專利名稱：在植物中通過調(diào)節(jié)GARP轉(zhuǎn)錄因子ZmRR10_p的產(chǎn)量增強(qiáng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
借助常規(guī)育種法的谷粒產(chǎn)量改善已經(jīng)在玉米中幾乎達(dá)到一個平臺期。 隨后自然要探索可能用來獲得進(jìn)一步產(chǎn)量提高的備選、非常規(guī)方法。由于 玉米中的收獲指數(shù)已經(jīng)在過去百年左右對谷粒產(chǎn)量選擇的期間基本上保持 不變，產(chǎn)量改善已經(jīng)因提高每單位土地面積的總生物量生產(chǎn)而實現(xiàn) (Sinclair等人(1998) C印38:638-643; Duvick等人(1999) CW 尸 5Wewce 39:1622-1630 ; 和 Tollenaar 等人(1999) Oop Sc/ewce 39:1597-1604)。這種提高的總生物量已經(jīng)通過增加植物密度實現(xiàn)，這導(dǎo)致 適應(yīng)性表型變更，如葉片角減小和玉米穗狀花序大小降^f氐，前者導(dǎo)致減少 對下部葉子的遮蔽并且后者可能提高收獲指數(shù)(Duvick等人(1999) 39:1622-1630)。
GARP是中等大小的基因家族分類，其包括玉米GOLDEN2 TF(Hall， L.N.，等人,(1988) GOLDEN 2: a novel transcriptional regulator of cellular differentiation in the maize leaf.尸/朋fCW/10:925-36)、擬南芥應(yīng)答 調(diào)節(jié)基因(ARRs; Hwang, I" H.C. Chen，和J. Sheen, (2002) Two-component signal transduction pathways in Arabidopsis.尸/"ai^ jPA戸》/， 129:500-15以 及其中的參考文獻(xiàn))以及擬南芥磷酸鹽饑餓應(yīng)答基因1 (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE1 ) (PHR1; Rubio， V.，等人，(2001) A conserved MYB transcription factor involved in phosphate starvation signaling both in vascular plants and in unicellular algae. Gewes1 Dev15:2122-33)。 ZmRR10—p (SEQ ID NO: 2)轉(zhuǎn)錄因子編碼包含轉(zhuǎn)錄因子的 GARP類的激活結(jié)構(gòu)域的部分蛋白質(zhì)。全長蛋白質(zhì)(SEQIDNO:4)編碼 玉米B型應(yīng)答調(diào)節(jié)基因，即ZmRR10B型應(yīng)答調(diào)節(jié)基因，其是一類屬于雙 組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)基因。高等植物中的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級 聯(lián)系統(tǒng)由組氨酸激酶、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶和應(yīng)答調(diào)節(jié)基因組成，它們一起 通過級聯(lián)磷酸化過程起作用來將來自激素或環(huán)境的外部信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞應(yīng) 答。應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)通常由N-末端接受(receiver)結(jié)構(gòu)域和C-末端輸出 (output)結(jié)構(gòu)域組成。前者通過其保守的天冬氨酸結(jié)構(gòu)域的磷酸化來接受來 自組氨酸激酶或組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的信號，并且這一磷酸化狀態(tài)觸 發(fā)了通過輸出結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞應(yīng)答。在玉米的IO個已知的應(yīng)答調(diào)節(jié)基因中， 七種是A型而三種是B型。A型應(yīng)答調(diào)節(jié)基因如此分類，因為它們都被激 素——細(xì)胞分裂素所誘導(dǎo)。B型應(yīng)答調(diào)節(jié)基因作用為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，因為它 們除了 N末端接受結(jié)構(gòu)域之外，還在其C末端包含myb型DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域和激活結(jié)構(gòu)域。作為B型應(yīng)答調(diào)節(jié)基因，ZmRRlO在其N末端包含接受 結(jié)構(gòu)域，其具有4個保守基序，使得該結(jié)構(gòu)域的特征為包括保守的天冬氨 酸殘基。ZmRRlO在其C末端還包含典型的myb類DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和推 定的激活結(jié)構(gòu)域。在這些實例中使用的部分蛋白質(zhì)包含全長ZmRRlO蛋白 質(zhì)的C末端一半，并且編碼推定的激活結(jié)構(gòu)域但是缺乏DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域 和接受結(jié)構(gòu)域。
ZmRRlO—p克隆編碼大約玉米RR10的C末端一半(氨基酸382-686 )， 其被認(rèn)為包括轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。在擬南芥中，已經(jīng)證明了當(dāng)與GAL4融合 時，ARR1和2的C末端部分(與玉米RR10基因相關(guān))可以作用為激活 結(jié)構(gòu)域(Sakai， H.， T. Aoyama,和A. Oka, (2000) Arabidopsis ARR1 and ARR2 response regulators operate as transcriptional activators. Haw尤/ 24:703-11 )。因此，本發(fā)明中的玉米克隆缺乏接受結(jié)構(gòu)域(即磷酸鹽受體 靶標(biāo)含天冬氨酰的結(jié)構(gòu)域)和"B-基序"(即5，-A/TjGAT[A/T〗-3，DNA結(jié) 合)，它們通常在B型ARR基因中發(fā)現(xiàn)。
這一玉米部分應(yīng)答調(diào)節(jié)基因(ZmRR10一p)在稻中的中等水平、組成型過表達(dá)導(dǎo)致了的總種子數(shù)量、總種子重量和收獲指數(shù)的顯著增加
(20-25%)。
在本領(lǐng)域中需要可以利用此類序列來調(diào)節(jié)植物中生長和產(chǎn)量的方法和 組合物。
發(fā)明簡述
提供了用于調(diào)節(jié)花器官發(fā)育、葉形成、向光性、頂端優(yōu)勢、果實發(fā)育、 根發(fā)端和用于提高植物中產(chǎn)量的組合物和方法。所述組合物包含 ZmRR10—p序列。本發(fā)明的組合物包含選自SEQ ID NO: 1-16的#^, 列和核苷#列及其變體和片段。
在用于目的植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體中提供了編碼ZmRR10—p的核 苷酸序列。還提供了包含本發(fā)明序列的表達(dá)盒、植物、植物細(xì)胞、植物部 分和種子。在具體的實施方案中，多核苷酸與組成型啟動子有效連接。
提供了用于調(diào)節(jié)植物或植物部分中ZmRR10一p序列的水平的方法。所 述方法包括將包含本發(fā)明的ZmRR10—p序列、信號接受結(jié)構(gòu)域，MYB樣 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10一p序列的片段或變體的異源多核苷酸導(dǎo)入植 物或植物部分。ZmRR10_p多肽的水平可以被提高或降低。此方法可以用 來提高植物中的產(chǎn)量；在一個實施方案中，該方法用來提高谷類中的谷粒 產(chǎn)量。
附圖筒述


圖1提供了玉米B型應(yīng)答調(diào)節(jié)因ZmRR8 (SEQ ID NO: 5)、 ZmRR9 (SEQ ID NO: 6)和ZmRR10的CLUSTAL X(1.83)多重序列比對。 ZmRR10_f (SEQ ID NO: 4)是全長蛋白質(zhì)而ZmRR10—p (SEQ ID NO: 2) 是部分蛋白質(zhì)。N末端接受結(jié)構(gòu)域以灰色突出顯示，具有保守的4個基序 (雙下劃線)和在基序上鑒定的它們的高度保守的元素。在磷酸化中涉及 的保守的天冬氨酸在比對上以黑體字母顯示，在比對之下以星號。Myb DNA結(jié)合基序以下劃線顯示，鑒定的Myb基序中的保守的元素在比對上為黑斜體。(SEQ ID NO:7對應(yīng)于ZmRRlO接受結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO:8 對應(yīng)于ZmRRlO Myb DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。
圖2提供了來自玉米(Zea mays)、稻(C o^" s^/v"附)(SEQ ID NO: 10)和擬南芥(/ir"6/甴/w/s狄"/,Vmfl) (SEQ ID NO: ll)的幾個ZmRRlO—p 序列的比對。信號接受結(jié)構(gòu)域是單下劃線的，MYB樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是 雙下劃線的，ZmRRlO—p序列是虛線下劃線的。展示了共有信號接受結(jié)構(gòu) 域(SEQIDNO:14) 、 MYB樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:15)和對 應(yīng)于ZmRRlO—p序列的共有激活結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 16 )。
發(fā)明詳述
現(xiàn)在將參考附圖在下文中更充分地描述本發(fā)明，其中顯示了 一些但非 全部的本發(fā)明實施方案。實際上，這些發(fā)明可以以多種不同形式體現(xiàn)并且 不得解釋為限于本文中所述的實施方案；相反，提供了這些實施方案，從
而;^/〉開內(nèi)容將滿足適用的法律要求。
這里所述的本發(fā)明的眾多修改和其他實施方案將是得益于在前面描述 和相關(guān)附圖中所展示教導(dǎo)的這些發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員可想起的。因 此，應(yīng)當(dāng)理解所述發(fā)明不意圖限于所公開的具體實施方案并且修改和其他 實施方案將意圖被包含于所附權(quán)利要求書的范圍中。盡管本文中使用了具 體術(shù)語，不過它們僅在一般性和描述性意義上4吏用并且其目的不在于限制。
I. 概述
提供了在植物中促進(jìn)花器官發(fā)育、根發(fā)端及產(chǎn)量和用于調(diào)節(jié)葉形成、 向光性、頂端優(yōu)勢、果實發(fā)育等的方法和組合物。本發(fā)明的組合物和方法 通過調(diào)節(jié)植物中至少一種ZmRRlO—p多肽或具有本發(fā)明ZmRR10一p多肽 的生物學(xué)活性變體或片段的多肽的水平產(chǎn)生改善的植物或作物產(chǎn)量。
II. 組合物
本發(fā)明的組合物包含了參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的ZmRR10一p多核苷酸和多肽 及其變體和片段。ZmRRlO ( ZmRRlO—p )編碼B型應(yīng)答調(diào)節(jié)物(response
8regulator),其包含參與在雙組分信號級聯(lián)放大中發(fā)生的磷酸中繼的接受 結(jié)構(gòu)域，所述信號級:pUi大由組氨酸激酶、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶和應(yīng)答調(diào)節(jié) 蛋白組成。其還包含大約60個氨基酸的高度保守的C末端序列段，構(gòu)成 了 GARP基序。ZmRRlO中的接受結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:7 )推定是從M 酸殘基18至130 (對應(yīng)于SEQ ID NO:2的^J^酸位置)，并且MYB DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:8)推定從SEQ IDN 0:2的^J^酸殘基198至 260(Hwang，等人，(2002); Hosoda，等人，(2002) Molecular Structure of the GARP family of Myb-related DNA binding motifs of the Arabidopsis response regulators.戶/"w《Ce// 14:2015-2029)。編碼部分ZmRR8序列的 ^i^酸序列(SEQ ID NO:9)對應(yīng)于ZmRRlO—p。"對應(yīng)于"意指對于每 個結(jié)構(gòu)域的所提到的M酸位置涉及所提到SEQ ID NO的M酸位置并 且意指包含這些結(jié)構(gòu)域的多肽可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)比對方法比對所述多肽與 所提到SEQ ID NO:而找到。
本發(fā)明的ZmRR10一p序列在雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中作用為B型應(yīng)答 調(diào)節(jié)子，其包含接受結(jié)構(gòu)域的N末端在雙組份砩酸中繼中發(fā)揮功能，而其 包含GARP結(jié)構(gòu)域的C末端在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮功能。
ZmRRlO主要在莖中表達(dá)。蛋白質(zhì)包含接受結(jié)構(gòu)域(其與B型應(yīng)答調(diào) 節(jié)物具有相似性)和GARP結(jié)構(gòu)域。玉米GoIden-2樣(GLK)基因(其 定義了轉(zhuǎn)錄因子的GARP類)中的突變已經(jīng)^皮才艮道為影響玉米葉中的細(xì)胞 分化(Hall,等人，(1998))。
如本文所用的，"ZmRRlO p"或"ZmRR10—p，，序列包含編碼ZmRRlO 的激活結(jié)構(gòu)域或所述激活結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性變體或片段的多核苷酸或者 具有ZmRRlO的激活結(jié)構(gòu)域或所述激活結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性變體或片段 的多肽。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含如SEQ ID NO: 2中所示M 斷列的分離的ZmRRlO—p多肽及其片段和變體。還提供了包含SEQID NO: 1中所述核苷酸序列的多核苷酸、ZmRRlO的全長核苷酸序列(SEQ ID NO:3 ) 、 ZmRRlO的全長^H&酸序列(SEQ ID NO:4 )和包含編碼接
9受結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 7)或MYB DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 8)的多核苷酸的序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含編碼接受結(jié)構(gòu)域、GARP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域的序列。
本發(fā)明包括分離的或基本上純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)組合物。"分離的"或"純化的"多核苷酸或蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含這樣的組分，其中所述組分通常伴隨或與該多核普酸或蛋白質(zhì)相互作用，如在該組分天然存在環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的那樣。因此，分離的或純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時基本上不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。最佳地，"分離的，，多核苦酸不含在衍生該多核苷酸的生物的基因組DNA中天然分布于該多核苷酸側(cè)翼(即位于該多核苷酸的5，或3，端)的序列(最佳地是蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在多個實施方案中，這種分離的多核苷酸可以含有在衍生該多核苦酸的細(xì)胞的基因組DNA中天然分布于該多核苷酸側(cè)翼的小于約5kb、 4kb、3 kb、 2 kb、 1 kb、 0.5 kb或0.1 kb的核苷斷列?；旧喜缓?xì)胞材料的蛋白質(zhì)包括具有小于約30%、 20%、 10%、 5%或1%(干重)雜質(zhì)蛋白的蛋白質(zhì)制品。當(dāng)重組地產(chǎn)生4^發(fā)明的蛋白質(zhì)或生物學(xué)活性部分時，培養(yǎng)基最佳地出現(xiàn)小于約30%、 20%、 10%、 5%或1% (干重)的化學(xué)前體或非目的蛋白質(zhì)化學(xué) 品。
