專利名稱：用于對選自bnp和bnp原的不穩(wěn)定抗原定量的免疫測定法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫測定法，并提供了用于檢測不穩(wěn)定抗原的免疫測定方法。所述方 法對于檢測BNP、BNP原(proBNP)及其片段是特別合適的。
背景技術：
BNP和BNP原是心力衰竭(HF)的可靠標志物，在臨床實踐中被廣泛使用。文獻中 記載了數(shù)種類型的三明治式免疫測定法(常規(guī)測定法)，它們利用對BNP的或BNP原分子 BNP片段的不同表位特異性的兩種單克隆或多克隆抗體。已知BNP分子是極端不穩(wěn)定的分子，在水溶液中快速丟失其免疫學活性。這種活 性丟失通常與該肽的蛋白水解性降解有關。通常用于定性或定量抗原免疫檢測的三明治式 免疫測定法利用對兩種或更多種不同表位特異性的兩種或更多種抗體。各表位之間的距離 越長，蛋白水解的位點會位于抗體的表位之間的概率越高，如此提高測定法對抗原的蛋白 水解性降解的敏感性。反之亦然，各表位彼此越接近，分子的蛋白水解性降解位于各表位之 間的概率越小。已經記載了用于很小的分子的免疫測定方法，包括應用所謂的抗變形抗體。披 露了例如用于檢測地高辛(Self等，1994，Clin. Chem. 40 =2035-2041)和血管緊張素 II (Towbin 等，1995，J. Immunol. Meth. 181 167-176)的此類方法。然而，將這種類型的方法應用于不同分析物的任務不容易，因為此類方法中需要 非常特異性的單克隆抗體。發(fā)明概述我們在這里描述一種用于對人血液中的BNP和BNP原定量的免疫測定法。我們已 經將這種測定法命名為“不等三明治式(unequal sandwich) 這種測定法適用于所有不 穩(wěn)定抗原的免疫檢測。本申請中所描述的免疫測定法利用兩種不同的單克隆抗體。在檢測BNP或BNP原 時，第一單克隆抗體(MAb 24C5)對包含BNP氨基酸殘基11-22 (nreRKMDRISSSS22)(與BNP 原的氨基酸殘基87-98對應)的區(qū)域(或此區(qū)域的一部分)是特異性的(

圖1)。用信號生 成構件標記的第二抗體(即MAb Ab-BNP2和Ab_BNP4)識別第一抗體與抗原(BNP、BNP原、 或其包含氨基酸殘基nreRKMDRISSSS22的片段或此序列的包含所述序列中至少三個氨基酸 殘基的一部分)的免疫復合物。第二抗體不識別(或以很低(低10倍或更小)的親和力 識別)游離的抗原或其片段或游離的MAb 24C5。如此，包含MAb 24C5和BNP (或BNP原或 其片段)的一級免疫復合物充當?shù)诙贵w(MAb Ab-BNP2和Ab-BNP4)的抗原。因此，本發(fā)明的總體目標是用于檢測樣品中不穩(wěn)定抗原的免疫測定方法，包括(a)使感興趣抗原接觸對所述抗原分子的第一表位特異性的第一抗體，以獲得一 級免疫復合物；(b)使步驟(a)得到的所述一級免疫復合物接觸識別所述一級免疫復合物且對由 所述感興趣抗原和所述第一抗體形成的第二表位特異性的第二抗體，以獲得二級免疫復合 物，其中所述第二抗體不能識別游離的抗原或其片段或游離的第一抗體，或以比它們識別所述一級免疫復合物顯著要低(低10倍或更小)的親和力識別它們；并(c)檢測所述二級免疫復合物形成。