專利名稱：：肽組合物的修飾以提高穩(wěn)定性和遞送效率的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請(qǐng)涉及用于提高生物活性試劑的載體進(jìn)入活組織細(xì)胞的組合物和方法。所述組合物和方法包括與修飾的tat肽綴合的PKC調(diào)節(jié)肽，所述修飾的tat肽為所述綴合物賦予提高的血漿穩(wěn)定性，允許更有效地吸收PKC調(diào)節(jié)肽進(jìn)入細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：研究已經(jīng)產(chǎn)生了許多具有作為治療性組合物的潛力的肽。然而，由于多種原因，尚未獲得實(shí)現(xiàn)和利用針對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的肽的全部治療性潛力。其中最重要的一個(gè)原因是大部分治療性肽不具有穿過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)它們的治療靶標(biāo)的能力。對(duì)該問(wèn)題的一種解決方案是使用作用為運(yùn)送貨物(cargo)肽進(jìn)入靶細(xì)胞的載體肽D存在許多有效促進(jìn)貨物肽穿過(guò)靶細(xì)胞膜的載體肽的著名實(shí)例。一個(gè)實(shí)例是來(lái)源于HIV病毒TAT蛋白的肽序列。參見，美國(guó)專利號(hào)6，316，003,其通過(guò)引用完全結(jié)合于此。另一種公知的載體肽序列是"聚-Arg"序列。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)6,306,993。在許多情形中，利用二硫鍵連接載體和貨物肽而產(chǎn)生治療性肽構(gòu)建體是解決使可溶肽靶向細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的問(wèn)題的有效策略。解釋二硫鍵的用途的一種理論認(rèn)為，一旦載體-貨物構(gòu)建體進(jìn)入靶細(xì)胞，這兩種肽可以通過(guò)二硫鍵還原而分離。與保留所述載體-貨物連接的其它連接機(jī)制相反，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的這種分離可以允許貨物肽在細(xì)胞內(nèi)更好的擴(kuò)散。然而，在這一點(diǎn)上，治療性肽的施用仍然遇到許多挑戰(zhàn)，諸如二硫鍵交換，蛋白水解降解和細(xì)胞吸收的效率。指導(dǎo)控制這些問(wèn)題的方法應(yīng)該增加治療性肽的穩(wěn)定性和功效。一種提高包括以二硫鍵與貨物肽鍵合的載體肽的治療性肽的功效的方法是減少二硫鍵交換。二硫鍵交換通過(guò)允許一個(gè)載體肽將其貨物肽換成另一個(gè)載體肽而減少給定樣品中的載體-貨物肽構(gòu)建體的量，由此導(dǎo)致產(chǎn)生載體-載體構(gòu)建體和貨物-貨物構(gòu)建體。僅有載體的構(gòu)建體將不具有治療作用。所述貨物-貨物構(gòu)建體將具有急劇減少的治療作用，如果不是完全消除的作用的話，因?yàn)樗鲚d體肽能夠?qū)⑺鲐浳镞f送至其細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。同樣地，控制二硫鍵交換的問(wèn)題對(duì)于使載體-貨物肽構(gòu)建體的治療潛力最大化非常重要。使用治療性肽所面對(duì)的另一個(gè)問(wèn)題是蛋白水解降解。肽是眾所周知的不穩(wěn)定分子，并且在施用給受試者時(shí)經(jīng)常容易受到蛋白水解攻擊而分解。在施用時(shí)降解的不穩(wěn)定的載體肽將減少或者甚至消除所述貨物肽的功效，因?yàn)樗鲐浳镆蕾囉谒鲚d體肽到達(dá)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。因此，控制或消除治療性肽的不穩(wěn)定的性質(zhì)的方法對(duì)于最大化載體-貨物肽的治療潛力也是重要的。提高治療性肽的細(xì)胞吸收效率是可能減少治療性肽的功效或潛力的另一個(gè)問(wèn)題。針對(duì)貨物肽最優(yōu)化載體肽的序列和位置提供用于提高治療性肽構(gòu)建體的穩(wěn)定性和潛力的方法。
發(fā)明內(nèi)容本公開的發(fā)明涉及制備包括載體肽和PKC活性調(diào)節(jié)貨物肽的治療性肽組合物的方法，由此形成的治療性肽組合物相對(duì)于未修飾的治療性肽具有提高的穩(wěn)定性和潛力。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是減少治療性肽組合物中的二硫鍵交換的方法，所述方法包括提供這樣的治療性肽組合物，所述治療性肽組合物包括包含第一半胱氨酸殘基的載體肽和包含第二半胱氨酸殘基的PKC活性調(diào)節(jié)貨物肽，其中所述載體肽和所述貨物肽通過(guò)在所述第一和第二半胱氨酸殘基之間的半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵連接；和引入至少一個(gè)緊鄰所述第一或第二半胱氨酸殘基、或兩者的脂族殘基，由此二硫鍵交換率相對(duì)于未修飾的治療性肽組合物減少。