ZmRR10_p結(jié)構(gòu)域或ZmRR10一p多核苦酸及其所編碼蛋白質(zhì)的片段和變體也被本發(fā)明的方法和組合物包括。"片段"意指多核苷酸的一部分或氨基*列的一部分。多核苷酸的片段可以編碼仍保留天然蛋白生物學(xué)活性并且因而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)片段。例如，多肽片段將包含接受結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:7 )或MYB DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:8 )或激活結(jié)構(gòu)域(如SEQIDNO:2所示)。在一些實施方案中，該多肽片段包含接受結(jié)構(gòu)域、MYB DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域。備選地，用于抑制或沉默(即降低表達(dá)水平)ZmRRl 0一p序列的片段不需要編碼蛋白質(zhì)片段，但仍將保留抑制此耙序列表達(dá)的能力。另外，用作雜交探針的片段通常不編碼保留生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)片段。因此，核苷^列的片段可以具有至少約18個核苷酸、約20個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸并多達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的全長多核苷酸。
編碼信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10—p多肽的多核苷酸的片段編碼至少15、 25、 30、 50、 100、 150、 200、 250、 300、350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 675、 700、 725、 750、 775、 800、825個連續(xù)M酸或多達(dá)全長信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10j蛋白(即SEQ ID NO: 2)中存在的^&酸總數(shù)。用作雜交探針、PCR引物或用作抑制構(gòu)建體的信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10_p多核苷酸的片段一般不需要編碼ZmRR10_p蛋白或ZmRR10_p結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性部分。
可以通過如下方式制備包含信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽或ZmRRlO—p蛋白的生物學(xué)活性部分，即通過分離ZmRRlO—p多核苷酸的一部分，表達(dá)ZmRRlO—p蛋白的所編碼部分(例如通過體外重組表達(dá))并評估ZmRRlO—p蛋白的所編碼部分的活性。作為ZmRRlO一p核苷^列的片段的多核苷酸或包含信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10—p多肽的多核苷紗列包含了至少16、 20、 50、 75、 100、150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、綱、卯0、 l，OOO、 1,100、 1,200、 1,300、 1,400、 1,500、 1，600、 1，700、 l，綱、l，卯O、 2，000、 2，050、 2,100、 2,150、 2,200、 2,250、 2,300、 2,350、 2,400、2,450、 2,500個連續(xù)核苷酸或多達(dá)全長信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRRlO—p多肽中或ZmRRlO—p多核苷酸(即SEQ ID NO: 1，1415個核苷酸)中存在的核苷酸數(shù)目。
"變體，，意指基本上相似的序列。對于多核苷酸而言，變體包含一個或多個核苷酸在天然多核苷酸內(nèi)部一個或多個內(nèi)部位點處的缺失和/或添加和/或一個或多個核苷酸在天然多核苷酸中一個或多個位點處的置換。如本文中所用，"天然"多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷酸序列或^J^酸序列。對于多核苷酸而言，保守性變體包括這些序列，其中所述序列因遺傳密碼的簡并性而編碼ZmRR10一p多肽或信號接受結(jié)構(gòu) 、MYB-樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRRlO—p多肽之一的^J^酸序列?？梢?吏用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定天然存在的等位基因變體，例如用下文說明的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體多核普酸也包括合成方式衍生的多核苷酸，例如通過位點定向誘變產(chǎn)生、不過仍編碼包含信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10一p多肽(或這三者)的多肽或能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或能夠降低(即抑制或沉默)ZmRR10—p多核苷酸之表達(dá)水平的ZmRR10_p多肽的那些多核苷酸。通常，本發(fā)明的特定多核苦酸的變體將與該特定核苷酸具有如通過本文其他地方描述的序列比對程序和參數(shù)所確定的至少約40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99。/。或更大的序列同一性。
本發(fā)明的特定多核苷酸(即參照多核苷酸)的變體也可以通過比較在變
一性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評價。因此，例如公開了一種分離的多核苷酸，其編碼與SEQ ID NO. 2的多肽具有給定序列同一性百分?jǐn)?shù)的多肽?？梢允褂迷诒疚钠渌胤矫枋龅男蛄斜葘Τ绦蚝蛥?shù)計算任意兩個多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)。在本發(fā)明任意給定的多核苷酸配對通過比較由所述多核苷酸編碼的兩個多肽所共有的序列同一性百分?jǐn)?shù)而進(jìn)行評價的情況下，這兩個編碼的多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)是至少約40%、 45%、 50%、 55%、 60%、65%、 70%、 75%、 80%、 85%、卯％、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、96%、 97%、 98%、 99%或更大的序列同一性。
"變體"蛋白質(zhì)意指從天然蛋白中通過在該天然蛋白中一個或多個內(nèi)部位點處缺失或添加一個或多個氨基酸和/或在該天然蛋白中一個或多個位點處置換一個或多個氨基酸而衍生的蛋白質(zhì)。由本發(fā)明包括的變體蛋白質(zhì)是有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)具有該天然蛋白的想要的生物學(xué)活性，即
如本文中所述調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。此類變體可以例如因遺傳多態(tài)性或因人類操作產(chǎn)生。本發(fā)明的ZmRR10一p蛋白的生物學(xué)活性變體(包含信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10—p多肽)將與ZmRR10_p蛋白的氨基酸序列或共有的信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10一p多肽的氨基酸序列具有如通過本文其他地方描述的序列比對程序和參數(shù)所確定的至少約40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、98%、 99%或更大的序列同一性。本發(fā)明的ZmRR10j蛋白的或者信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRRlO—p多肽的生物學(xué)活性變體可以與該蛋白質(zhì)具有少至1-15個氨基酸殘基，少至1-10個，如6-10個，少至5個，少至4、 3、 2個或甚至1個氨基酸殘基的不同。
本發(fā)明的多核苷酸可以按照多種方式進(jìn)行改變，所述的方式包括M酸置換、缺失、截短和插入。用于此類操作的方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過在DNA中突變來制備ZmRR10一p蛋白或信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10一p多肽的J^,列變體和片段。用于誘變和多核苷酸變更的方法是本領(lǐng)域熟知的。見，例如，Kunkel，(1985)7V"http://.」ow/. 5W. f/SJ 82:488-492; Kunkel等人(1987) Methods inEnzymol. 154:367-382;美國專利號4,873,192; Walker和Gaastra編著
(1983)， rec/rw/《wes /" 祝o/ogy (MacMillan Publishing Company,
紐約)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的適宜氮基酸置換的指導(dǎo)可以在Dayhoff等人(1978) /^/^ 0/尸rW"" S^r"ewce朋</ S^w"we (Natl. Biomed. Res. Found" Washington, D.C.)的模型中找到，所述文獻(xiàn)在本文中引用作為參考。保守性置換，如將一個氨基酸交換為具有相似特性的另一個氨基酸，可以是最佳的。
因此，本發(fā)明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突變形式。同樣，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括天然存在的蛋白質(zhì)以及其改變和修飾的形式。此類變體將繼續(xù)具有想要的活性(即，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或降低靶ZmRR10—p序列的表達(dá)水平的能力)。在具體的實施方案中，將于編碼該變體的DNA中產(chǎn)生的突變未使該序列不符合可讀框并且不產(chǎn)生可能產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補性區(qū)域。見，EP專利申請公開號75,444。
不希望本文中所包括的蛋白質(zhì)序列的缺失、插入和置換導(dǎo)致該蛋白質(zhì)特征的基本變化。然而，當(dāng)難以在這樣做之前預(yù)測所述置換、缺失或插入的確切作用時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可以通過常規(guī)篩選測定法評估這種
作用。例如，ZmRRl(Lp多肽的活性可以通過測試該多肽調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力進(jìn)行評價?？梢允褂枚喾N方法來測試這種活性，所述方法包括直接監(jiān)測耙基因在核普酸或多肽水平上的表達(dá)水平。用于這種分析的方法是已知的，并且包括例如Northern印跡法、Sl保護(hù)測定法、Western印跡法、酶測定法或比色測定法。在特定的實施方案中，可以通過監(jiān)控靶基因的水平或活性的增加或減少來測定以確定序列是否具有ZmRR10一p活性，所述序列包括在玉米葉中的細(xì)胞分化中所涉及的那些。例如，在特定的實施方案中，ZmRR10—p序列可以調(diào)節(jié)乾基因的轉(zhuǎn)錄，所述粑基因例如葉中的細(xì)胞分化所涉及的那些。備選地，測試對轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)作用的方法可以包括監(jiān)測植物表型的改變。例如，如在本文其他地方更詳細(xì)地討論，調(diào)節(jié)ZmRR10_p多肽的水平可以導(dǎo)致植物生長變化和產(chǎn)量變化。測試這些變化的方法在本文其他地方進(jìn)一步詳細(xì)地描述。
變體多核苷酸和蛋白質(zhì)也包括從誘變的和重組方法如DNA改組法衍生的序列和蛋白質(zhì)。用這種方法，可以操作一個或多個不同的ZmRR10—p編碼序列以產(chǎn)生具有想要特性的新ZmRR10—p序列或信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10—p多肽。以這種方式，從包含具有顯著序列同一性并且可以進(jìn)行體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)的相關(guān)序列多核苷酸群體中產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫。例如，使用這種方法，可以在本發(fā)明的ZmRRlO—p基因與其他已知ZmRR10_p基因之間改組編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序以獲得編碼蛋白質(zhì)的新基因，其中所述蛋白質(zhì)具有改善的目的屬性，如在酶的情況下提高的Km。用于此類DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。見，例如Stemmer (1994) 7Voc 7V"" ^c^w/. 5W. f/5^91:10747-10751; Stemmer (1994) iV"似^ 370:389-391; Crameri等人(1997)iV ,M"必/otec^ 15:436-438; Moore等人(1997) / Mo/.所o/. 272:336-347;Zhang等人(7M7)7Vfl汰^c^/. 1/^4 94:4504-4509; Crameri等人(1998) 7Vfl似re 391:288-291;和美國專利號5,605,793和5，837，458。本發(fā)明的多核苷酸可以用來分離來自其他生物、特別來自其他植物、
更特別來自其他單子葉植物的相應(yīng)序列。以這種方式，方法如PCR、雜交 等可以用來基于它們與本文中所述序列的同源性鑒定此類序列?；谒鼈?與本文中所述的完整ZmRR10一p序列或與信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10—p多肽或與其變體和片段的序列同一性而分離的 序列被本發(fā)明包括。此類序列包括作為所公開序列的直向同源物的序列。 "直向同源物"意指從共同先祖基因衍生并且作為物種形成的結(jié)果而存在于 不同物種中的基因。當(dāng)存在于不同物種中的諸基因的核普*列和/或它們 所編碼的蛋白質(zhì)序列共有至少60%、 70%、 75%、 80%、 85%、卯％、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更大的序列同一性 時，將所述存在于不同物種中的諸基因視為直向同源物。直向同源物的功 能往往在物種之間是高度保守的。因此，下述分離的多核苷酸被本發(fā)明包 括，其中所述的分離的多核苷酸能夠沉默或抑制ZmRR10—p序列的表達(dá)或 編碼ZmRR10—p蛋白的多核苷酸的表達(dá)，并在嚴(yán)格條件下與本文中公開的 ZmRR10—p序列或與其變體或片段雜交。
在PCR方法中，可以設(shè)計用在PCR反應(yīng)中的寡核苷酸引物，以從提 取自任意目的植物的cDNA或基因組DNA中擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。用 于設(shè)計PCR引物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域通常已知的并且在 Sambrook等人(1989) Mo/ecw/ffr C7顯/w」丄tffwflto/j Ma聰a/ (第2版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview，紐約)。也見Innis等人 編輯(1990) iVotocd. Gw/flfe to Me幼o(hù)^s flw^f々/;/Zctf,/ow51 (Academic Press,紐約)；Innis和Gelfand編輯(1995)尸O 5^ateg/es (Academic Press, 紐約)；以及Innis和Gelfand編輯(1999)戶C及A^勸"^yAf""""/(Academic Press,紐約)中公開。已知的PCR方法包括但不限于使用配對引物、巢式 引物、單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部 分錯配引物等的方法。
在雜交技術(shù)中，使用已知多核苷酸的全部或部分作為探針，其中所述 探針與存在于來自所選生物的克隆基因組DNA片段或cDNA片段群體(即
15基因組或cDNA文庫)中的其他對應(yīng)多核苷酸選擇性地雜交。雜交探針可以 A^因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以 用可檢測基團(tuán)如32P或任何其他可檢測標(biāo)記物標(biāo)記。因此，例如，可以通 過標(biāo)記基于本發(fā)明ZmRR10—p多核苷酸的合成寡核苷酸產(chǎn)生用于雜交的 探針。制備用于雜交的探針和用于構(gòu)建cDNA和基因組文庫的方法是本領(lǐng) 域通常已知的并且在Sambrook等人(1989) Mo/ec"/flf a朋/"g,爿 Z^w"to/j A/aww"/ (第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview，紐約)中公開。