本發(fā)明的一個具體目標是用于檢測樣品中選自下組的抗原的免疫測定方法BNP，BNP原及其片段，包括(a)使所述抗原接觸對BNP分子的片段nreRKMDRISSSS22或對此肽的包含所述序 列中至少三個氨基酸殘基的部分特異性的第一抗體，以獲得一級免疫復合物；(b)使步驟(a)得到的所述一級免疫復合物接觸識別所述一級免疫復合物的第二 抗體，以獲得二級免疫復合物，其中所述第二抗體不能識別游離的BNP、BNP原或其片段或 游離的第一抗體，或以比它識別所述一級免疫復合物顯著要低(低10倍或更小)的親和力 識別它們；并(C)檢測所述二級免疫復合物形成。我們成功地生成了適用于本發(fā)明方法的特異性單克隆抗體。這些抗體是本發(fā)明的 具體目標。與利用對相距較遠的表位特異性的抗體的測定法相比，本文中所描述的不等三明 治式展現(xiàn)出對抗原的蛋白水解性降解的非常不易感性。而且，此類辦法可用于為如下抗原的免疫檢測開發(fā)測定法的情況，所述抗原與一 種或多種其它抗原類似；在其表面上具有眾多不同表位，但是只有一個(或多個，但是非常 有限的數(shù)目)將該特定抗原區(qū)別于所有其它抗原的獨特表位。附圖簡述圖1 :BNP和BNP原結構和MAb 24C5的表位特異性。MAb 24C5識別BNP分子包含氨基酸殘基11-22的片段和由氨基酸殘基87_98組成 的BNP原片段(以深色標示)。圖2A、2B和2C 抗體Ab_BNP2和Ab_BNP4不識別不與MAb 24C5復合的BNP或BNP原。將Eu標記的MAb 24C5，Ab_BNP2、Ab_BNP4 (200ng/孔)在用以下各項包被的板中
溫育A.BNP 50ng/孑LB. BNP 原 IOOng/ 孑LC.與BNP (0. 5ng/孔)預溫育的多克隆抗BNP抗體(2 μ g/孔)圖3 抗體Ab-BNP2和Ab_BNP4能識別BNP (或肽11-22)與MAb 24C5的免疫復合 物。三步測定方案第一步將板用捕捉MAb 24C5預包被；第二步清洗后，將板與抗原(BNP或肽11-22) —起溫育；第三步清洗后，將板與檢測(Eu3+標記的)抗體(Ab_BNP2、Ab_BNP4或57H3) — 起溫育。清洗后，添加增強液并測量信號。圖4 抗體Ab-BNP2和Ab_BNP4能識別BNP原，其與MAb 24C5形成免疫復合物。三步測定方案
第一步將板用捕捉MAb 24C5預包被；第二步清洗后，將板與BNP原(5ng/ml) —起溫育；第三步清洗后，將板與檢測抗體(Ab-BNP2、Ab_BNP4或57H3) —起溫育。清洗后， 添加增強液并測量信號。圖5 =BNP在正常人血漿中的穩(wěn)定性。將合成的BNP摻入合并的正常人血漿(2ng/ml)，于+4°C溫育不同時間段。在三種 不同測定法中測試免疫學活性_ 一種常規(guī)的和兩種不等的三明治式。圖6 =HF患者和健康供體的血液中的BNP/BNP原測量。在三種測定法中測試了 6 名心力衰竭患者的血漿樣品(HFl至HF6)和健康供體的血漿樣品(NPl至NP4)。在所有測 定法中使用合成的BNP(Bachem)作為校準物。圖7A、7B和7C 兩種不等三明治式(24C5-Ab_BNP2、24C5-Ab_BNP4)和一種常規(guī)測 定法(50E1-24C5-EU)的校準曲線。抗原合成的BNP(Bachem)。