本公開的發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及減少治療性肽組合物的蛋白水解降解的方法，所述方法包括提供這樣的治療性肽組合物，所述治療性肽組合物包括載體肽和PKC活性調(diào)節(jié)貨物肽，并且其中所述載體肽與所述貨物肽連接；確定在所述載體肽、貨物肽、或這兩種肽上的蛋白水解不穩(wěn)定位點(diǎn)；和修飾在所述不穩(wěn)定位點(diǎn)的氨基酸序列，以便使所述位點(diǎn)處的蛋白水解降解率相對(duì)于未修飾的治療性肽組合物而減少。本公開的發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及提高治療性肽組合物的血漿穩(wěn)定性的方法，所述方法包括提供這樣的治療性肽組合物，所述治療性肽組合物包括載體肽和PKC活性調(diào)節(jié)貨物肽，并且其中所述載體肽與所述貨物肽連接；修飾所述載體肽、貨物肽、或二者的氨基端、羧基端或兩端的殘基，以便所述治療性肽組合物的血槳穩(wěn)定性相對(duì)于未修飾的治療性肽組合物得到提高。還打算在本文中公開組合物。所公開的組合物的一個(gè)實(shí)施方案包括蛋白激酶C(PKC)調(diào)節(jié)肽組合物，其包括與細(xì)胞內(nèi)載體肽共價(jià)連接的PKC調(diào)節(jié)肽，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽、所述調(diào)節(jié)肽、或二者均在N-端被修飾。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示繪制CK釋放相對(duì)于治療性肽KAI-9706和KAI-1455的濃度的圖。圖2顯示繪制梗死百分?jǐn)?shù)相對(duì)于增加濃度的治療性肽KAI-9706和KAI-1455的圖。圖3A-3B顯示繪制完整的治療性肽KAI-9803、KAI-9706、和KAI-1455在人血清中(3A)、豬血清(3B)、和大鼠血清(3C)中隨時(shí)間存活的百分?jǐn)?shù)的圖。'圖4顯示包括通過(guò)二硫鍵連接的載體肽和貨物肽的治療性肽轉(zhuǎn)化為線性形式治療性肽的圖解。該線性肽(KP-01547)已在其氨基端和羧基端加帽，并且包含短的氨基酸序列連接體。圖5顯示繪制完整的治療性肽(線性的和非線性的)隨時(shí)間(天數(shù))的百分?jǐn)?shù)的圖。圖6顯示比較治療性肽隨時(shí)間(天數(shù))的穩(wěn)定性的圖。圖7顯示示例的兩種線性肽。圖8顯示比較各種PKC-A治療性肽隨時(shí)間的穩(wěn)定性的圖。圖9顯示比較各種PKC-P治療性肽隨時(shí)間的穩(wěn)定性的圖。圖10A-10D顯示舉例說(shuō)明在26°C(IOA)和37°C(IOB)溫度對(duì)KAI-9706的穩(wěn)定性的影響，和在26。C(IOC)和37°C(IOD)溫度對(duì)KAI1455的穩(wěn)定性的影響的圖。圖11顯示繪制在Langendorff體外局部缺血后測(cè)定中采用10分鐘灌流時(shí)，在存在增加濃度的KAI-9803或KAI-1355肽的條件下肌酸激酶釋放的圖。圖12顯示描述構(gòu)建KAI-1479的圖解。圖13A和13B顯示來(lái)自再灌流研究的結(jié)果的柱狀圖，其中13A舉例說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中事件的時(shí)間線索，13B顯示舉例說(shuō)明各種治療性肽(KAI-9803，KAI-1479，和KAI-1482)的保護(hù)特性的柱狀圖。圖14顯示SEQIDNO:33的貨物肽的圖解，其中在所述肽的氨基端具有一個(gè)半胱氨酸殘基。圖15A-15D顯示治療性肽多聚體的4種不同的可能的構(gòu)型。圖16顯示線性肽KP-1680,KP-1681,KP-1633,和KP-1678。圖17A-D顯示測(cè)試溶液中隨時(shí)間殘余的肽的百分?jǐn)?shù)的圖。實(shí)施發(fā)明的方式本公開的發(fā)明涉及修飾肽組合物以提高穩(wěn)定性和遞送效率的方法。具體地，本公開的發(fā)明涉及提高蛋白激酶C(PKC)調(diào)節(jié)肽組合物的穩(wěn)定性和遞送效率的方法。"治療性肽組合物"包括"載體肽"和"貨物肽"。"載體肽"是促進(jìn)細(xì)胞吸收治療性肽組合物的肽或肽內(nèi)的氨基酸序列。所述"貨物肽"是PKC調(diào)節(jié)肽。本發(fā)明所述的對(duì)所述載體肽、所述貨物肽或兩者的肽修飾通過(guò)減少二硫鍵交換、物理穩(wěn)定性、減少蛋白水解降解、和增加細(xì)胞吸收的效率而提高治療性肽組合物的穩(wěn)定性和遞送效率。二硫鍵交換所公開的治療性肽組合物的優(yōu)選實(shí)施方案提供通過(guò)在兩個(gè)連接性含硫殘基之間的二硫鍵與載體肽偶聯(lián)的貨物肽，所述連接性含硫殘基在每個(gè)肽中各有一個(gè)。無(wú)論所述治療性肽組合物處于溶液中、凍干、沉淀、結(jié)晶、或噴霧干燥，該實(shí)施方案的二硫鍵可以是不穩(wěn)定的，這導(dǎo)致載體-貨物組合降解成無(wú)活性的載體-載體組合物、和同樣無(wú)活性且通常不溶的貨物-貨物組合物。