例如，可以使用完整ZmRRl(Lp多核苷酸或本文公開的信號接受結(jié)構(gòu) 域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10一p多肽或其一個或多個部分作 為能夠與相應(yīng)ZmRR10一p多核苷酸和信使RNA特異性雜交的探針。為了 在多種條件下實現(xiàn)特異性雜交，此類探針包括在ZmRR10一p多核苷酸序列 中獨特并且最佳地具有至少約10個核苷酸長度并且最為最佳地具有至少 約20個核苷酸長度的序列。此類探針可以用來通過PCR擴(kuò)增來自所選植 物的相應(yīng)ZmRR10—p多核苷酸。該項技術(shù)可以用來從所需植物分離額外的 編碼序列或用作診斷測定法以確定編碼序列在植物中的存在。雜交技術(shù)包 括鋪板DNA文庫的雜交篩選法(蝕斑或菌落；見，例如，Sambrook，等人 (1989) Mo/ecw/fl/* C7o"/"g:爿Z^6onitorj; Ma聰a/ (2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,紐約)。
此類序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下實施。"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格雜交條 件"意指這樣的條件，其中探針與其耙序列在所述M下雜交至大于與其他
序列雜交的可檢測程度(例如，高于背景至少2倍)。嚴(yán)^MHf是序列依賴 的并且會在不同環(huán)境中不同。通過控制雜交和/或洗滌M的嚴(yán)格性，可以 鑒定與探針100%互補的乾序列(同源性探測)。備選地，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格M
以允許序列中的一些錯配，從而檢測到較低程度的相似性(異源性探測)。
通常，探針小于約1000個核苷酸長度，最佳地小于500個核苷酸長度。
一般，嚴(yán)格條件將是這些條件，其中鹽濃度在口117.0至8.3時小于約 1.5MNa離子， 一般約0.01至1.0 M Na離子濃度(或其他鹽)；并且對于短探針(例如10至50個核苷酸)，溫度是至少約30。C;對于長探針(例如大 于50個核苷酸)，是至少約60。C。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲 酰胺來實現(xiàn)。示例的低嚴(yán)格條件包括在37°C用30至35%甲酰胺，1 M NaCl， 1。/。SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液雜交，并且在50至55。C于lx 至2xSSC(20xSSC-3.0MNaCl/0,3M杼檬酸三鈉)中洗滌。示例的中等嚴(yán) 格條件包括在37。C于40至45。/。甲酰胺，l.OMNaCl， 1。/。SDS中雜交， 并且在55至60。C于0.5x至lxSSC中洗滌。示例的高嚴(yán)格條件包括在37°C 于50%甲酰胺，1 MNaCl, 1% SDS中雜交，并且在60至65。C于O.lxSSC 中洗滌。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0.1%至約1。/。SDS。雜交的持續(xù) 時間一般是小于約24小時，通常約4至約12小時。洗滌的持續(xù)時間將是 至少足以達(dá)到平衡的 一個時間長度。
特異性一般是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是終末洗滌液的離子強(qiáng)度 和溫度。對于DNA-DNA雜合體，Tm可以從Meinkoth和Wahl (1984) /1m /. 祝oc/^附.138:267-284的等式Tm = 81.5。C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC)-0.61 (% form)-500/L近似獲得；其中M是單價陽離子的體積摩爾 濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧咬核苷酸的百分?jǐn)?shù)，％ form是雜交液 中甲酰胺的百分?jǐn)?shù)，并且L是該雜合體的堿基對長度。Tm是50%互補性 靼序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在定義的離子強(qiáng)度和pH下)。Tm因 每P/o錯配下降約l。C;因此，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件旨在與具 有想要的同一性的序列雜交。例如，若尋求具有^0。/。同一性的序列，Tm 可以降低10。C。通常，選擇嚴(yán)格條件比在定義的離子強(qiáng)度和pH下的特定 序列及其互補物低的熱解鏈溫度(Tm)低約5。C。然而，極嚴(yán)格條件可以利 用比熱解鏈溫度(Tm)低l、 2、 3或4。C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可 以利用比熱解鏈溫度(Tm)低6、 7、 8、 9或10。C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格 條件可以利用比熱解鏈溫度(Tm)低ll、 12、 13、 14、 15或20。C的雜交和/ 或洗滌。使用該等式、雜交與洗滌組合和想要的Tm,普通技術(shù)人員將理解 本申請固有地描述了雜交液和/或洗滌液的嚴(yán)格性的變化。若想要的錯配程 度引起小于45。C(水溶液)或32。C(甲酰胺溶液)的Tm，最佳是提高SSC濃度，從而可以使用較高的溫度。對核酸雜交的廣泛指南存在于Tijssen (1993)
Z^6orato/^ 7VcAm々Mes /" J ZocAe附/欲y 朋</ Mo/"M/"r J /0/o^v-/fy6/7V//za,,》/i w/幼^/V"c/e/d'V//Vo6&s， I部分，第2章(Elsevier，紐 約)；和Ausubel等人編輯(1995) C"/re", 7V。toco/s /" A/o/ecw/",祝o/柳， 第2章(Greene Publishing和Wiley-Interscience，紐約)。見Sambrook等 人(1989) A/o/ecM/"尸C7ow/wg: j Zfl6oni^v (第2版，Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Plainview，紐約)。
使用以下術(shù)語來描述兩個或多個多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系 (a)"參照序列"、(b)"比較窗口"、 (c)"序列同一性"和(d)"序列同一性百分 數(shù)"。
(a) 如本文中所用，"參照序列"是作為序列比較基礎(chǔ)所用的定義序 列。參照序列可以是特定序列的子集或全部；例如，作為全長cDNA或基 因序列的節(jié)段，或完整的cDNA或基因序列。
(b) 如本文中所用，"比較窗口"指多核普酸序列的連續(xù)和指定的節(jié) 段，其中與參照序列(其不包含添加或缺失)相比，在比較窗口中的多核苷
酸序列可以包含添加或缺失(即空位)以最佳地比對兩個多核苷酸。通常， 該比較窗口是至少20個連續(xù)核苷酸長度，并且任選地可以是30、 40、 50、 100個或更長的連續(xù)核苷酸長度。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為了避免因多核苷 酸序列中包含空位而所致與參照序列的高度相似性， 一般引入并且從匹配 數(shù)中扣除空位罰分。
出于比較而比對序列的方法是本領(lǐng)域熟知的。因此，可以使用數(shù)學(xué)算 法完成任意兩個序列之間序列同 一性百分?jǐn)?shù)的確定。此類數(shù)學(xué)算法的非限 制性實例是Myers和Miller (1988) 4:11-17的算法；Smith等人
(1981) Jrfv. J/;/;/. 2:482的局部比對算法；Needleman和Wunsch
(1970) / Mo/.48:443-453的全局比對算法；Pearson和Lipman (1988) 〗Vfl汰爿ow/.85:2444-2448的搜索-局部比對方法；Karlin和 Altschul (1990) iVoc. 7V"汰JcflACAS^ 872264的算法，如Karlin和 Altschul (1993) iVoc. Mi汰Xcflrf. Sc/. fASJ 90:5873-5877中那樣進(jìn)行改良。這些數(shù)學(xué)算法的計算機(jī)執(zhí)行可以用于序列的比較以確定序列同 一性。
此類執(zhí)行包括但不限于:PC/Gene程序(從Intelligenetics， Mountain View, California可獲得)中的CLUSTAL; ALIGN程序(2.0版本)和GCG Wisconsin Genetics軟件包，版本IO(從Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA可獲得)中的GAP、 BESTFIT、 BLAST、 FASTA 和TFASTA。使用這些程序的比對可以利用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行。CLUSTAL程 序由Higgins等人(1988) Ge"e 73:237-244 (1988); Higgins等人(1989) Clfi/Oy 5:151-153; Corpet等人(1988) 7V"cfe/c/ 仏16:10881-90; Huang等人(1992) C45/OS 8:155-65;和Pearson等人(1994) Afe幼.Afo/.
24:307-331充分地描述。ALIGN程序基于上文的Myers和Miller (1988)算法。當(dāng)比較^J^酸序列時，可以隨ALIGN程序使用PAM120權(quán) 重殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4。 Altschul等人(1990) /. Mo/. 215:403的BLAST程序基于上文的Karlin和Altschul (1990)算法。可以用 BLASTN程序、分值=100、字長=12進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與 編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列?？梢杂肂LASTX程 序、分值=50、字長=3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白 質(zhì)或多肽同源的M酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可以如 Altschul等人(1997) 7V"c/"c ^"Vfe及d 25:3389中所述4吏用空位BLAST(在 BLAST 2.0中)。備選地，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用來進(jìn)行檢測 分子之間遠(yuǎn)緣關(guān)系的反復(fù)搜索。見上文的Altschul等人(1997)。當(dāng)使用 BLAST、空位BLAST和PSI-BLAST時，可以j吏用相應(yīng)禾呈序(例如BLASTN 用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))的默認(rèn)參數(shù)。見 www.ncbi.nlm.nih.gov。比對可以通過目測法人工地進(jìn)4亍。
除非另外說明，本文中提供的序列同一性/相似性值指使用GAP第10 版，利用以下參數(shù)核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP權(quán)重 50和長度權(quán)重3，和nwsgapdna.cmp評分矩陣；^J^酸序列的。/。同一性和 %相似性，使用GAP權(quán)重8和長度權(quán)重2，和BLOSUM62評分矩陣；或 其任意的等價程序所獲得的值。"等價程序，，意指任意的序列比較程序，其中對于所討論的任意兩個序列而言，與GAP第10版所產(chǎn)生的相應(yīng)比對比
列同一性百分?jǐn)?shù)的比對。
GAP使用Needleman和Wunsch (1970) / Mo/.48:443-453的算
法來找到兩個互補序列的比對，所述的比對使匹配數(shù)最大并使空位數(shù)最小。 GAP考慮了全部可能的比對和空位位置并且產(chǎn)生具有最大匹配數(shù)和最少 空位的比對。它允許提供匹配的威基單元中的空位創(chuàng)立罰分和空位延伸罰 分。GAP必須為其插入的每個空位產(chǎn)生空位創(chuàng)立罰分匹配數(shù)目的收益。 若選擇大于零的空位延伸罰分，GAP必須額外地為乘以空位延伸罰分的空 位長度的每個所插入空位產(chǎn)生收益。GCG Wisconsin Genetics軟件包第10
2。對于核苷酸序列，默認(rèn)空位創(chuàng)立罰分是50而默認(rèn)空位延伸罰分是3。 空位創(chuàng)立罰分和空位延伸罰分可以表述為選自由0至200的整數(shù)組成的組 中的整數(shù)。因此，例如，空位創(chuàng)立罰分和空位延伸罰分可以是O、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65 或更大。
GAP代表顯示最佳比對家族的一個成員?？赡艽嬖谠摷易宓谋姸喑?員，不過其他成員均不具有較好的質(zhì)量。GAP為比對顯示了四個優(yōu)點特征 品質(zhì)、比率、同一性和相似性。所述品質(zhì)是旨在比對序列而最大化的量度。 所迷比率是除以較短節(jié)段中^數(shù)的品質(zhì)。同一性百分?jǐn)?shù)是實際上匹配的 符號的百分?jǐn)?shù)。相似性百分?jǐn)?shù)是相似符號的百分?jǐn)?shù)。忽略了在空位對面的 符號。當(dāng)一對符號的評分矩P車值大于或等于相似性閾值0.50時，計為相似 性 在GCG Wisconsin Genetics軟件包第10版中使用的評分矩陣是 BLOSUM62(見Henikoff和Henikoff (1989) 7Va汰爿a^. Sd. (AX4
89:10915)。
(c) 如本文中所用，"序列同一性"或"同一性"在兩個多核苷酸或多肽 序列的環(huán)境下意指當(dāng)對指定比較窗口范圍內(nèi)的最大對應(yīng)性進(jìn)行比對時，在 這兩個序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分?jǐn)?shù)就蛋白質(zhì)而使用時，認(rèn)識到不相同的殘基位置往往不同在于保守性氨基酸置換，其中氨基酸殘基被 置換為具有相似化學(xué)屬性(例如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基并且因而 不改變該分子的功能性屬性。當(dāng)序列不同在于保守性置換時，可以向上調(diào) 節(jié)序列同一性百分?jǐn)?shù)以針對該置換的保守本質(zhì)進(jìn)行校正。將不同在于此類 保守性置換的序列稱作具有"序列相似性"或"相似性"。用于作出這種調(diào)節(jié)
的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此，例如當(dāng)分值i給予相同"H&酸并 且分值o給予非保守性置換的情況下，給予保守性置換在o至i之間的分
值。例如，如在禾呈序PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)
中執(zhí)行的那樣來計算保守性置換的分值。
(d)如本文中所用，"序列同一性百分?jǐn)?shù)"意指通過在比較窗口范圍內(nèi) 比較兩個最佳比對的序列而測定的值，其中與參照序列(其不包含添加或缺 失)相比時，所述多核苷酸序列在比較窗口中的部分可以包含添加或缺失 (即空位)以最佳地比對這兩個序列。通過以下方式計算百分?jǐn)?shù)，即確定其 中相同的核酸威基或氨基酸殘基在兩個序列中出現(xiàn)的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹 配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置總數(shù)并且將結(jié)果 乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分?jǐn)?shù)。
III.植物
在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了具有改變水平(即提高或降低)的 ZmRR10一p序列的植物、植物細(xì)胞和植物部分。在一些實施方案中，所述 植物和植物部分具有編碼ZmRR10一p多肽的至少一個異源多核苷酸穩(wěn)定 地并入它們的基因組，其中所述的ZmRR10一p多肽分別包含信號接受結(jié)構(gòu) 域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRRlO—p多肽(其如SEQ ID NO:2所 示并被包括在SEQ ID NO:4中)或其生物學(xué)活性變體或片段。在一個實施 方案中，編碼ZmRRlO—p多肽的多核苷酸如SEQIDNO: l或其生物學(xué)活 性變體或片段中描述。
又在其他實施方案中，提供了這樣的植物和植物部分，其中穩(wěn)定整合
21高ZmRR10_p多肽水平的多核普酸，其中所述的多肽包含信號接受結(jié)構(gòu) 域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10一p多肽、或其活性變體或片段。 可以用來增加ZmRR10一p多^^達(dá)的序列包括但不限于如SEQ ID NO:l 所示的序列或其變體或片段。
如本文中其他地方更詳細(xì)地討論，此類植物、植物細(xì)胞、植物部分和 種子可以具有改變的表型，所述改變的表型包括例如改變的花器官發(fā)育、 葉形成、向光性、頂端優(yōu)勢、果實發(fā)育、根發(fā)端和改善的產(chǎn)量。