實施例注意在所有實驗中使用用穩(wěn)定的Eu螯合物標記的抗體作為檢測抗體。實驗中 所使用的單克隆抗體 24C5，Ab-BNP2、Ab_BNP4、57H3 和 50E1，可得自 Hytest Ltd, Turku, Finland。實施例1 抗體Ab-BNP2和Ab_BNP4不識別不與MAb 24C5復合的BNP或BNP原 (圖2)在圖2A和圖2B所呈現(xiàn)的實驗中，將抗原(分別為BNP和BNP原)用于板包被，并 在直接免疫測定法中用抗原測試Eu標記的抗體?？贵w24C5識別這兩種形式的抗原，而MAb Ab-BNP2和Ab-BNP4對這兩種抗原均沒有響應(信號與背景相當)。在圖2C所呈現(xiàn)的實驗中，將板用對BNP分子上不同表位特異性的多克隆抗體包 被。在第二步，將板與BNP，然后與Eu標記的抗體一起溫育。此類辦法有助于獲得抗原對板 表面的可變取向，確保分子在板表面上的取向對實驗結果沒有影響。在此實驗中，得到了與 上文所述相同的結果MAb Ab-BNP2和Ab_BNP4不能識別不與MAb 24C5復合的抗原。實施例2 抗體Ab-BNP2和Ab_BNP4能識別與MAb 24C5形成免疫復合物的BNP和 肽 11-22 (圖 3)MAb 24C5對BNP分子的片段11_22或對BNP原的相應區(qū)域87_98是特異性的。為 了證明免疫復合物24C5-BNP和24C5-肽11-22能被MAb Ab_BNP2和Ab_BNP4識別，我們 將MAb 24C5用于板包被，然后將板與BNP或對應于BNP序列的氨基酸11_22的合成肽(肽 11-22) —起溫育。在MAb 24C5與抗原之間的免疫復合物形成后，將板與Eu標記的、對BNP 分子的區(qū)域26-32特異性的抗體Ab-BNP2、Ab_BNP4和57H3 —起溫育。不等三明治式幾乎以相同效率識別BNP和肽。利用抗體24C5 (包被)-57H3_Eu的 測定法不識別肽11-22 (信號與背景相當)。 實施例3 抗體Ab-BNP2和Ab_BNP4能識別與MAb 24C5形成免疫復合物的BNP原 (圖4) 不等三明治式以與常規(guī)測定法相同的效率識別BNP原。我們將MAb24C5用于板包 被，然后將板首先與重組BNP原(5ng/ml)，然后與Eu標記的、對BNP分子的區(qū)域26-32特異性的抗體Ab-BNP2，Ab-BNP4和57H3 —起溫育。在不等三明治式和常規(guī)免疫測定法中得到 的信號是相當?shù)?。我們得出結論，新的測定法可用于BNP原的定量免疫檢測。實施例4 抗原的表觀穩(wěn)定性(圖5)將合成的BNP(Bachem)摻入合并的正常人血漿(2ng/ml)，于+4°C溫育不同時間 段，并在三種不同測定法中測試免疫學活性_ 一種常規(guī)的和兩種不等的三明治式。與通過利用對BNP分子不同部分特異性的兩種Mab進行的常規(guī)BNP測定法所測定 的穩(wěn)定性相比，在本文描述的不等三明治式中所測定的抗原表觀穩(wěn)定性顯著更高。作為常 規(guī)測定法的例子，我們使用如下測定法，該測定法利用對BNP分子的區(qū)域26-32特異性的 MAb 50E1和對BNP分子的區(qū)域11-22特異性的MAb 24C5。在使用不等三明治式來測定免 疫反應性的情況中，于+4°C溫育24小時后觀察到大約70%的免疫學活性(利用Ab-BNP2 和Ab-BNP4的測定法分別為69. 8%和68% )，而在常規(guī)測定法的情況中只有28%。在開始 溫育后6天，在常規(guī)測定法的情況中觀察不到免疫反應性，而在不等三明治式的情況中觀 察到大約1/4的初始免疫反應性。 實施例5 心力衰竭患者(HF患者)的血液和健康供體的血液中的BNP/BNP原測 量(圖6)不等三明治式以及常規(guī)BNP測定法能夠檢測人血液中的展示“BNP免疫反應性”的 兩種形式的抗原_即BNP和BNP原。在三種測定法中測試來自數(shù)名HF患者和健康供體的 血液樣品_ 一種常規(guī)的，利用對BNP分子的片段26-32特異性的捕捉MAb 50E1和檢測MAb 24C5-EU，和兩種不等三明治式。