所公開的治療性肽組合物的穩(wěn)定性通過(guò)使用化學(xué)修飾和通過(guò)在使用前控制所述肽組合物的物理環(huán)境而得到提高。化學(xué)修飾連接性含硫殘基可以位于所述載體或貨物肽序列中的任何位置。例如，所公開的治療性肽組合物的優(yōu)選實(shí)施方案典型地具有位于所述載體肽和貨物肽的氨基端處的連接性含硫殘基。所述連接性含硫殘基可以位于所述肽的羧基端，或備選地位于肽的氨基端和位于另一種肽的羧基端。另外，所述連接性含硫殘基可以位于任一種或這兩種肽序列中的任何位置處。已經(jīng)觀察到將所述連接性含硫殘基置于所述載體肽、所述貨物肽、或二者內(nèi)減少了二硫鍵交換率。有效用于穩(wěn)定所述治療性肽組合物的二硫鍵的化學(xué)修飾的實(shí)例包括最優(yōu)化緊鄰用來(lái)連接所述載體和貨物肽的含硫殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。穩(wěn)定二硫鍵的優(yōu)選方法包括將脂族殘基置于所述載體肽和/或貨物肽中緊鄰含硫殘基的位置處。脂族殘基包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。因此，當(dāng)將所述連接性含硫殘基置于肽的氨基端時(shí)，將脂族殘基置于該肽的倒數(shù)第二個(gè)氨基端位置處，從而減少二硫鍵交換率。當(dāng)所述連接性含硫殘基位于肽的羧基端時(shí)，脂族殘基位于該肽的倒數(shù)第二個(gè)羧基端位置處，從而減少二硫鍵交換率。當(dāng)所述連接性含硫殘基位于肽的序列內(nèi)時(shí)，可以將脂族殘基置于該殘基的氨基端或羧基端側(cè)、或兩側(cè)。預(yù)計(jì)多種含硫殘基用于本公開的發(fā)明。半胱氨酸和半胱氨酸類似物也可以用作肽組合物中的連接性半胱氨酸殘基。具體的半胱氨酸類似物包括D-半胱氨酸，高半胱氨酸，(X-甲基半胱氨酸，巰基丙酸，巰基乙酸，青霉胺，這些類似物的能夠接受乙?；鶊F(tuán)的乙?；问剑约坝闷渌忾]基團(tuán)修飾的半胱氨酸類似物。例如，已經(jīng)表明在所述貨物肽、載體肽或這兩種肽中使用高半胱氨酸、乙?；母甙腚装彼?、青霉胺、和乙?；那嗝拱贩€(wěn)定所述肽組合物并且減少二硫鍵交換。a-甲基半胱氨酸抑制二硫鍵降解，因?yàn)閴A介導(dǎo)從一個(gè)半胱氨酸中奪取a氫被硫原子的存在而阻止。已經(jīng)表明通過(guò)二硫鍵連接的貨物/載體肽綴合物比未修飾的肽更抗谷胱甘肽還原。其它半胱氨酸類似物也有效用作連接性半胱氨酸。類似地，半胱氨酸的立體異構(gòu)體將抑制二硫鍵交換?？梢酝ㄟ^(guò)連接所述載體和貨物肽形成單一的線性肽而完全消除二硫鍵交換。下文討論該方法。物理穩(wěn)定性二硫鍵的物理環(huán)境對(duì)穩(wěn)定性有影響。如在圖10中(部分)所示，溶液中的穩(wěn)定性在溶液的pH減小(酸性環(huán)境優(yōu)于堿性)、溶液溫度降低時(shí)，和在溶液中肽組合物的濃度減小時(shí)提高。采用凍干形式時(shí)，穩(wěn)定性隨pH減小、溫度降低，和所述肽組合物與賦形劑的比例升高而提高。優(yōu)選的賦形劑在于2005年9月30日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/240,962中討論，其通過(guò)引用完全結(jié)合于此。出乎意料的"賦形劑作用"對(duì)于甘露糖醇是最顯著的，所述甘露糖醇是一種髙度晶體狀的賦形劑。使用較少晶體狀賦形劑(諸如蔗糖)或者甚至不使用賦形劑，表現(xiàn)出對(duì)肽組合物的量少得多的依賴性。盡管不希望受到任何理論的束縛或局限，應(yīng)該認(rèn)為使用非晶體狀賦形劑產(chǎn)生非晶形基質(zhì)，其輔助防止分子間締合。理論上，在晶體狀基質(zhì)中，所述肽組合物被排斥并且被迫使到瓶壁處，可能引起高的局部濃度。使用少量的API，所形成的薄膜具有高的肽-玻璃接觸面積，并且使硅石不穩(wěn)定。許多因素影響靶細(xì)胞吸收治療性肽組合物的效率。例如，治療性肽的溶解性影響耙細(xì)胞吸收該肽的效率。載體或貨物肽的氨基酸序列又在很大程度上決定在其中使用它們的肽組合物的溶解性。一些肽，特別是貨物肽，應(yīng)該包含具有常規(guī)間隔的疏水殘基，(例如，Phe,Tyr，Leu)，所述間隔允許通過(guò)"拉鏈"機(jī)制進(jìn)行分子內(nèi)相互作用從而引起聚集。所述有潛在問(wèn)題的肽的實(shí)例顯示在圖14中。據(jù)信所示例的序列在SPKC的VI結(jié)構(gòu)域中形成P-鏈。所述肽具有形成不溶沉淀物的傾向。所述肽的溶解性可以通過(guò)對(duì)貨物肽序列進(jìn)行某些修飾而提高。例如，在氨基和或羧基端或內(nèi)部殘基上引入增溶基團(tuán)，諸如水合基團(tuán)，如聚乙二醇(PEG)，高度帶電荷基團(tuán)，如季銨鹽，或特定氨基酸殘基的大的、分支鏈，將提高肽，如在圖14中所示例的那種肽的溶解性。另外，顯示對(duì)于活性不是必需的那些疏水性側(cè)鏈可以通過(guò)缺失或用保守或非干擾性殘基如丙氨酸、甘氨酸、或絲氨酸取代而去除，由此提高該肽的溶解性。