如本文中所用，術(shù)語"植物，，包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、從中可以 再生植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物團(tuán)塊和在植物或植 物部分如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、谷粒、谷穗、穗軸、 莢殼、莖、根、根尖、花藥中完整的植物細(xì)胞等。谷粒意指由商業(yè)種植者 產(chǎn)生的用于除生長或再生物種之外目的的成熟種子。再生植物的后代、變 體和突變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這些部分包含本文中所公開的 導(dǎo)入性或異源多核苷酸即可。
本發(fā)明可以用于轉(zhuǎn)化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子 葉植物。目的植物物種的實例包括但不限于玉米(Zefl w"p)、蕓苔屬物種 CBmwcfl印.)(例3口歐洲油菜(必.wa/7附)、蕪青CB. m/7fl)、芥菜CB. y"w""))， 尤其是可作為種子油來源的蕓苔屬物種，苜蓿(MW/cfl^^attVfl)、稻(Oo^f s"ftVfl)、黑麥(5^c"/e ce""/e)、 高粱(雙色蜀黍(Sorg/iw附6/co/w)、高粱 (5"wg/rw附vw(gw"e))、 粟(例如,御谷(J^fm/s"w附g/flwcw附)、稷(jP"w/c"附 附Z/Zflcew附)、谷子(5^似n'tf ,似Z/c")、 龍爪稷(^7ewwVie cor"c"""))、 向日葵 (/^//aw幼MS awwwM5)、紅花(C"flr幼"附MS riwctof7'"s)、 'J、麥(普通d、麥(7Wft'cww aeyft'vM附)、大豆(G7j;c//1 e /wax)、煙草(iV/cofta"a似A"c"附)、馬鈴著(5^/"" "/w 尤w6cosw附)、落花生(JnicA/s /^/wgfle")、 才帛(海島棉((7ass^/7i'"附 ^w6m/ewse)、陸地沖帛((7os5^p/w附A/rs"似附))、甘薯(J^o附oe" 6fl似似s)、木薯 (Ata幼CescM/e幽)、咖啡(Oj^fl卿.)、椰子(Coc仍w腦7^r")、鳳梨(y4w"順s
5"/"ms/s)、香蕉(芭蕉屬物種(M"sflrsp/7.))、鱘梨(戶e度""艦riV""")、無花果(jF/c附、番石榴CPwVZ/m附gMfl/.avfl)、芒果(A/awg^m /"、油W￡ (Ctof ewo;p"efl)、 番木瓜(CViri'cflT/ fl/7"戸)、腰果(j朋cwyZ/w附oc"V/e她/e)、 全緣葉澳洲堅果(Maow/fl附/fl ,Vifeg"/o/,Vi)、扁杉匕(7Vww附fl附y(tǒng)^/"/附)、甜菜 (Se似vw/g"nX)、甘蔗(甘蔗屬物種(S"cc/ittr"w s/;/7.))、 燕麥、大麥、蔬菜、 觀賞植物和卡>柏類植物。
蔬菜包括番癡(丄j;co/7era/c^w esrw/ew似附)、生菜(例如萵苣(丄flc似ca s"rfv"))、青豆(菜豆(尸/roseo/"s vw/g",)、利馬豆(/Vi"s^/ms//附ews^),豌豆 (山黛豆屬物種(丄a幼F附spp.))和黃瓜屬(Cwc"附is)成員如黃瓜(C. sfl"v附)、 網(wǎng)紋甜瓜(C. ctf"to/"/^附/s)和香甜瓜(C wefo)。觀賞植物包括杜鵑花(杜鵑 屬物種spp.))、 八仙花(Mam /7/^〃" /y^/m"g—、 朱槿 (H/6&c"s r仍flsflwe附/s)、玫瑰(玫瑰屬物種(及仍"spp.))、郁金香(郁金香屬 (7W^！ spp.))、水仙(水仙屬物種(7V"/t&附spp.))、矮牽牛CP""附Vi /^ftnV/a)、康乃馨(DzVm幼"s cflijo /;/^〃Ms)、 一品紅(E"/;/ro尸6iVi /7m/cAc/附")
和菊花o
可以在實施本發(fā)明中使用的松柏類植物例如包括松如火炬松Cft7i附
toeda)、 濕地松(尸/""s e〃/W/)、 西黃松(P/"附/w"fifemwz)、 小干松(尸/""s co"tor似)和輻射木〉(尸/w"s fYwf/a似)；花旗木〉(尸sgMflfe傷wg" we"zZes/Z);力口拿大 4失杉(rsw^i owiii^fewwX); 白云才- (P/"a g/"; ;J匕美紅杉(5^《wo,Vi M/w/;en^>*ews); 真冷才》ft口 4艮才- (J6/es "/wfl6///s)和紅沖- (香月旨冷才鄉(xiāng)(JA/es 6fl/^mi^));和柏樹如西部ir^^(光4喬^(77^/Vi /7"c"似))和阿拉斯加黃柏 (黃柏(C7i"wfleo;/^r/s朋o汰"fe附&))。在具體的實施方案中，本發(fā)明的植物 是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔屬(5m^i'cfl)植物、大豆、棉、 紅花、落花生、高粱、小麥、谷子、煙草等)。在其他實施方案中，玉米和 大豆植物是最佳的，并且又在其他實施方案中，玉米植物是最佳的。
其他目的植物包括提供目的種子的谷物植物、油籽植物和豆科植物。 目的種子包括谷物種子，如玉米、小麥、大麥、稻、高粱、燕麥等。油籽 植物包括棉、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬植物、玉米、苜蓿、棕櫚、椰 子等。豆科植物包括豆類和豌豆類。豆類包括瓜爾豆(guar)、角豆(locustbean)、胡盧巴、大豆、四季豆(garden bean)、虹豆(cowpea)、綠豆、利馬 豆(limabean)、蠶豆(fava bean)、兵豆(lentil)、鷹嘴豆等。
"主題植物或植物細(xì)胞"是其中改變(如轉(zhuǎn)化或?qū)攵嚯?已經(jīng)發(fā)生的一
述改變的植物或植物細(xì)胞。"對照"或"對照植物"或"對照植物細(xì)胞"提供了 用于測量主題植物或植物細(xì)胞的表型變化的參照點。
對照植物或植物細(xì)胞可以包含例如(a)野生型植物或細(xì)胞，即，以相同 基因型的野生型植物或細(xì)胞作為用于改變的原材料，其中所述改變導(dǎo)致產(chǎn) 生主題植物或細(xì)胞；(b)相同基因型的植物或植物細(xì)胞，作為原材料但是已 經(jīng)用無效構(gòu)建體(即用已知不影響目的性狀的構(gòu)建體，如包含標(biāo)記基因的構(gòu) 建體)轉(zhuǎn)化；(c)作為主題植物或植物細(xì)胞的后代當(dāng)中非轉(zhuǎn)化的分離體的植物
或植物細(xì)胞；(d)遺傳上與主題植物或植物細(xì)胞相同但是不暴露于將誘導(dǎo)目 的基因表達(dá)的條件或刺激的植物或植物細(xì)胞；或(e)在不表達(dá)目的基因的條 件下的該主題植物或植物細(xì)胞本身。
IV.多核苷酸構(gòu)建體
術(shù)語"多核苷酸"的使用不意圖將本發(fā)明限于包含DNA的多核苷酸。 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷 酸與脫氧核糖核苷酸的組合。此類脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然 存在的分子和合成的類似物。本發(fā)明的多核苷酸還包括全部的序列形式， 包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖和環(huán)結(jié)構(gòu)等。
可以在用于目的植物中表達(dá)的表達(dá)盒中提供在本發(fā)明方法和組合物中 使用的多種多核苷酸。該表達(dá)盒將包括與本發(fā)明多核苷酸有效連接的5'和 3'調(diào)節(jié)序列。"有效連接"意指兩個或多個元件之間的功能性連接。例如， 目的多核苷酸和調(diào)節(jié)序列(即啟動子)之間的有效連接是允許該目的多核苷 酸表達(dá)的功能性連接。有效連接的元件可以是鄰接的或非鄰接的。當(dāng)用來 指兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的連接時，有效連接意指所述編碼區(qū)位于相同的可讀 框中。該表達(dá)盒可以額外地含有待共轉(zhuǎn)化至生物內(nèi)的至少一個額外基因。備選地，可以在多個表達(dá)盒上提供所述的額外基因。向這種表達(dá)盒提供多
個限制性位點和/或重組位點，用于插入ZmRR10—p多核苷酸以處在該調(diào) 節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用下。該表達(dá)盒可以額外地含有選擇性標(biāo)記基因。
此表達(dá)盒可以在5，-3，轉(zhuǎn)錄方向上包括在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯 起始區(qū)(即啟動子)、ZmRR10一p多核苷酸以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止 區(qū))。調(diào)節(jié)區(qū)(即啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和翻譯中止區(qū))和/或ZmRRlO—p多核 苷酸可以對于宿主細(xì)胞或彼此是天然的/類似的。備選地，所述調(diào)節(jié)區(qū)和/ 或ZmRR10一p多核苷酸可以對于宿主細(xì)胞或彼此是異源的。如本文中所 用，"異源的"對序列而言是這樣的序列，其源自外來物種，或若來自相同 的物種，則因人類有意介入在組成和/或基因組位點而被顯著地修飾，有別 于其天然形式。例如，與異源多核苷酸有效連接的啟動子來自與衍生該多 核苷酸的物種不同的物種，或若來自相同的/類似的物種，其一或二者均受 到顯著的修飾而有別于其原始形式和/或基因組位點，或該啟動子不是有效 連接的多核苷酸的天然啟動子。如本文中所用，嵌合基因包含編碼序列， 其中所述的編碼序列有效連接到對該編碼序列為異源的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
盡管使用異源啟動子表達(dá)該序列可能是最佳的，不過可以使用天然啟 動子序列。此類構(gòu)建體可以改變植物或植物細(xì)胞中ZmRRlO—p轉(zhuǎn)錄物或蛋 白質(zhì)的表達(dá)水平。因此，可以改變植物或植物細(xì)胞的表型。
終止區(qū)可以對于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是天然的，可以對于有效連接的目的 ZmRRlO—p多核苷酸是天然的，可以對于植物宿主是天然的，或可以從另 一來源f;t生，即對于所述啟動子、目的ZmRRlO—p多核苷酸、植物宿主或 其任意組合為外來或異源的。常規(guī)終止區(qū)可以從根瘤農(nóng)桿菌(j.,"附e/flc/e附) 的Ti質(zhì)粒得到，如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。也參見Guerineau等 人(1991) Mo/. 262:141-144; Proudfoot (1991) CW/ 64:671-674;
Sanfacon等人(1991) Z>ev. 5:141國149; Mogen等人(1990) /V"W Ce〃
2:1261畫1272; Munroe等人(19卯)91:151-158; Ballas等人(1989) 7V"c/"cW" 17:7891-7903;和Joshi等人(1987) 7Vwc/"c 15:9627-9639。根據(jù)需要，可以優(yōu)化所述多核苷酸以在轉(zhuǎn)化植物中增加表達(dá)。即，可
以使用植物優(yōu)選的密碼子合成該多核苦酸以改進(jìn)表達(dá)。見，例如，Campbell 和Gowri (1990) /V^^尸A);wW. 92:1-11對宿主優(yōu)選的密碼子4吏用的討論。本 領(lǐng)域中可獲得用于合成植物優(yōu)選的基因的方法。見，例如，美國專利號 5,380,831和5，436，391 ，和Murray等人(1989) 7V"c/"c及m. 17:477-498,所述文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文。
增強(qiáng)細(xì)胞宿主中基因表達(dá)的額外序列修飾是已知的。這些序列修飾包 括消除編碼假多腺苷酸化信號、外顯子-內(nèi)含子剪接位點信號、轉(zhuǎn)座子重復(fù) 序列和可能有損于基因表達(dá)的其它充分表征的此類序列?？梢哉{(diào)整序列的 G-C含量至對于給定細(xì)胞宿主為平均的水平，其中所述的水平如通過參考 在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因進(jìn)行計算。當(dāng)可能時，修飾此序列以避免 預(yù)測的發(fā)夾二級mRNA結(jié)構(gòu)。
表達(dá)盒可以額外含有5，前導(dǎo)序列。此類前導(dǎo)序列可以起到增強(qiáng)翻譯的 作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的，并且包括小RNA病毒前導(dǎo)序列， 例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5'非編碼區(qū))(Elroy-Stdn等人，(1989) iVfl" 5W. f/5L4 86:6126-6130);馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如
TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕斑病毒)(Gallie等人，(1995) 165(2):233醫(yī)238)、 MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮化花葉病毒)(Virology 154:9-20)，和人免疫球蛋白 重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991) 7Vfl似 353:卯-94);來自苜?；?葉病毒的外殼蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻譯前導(dǎo)序列(Jobling等人， (1987) 7Va似"325:622-625);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列(Gallie等人 (1989)，于Molecular Biology of RNA—書中，Cech編著(Liss，紐約)，第 237-256頁)；玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)序列(MCMV)(Lommel等人， (1991)Virology 81:382-385)。也見Della畫Cioppa等人(1987)， Plant Physiol. 84:965-968。
在制備表達(dá)盒時，可以操作多種DNA片段，從而使得DNA序列處于 合適方向并且根據(jù)需要處于恰當(dāng)?shù)拈喿x框中。為此目的，可以使用銜接頭 或接頭來連接所述DNA片段或可以包括其它操作以提供方便的限制性位
26點、移除多余的DNA、除去限制性位點等。為此目的，可以涉及體外誘變、 引物修復(fù)、限制作用、復(fù)性和再置換，例如轉(zhuǎn)換和顛換。
可以在本發(fā)明的實施中使用眾多啟動子，包括目的多核苷酸序列的天 然啟動子。可以基于想要的結(jié)果選擇啟動子。核酸可以與用于植物中表達(dá) 的組成型、組織優(yōu)選的或其它啟動子組合。
例如，此類組成型啟動子包括Rsyn7啟動子的核心啟動子和在WO 99/43838和美國專利號6，072，050中公開的其它組成型啟動子；核心CaMV 35S啟動子(Odell等人(1985) 7V"r" 313:810-812);稻肌動蛋白(McElroy 等人(1990)尸/"W CW/ 2:163-171);遍在蛋白(Christensen等人(1989)尸/做f Afo/.祝o/. 12:619-632和Christensen等人(1992)尸/""f 3/。/. 18:675-689); pEMU (Last等人(1991) 7Tiew.81:581-588); MAS(Velten等人(1984) /. 3:2723-2730); ALS啟動子(美國專利號
5,659,026)、 GOS2啟動子(dePater等人(1992)/Y"/^/. 2:837-44)等。其它組 成型啟動子包括例如美國專利號5,608,149、 5,608,144、 5,604,121、 5,569,597、 5,466,785、 5,399,680、 5,268,463、 5,608,142和6,177,611。
表達(dá)盒也可以包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因 用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，如編
碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的那些基因，以及 賦予針對除草劑化合物如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸 酯(2，4-D)的抗性的基因。額外的選擇標(biāo)記包括表型標(biāo)記如p-半乳糖普酶和 熒光蛋白如綠色焚光蛋白(GFP)(Su等人(2004)仏W"^w/ 5,W"g S5;610-9 和Fetter等人(2004)戶/""f CW/ 76:215-28)、藍(lán)色(cyan)熒光蛋白(CYP)(Bolte 等人(2004) /. Ce// 277:943-54和Kato等人(2002) iV"wf P/i^/o/
7":913-42)和黃色熒光蛋白(來自Evrogen的PhiYFP ,見Bolte等人(2004) /. CW//77:943-54)。對于額外的選擇標(biāo)記， 一般見Yarranton (1992) C"/r. O/;/".3:506-511; Christopherson等人(1992)7V^/.