所有測定法使用合成的BNP進行校準。由圖6可見，三種測 定法中的測試結果非常相似。在有些樣品中，常規(guī)測定法中的測試結果低于不等三明治式 測定法中的測試結果。此觀察結果可以通過此類樣品中的BNP是部分降解的事實來解釋， 但是由于抗原在不等三明治式中展示更好的表觀穩(wěn)定性的事實，通過這些測定法測得的抗 原值高于在常規(guī)測定法中測得的抗原值。實施例6 校準曲線(圖7)圖7(A、B和C)中呈現(xiàn)了兩種不等三明治式測定法和一種常規(guī)測定法的校準曲線， 其中使用合成的BNP作為抗原。兩種不等三明治式均展現(xiàn)出高靈敏度，與常規(guī)測定法的靈 敏度相當且可用于人血液中BNP和BNP原免疫反應性的精確檢測。
權利要求
一種免疫測定方法，其用于檢測樣品中選自下組的不穩(wěn)定抗原BNP，BNP原及其片段，所述方法包括(a)使所述抗原接觸對BNP分子的片段11FGRKMDRISSSS22(SEQ IDNO3)或對此肽的包含所述序列中至少三個氨基酸殘基的部分特異性的第一抗體，以獲得一級免疫復合物；(b)使步驟(a)得到的所述一級免疫復合物接觸識別所述一級免疫復合物的第二抗體，以獲得二級免疫復合物，其中所述第二抗體不能識別游離的BNP、BNP原或其片段或游離的第一抗體，或以比它識別所述一級免疫復合物顯著要低(低10倍或更小)的親和力識別它們；并(c)檢測所述二級免疫復合物形成。
2.一種單克隆抗體，其對BNP分子的片段nreRKMDRISSSS22或對此肽的包含所述序列 中至少三個氨基酸殘基的部分是特異性的。
3.一種單克隆抗體，其對BNP、BNP原或其片段與如下抗體的一級免疫復合物是特異性 的，所述抗體對BNP分子的片段nreRKMDRISSSS22或對此肽的包含所述序列中至少三個氨基 酸殘基的部分是特異性的。
4.一種免疫測定試劑盒，其用于檢測樣品中選自下組的抗原BNP，BNP原及其片段，所 述試劑盒包括(a)第一抗體，其對BNP分子的片段nreRKMDRISSSS22(SEQID NO 3)或對此肽的包含 所述序列中至少三個氨基酸殘基的部分是特異性的，所述抗體能夠與所述抗原形成一級免 疫復合物；和(b)第二抗體，其識別步驟(a)得到的所述一級免疫復合物且對由所述抗原和所述第 一抗體形成的BNP第二表位是特異性的，且能夠與所述一級免疫復合物形成二級免疫復合 物，其中所述第二抗體不能識別游離的BNP、BNP原或其片段或游離的第一抗體，或以比它 識別所述一級免疫復合物顯著要低(低10倍或更小)的親和力識別它們。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測BNP、BNP原及其片段的免疫測定法。本質上，所述測定法包括a)使所述抗原接觸對與BNP的氨基酸11-22對應的片段或對此肽的包含所述序列中至少三個氨基酸的一部分特異性的第一抗體，以獲得一級免疫復合物；b)使步驟(a)得到的所述一級免疫復合物接觸識別所述一級免疫復合物的第二抗體，以得到二級免疫復合物，其中所述抗體不能識別游離的BNP、BNP原或游離的第一抗體；c)檢測所述二級免疫復合物。
文檔編號C07K16/26GK101842707SQ200880011741
公開日2010年9月22日 申請日期2008年4月14日 優(yōu)先權日2007年4月13日
發(fā)明者亞歷克西·G·卡特魯卡, 奧爾加·V·科洛索瓦, 娜塔利亞·N·塔姆, 弗拉迪米爾·L·菲拉托夫 申請人:西特斯特有限公司