蛋白水解降解血漿穩(wěn)定性血液和血漿包含蛋白酶，所述蛋白酶可以降解本文公開的蛋白激酶c調(diào)節(jié)肽或促進(jìn)細(xì)胞吸收肽組合物的載體肽，或二者。減少載體或貨物肽的蛋白水解降解的一種方法是掩蔽由所述治療性肽組合物呈遞的蛋白酶的靶標(biāo)。所述治療性肽一旦進(jìn)入受試者的血漿，它變得容易受肽酶的攻擊。提供這樣的策略，所述策略針對(duì)由外肽酶(水解由肽鏈的末端氨基酸形成的肽鍵的一組酶中的任一種)或內(nèi)肽酶(水解在蛋白分子長(zhǎng)鏈內(nèi)部的肽鍵的一組酶中的任一種)引起的肽降解。外肽酶是從肽或蛋白的氨基或羧基端分裂氨基酸殘基的酶，并且可以在特定的或非特定的位點(diǎn)分裂。內(nèi)肽酶，其在氨基酸序列內(nèi)部分裂，也可^是非特異性的，然而，內(nèi)肽酶通常識(shí)別特定的氨基序列(識(shí)別位點(diǎn))，并且在那些位點(diǎn)處或在那些位點(diǎn)附近分裂該肽。保護(hù)肽組合物免于蛋白水解降解的一種方法包括對(duì)該肽的氨基和/或羧基端進(jìn)行"加帽"。術(shù)語(yǔ)"加帽"是指通過(guò)共價(jià)修飾向肽的末端引入封閉基團(tuán)。適當(dāng)?shù)姆忾]基團(tuán)作用為對(duì)該肽的末端加帽，但不減小該肽的生物活性。所述肽的氨基端的乙酰化是保護(hù)肽免于蛋白水解降解的優(yōu)選方法。其它的加帽部分是可能的。選擇?；糠譃閷?duì)肽"加帽"并且調(diào)整化合物的疏水性提供機(jī)會(huì)。例如，對(duì)于下述?；鶊F(tuán)系列疏水性增加甲?；?、乙?；?、丙酰基(propanoyl)、己酰基、肉豆蔻?；?，并且還考慮作為加帽部分。所述肽的羧基端酰胺化也是保護(hù)該肽免于蛋白水解降解的一種優(yōu)選方法。保護(hù)肽免受內(nèi)肽酶作用典型地包括識(shí)別并且消除肽的內(nèi)肽酶識(shí)別位點(diǎn)。蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的。因此，識(shí)別潛在的內(nèi)肽酶識(shí)別位點(diǎn)并且然后通過(guò)改變所述識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸序列而消除所述位點(diǎn)是可能的?？梢砸苿?dòng)或移除識(shí)別序列內(nèi)的殘基，以破壞所述識(shí)別位點(diǎn)。優(yōu)選地，使用包括確定的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行保守取代。這些氨基酸的側(cè)鏈具有多種化學(xué)特性。為了本討論的目的，將最常見的氨基酸歸納為9組，在下文列出。認(rèn)為在這些組內(nèi)的取代是保守取代。保守氨基酸取代<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>細(xì)胞吸收效率除了上文討論的修飾之外，改進(jìn)所公開的治療性肽組合物的效用可以通過(guò)改變所述載體和貨物肽的連接而實(shí)現(xiàn)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，載體和貨物肽通過(guò)肽鍵連接，形成線性肽。還可以通過(guò)構(gòu)建肽多聚體而提高治療性肽的穩(wěn)定性和效力，其中將多個(gè)貨物肽連接于一個(gè)或多個(gè)載體肽。還討論了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，其包括可分裂的連接體序列。線性肽提高肽組合物穩(wěn)定性的另一種策略包括將所述貨物和載體肽連接成單一的肽，這與通過(guò)二硫鍵連接肽相反。例如，在圖4A所示的實(shí)施方案中，貨物肽(SEQIDN0:13)通過(guò)氨基端半胱氨酸連接。貨物和載體肽的線性形式顯示在圖4B中，其中所述貨物和載體肽通過(guò)短的二肽連接體(例如，Ser-Gly)連接。該連接體是示例性的。在所示例的實(shí)例中，貨物的C-端與載體的N-端通過(guò)連接體連接。然而，還考慮了其它可能的變換，包括通過(guò)它們的C-端、它們的N-端連接所述肽，并且其中所述載體肽位于該肽組合物的N-端部分。另外，在適宜的情形中，還可以對(duì)線性的使用上文討論的穩(wěn)定二硫鍵連接的肽組合物的步驟。例如，圖4B所示的線性肽組合物已經(jīng)在其氨基和羧基端加帽。此外，在肽內(nèi)的序列可以混雜(scramble)或取代為D-氨基酸。如在圖7中所示，已經(jīng)觀察到在|3-1的位置7處的Asn的脫氨作用在通過(guò)Asn-Gly連接的線性化肽組合物形式中引起顯著的不穩(wěn)定性。將Gly改變?yōu)長(zhǎng)eu穩(wěn)定該線性的肽組合物。類似地，觀察到在線性p-II組合物的位置2處的Gln殘基的脫氨作用引起顯著的不穩(wěn)定性。用Glu取代提高所述線性組合物的穩(wěn)定性。比較這些肽的修飾形式的數(shù)據(jù)顯示在圖8和9中。在不受任何特定理論局限的條件下，認(rèn)為脫氨作用由a或主鏈酰胺HN-C-末端對(duì)Asn的側(cè)鏈酰胺上的Asn殘基的攻擊引起，產(chǎn)生環(huán)狀天冬酰胺中間體，所述中間體可以水解成天冬氨酸部分。