t/5^ 89:6314-6318; Yao等人(1992) CW/ 71:63-72; Reznikoff (1992) MC AfZcro6"/. 6:2419-2422; Barkley等人(1980)在77^ 中第177-220頁；Hu等人(1987) O// 48:555-566; Brown等人(1987) Ce// 49:603-612; Figge 等人(1988) Ce// 52:713-722; Deuschle等人(1989) iV"汰爿cw/.爿c/. tASL4 86:5400-5404; Fuerst等人(1989) /Vy c 7V"汰爿ow/. Sc/. tAX4 86:2549-2553; Deuschle等人(1990)5Wew" 248:480-483; Gossen (1993)博士論文，海德堡 大學(xué)；Reines等人(1993) iV"汰/4c"d Sc/. tA^4卯:1917-1921; Labow 等人(1990) Mo/.CW/.丑/o/: 10:3343-3356; Zambretti等人(1992) A^/. 爿ow/. 5W. tAS^ 89:3952-3956; Baim等人(1991) 胸/.5W. C/5L4 88:5072-5076; Wyborski等人(1991) 7V"c/" ^"Vfe及m. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) 7^/ /^. 5/"/. 10:143-162; Degenkolb等人
(1991) ^wft.附/c,( 6.々ew^s C/r柳o汰ef. 35:1591-1595; Kleinschnidt等人 (1988) fi/oc/^/w&^v 27:1094-1104; Bonin (1993)博士論文，海德堡大學(xué)； Gossen等人(1992) 7Va//.爿aw/.t7&4 89:5547-5551; Oliva等人
(1992) JwrtVmVrM.C/^附W/^r. 36:913-919; Hlavka等人(1985) J7aw必0( A; o/ ^Ex/7m.附ew似/ PAa環(huán)"c0/og);， 第 78 巻 (Springer國Verlag， Berlin); Gill等人(1988) A^w/r 334:721-724。此類公開內(nèi)容通過引用的方 式并入本文。上述選擇性標(biāo)記基因的名單不意在限制。在本發(fā)明中可以使 用任意的選擇性標(biāo)記基因。
在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以與目的多核苷酸序列的任 何組合堆積以產(chǎn)生具有所需性狀的植物。如本文中所用，性狀指從特定序 列或序列群組衍生的表型。所產(chǎn)生的組合也可以包括任一種目的多核苷酸 的多重拷貝。本發(fā)明的多核苷酸也可以與所需的對疾病或除草劑抗性(例如 煙曲霉毒素解毒基因(美國專利號5,792，931)的性狀；無毒力和疾病抗性基 因(Jones等人(1994) Sc/ewce 266:789; Martin等人(1993) 262:1432; Mindrinos等人(1994) CW/ 78:1089);導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS) 突變體如S4和/或Hra突變體；谷氨酰胺合酶抑制劑如膦絲菌素或basta(例 如bar基因)；和草甘磷抗性(EPSPS基因))；和加工過程或加工產(chǎn)品想要的 性狀如高油(例如美國專利號6,232,529);改性油(例如脂防酸去飽和酶基因 (美國專利號5,952,544; WO 94/11516));改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(SDBE));和 聚合物或生物塑料(例如美國專利號5.602,321;促進(jìn)聚羥基鏈烷酸酯(PHAs) 表達(dá)的p-酮基硫解酶、聚羥基丁酸酯合酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶 (Schubert等人(1988) /. 5""cW, 170:5837-5847)堆積；所述文獻(xiàn)的公開內(nèi) 容通過引用的方式并入本文。也可能將本發(fā)明的多核苷酸與提供農(nóng)學(xué)性狀 如雄性不育(例如見美國專利號5，583，210)、莖強(qiáng)度、開花時間或轉(zhuǎn)化技術(shù) 性狀如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)作用或基因靶向作用(例如WO 99/61619、 WO 00/17364和WO 99/25821)的多核普酸組合；所述文獻(xiàn)的乂〉開內(nèi)容通過引用 的方式并入本文。
這些堆積的組合可以通過任意方法產(chǎn)生，所述的方法包括但不限于通 過任何常規(guī)方法或頂交法或遺傳轉(zhuǎn)化法使植物雜交育種。若所述序列通過 遺傳方式轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行堆積，則目的多核苷酸序列可以在任何時間并以任 何順序進(jìn)行組合。例如，可以使用包含一個或多個所需性狀的轉(zhuǎn)基因植物 作為通過后續(xù)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入其他性狀的靶標(biāo)。性狀可以在共轉(zhuǎn)化方法中用通過 轉(zhuǎn)化盒的任意組合提供的目的多核番酸同時導(dǎo)入。例如，若導(dǎo)入兩個序列， 則這兩個序列可以包含在獨立的轉(zhuǎn)化盒中(反式)或包含在相同的轉(zhuǎn)化盒上 (順式)。所述序列的表達(dá)可以由相同啟動子或由不同啟動子驅(qū)動。在某些 情況下，可能想要的是導(dǎo)入抑制目的多核苷酸表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒。這可以與其 他抑制盒或過量表達(dá)盒的任意組合進(jìn)行組合，以在植物中產(chǎn)生想要的性狀 組合。進(jìn)一步認(rèn)識到，使用位點特異性重組系統(tǒng)，可以在想要的基因組位 置處堆積多核苷酸序列。見，例如，W099/25821 、 W099/25854 、 WO99/25840、 W099/25855和W099/25853，全部專利文獻(xiàn)通過引用的方 式并入本文。
IV.導(dǎo)入方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的方法包括導(dǎo)入多肽或多核苷酸到植物中。"導(dǎo)入"意指將多核 苷酸或多肽以這樣的方式遞呈至植物中，從而該序列進(jìn)入該植物的細(xì)胞內(nèi) 部。本發(fā)明的方法不依賴于用于導(dǎo)入序列至植物中的具體方法，只要多核苷酸或多肽進(jìn)入該植物的至少一個細(xì)胞內(nèi)部即可。用于導(dǎo)入多核苷酸或多 肽到植物中的方法是本領(lǐng)域已知的，所述方法包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、 瞬時轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。
"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"意指導(dǎo)入植物中的核苷酸構(gòu)建體整合至該植物的基因組中 并且能夠由其后代繼承。"瞬時轉(zhuǎn)化"意指多核苷酸被導(dǎo)入植物且不整合到 該植物的基因組中，或多肽4皮導(dǎo)入植物。
轉(zhuǎn)化方案以及用于導(dǎo)入多肽或多核苷酸序列到植物中的方案可以根據(jù)
將多肽和多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞中的合適方法包括顯微注射法(Crossway 等人(1986)，祝W"/^/^m 4:320-334)、電穿孔法(Riggs等人(1986) 7VW/. Jaw/.CA^4 83:5602-5606)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(美國專利號 5,563,055和美國專利號5，981，840)、直接基因轉(zhuǎn)移法(Paszkowski等人(1984)
/. 3:2717-2722)和射彈粒子加速法(見，例如美國專利號4，945，050、 美國專利號5,879,918、美國專利號5,886,244和美國專利號5，932，782， Tomes等人(1995)在iVawf CW/， Hssw, CW似w Fwwdfl艦幽/
Af"/^flfe，編者Gamborg和Phillips (Springer-Verlag， Berlin)中；McCabe 等人(1988)祝otecA朋/o^v 6:923國926)和Lecl轉(zhuǎn)化法(WO 00/28058)。也見， Weissinger等人(1988)及e仏Ge"". 22:421-477; Sanford等人(1987) iW/c"/"te "fw/ r"/iw0/柳5:27-37(洋蔥)；Christou等人(1988)
87:671-674 (大豆)；McCabe等人(1988)必,V7^Aw"/^y 6:923-926 (大豆)；Finer和McMullen(1991) /" K/^ro CW/ Dev.祝o/. 27P: 175-182 (大豆)；Singh等人(1998) 7T^c 96:319-324 (大
豆)；Datta等人(1990)所W"/^o/ogy 8:736-740(稻)；Klein等人(1988) A^/.f/iSJ 85:4305-4309 (玉米)；Klein等人(1988)必/W"A"o/o^; 6:559-563(玉米)；美國專利號5,240,855; 5，322，783和5，324，646; Klein等 (1988) /VflW戶/i"/0/. 91:440-444 (玉米)；Fromm等人(1990) 5/oted^otogv 8:833-839 (玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)， 7VW"" (Xow甴") 311:763-764;美國專利號5，736，369(谷類)；Bytebier等人(1987)/Voc. AW/.v4cyw/. f75^ 84:5345-5349 (百合科(丄,7iflcefle)); De Wet等人(1985)在77re J5"jc/;er/應(yīng)w,fl/ Mafw]pw/",/0w ( v /e 7Yssws1，編貴Chapman等人，Longman, NY，第197-209頁中(花粉)；Kaeppler等人(19卯)戶/""f CW// e/7oWs 9:415-418 和 Kaeppler 等人(1992) T^e。r. j/7/7,.84:560-566(晶須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)4匕法(whisker-mediated transformation));D'Halluin等(1992) /V朋/ CW/ 4:1495-1505 (電穿孔法)；Li等人(1993)CW/ / e/wrte 12:250-255;以及Christou和Ford(1995) 必o,""y75:407-413 (稻)；Osjoda等人(1996) 7Va,"re 5/ofed朋/ogv 14:745-750 (借助根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的玉米)；全部文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文。
在具體的實施方案中，可以使用多種瞬時轉(zhuǎn)化方法向植物提供ZmRR10一p序列或其變體和其片段。此類瞬時轉(zhuǎn)化方法包括但不限于直接導(dǎo)入ZmRR10—p蛋白或其變體和片段到植物中或?qū)隯mRR10—p轉(zhuǎn)錄物到該植物中。此類方法例如包括微量注射法或粒子轟擊法。見，例如，Crossway等人(1986) Mo/ 2^:179-185; Nomura等人(1986)
/V做f ":53歷5S; Hepler等人(1994)7V ,/.爿ow/, Sc/. W:2176-2180和Hush等人(1994) 77^ /owrrtfl/ o/Ce// M7:775-784，全部文獻(xiàn)通
過引用的方式并入本文。備選地，ZmRR10—p多核苷酸可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)瞬時地轉(zhuǎn)化到植物中。此類技術(shù)包括病毒載體系統(tǒng)并且以排除DNA的隨后釋放的方式沉淀多核苷酸。因此，來自粒子結(jié)合性DNA的轉(zhuǎn)錄可以發(fā)生，但是該DNA被釋放以整合到基因組中的頻率大大降低。此類方法包括使用以聚乙基亞胺(polyethylimine) (PEI; Sigma幷P3143)涂敷的粒子。
在其他實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以通過使植物與病毒或病毒核酸接觸而導(dǎo)入植物中。通常，此類方法包括并入本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體到病毒DNA或RNA分子中。認(rèn)識到ZmRR10—p序列或其變體或片段可以最初作為病毒多蛋白的一部分加以合成，隨后通過體內(nèi)或體外的蛋白水解進(jìn)行加工以產(chǎn)生所需的重組蛋白。另外，認(rèn)識到本發(fā)明的啟動子也包括用于通過病毒RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動子。用于導(dǎo)入多核苷酸(包括病毒DNA或RNA分子)到植物中并表達(dá)其中所編碼的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。見，例如，美國專利號5,889,191、 5,889,190、 5,866,785、 5,589,367、5,316,931和Porta等人(1996) Afo/""/w丑,W"Awo/ogv 5:209-221;所述文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文。
用于在植物基因組中的特定位置處耙向插入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個實施方案中，使用位點特異性重組系統(tǒng)實現(xiàn)在所需的基因組位置處插入多核普酸。見，例如，W099/25821、 W099/25854 、WO99/25840、 W099/25855和W099/25853,全部專利文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文。簡而言之，可以在側(cè)翼具有兩個非重組性重組位點的轉(zhuǎn)移盒中含有本發(fā)明的多核普酸。導(dǎo)入該轉(zhuǎn)移盒到使得在耙位點穩(wěn)定并入其基因組的植物，其中所述的耙位點在側(cè)翼具有與該轉(zhuǎn)移盒的位點相對應(yīng)的兩個非重組性重組位點。提供適宜的重組酶并且該轉(zhuǎn)移盒在所述耙位點整合。目的多核苷酸因而在植物基因組特定的染色體位置處整合。
已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以根據(jù)常規(guī)方法培育成植物。見，例如McCormick等人(1986) Ce// / e/wte 5:81-84。隨后可以培育這些植物，并且用相同的轉(zhuǎn)化抹系或不同的林系授粉，并且可以鑒定具有所需表型特征的組成型表達(dá)的所得后代。可以培育兩個或多個世代以確保所需表型特征的表達(dá)是穩(wěn)定維持和遺傳的，并且隨后可以收獲種子以確保已經(jīng)實現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)。以這種方式，本發(fā)明提供了使得本發(fā)明的多核苷酸(例如本發(fā)明的表達(dá)盒)穩(wěn)定并入其基因組的轉(zhuǎn)化種子(也稱作"轉(zhuǎn)基因種子")。
V. 4吏用方法
A.用于調(diào)節(jié)植物或植物部分中至少一個ZmRR10—p序列或其變體或片段的表達(dá)的方法
多肽的"受調(diào)節(jié)的水平，，或"調(diào)節(jié)水平"在本發(fā)明方法的上下文中指基因產(chǎn)物的表達(dá)、濃度或活性的任意提高或降低，包括表達(dá)、濃度或活性的任意的相對增量。在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)節(jié)耙基因產(chǎn)物表達(dá)或調(diào)節(jié)靼基因產(chǎn)物活性的任意方法或組合物可以用來實現(xiàn)乾基因產(chǎn)物的受調(diào)節(jié)的表達(dá)、濃度、
32活性。通常，相對于適宜的對照植物、植物部分或細(xì)胞，所述水平提高或
