口服或可注射途 徑給藥的形式。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14的藥物組合物，特征在于其包含一種 或多種可用于治療或預(yù)防結(jié)核病的其它產(chǎn)品，例如BCG或分枝桿菌 蛋白。
16. 產(chǎn)品，包含-至少一種根據(jù)權(quán)利要求1 - 12中任一項(xiàng)的化合物，和 -至少一種可用于治療或預(yù)防結(jié)核病的其它產(chǎn)品，例如BCG或 分枝桿菌蛋白，作為組合制劑同時(shí)、分別或依次用于治療或預(yù)防結(jié)核病。
17. 至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的化合物用于制備意 圖用來治療或預(yù)防結(jié)核病的藥物，特別是疫苗的用途。
18. 至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的化合物作為免疫反 應(yīng)活化劑，更尤其是炎性反應(yīng)活化劑的用途。
19. 至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的化合物用于誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞活化的用途。
20. 至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的化合物用于誘導(dǎo) IFN-y、 TNF-a、 IL-4或顆粒溶素的產(chǎn)生的用途。
21.用于診斷結(jié)核病的體外方法，包括下列步驟: 一從ppd陽性的個(gè)體中提供生物學(xué)試樣； -使所述試樣與式(X)化合物接觸OR3(X)其中r2'、 r3'相同或不同，獨(dú)立地選自h、 s03h或s037m+，條件是 r2'、 r3'中的至少一個(gè)是s03h或s037m+; m+是金屬陽離子，例如Na+、 k+; r2、 rs相同或不同，獨(dú)立地選自a) 脂肪?；鵲b) -g-x，其中X為任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的不飽和直鏈或支鏈烴鏈；及其對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽 或酯，-評價(jià)T淋巴細(xì)胞的活化；和-對比給藥所述化合物之后和之前的T淋巴細(xì)胞活化。
22.用于診斷結(jié)核病的試劑盒，包含 -式(X)化合物<formula>formula see original document page 11</formula>(X)其中R2'、 R3'相同或不同，獨(dú)立地選自H、 S03H或SCV/M+,條件是 R2'、 R3'中的至少一個(gè)為S03H或S037M+; M+為金屬陽離子，例如Na+、 K+; R2、 Rs相同或不同，獨(dú)立地選自a) 脂肪?；?lt;formula>formula see original document page 11</formula>b) -^-X，其中X為任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的不飽和直鏈 或支鏈烴鏈；及其對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽 或酯，-樹突狀細(xì)胞；和-用于檢測T淋巴細(xì)胞活化的裝置。
23.式(X)化合物用于評價(jià)由重組結(jié)核分枝桿菌制備的疫苗的效 果的用途<formula>formula see original document page 11</formula>(X)其中R2'、 R3'相同或不同，獨(dú)立地選自H、 S03H或SCV/M+，條件是r2'、 R3'中的至少一個(gè)為s03h或S037M+; M+為金屬陽離子，例如Na+、 K+, r2、 rS相同或不同，獨(dú)立地選自a) 脂肪?；鵲b) -g-X,其中X為任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的不飽和直鏈或支鏈經(jīng)鏈；及其對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽 或酯。
24.式(X)化合物的配體OR3(X)其中R2'、 R3'相同或不同，獨(dú)立地選自H、 S03H或S(V/M+，條件是 R2'、 R3'中的至少一個(gè)為S03H或SCV/M+; M+為金屬陽離子，例如Na+、 K+, R2、 Rs相同或不同，獨(dú)立地選自a) 脂肪?；鵲b) -S-X，其中X為任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的不飽和直鏈或支鏈烴鏈；及其對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物和藥學(xué)上可接受的鹽 或酯。
25. 根據(jù)權(quán)利要求21、 22、 23或24的方法、試劑盒、用途或配 體，其中式(X)化合物為根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的式(I)的那些化 合物。
26. 制備根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的式(I)化合物的方法，包 括下列步驟-磺化，和-用相應(yīng)的式(IV)和(IV')化合物R2X R3Y (IV) (IV') 其中W和R"如式(I)中的定義，且X和Y獨(dú)立地代表卣素原子或 OH基團(tuán)，酰化式(III)化合物其中P4、 P5、 P4'、 P5'各自相同或不同，代表H或OH-保護(hù)基團(tuán)， 或者P"和pS和/或P^和ps'—起形成環(huán)狀OH-保護(hù)基；其中，所述磺化和?；磻?yīng)以任何順序連續(xù)或交替進(jìn)行。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其進(jìn)一步包括保護(hù)和/或脫保護(hù)步驟。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26或27的方法，其進(jìn)一步包括分離所得的化 合物的步驟。
29.<formula>formula see original document page 14</formula>
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的化合物，其制備方法及其在治療或預(yù)防結(jié)核病中的用途。
文檔編號C07H13/06GK101622266SQ200880006090
公開日2010年1月6日 申請日期2008年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月24日
發(fā)明者G·德里貝羅, G·皮佐, J·吉亞爾, J·普朗迪, L·莫里, M·吉勒龍, S·鮑利迪 申請人:國家科研中心