認(rèn)為增加Asn的C-端殘基的尺寸增加對(duì)主鏈酰胺的空間位阻，顯著減慢脫酰胺作用。肽多聚體提高穩(wěn)定性和效力的另一種方法通過(guò)形成具有與一個(gè)或多個(gè)載體肽締合的多個(gè)貨物肽的多聚體而提供。所述制劑的實(shí)例顯示在圖15中。分支的、多價(jià)肽組合物將提高所述組合物的親和性、效力和穩(wěn)定性。通過(guò)將分裂位點(diǎn)或其它釋放機(jī)制改造成多聚體組合物，多個(gè)組合物可以幾乎同時(shí)在靶細(xì)胞內(nèi)釋放PKC調(diào)節(jié)性貨物肽。多聚體肽的實(shí)例在Yu等.JBC275(6):3943-9(2000)中討論。可分裂的序列典型地，所述載體和貨物通a可以由遍在酶諸如酯酶、酰胺酶等分裂的連接而連接。假設(shè)所述酶的濃度在細(xì)胞內(nèi)比在細(xì)胞外環(huán)境中更高。因此，所述綴合物一旦在細(xì)胞內(nèi)時(shí)，它更可能遇到可以分裂貨物和載體之間的連接的酶。因此，該酶可以在細(xì)胞內(nèi)釋放生物活性貨物，在此處大概是最有效的。蛋白激酶C調(diào)節(jié)肽術(shù)語(yǔ)蛋白激酶C調(diào)節(jié)肽是指來(lái)源于PKC同工酶-和/或可變區(qū)的肽。已經(jīng)描述了多種PKC同工酶-和可變區(qū)-特異性的肽，并且其可以用于本公開的發(fā)明。優(yōu)選地，PKC調(diào)節(jié)肽是Vl,V3或V5-來(lái)源的肽。(術(shù)語(yǔ)"VI"和"C2"是同義的。)下述美國(guó)專利或美國(guó)申請(qǐng)描述了多種可以用于本公開的發(fā)明的適宜的肽5，783，405，6,165，977，6,855,693，US2004/0204364，US2002/0150984,US2002/0168354，US2002/057413，US2003/0223981,US2004/0009922和10/428,280,其每一個(gè)通過(guò)引用完全結(jié)合于此。表1提供了用于本發(fā)明的優(yōu)選的PKC調(diào)節(jié)肽的列表。表1來(lái)源于PKC同工酶的貨物肽肽SEQIDNO.序列aV3-lSEQIDN0:2I-P-E-G-D-E-E-GaV5-lSEQIDNO:3Q-L"V-I-A-NaV5-1.1SEQIDNO:4G-L-G-A-E-NaV5-1.2SEQIDNO:5A-R-G-A-E-NaV5-13SEQIDNO:6C-G-K-G-A-E-NctV5-1.4SEQIDNO:7C-G-K-G-A-E-NI3C2-1SEQIDNO:8K-Q-K-T-K-T-I-KPC2-2SEQIDNO:9M-D-P-N-G;S-D-P國(guó)Y-V-K-LSEQIDNO:IOI-P-D-P-K-S-E[3C2-4SEQIDNO:11S-LN-P-E-W-N-E-T&V3-1SEQIDNO:12V-P-P-E-G-S-E-APIV5-1SEQIDNO:13K-L"F-I-M-NPIV5-2SEQIDNO:14R-D-K-R-D-T-Sprv5-2,i卿IDNO:15C陽(yáng)A-R-D-K-R-D-T-S(3IV5-2.2SEQIDNO:16G-R-D-K-R-D-T-S(HV5-23SEQIDNO:17A-R-D-K-R-D-T-SPIV5-3SEQIDNO:18A-R-D-K-R-D-T-S-N-F-D-K<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>載體的其它實(shí)例包括octa-Arg，octa-D-Arg，禾口角蟲角足(爿"fe""ap^/^)來(lái)源的肽，其是本領(lǐng)域已知的。提供下述實(shí)施例用以舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1外肽酶保護(hù)加帽的肽的血漿穩(wěn)定性比較了加帽的肽的血漿穩(wěn)定性。在KAI-9706的氨基和羧基端逐步修飾KAI-9706。通過(guò)在15分鐘后殘留的肽組合物的百分?jǐn)?shù)測(cè)量血漿穩(wěn)定性。結(jié)果提供在表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在i5分鐘殘留的y。親本在大鼠血漿中的t^=40-45分鐘，對(duì)于最長(zhǎng)存活的衍生物上述提供的數(shù)據(jù)表明包括未修飾的貨物和載體肽的肽組合物最不穩(wěn)定。此外，僅對(duì)載體肽進(jìn)行保護(hù)不能提高所述肽組合物在血漿中的半衰期。并且，修飾貨物肽而不修飾載體肽對(duì)血槳中的半衰期穩(wěn)定性沒(méi)有明顯的影響。然而，對(duì)載體肽添加保護(hù)基團(tuán)，不管是在氨基還是羧基端，均導(dǎo)致所述肽組合物血漿穩(wěn)定性的顯著的和幾乎等價(jià)的提高。保護(hù)載體肽中的兩個(gè)基團(tuán)提供額外的保護(hù)。令人感興趣的是對(duì)貨物肽的保護(hù)對(duì)所述組合物的穩(wěn)定性具有很少或者沒(méi)有影響。實(shí)施例2D-肽對(duì)血漿穩(wěn)定性的影響用D-氨基酸改造KAI-9706，以確定它們對(duì)肽組合物穩(wěn)定性的影響。