降低至少1%、 5%、 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 800/0、卯％或更多。本發(fā)明中的調(diào)節(jié)可以在植物生長到所需的發(fā)育期期間和/或其后發(fā)生。在具體的實施方案中，調(diào)節(jié)了單子葉植物、尤其谷物植物如稻、小麥、玉米等中的本發(fā)明多肽。
具有信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10—p多肽或其生物學(xué)活性變體或片段的多肽的表達(dá)水平可以直接測量，例如通過測試植物中ZmRR10_p多肽的水平，或間接地測量，例如通過測量植物中編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸的水平或通過測量ZmRR10一p多肽的活性。用于確定ZmRR10一p多肽活性的方法在本文其他地方描述。
在具體的實施方案中，將本發(fā)明的多肽或多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞。隨后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如，但不限于DNA印跡分析、DNA測序、PCR分析或表型分析法，選擇具有導(dǎo)入的本發(fā)明序列的植物細(xì)胞。由前述實施方案改變或修飾的植物或植物部分在形成植物的條件下培育一段時間，其中所述時間足以調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽在植物中的濃度和/或活性。形成植物的M是本領(lǐng)域熟知的并且在本文中其他地方簡要討論。
還認(rèn)識到可以通過使用不能在轉(zhuǎn)化的植物中指導(dǎo)蛋白質(zhì)或RNA表達(dá)的多核苷酸調(diào)節(jié)多肽的水平和/或活性。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以用來設(shè)計多核苷酸構(gòu)建體，其中所述的多核苷酸構(gòu)建體可以在改變或突變生物中基因組核苦酸序列的方法中使用。此類多核苷酸構(gòu)建體包括但不限于RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNA:DNA修復(fù)載體、混合的雙鏈體寡核苷酸、自我互補的RNA:DNA寡核苷酸和重組性寡核酸^。此類核苷酸構(gòu)建體和使用方法是本領(lǐng)域已知的。見，美國專利號5，565，350;5,731,181; 5,756,325; 5,760,012; 5,795,972和5,871,984;全部專利文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文。也見WO 98/49350、 WO 99/07865、 WO 99/25821和Beetham等人(1999) /Voc 7V"汰^c"cf. f/&4 96:8774-8778;這些文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文。
因而認(rèn)識到本發(fā)明的方法不依賴于完整的多核苷酸并入基因組中，只要植物或其細(xì)胞因?qū)朐摱嗪塑账岬郊?xì)胞中而改變即可。在本發(fā)明的 一個 實施方案中，基因組可以在導(dǎo)入所述多核苷酸至細(xì)胞中之后被改變。例如， 多核苷酸或其任意部分可以并入植物的基因組。改變本發(fā)明的基因組包括 但不限于向基因組中添加、缺失和置換核苷酸。盡管本發(fā)明的方法不取決 于添加、缺失和置換任何具體數(shù)目的核苷酸，然而認(rèn)識到此類添加、缺失 或置換包含至少一個核苷酸。
在一個實施方案中，ZmRR10_p多肽的活性和/或水平提高。 ZmRRlO—p多肽的水平和/或活性的提高可以通過向植物提供ZmRRlO—p 多肽或其生物學(xué)活性變體或片段實現(xiàn)。如本文中其他地方所討論，本領(lǐng)域 已知用于向植物提供多肽的多種方法，所述方法包括但不限于直接導(dǎo)入 ZmRR10_p多肽到植物中或(瞬時或穩(wěn)定地)導(dǎo)入編碼具有ZmRRlO—p活性 的多肽的多核苦酸構(gòu)建體到植物中。還認(rèn)識到本發(fā)明的方法可以使用不能 在轉(zhuǎn)化的植物中指導(dǎo)蛋白質(zhì)或RNA表達(dá)的多核苷酸。因此，ZmRRlO—p 多肽的水平和/或活性可以通過改變編碼ZmRRlO—p多肽的基因或其啟動 子而提高。見，例如，Kmiec美國專利號5，565，350; Zarling等人 PCT/TJS93/03868。因而，提供了在ZmRRlO—p基因中攜帶突變的誘變植 物，其中所述的突變增加ZmRR10_p基因的表達(dá)或提高所編碼ZmRR10_p 多肽的活性。
在其他實施方案中，本發(fā)明的ZmRR10—p多肽的活性和/或水平通過導(dǎo) 入抑制多肽水平或活性的多核苷酸到植物中而降低或消除。該多核苷酸可 以通過阻止ZmRRl(Lp信使RNA翻譯而直接抑制ZmRR10—p基因的表達(dá)， 或通過編碼一種抑制編碼ZmRRl(^p蛋白的ZmRR10一p基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的 多肽而間接抑制ZmRR10—p基因的表達(dá)。用于抑制或消除植物中基因表達(dá) 的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且可以在本發(fā)明中使用任意的方法來抑制植物 中至少一個ZmRRl(Lp序列的表達(dá)。在本發(fā)明的其他實施方案中， ZmRRlO—p多肽的活性通過用編碼抑制ZmRRl(Lp多肽的活性的多肽的序 列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而降低或消除。在其他實施方案中，ZmRRlO—p多肽的活 性可以通過破壞編碼ZmRRl(Lp多肽的基因而降低或消除。本發(fā)明包括在ZmRRl(Lp基因中攜帶突變的誘變植物，其中所述的突變減少ZmRRl(Lp 基因的表達(dá)或抑制所編碼的ZmRR10一p多肽的ZmRRl(Lp活性。
降低特定基因的活性(也稱作基因沉默或基因抑制作用)對于植物中的 基因工程的幾個方面是想要的。用于基因沉默的眾多技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的，它們包括但不限于反義技術(shù)(見例如Sheehy等人(1988) iVoc， 7V"" y4cad tAS/4 85:8805-8809和美國專利號5，107，065; 5，453，566和 5，759，829);共抑制(例如Taylor (1997) P/朋《Ce//9:1245; Jorgensen (19卯) 7>e"A8(12):340-344; Flavell (1994)尸 c 7V""爿ow/. Sc/. 91:34卯-3496; Finnegan等人(1994)丑,Vr"/^o/og); 12:883-888和Neuhuber 等人(1994) Afo/. 244:230-241); RNA干擾(Napoli等人(1990)
戶/aw, Ce// 2:279-289;美國專利號5,034,323; Sharp (1999)Ge"" Z)ev. 13:139-141; Zamore等人(2000) CW/101:25-33;和Montgomery等人(1998)
7V^/. ^cw/. 95:15502-15507)、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Burton
等人(2000)CV〃 12:691-705;和Baulcombe (1999) Cwr. 0/ .尸/fl"/5/仏 2:109-113);耙RNA特異性核酶(Haseloff等人(1988) 7V"m" 334:585-591); 發(fā)夾結(jié)構(gòu)物(Smith等人(2000) 7V",w" 407:319-320; WO 99/53050; WO 02/00卯4; WO 98/53083; Chuang和Meyerowitz (2000) 7V"漢
97:4985-4990; Stoutjesdijk等人(2002)尸/朋f尸/^w》/. 129:1723-1731; Waterhouse和Helliwell (2003) 7Vat及ev.4:29-38; Pandolfini等人， 丑AfC祝ofec/mo/ogv 3:7，美國專利公開號20030175965; Panstruga等人 (2003) Mo/.祝o/.及印.30:135-140; Wesley等人(2001) 27:581-590; Wang和Waterhouse (2001) /VtfWAW， 5:146畫150;美國專利公
開號20030180945和WO 02/00卯4，全部文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文)； 核酶(Steinecke等人(1992)五MBO /. 11:1525;和Perriman等人(1993) jw他e附ei ^. "ev. 3:253);寡核苷酸介導(dǎo)的靶向修飾(例如，WO 03/076574 和WO 99/25853); Zn指靶向的分子(例如WO 01/52620; WO 03/048345和 WO 00/42219);轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法(Maes等人(1999) 7>emfe尸/fl"f 4:90-96; Dharmapuri和Sonti (1999) ^FEM5 7VZ/cty^,W.丄e汰179:53-59; Meissner等人(2000) P/"W丄22:265-274; Phogat等人(2000)/.25:57-63; Walbot (2000) Cwir./Vaw,祝o/. 2:103-107; Gai等人(2000) 7Vmc/"c爿"Vfa 28:94-96; Fitzmaurice等人(1999) Ge""/a 153:1919-1928; Bensen等人(1995) /Vfl"f CW/ 7:75-84; Mena等人(1996) 5We"ce 274:1537-1540和美國專利號 5,962,764);每份文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文；和其他方法或本領(lǐng)域寺支術(shù) 人員已知的上述方法的組合。
認(rèn)識到借助本發(fā)明的多核普酸，可以構(gòu)建與ZmRR10—p序列的信使 RNA(mRNA)的至少一部分互補的反義構(gòu)建體。構(gòu)建反義核苷酸以同對應(yīng) 的mRNA雜交?？梢孕揎椃戳x序列，只要所述序列與對應(yīng)的mRNA雜交 并干擾其表達(dá)即可。以這種方式，可以使用與對應(yīng)的反義序列具有70%、 最佳地80%，更為最佳地85%序列同一性的反義構(gòu)建體。另外，反義核苷 酸的部分可以用來破壞粑基因的表達(dá)。通常，可以使用具有至少50個核苷 酸、IOO個核苷酸、200個核苷酸、300、 400、 450、 500、 550個或更多個 核苷酸的序列。達(dá)。
的。所述方法通常包括用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，其中所述的DNA構(gòu)建體
分有效連接的啟動子。 一般，這樣的核苷^列與該內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄物的序 列具有相當(dāng)大的序列同一性，最佳地大于約65。/。的序列同一性、更為最佳 地大于約85%的序列同一性，最為最佳地大于約95%的序列同一性。見， 美國專利號5,283,184和5,034,323，它們通過引用的方式并入本文。
因此，許多方法可以用來降低或消除ZmRR10一p多肽或其生物學(xué)活性 變體或片段的活性。另外，可以使用方法的組合來降低或消除至少一種 ZmRR10一p多肽的活性。還認(rèn)識到可以調(diào)節(jié)單一 ZmRR10—p序列的水平 以產(chǎn)生所需的表型。備選地，可能想要的是調(diào)節(jié)(提高和/或降低)具有信號 接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10_p多肽或其生物學(xué)活 性變體或片段的多種序列的表達(dá)水平。如上所討論，可以使用多種啟動子來調(diào)節(jié)ZmRR10一p序列的水平。在 一個實施方案中，調(diào)節(jié)至少一種ZmRR10一p多肽水平的異源多核苷酸的表 達(dá)可以由組織優(yōu)選的啟動子、尤其葉優(yōu)選的啟動子(即葉肉優(yōu)選的啟動子或 維管束鞘優(yōu)選的啟動子)和/或種子優(yōu)選的啟動子(即胚乳優(yōu)選的啟動子或胚 優(yōu)選的啟動子)調(diào)節(jié)。
B.調(diào)節(jié)植物中花器官發(fā)育和產(chǎn)量的方法
因此，提供了調(diào)節(jié)ZmRR10一p和ZmRR10一p多肽并且因此調(diào)節(jié)植物 中花器官發(fā)育和產(chǎn)量的方法和組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合 物可以用來提高谷類植物中的谷粒產(chǎn)量。在這個實施方案中，在目的谷類 植物中表達(dá)ZmRR10一p編碼序列以增加ZmRR10_p轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。
以這種方式，所述方法和組合物可以用來提高植物中的產(chǎn)量。如本文 中所用，術(shù)語"改善的產(chǎn)量"意指任何測量的植物產(chǎn)物的產(chǎn)量方面的任意改 善。產(chǎn)量的改善可以包括所測量的植物產(chǎn)物提高0.1%、 0.5%、 1%、 3%、 5%、 10%、 15%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或 更多。備選地，提高的植物產(chǎn)量可以包括所測量的植物產(chǎn)物提高約0.5倍、 l倍、2倍、4倍、8倍、16倍或32倍。例如，與在相同條件下培育的未 處理的大豆或玉米的蒲式耳/英畝產(chǎn)量相比，從具有本發(fā)明處理的作物衍生 的大豆或玉米的蒲式耳/英畝產(chǎn)量提高將視為產(chǎn)量改善。提高的產(chǎn)量也意指 總種子數(shù)提高、總種子重量提高、根生物量增加和收獲指數(shù)提高中的至少 一種提高。收獲指數(shù)定義為收獲時產(chǎn)量生物量對總累積生物量之比。
因此，提供了提高植物產(chǎn)量的多種方法。在一個實施方案中，提高植 物或植物部分的產(chǎn)量包括導(dǎo)入異源多核苷酸到該植物或植物部分中；并且 在該植物或植物部分中表達(dá)該異源多核苷酸。在這種方法中，該異源多核 苷酸的表達(dá)調(diào)節(jié)植物或植物部分中至少一種ZmRR10_p多肽的水平，其中 所述ZmRR10—p多肽包含了具有SEQIDNO:7(信號接受結(jié)構(gòu)域)或SEQ ID NO:8(MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或包括在SEQ ID NO:2中(pZmm10 激活結(jié)構(gòu)域)的M酸序列的信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 或者ZmRR10_p多肽結(jié)構(gòu)域(或全部三者)或所述結(jié)構(gòu)域的變體或片段。在具體的實施方案中，調(diào)節(jié)ZmRR10_p多肽的水平包括提高至少一種 ZmRR10一p多肽的水平。在此類方法中，導(dǎo)入植物的異源多核苷酸編碼具 有信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10_p多肽結(jié)構(gòu)域 或其生物學(xué)活性變體或片段的多肽。在具體的實施方案中，該異源多核苷 酸包含至少一個SEQ ID NO: 1和/或其生物學(xué)活性變體或片段中所示的序 列。
在其他實施方案中，調(diào)節(jié)至少一種ZmRRlO—p多肽的水平包括降低至 少一種ZmRRlO—p多肽的水平。在此類方法中，導(dǎo)入植物的異源多核苷酸 不需要編碼有功能的ZmRR10_p多肽，但是，該多核苷酸的表達(dá)導(dǎo)致包含 信號接受結(jié)構(gòu)域、MYB-樣DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ZmRR10_p多肽結(jié)構(gòu)域或 所述結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性變體或片段的ZmRR10_p多肽的表達(dá)降低。在具 體的實施方案中，具有降低水平的ZmRRlO—p多肽在至少一個SEQ ID NO: 2、 4、 5或9或其生物學(xué)活性變體或片段中描述。
項
1. 分離的多核苷酸，其包含選自以下的核苷酸序列
(a) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；
(b) 編碼SEQ ID NO: 2的^J^酸序列的核普酸序列；
(c) 與SEQ ID NO: 1具有至少卯％序列同一性的核苷酸序列，其中 所述的核苷酸序列編碼具有ZmRRlO—p蛋白活性的多肽；