將未修飾的KAI-9706與具有相同氨基酸序列的肽組合物比較，但是所用的氨基酸為d-對(duì)映體而不是l-氨基酸。還制備了所述肽組合物的逆-反形式和混雜形式。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在表3中。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例6加帽的KAI-9706表現(xiàn)出提高的效力在中風(fēng)模型中檢測(cè)KAI-1455。如在圖2中所示，當(dāng)通過(guò)梗死(infract)百分?jǐn)?shù)判斷時(shí)，肽組合物的加帽形式對(duì)腦組織提供提高的保護(hù)作用。這一數(shù)據(jù)表明以較低劑量獲得對(duì)腦組織的顯著保護(hù)。實(shí)施例7與物種無(wú)關(guān)的肽穩(wěn)定性的提高在人(圖3A)，豬(圖3B)和大鼠血清(圖3C)中，針對(duì)KAI-9706和KAI-9803比較修飾的KAI-9706肽(KAI-1455)的穩(wěn)定性。加帽的形式，KAI-1455，在所有三種物種中表現(xiàn)出提高的血漿穩(wěn)定性。實(shí)施例8線性肽的穩(wěn)定性構(gòu)建KAI-9803和BC2-4的線性形式，以評(píng)估它們相對(duì)于這些和其它肽組合物的二硫鍵連接形式的穩(wěn)定性。將所述肽以0.1mg/ml的溶液在37。C置于PBS(pH7.4)中。如圖5所示，KAI-9803和BV2-4的線性形式表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性。實(shí)施例9線性PKC-^和PKC-P^肽組合物表現(xiàn)出超越二硫鍵連接的組合物的提高的穩(wěn)定性在實(shí)施例8所述的條件下，溫育PKC-^和PKC-(3u肽組合物的線性和二硫鍵連接形式。如圖6所示，PKC-P,和PKC-Pn肽的線性形式，與它們的非線性負(fù)體相比，表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性。實(shí)施例10線性PKC-3l和PKC-(J!l肽組合物的提高的穩(wěn)定性PKC-(^和PKC-Pu肽組合物的線性形式表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性，但是還是脫氨反應(yīng)的對(duì)象。特別是在(3-1和P-II肽的位置7處的Asn殘基和在(3-II肽的位置2處的Gln。這些線性肽組合物通過(guò)用在(3-1肽組合物中的Leu取代緊鄰AsnC-端的Gly，或用在p-II肽組合物中的lie取代Gly來(lái)修飾。還用Glu殘基取代在(3-II肽組合物中位置2處的Gln。在實(shí)施例8所述的條件下研究該肽的穩(wěn)定性。如在圖8和9中所示，上文討論的氨基酸取代起穩(wěn)定這些線性肽組合物的作用。實(shí)施例11KAI-9803衍生物(KAI-1355)保持效力檢測(cè)KAI-9803的剪截形式即KAI-1355的效力，在KAI-1355中去除了羧基端亮氨酸。對(duì)KAI-1355的穩(wěn)定性研究表明缺失C-端Leu殘基提高該貨物肽的穩(wěn)定性。在Langendorff體外局部缺血后模型中，比較衍生的肽組合物的效力與全長(zhǎng)形式即KAI-9803的效力。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖11中。如所示，KAI-1355(KAI-9803的修飾形式)仍然能夠以與全長(zhǎng)KAI-9803相當(dāng)?shù)男ЯΡＷo(hù)心臟組織免于局部缺血。實(shí)施例12最優(yōu)化KAI-9803產(chǎn)生KAI-1479己經(jīng)表明對(duì)KAI-9803的貨物肽的剪截對(duì)效力具有很小或沒(méi)有(now)影響，同時(shí)穩(wěn)定所述肽組合物。如在圖12中所示例，TAT載體肽的加帽形式與KAI-1355的剪截的貨物肽結(jié)合，產(chǎn)生KAI-1479，其包括剪截的9803貨物肽和完全加帽的TAT載體肽。在大鼠中腦動(dòng)脈閉塞(MCAO)中風(fēng)模型中測(cè)定修飾的KAI-1479、KAI-9803和KAI-1482肽組合物，以確定所述肽組合物抑制梗死尺寸的能力。大鼠經(jīng)受2小時(shí)期間的中腦動(dòng)脈閉塞。在即將進(jìn)行22小時(shí)的再灌流期間之前對(duì)測(cè)試動(dòng)物施用所述肽組合物或鹽水中的一種，此時(shí)間之后，將動(dòng)物處死，并且測(cè)量梗死的尺寸。如圖13所示，與KAI-9803相比，修飾的KAI-1479肽組合物表現(xiàn)出提高的阻止梗死尺寸的能力。KP-01482具有與帶有N-端Cys的TAT肽連接的貨物序列(CELGSLQAEDD)，其在兩端加帽并且與貨物二硫鍵綴合。實(shí)施例13一系列線性sPKC抑制劑的體外生物學(xué)穩(wěn)定性研究了N-端乙?；虲-端酰胺化對(duì)化合物在大鼠和人血漿和血清中的穩(wěn)定性的影響。檢驗(yàn)的線性肽顯示在圖16中?；衔镆?00pg/ml的濃度在血漿/血清中進(jìn)行檢測(cè)。溶液在室溫溫育，用5。/。TCA沉淀，并且然后用乙酸銨中和上清。然后通過(guò)LC/MS分析所述肽。如從圖17A-17D中的數(shù)據(jù)可以看出，所有檢測(cè)的化合物在人血漿中均相對(duì)穩(wěn)定，而包含C-端酰胺的KP-1633和KP-1678在人血清中表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性。單獨(dú)的N-端乙?；环€(wěn)定所述肽。令人感興趣的是，KP-1680的氨基酸序列及其降解產(chǎn)物表明該肽的代謝形式表現(xiàn)出從C-端連續(xù)分裂精氨酸殘基。在血漿而非血清中的羧肽酶N活性可以解釋所觀察到的穩(wěn)定性的差異。血漿樣品是用EDTA收集的，已知EDTA抑制這種鋅金屬蛋白酶。權(quán)利要求1.減少治療性肽組合物中的二硫鍵交換的方法，所述方法包括提供這樣的治療性肽組合物，所述治療性肽組合物包括包含第一半胱氨酸殘基的載體肽和包含第二半胱氨酸殘基的PKC活性調(diào)節(jié)貨物肽，其中所述載體肽和所述貨物肽通過(guò)在所述第一和第二半胱氨酸殘基之間的半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵連接；和引入至少一個(gè)緊鄰所述第一或第二半胱氨酸殘基、或兩者的脂族殘基，由此二硫鍵交換率相對(duì)于未修飾的治療性肽組合物減小。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一半胱氨酸位于所述載體肽序列的氨基端、羧基端、或內(nèi)部。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二半胱氨酸位于所述貨物肽序列的氨基端、羧基端、或內(nèi)部。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述半胱氨酸殘基是半胱氨酸類似物。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述半胱氨酸類似物是高半胱氨酸。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述半胱氨酸類似物是D-半胱氨酸。7.權(quán)利要求4的方法，其中所述半胱氨酸類似物是a-甲基半胱氨酸。8.減少治療性肽組合物的蛋白水解降解的方法，所述方法包括提供這樣的治療性肽組合物，所述治療性肽組合物包括載體肽和PKC活性調(diào)節(jié)貨物肽，并且其中所述載體肽與所述貨物肽連接；確定在所述載體肽、貨物肽、或這兩種肽上的蛋白水解不穩(wěn)定位點(diǎn)；和修飾氨基酸序列從而抑制蛋白水解，以便使在所述位點(diǎn)處的蛋白水解降解率相對(duì)于未修飾的治療性肽組合物而減小。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述修飾步驟包括將所述載體肽、所述貨物肽、或二者的氨基末端酰化。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述修飾步驟包括將所述載體肽、所述貨物肽、或二者的羧基末端酰胺化。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述蛋白水解不穩(wěn)定位點(diǎn)是蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述修飾步驟包括在所述蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)引入氨基酸添加、缺失或取代，以便改變所述識(shí)別位點(diǎn)序列。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述氨基酸添加或所述氨基酸取代包括引入D-氨基酸。14.權(quán)利要求11的方法，其中所述修飾步驟包括引入所述蛋白水解不穩(wěn)定位點(diǎn)的化學(xué)修飾。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述化學(xué)修飾是(x-甲基化、或N-甲基化。16.提高治療性肽組合物的血漿穩(wěn)定性的方法，所述方法包括提供這樣的治療性肽組合物，所述治療性肽組合物包括載體肽和PKC活性調(diào)節(jié)貨物肽，并且其中所述載體肽與所述貨物肽連接；修飾所述載體肽、所述貨物肽、或二者的氨基端、羧基端或兩端的殘基，以便使所述治療性肽組合物的血漿穩(wěn)定性相對(duì)于未修飾的治療性肽組合物得到提高。.17.權(quán)利要求13的方法，其中所述載體肽是修飾的tat肽。18.權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾的tat肽是通過(guò)在其N-端氨基酸胺基基團(tuán)的?；蛟谄銫-端氨基酸羧基基團(tuán)的酰胺化、或兩者進(jìn)行修飾的。19.蛋白激酶C(PKC)調(diào)節(jié)肽組合物，其包括與細(xì)胞內(nèi)載體肽共價(jià)連接的PKC調(diào)節(jié)肽，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽、調(diào)節(jié)肽、或兩者在N-端修飾。