(d) 包含SEQIDNO: l的至少50個連續(xù)核苦酸或其互補序列的核苷 ^列；和，
(e) 編碼與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同 一性的M酸序列的 核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列編碼具有ZmRRlO—p蛋白活性的多 肽。
2. 表達(dá)盒，其包含項1的多核苷酸。
3. 項2的表達(dá)盒，其中所述的多核苷酸與驅(qū)動在植物中表達(dá)的啟動 子有效連接。4. 項3的表達(dá)盒，其中所述的多核苷酸與組成型啟動子有效連接。
5. 植物，其包含項3或項4的表達(dá)盒。
6. 項5的植物，其中所述植物是單子葉植物。
7. 項6的植物，其中所述的單子葉植物是玉米、小麥、稻、大麥、 高粱或黑麥。
8. 項7的植物，其中所述單子葉植物是稻。
9. 項7的植物，其中所述單子葉植物是玉米。
10. 項5的植物，其中所述的植物具有選自以下的多肽提高的水平
(a) 包含SEQ ID NO: 2的^J^斷列的多肽；
(b) 與SEQ ID NO: 2具有至少卯％序列同一性的多肽，其中所述的 多肽具有ZmRR10一p蛋白活性；和-
(c) 包含SEQ ID NO: 8中所示結(jié)構(gòu)域的多肽。
11. 項5的植物，其中所述的植物具有選自以下的表型
(a) 提高的總種子數(shù)；
(b) 提高的總種子重量；
(c) 提高的收獲指數(shù)；和
(d) 增加的根生物量。
12. 提高植物中多肽水平的方法，所述方法包括導(dǎo)入項3或項4的表 達(dá)盒到所述植物中。
13. 項12的方法，其中植物的產(chǎn)量提高。
14. 項12的方法，其中提高所述多肽的水平在植物中產(chǎn)生選自以下 的表型
(a) 提高的總種子數(shù)；
(b) 提高的總種子重量；
(c) 提高的收獲指數(shù)；和
(d) 增加的4艮生物量。
15. 項13的方法，其中所述的表達(dá)盒穩(wěn)定地整合到植物的基因組中。
16. 項13的方法，其中所述植物是單子葉植物。17. 項16的方法，其中所述的單子葉植物是玉米、小麥、稻、大麥、 高粱或黑麥。
18. 項17的方法，其中所述單子葉植物是稻。
19. 項17的方法，其中所述單子葉植物是玉米。
20. 提高植物中產(chǎn)量的方法，所述方法包括增加ZmRRlO—p多肽在 所述植物中的表達(dá)，其中所述的ZmRRlO—p多肽具有ZmRR10一p蛋白活 性并且選自以下多肽
(a) 包含與SEQ ID NO: 2中所示的序列具有至少80%序列同一性的 氨基酸序列的多肽；
(b) 包含SEQIDNO:7中所示結(jié)構(gòu)域的多肽；和，
(c) 包含SEQ ID NO: 7中所示結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO: 8中所示結(jié)構(gòu) 域的多肽。
21. 項20的方法，其中所述的多肽包含與SEQIDNO: 2中所示序列 具有至少95%序列同 一性的M酸序列。
22. 項22的方法，其中所述的多肽包含SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列。
23. 項20至22中任一項所述的方法，所述方法包括將表達(dá)盒導(dǎo)入所迷 的植物，所述的表達(dá)盒包含與驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子有效連接的 編碼所述ZmRRl(Lp多肽的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含選自以下 的核普^^列
(a) SEQIDNO: l中所示的核苷酸序列；
(b) 編碼SEQIDNO: 2的多肽的核苷酸序列；
(c) 包含與SEQ ID NO: 1中所示序列至少95%序列同一性的核苷酸 序列；
(d) 編碼包含SEQIDNO: 2中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；
和，
(e) 編碼與SEQ ID NO: 2中所示序列具有至少卯％序列同一性的氨 基酸序列的核苷酸序列。24. 項23的方法，所述方法包括
(a) 用所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和
(b) 從步驟(a)的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)化的植物。
25. 項23或項24的方法，其中所述的表達(dá)盒穩(wěn)定地并入植物的序列中。
26. 項23的方法，其中所述啟動子是組成型啟動子。
27. 分離的多肽，其包含選自以下的>11&*列
(a) 包含SEQ ID NO: 2的^J^酸序列；
(b) 包含與SEQ ID NO: 2至少90%序列同一性的^J^餅列，其中 所述的多肽具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力；和，
(c) 包含SEQ ID NO: 2的至少50個連續(xù)氨基酸的M酸序列，其中 所述的多肽保留調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力。
實驗
以示例方式而非限制方式提供下列實施例 實施例1:玉米ZmRR10—p基因的克隆
通過來自EST集合的序列同源性鑒定編碼玉米ZmRR10_p多肽的 cDNA，其中使用針對NCBI DNA序列數(shù)據(jù)庫的BLAST 2.0(Altschul等人 (1990) /, Mo/.215:403)從玉米cDNA文庫產(chǎn)生所述的EST集合。通過 PCR，使用Hifi Taq DNA聚合酶，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用包含用于GATEWAY 重組克隆的AttB位點的玉米ZmRRlO—p-特異性S1物從EST質(zhì)粒擴(kuò)增玉米 ZmRR10—p cDNA片段。使用如Sambrook等人(1989) A^/"w/"r C7om"g: j Z^6orflto/j Ma簡fl/ (第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview，紐約)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和純化具有預(yù)期長度的PCR片段。 隨后進(jìn)行GATEWAY⑧方法的第一步驟，即BP反應(yīng)，在此期間所述PCR 片段與pDONR201質(zhì)粒在體內(nèi)重組以產(chǎn)生"i^克隆"。質(zhì)粒pDONR201 從Invitrogen購買，作為GATEWAY⑧技術(shù)(Invitrogen, Carlsbad， CA)的 部分。實施例2:載體構(gòu)建(pGOS2::ZmRRl(Lp)
該i^克隆隨后在LR反應(yīng)中與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起使用。這 種載體含有植物選擇標(biāo)記、篩選標(biāo)記和GATEWAY⑧盒作為T-DNA邊界 內(nèi)部的功能性元件，其中所述的GATEWAY⑧盒意圖與已經(jīng)在該ii^克隆 中克隆的目的序列發(fā)生LR體內(nèi)重組。這個GATEWAY⑧盒的上游^J賦予 目的基因中等程度組成型表達(dá)的稻.GOS2啟動子(Hensgens等人(1993) 尸/朋,Afo/.祝o/. 23:643-669)。在LR重組步驟后，將所得的表達(dá)載體 pGOS2::ZmRR10—p轉(zhuǎn)化到才艮癌農(nóng)桿菌菌林LBA4044中并且隨后轉(zhuǎn)化至 粳稻"日本晴"(Oo;z" s她Vfl var. Nipponbare)植物(見Chan， M.T.等人(1993) 尸/朋,Afo/祝o/ 22(3):491-506和Chan， M.T.等人(1992) CW/ 33(5):577-583)。培育轉(zhuǎn)化的稻植物并且如實施例4中所述檢驗多種生長特 征。
實施例3:稻轉(zhuǎn)化方法
使用涂敷以核酸構(gòu)建體的金屬粒子的高速射彈轟擊法用來轉(zhuǎn)化野生型 稻(Klein等人(1987)A^we 327:70-73;美國專利號4,945,050，所述文獻(xiàn)通 過引用的方式并入本文)。生物射彈PDS-1000/He (BioRAD Laboratories, Hercules, CA)用于這些互補作用實驗。粒子轟擊4支術(shù)用來以 pGOS2::ZmRR10一p轉(zhuǎn)化野生型稻。使用來自吸水鏈霉菌0^r印to附j(luò);ces /i;;^wco/7,'c"力的細(xì)菌潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hpt II)基因(其賦予抗生素抗性) 作為稻轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記。在載體pML18中，對Hpt II基因設(shè)計配備來自 花椰菜花葉病毒的35S啟動子和來自根癌農(nóng)桿菌章魚堿合酶基因的終止和 聚腺苷酸化信號。pML18在WO 97/47731中描述，所述專利的>5^開內(nèi)容 通過引用的方式并入本文。
從正在萌發(fā)的稻種子的小盾片中衍生的胚發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)物用作轉(zhuǎn) 化實驗的來源材料。這種材料通過在愈傷組織發(fā)端培養(yǎng)基(MS鹽，Nitsch 和Nitsch維生素，1.0 mg/1 2，4-D和10 AgN03)上于黑暗中在27-28。C 萌發(fā)無菌稻種子產(chǎn)生。隨后轉(zhuǎn)移從胚的小盾片中增殖的胚發(fā)生愈傷組織至 CM培養(yǎng)基(N6鹽，Nitsch和Nitsch維生素，1 mg/12，4-D; Chu等人(1985)
42S/"/cff 18:659-668)。愈傷組織培養(yǎng)物通過常規(guī)傳代培養(yǎng)法在CM上間 隔兩周維持培養(yǎng)并且在發(fā)端的10周內(nèi)用于轉(zhuǎn)化。通過傳代培養(yǎng)置于CM培 養(yǎng)基上的圓形Whatman #541濾紙中央的相距大約1 mm、 排歹'J在約4 cm 直徑環(huán)形區(qū)域內(nèi)的0.5-1.0 mm小片，制備用于轉(zhuǎn)化的愈傷組織。M傷組 織的平板在27-28°C于黑暗中溫育3-5日。轟擊前，轉(zhuǎn)移帶愈傷組織的濾 紙至補充有0.25M甘露醇和0.25M山梨醇的CM,在黑暗中持續(xù)3小時。 隨后在無菌柜中半開啟培養(yǎng)臟蓋20-45分鐘以使得組織上的潮氣消散。
將每個DNA片段與含有稻轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記的pML18共沉淀到金粒子 的表面。為實現(xiàn)這一點，將性狀:選擇標(biāo)記DNA比例為2:1的總計10照 DNA添加至已經(jīng)以60 mg ml"濃度重懸的50 等分試樣的金粒子。隨后 添加氯化釣(2.5M溶液50 ^il)和亞精胺(0.1 M溶液20 jd)至金-DNA懸液， 同時將管子渦旋混合3分鐘。將金粒子在微型離心機(jī)中離心1秒鐘并棄去 上清液。金粒子隨后用1 ml無水乙醇洗滌兩次并重懸于50 nl無水乙醇中 并超聲處理(浴槽式超聲處理器)1秒鐘以^ft金粒子。金懸液在-70。C溫育 5分鐘并超聲處理(浴槽式超聲處理器)以^t粒子。隨后將6nl DNA涂敷 的金粒子加載到邁拉巨栽體盤上并且使乙醇蒸發(fā)。
在干燥期結(jié)束時，含有組織的培養(yǎng)臟置于PDS-1000/He的腔室。
排出腔室內(nèi)的空氣至真空度28-29英寸Hg。使用激波管內(nèi)He壓力達(dá)到 1080-1100 psi時破裂的防爆膜，用氦激波加速巨載體。組織距中止屏大約 8 cm放置并且轟擊愈傷組織2次。以這種方式用DNA涂敷的金粒子轟擊 2至4個組織平板。轟擊后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到無山梨醇或甘露醇補充物 的CM培養(yǎng)基。
轟擊后3至5日，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至SM培養(yǎng)基(含有50 mg/1潮霉素 的CM培養(yǎng)基)。為實現(xiàn)這一點，將愈傷組織從平板轉(zhuǎn)移至無菌的50 ml錐 形管并稱重。使用2.5 ml頂層瓊脂/100 mg愈傷組織，添加40。C的融化 頂層瓊脂。通過IO ml吸管反復(fù)分歉，將愈傷組織團(tuán)塊^L成直徑小于2 mm的碎片。將3ml等分試樣的愈傷組織懸液涂布在新鮮的SM培養(yǎng)基上 并將平板在27-28。C于黑暗中溫育4周。4周后，鑒定轉(zhuǎn)基因愈傷組織事件、轉(zhuǎn)移至新鮮的SM平板并在27-28°C于黑暗中培育額外的2周。
將正在生長的愈傷組織轉(zhuǎn)移至RM1培養(yǎng)基(MS鹽，Nitsch和Nitsch 維生素，2%蔗糖，3%山梨醇，0.4%脫乙酰吉蘭糖膠+50ppm潮霉素 B)在25。C于黑暗持續(xù)2周。2周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至RM2培養(yǎng)基(MS 鹽，Nitseh和Nitsch維生素，3。/。蔗糖，0.4%脫乙酰吉蘭糖膠+ 50 ppm潮 霉素B)并置于冷白光( 40jLiEm-Vi)下，12小時光周期，25°C和30-40%濕 度。在光照下2-4周后，愈傷組織開始組織起來并形成幼枝。將幼枝從環(huán) 繞的愈傷組織/培養(yǎng)基取出并溫和地轉(zhuǎn)移至植物托盤(phytatrays)(Sigma Chemical Co" St. Louis， MO)中的RM3培養(yǎng)基(1/2 x MS鹽，Nitsch和 Nitsch維生素，1%蔗糖+50 ppm潮霉素B)，并且使用與前述步驟中所 述相同的條件繼續(xù)溫育。2-3周后當(dāng)足夠的根和幼枝生長已經(jīng)發(fā)生時，將 所得的TO轉(zhuǎn)化體從RM3轉(zhuǎn)移至含有Metro mix 350的4英寸花缽。
實施例4: 在用pGOS2::ZmRR10—p轉(zhuǎn)化的T0、 Tl和T2稻植物中 評價過量表達(dá)ZmRR10—p序列以在稻中提高產(chǎn)量
產(chǎn)生大約15至20個獨立的TO轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)室 轉(zhuǎn)移至溫室以培育和收獲Tl種子。留下對于轉(zhuǎn)基因存在/不存在以3:1分 離的Tl子代的6個事件。"無效植物"或"無效分離體"或"失效合子"是按 照與轉(zhuǎn)基因植物相同的方式處理但是其中轉(zhuǎn)基因已經(jīng)分離的植物。也可以 將無效植物描述為純合的陰性轉(zhuǎn)化體。對于這些事件中的每一個事件，通
基因的大約10林Tl籽苗(失效合子)。
基于(本文中描述的)T1評價的結(jié)果，選擇在Tl水平顯示出改善的生 長和產(chǎn)量特征的4個事件以在T2世代中進(jìn)一步表征。至此，通過監(jiān)測標(biāo) 記表達(dá)而篩選來自陽性Tl植物(雜合子和純合子)的種子批次。對于每個所 選的事件，隨后選擇雜合種子批次用于T2評價。移植每個種子批次中相 等數(shù)目的陽性和陰性植物用于在溫室中評價(即對于每個事件40林植物， 其中20林對轉(zhuǎn)基因為陽性并且20林對于該轉(zhuǎn)基因為陰性)。對于這四個事 件，評價T2世代中的總計160林植物。如本文中所述，將T1和T2植物這兩者都轉(zhuǎn)移至溫室并評價營養(yǎng)生長參數(shù)。
對轉(zhuǎn)基因T1和T2品系的統(tǒng)計分析
使用對非平衡設(shè)計所校正的兩因素ANOVA(方差分析)作為用于所觀 察植物表型特征的數(shù)值的統(tǒng)計評價模型。數(shù)值接受,-檢驗和F-檢驗。通過 比較,"-值與"分布或備選地通過比較F-值與F-分布獲得/ -值。/7-值代表虛 假設(shè)(即無轉(zhuǎn)基因的作用)為正確的概率。
對每個事件的全部植物的全部值進(jìn)行/-檢驗。這種"檢驗對每個事件
和對每個生長特征重復(fù)進(jìn)行。實施f檢驗以檢查基因在一個轉(zhuǎn)化事件中的 效應(yīng)，在本文中也稱作"品系特異的效應(yīng)"。在f檢驗中，顯著性品系特異 的效應(yīng)的閾值設(shè)在10。/。概率水平。因此，具有小于10% (0.1)的f檢驗 的/ -值的數(shù)據(jù)意指在該品系的轉(zhuǎn)基因植物中觀察到的表型因轉(zhuǎn)基因的存在 所致。在一個轉(zhuǎn)化事件群體中， 一些事件可小于或低于該閾值。這種差異 可能因該轉(zhuǎn)基因在稻基因組中位置的差異所致(即基因可能僅在基因組的 某些位置中有效應(yīng))。因此，"品系特異的效應(yīng)"有時稱作"位置依賴的效應(yīng)"。