20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述PKC調(diào)節(jié)肽通過(guò)二硫鍵與細(xì)胞內(nèi)載體肽連接。21.權(quán)利要求19的組合物，其中所述PKC調(diào)節(jié)肽是抑制PKC同工酶活性的抑制性肽。22.權(quán)利要求19的組合物，其中所述PKC調(diào)節(jié)肽是促進(jìn)PKC同工酶活性的激活肽。23.權(quán)利要求19的組合物，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽是包括YGRKKRRQRRR(SEQIDNO:)的修飾的tat肽。24.權(quán)利要求19的組合物，其中所述細(xì)胞內(nèi)載體肽是包括CYGRKKRRQRRR(SEQIDNO:)的修飾的tat肽。25.權(quán)利要求23或24的組合物，其中所述修飾的tat肽在其N-端末端被酰基、烷基、或磺?；〈?。26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述修飾的tat肽在其N-端末端被?；?。27.權(quán)利要求19的組合物，其中所述tat肽還在其C-端末端被修飾。28.權(quán)利要求19的組合物，其中所述tat肽還通過(guò)在其C-端末端形成酰胺而修飾。29.權(quán)利要求19的組合物，其中所述PKC調(diào)節(jié)肽與所述修飾的tat肽的氨基酸側(cè)鏈共價(jià)連接。30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述PKC調(diào)節(jié)肽與選自半胱氨酸、賴氨酸、和酪氨酸的殘基的側(cè)鏈共價(jià)連接。31.權(quán)利要求24的組合物，其中所述PKC調(diào)節(jié)肽與N-端半胱氨酸殘基的側(cè)鏈共價(jià)連接。32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述M肽的N-端半胱氨酸被?；?。33.權(quán)利要求31的組合物，其中所述tat肽的C-端精氨酸是伯(primary)羧酰胺。34.權(quán)利要求31的組合物，其中所述PKC調(diào)節(jié)肽通過(guò)在其N-末端?；?、或在其C-末端酰胺化、或通過(guò)在其N-末端?；驮谄銫-末端酰胺化二者而被修飾。35.權(quán)利要求19的組合物，其中所述修飾的tat肽是Ac-CYGRKKRRQRRR-NH2。36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述PKC調(diào)節(jié)肽通過(guò)所述tat肽的半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)與所述tat肽共價(jià)連接。37.權(quán)利要求19的組合物，其還包括第二膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽。38.線性治療性肽，其包括載體肽和PKC活性調(diào)節(jié)貨物肽，其中所述載體肽和所述貨物肽通過(guò)肽鍵連接。39.權(quán)利要求38的線性治療性肽，其還包括位于所述載體肽和所述貨物肽之間的連接體肽，其中所述載體肽和所述貨物肽通過(guò)肽鍵與所述連接體肽連接。40.權(quán)利要求38的線性治療性肽，其中所述治療性肽的氨基端、羧基端、或兩端在氨基端氨基酸胺基基團(tuán)?；蛟隰然税被狒然鶊F(tuán)酰胺化、或二者。41.治療性肽多聚體，其包括至少一個(gè)載體肽，其與多個(gè)PKC活性調(diào)節(jié)貨物肽綴合。42.權(quán)利要求41的治療性肽多聚體，其中所述至少一個(gè)載體蛋白包括第一和第二半胱氨酸殘基。43.權(quán)利要求42的治療性肽多聚體，其中第一貨物肽通過(guò)二硫鍵與所述第一半胱氨酸殘基連接，并且第二貨物蛋白通過(guò)二硫鍵與所述第二半胱氨酸殘基連接。全文摘要本公開的發(fā)明涉及修飾肽組合物以提高穩(wěn)定性和遞送效率的方法。具體地，本公開的發(fā)明涉及提高蛋白激酶C(PKC)調(diào)節(jié)肽組合物的穩(wěn)定性和遞送效率的方法?！爸委熜噪慕M合物”包括“載體肽”和“貨物肽”?！拜d體肽”是促進(jìn)細(xì)胞吸收所述治療性肽組合物的肽或肽內(nèi)的氨基酸序列。所述“貨物肽”是PKC調(diào)節(jié)肽。本發(fā)明所述的對(duì)所述載體肽、所述貨物肽或兩者的肽修飾通過(guò)減少二硫鍵交換、物理穩(wěn)定性、減少蛋白水解降解、和增加細(xì)胞吸收的效率而提高治療性肽組合物的穩(wěn)定性和遞送效率。文檔編號(hào)C07K14/00GK101675067SQ200880008559公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2008年1月22日優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日發(fā)明者德里克·麥克萊恩申請(qǐng)人:凱制藥公司