對全部事件的全部植物的全部值實施F-檢驗。對每個生長特征重復(fù)進(jìn) 行F-檢驗。實施F-檢驗以檢查基因?qū)θ哭D(zhuǎn)化事件的效應(yīng)并且以驗證該基 因的全局效應(yīng)，在本文中也稱作"基因效應(yīng)"。在F-檢驗中，顯著的總基因 效應(yīng)的閾值設(shè)在5%概率水平。因此，具有小于5%的F檢驗的； -值的數(shù) 據(jù)意指觀察到的表型不僅因轉(zhuǎn)基因的存在和/或因該轉(zhuǎn)基因在基因組中的 位置引起。"基因效應(yīng)"A^因在轉(zhuǎn)基因植物中廣泛應(yīng)用的一種指示。
營養(yǎng)生長測定
在溫室中培育選擇的植物。每林植物接受唯一條碼標(biāo)簽以無誤地將表 型數(shù)據(jù)與相應(yīng)的植物關(guān)聯(lián)。選擇的植物在直徑10cm的透明花缽的土壤中， 于以下環(huán)境設(shè)置中培育光周期=11.5小時；晝間光照強(qiáng)度-30,000 lux或 更大；晝間溫度-28。C或更高；夜間溫度-22。C;和相對濕度=60-70%。轉(zhuǎn) 基因植物和相應(yīng)的失效合子以隨機(jī)的位置并排培育。從播種期直至成熟期 (即，此期間生物量不再增加)，使植物每周通過數(shù)字成像室。在每個時間 點上，從至少6個不同角度拍攝每林植物的數(shù)字圖像(2048x1536像素，1千6百萬色彩)。使用圖像分析軟件，以自動方式從數(shù)字圖像衍生本文中所 述的參數(shù)。
還使植物通過根成像系統(tǒng)，其中所述的根成像系統(tǒng)以數(shù)字方式從透明 底花缽的基部拍纟聶才艮形態(tài)和根體的畫面。通過計數(shù)來自植物部分的與背景 相區(qū)別的像素總數(shù)確定植物地上部分的面積和根質(zhì)量。地上部分值對在相 同時間點上從不同角度拍攝的圖片平均，并且轉(zhuǎn)換成經(jīng)校正的以平方毫米 表示的實際表面值。實驗已經(jīng)顯示對應(yīng)于以這種方式測量的最大總面積的 地上部分植物面積同地上植物部分的生物量相關(guān)。
除了植物生長期間的數(shù)字圖像外，當(dāng)植物達(dá)到成熟并且衰老時，手工 計數(shù)每林植物的圓錐花序數(shù)和每株植物的小花總數(shù)。收集干燥的小花，并 且使用封閉式空氣驅(qū)動的鼓風(fēng)系統(tǒng)機(jī)械分開具有充實種子的那些小花與空 的小花。隨后收集脫殼的種子并且使用種子計數(shù)儀計數(shù)和使用標(biāo)準(zhǔn)天平稱 重。使用每林植物所產(chǎn)生種子的總重量與如本文中所ii^數(shù)字圖像計算的 生物量的比率計算收獲指數(shù)。從每沐&物的總種子重量與每休tt物的充實 種子數(shù)之比乘以1000計算千粒重。至開花的時間記錄為播種與首個圓錐花 序出現(xiàn)之間的天數(shù)，通過在檢測到圓錐花序的最早成像過程中圓錐花序的 尺寸和該成像過程的日期外推而來。
ZmRRlO u在稻中的總效應(yīng)
就所檢驗的5個事件平均而言，與失效合子相比，Tl世代中的 pGOS2:: ZmRRl 0—p轉(zhuǎn)基因植物以小于0.0015的/;-值顯示每^Mi物的充實 種子數(shù)統(tǒng)計學(xué)顯著的總共提高23%、每林植物的總種子重量提高25%并且 收獲指數(shù)提高20%。這些數(shù)據(jù)顯示組成型表達(dá)的Zm ZmRR10_p基因?qū)χ?物中幾種重要的產(chǎn)量性狀賦予強(qiáng)烈的正效應(yīng)。
實施例5: ZmRRl(Lp序列在玉米中的過量表達(dá)
來自溫室供體植物的不成熟玉米胚用含有在UB1啟動子控制下的 ZmRR10—p序列(如ZmRR10—p/SEQ ID NO: l)和賦予除草劑雙丙氨磷抗 性的選擇標(biāo)記基因PAT(Wohlleben等人(1988) (7ewe 70:25-37)的質(zhì)粒轟擊。 備選地，在一個單獨質(zhì)粒上提供該選擇標(biāo)記基因。轉(zhuǎn)化如下文進(jìn)行。培養(yǎng)基配方4口下。
耙組織的制備
將玉米穗去殼并在加0.5% Micro去垢劑的30% Clorox漂白液中表面 消毒20分鐘，并用無菌水漂洗2次。將不成熟胚切下并按照胚軸側(cè)面向下 (小盾片側(cè)面向上)方式在560Y培養(yǎng)基上放置4小時，每個平板25個胚， 并且隨后排列在準(zhǔn)備轟擊的2.5cm靶區(qū)內(nèi)部。
產(chǎn)生了包含與遍在蛋白啟動子有效連接的ZmRRlO—p序列的質(zhì)粒載 體。使用如下的CaCh沉淀法100 pl制備好的在水中的鎢粒子；10 照) 在Tris EDTA緩沖液中的DNA(l照總DNA); 100 jd 2.5 M CaCl2;和 10 pl 0.1 M亞精胺，將這種質(zhì)粒DNA及含有PAT選擇標(biāo)記的質(zhì)粒DNA 沉淀在1.1 |Ltm (平均直徑)鵠沉淀物上。
每種試劑依次添加至鎢粒子懸液內(nèi)，同時在多管渦旋混合器上維持。 短暫地超聲處理終末混合物并且使其在恒定的渦旋混合下溫育10分鐘。在 沉淀期后，將管子短暫離心，除去液體，用500 ml 100%乙醇洗滌并離心 30秒。再次除去液體，并添加105 pl 100%乙醇至最終的鴒粒子沉淀物。 對于粒子槍轟擊，短暫地超聲處理鎢/DNA粒子，并且將10 懸液點在每 個巨載體的中心上并且使其在轟擊前干燥約2分鐘。
在水平#4上用粒子槍轟擊樣品平板(美國專利號5，240，855)。全部樣 品接受650 PSI的單次射擊，從每個制備的粒子/DNA管中取出總計10個 等分試樣。
在轟擊后，將胚在560Y培養(yǎng)基上保持2日，隨后轉(zhuǎn)移到含有3 mg/ 升雙丙胺膦的560R選擇培養(yǎng)基并每隔2周傳代培養(yǎng)。在選擇大約10周后， 將抗選擇作用的愈傷組織克隆轉(zhuǎn)移至288J培養(yǎng)基以啟動植物再生。在體 細(xì)胞胚成熟(2-4周)后，將充分發(fā)育的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基以萌發(fā)并轉(zhuǎn)移 到光照的培養(yǎng)室內(nèi)。大約7-10日后，將正在發(fā)育的小植物轉(zhuǎn)移到管中的 272V無激素培養(yǎng)基內(nèi)持續(xù)7-10日直至小植物充分地建立。隨后將植物轉(zhuǎn) 移至平臺中含有盆栽土壤的卡盤(等同于2.5"花缽)內(nèi)并在生長箱中培育1 周，隨后在溫室中培育另外l-2周，隨后轉(zhuǎn)移至常規(guī)600花缽(1.6加侖)內(nèi)并培育至成熟。監(jiān)測植物并對其氮利用效率增加、產(chǎn)量提高或脅迫耐受性 提高進(jìn)行評分。
轟擊培養(yǎng)基(560Y)包含4.0 g/1 N6 !^出鹽(SIGMA C-1416)、 1.0 ml/1 Eriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、 0.5 mg/1硫胺素HC1、 120.0 g/1蔗糖、1.0 mg/1 2，4-D和2.88 g/1 L-脯氨酸(用KOH調(diào)節(jié)至pH 5.8后， 用去離子水H20補足體積)；2.0 g/1脫乙酰吉蘭糖膠(用去離子水H20補足 體積后添加)；和8,5 mg/1硝酸4艮(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后添加)。選 擇培養(yǎng)基(560R)包含4.0 g/1 N6 ^A鹽(SIGMA C-1416)、 1.0 ml/1 Eriksson 維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、 0.5 mg/1硫胺素HCl、 30.0 g/1蔗糖， 和2.0 mg/12，4-D(用KOH調(diào)節(jié)至pH 5.8后，用去離子水H20補足體積)； 3.0 g/1脫乙酰吉蘭糖膠(用去離子水H20補足體積后添加)；和0.85 mg/1硝 酸4艮和3.0 mg/1雙丙胺膦(均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后添加)。
植物再生培養(yǎng)基(288J)包含4.3 g/1 MS鹽(GIBCO 11117-074)、 5.0 ml/1 MS維生素貯存液(0.100 g煙酸、0.02 g/1硫胺素HCL、 0.10 g/1吡哆醇 HCL和0.40 g/1甘氨酸，用精加工的去離子水補足體積)(Murashige和 Skoog (1962)尸A"/0/. 15:473)、 100 mg/1肌醇、0.5 mg/1玉米素、60 g/1
蔗糖、和1.0 ml/1 0.1 mM脫落酸(調(diào)節(jié)至pH 5.6后，用精加工的去離子水 補足體積)；3.0 g/1脫乙酰吉蘭糖膠(用去離子水H20補足體積后添加)； 和1.0 mg/1吲咮乙酸和3.0 mg/1雙丙胺膦(在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至60°C 后添加)。無激素培養(yǎng)基(272V)包含4.3 g/1 MS鹽(GIBCO 11117-074)、 5.0 ml/1 MS維生素貯存液(0.100 g/1煙酸、0.02 g/1硫胺素HCL、 0.10 g/1吡 ,醇HCL和0.40 g/1甘氨酸，用精加工的去離子水補足體積)、0.1 g/1肌醇 和40.0 g/1蔗糖((調(diào)節(jié)至pH 5.6后，用精加工的去離子水補足體積)；和6 g/1 細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(用精加工的去離子水補足體積后添加)，消毒并冷卻至 60oC。
實施例6:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
對于用ZmRR10一p多核苷酸進(jìn)行的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，使用Zhao 的方法(美國專利號5，981，840和PCT專利7>開W098/32326;所述文獻(xiàn)的
48內(nèi)容通過引用的方式并入)。簡而言之，從玉米分離不成熟的胚并^J^與農(nóng)
桿菌懸液接觸，其中所述的細(xì)菌能夠轉(zhuǎn)移ZmRR10—p多核苷酸到至少一個 不成熟胚的至少一個細(xì)胞內(nèi)(步驟1:感染步驟)。在該步驟中，將不成熟 胚浸沒在農(nóng)桿菌懸液中以啟動接種。胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時間(步驟2: 共培育步驟)。不成熟胚在感染步驟后于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在這個共培育 時期后，構(gòu)思了任選的"靜息，，步驟。在這個靜息步驟中，在已知抑制農(nóng)桿 菌生長的至少一種抗生素存在下，在不添加用于植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑的情 況下，溫育所述胚(步驟3:靜息步驟)。在含抗生素但無選擇劑的固體培養(yǎng) 基上培養(yǎng)不成熟胚，以消除農(nóng)桿菌并且持續(xù)感染細(xì)胞的靜息期。接下來， 在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)接種的胚并且回收生長的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步 驟4:選擇步驟)。在含選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)不成熟的胚，從而導(dǎo)致 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的的選擇性培育。愈傷組織隨后再生成植物(步驟5:再生步驟)，
物。 。A 、'丄、、 ；土 。'
實施例7:大豆胚轉(zhuǎn)化 培養(yǎng)條件
大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物(栽培品種Jack)在150轉(zhuǎn)/分鐘的旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng) 箱上的35 ml液體培養(yǎng)-基SB196(見下文配方)中維持，26。C，用冷白色熒 光燈按照16:8小時晝/夜的光周期以光強(qiáng)度60-85 nE/m2/s照明。培養(yǎng)物每 隔7日至2周通過接種大約35mg組織到35ml新鮮液體培養(yǎng)基SB196中 進(jìn)行傳代培養(yǎng)(優(yōu)選的傳代培養(yǎng)間隔期是每隔7日)。
大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物用以下實施例中描述的質(zhì)粒和DNA片段，通 過粒子槍轟擊法(Kldn等人(1987) A^"", 327:70)轉(zhuǎn)化。
大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物的啟動
每月兩次啟動大豆培養(yǎng)物，每個啟動之間間隔5-7日。 從種植45-55日后的可獲得的大豆植物挑出帶不成熟種子的豆莢，從 它們的殼中取出并置于滅菌的深紅色盒中。通過在含1滴象牙色皂的5% Clorox溶液(95 ml高壓消毒的蒸鎦水外加5 ml Clorox和1滴皂液)中振搖15分鐘對大豆種子消毒。充分混合。使用2個1升瓶的無菌蒸餾水漂洗種 子并且將小于4 mm的種子置于分別的顯孩i鏡載玻片上。切開種子的小端 并將子葉從種衣擠出。子葉轉(zhuǎn)移至含有SB1培養(yǎng)基的平板(每個平板25-30 片子葉)。平板用纖維膠帶包裹并貯存8周。這段時間后，切下次生胚并置 于SB196液體培養(yǎng)基中7曰。 制備用于轟擊的DNA
含有目的基因和選擇標(biāo)記基因的完整質(zhì)?；駾NA質(zhì)粒片段用于轟擊。 使用PromegaTM方案和應(yīng)用指南2版(第106頁)中所述的方法常規(guī)地制備 和純化用于轟擊的質(zhì)粒DNA。通過凝膠分離經(jīng)雙酶切消化的質(zhì)粒獲得攜帶 ZmRR10—p多核苷酸的質(zhì)粒片段。在每種情況下，100照質(zhì)粒DNA在0,5 ml的適于目的質(zhì)粒的特定酶混合物中消化。所得的DNA片段通過在1% SeaPlaque GTG瓊脂糖(BioWhitaker Molecular Applications)上凝膠電泳 分離和從所述瓊脂糖凝膠切下含有ZmRRlO—p多核苷酸的DNA片段。使 用GELase消化酶，按照制造商方案從瓊脂糖純化DNA。
含有3 mg金粒子(3 mg金)的50 pi等分試樣的無菌蒸餾水添加至5 pi 的1 ng/jil DNA溶液(如上所述制備的完整質(zhì)粒或DNA片段)、50 jil 2.5M CaCh和20 pi的0.1 M亞精胺。該混合物在渦旋振蕩器的第3水平振搖3 分鐘并在桌面離心機(jī)中離心10秒鐘。用400jU100。/。乙醇洗滌后，通過超 聲處理使沉淀懸浮于40 nl的100%乙醇中。5jil DNA懸液分配至Biolistic PDS1000/HE儀器盤(instrument disk)的每個飛盤(flying disk)。每個5 jtl等 分試樣大約含有每次轟擊(即每個盤)0.375 mg金。
組織制備和用DNA轟擊
大約150-200 mg的7日齡胚懸浮培養(yǎng)物置于一個空的、無菌60x15 mm 培養(yǎng)jnL中并且該培養(yǎng)亞用塑料網(wǎng)覆蓋。以每個平板1或2次射擊方式轟擊 組織，膜破裂壓力設(shè)在1100 PSI并且將腔室排空至27-28英寸汞柱的真空。 距滯留/中止屏大約3.5英寸放置組織。
轉(zhuǎn)化胚的選擇
使用潮霉素(當(dāng)使用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT基因作為選擇標(biāo)記時)或氯磺隆(當(dāng)使用乙酰乳酸合酶ALS基因作為選擇標(biāo)記時)選擇轉(zhuǎn)化的胚。 潮霉素(HPT)選擇
轟擊后，將組織置于新鮮SB196培養(yǎng)基中并且如上所述培養(yǎng)。轟擊6 曰后，將SB196更換為含有30mg/L潮霉素選擇劑的新鮮SB196。該選擇 培養(yǎng)基每周更新。選擇4至6周后，可以觀察到從非轉(zhuǎn)化的壞死性胚發(fā)生 團(tuán)塊中長出的綠色轉(zhuǎn)化組織。取出分離的綠色組織并接種到多孔板中，以 產(chǎn)生新的克隆性繁殖的轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。
氯磺隆(ALS)選擇
轟擊后，將組織在含有新鮮SB196培養(yǎng)基的2個燒瓶之間分配并且如 上所述培養(yǎng)。轟擊6至7日后，將SB196更換為含有100 ng/ml氯磺隆選 擇劑的新鮮SB196。該選擇培養(yǎng)基每周更新。選擇4至6周后，可以觀察 到從非轉(zhuǎn)化的壞死性胚發(fā)生團(tuán)塊中長出的綠色轉(zhuǎn)化組織。取出分離的綠色
組織并接種到含有SB196的多孔板中，以產(chǎn)生新的克隆性繁殖的轉(zhuǎn)化的胚 發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。
大豆體細(xì)胞胚再生成植物
為了從胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物獲得完整植物，必須使組織再生。 胚成熟
胚在26。C于SB196中，在冷白色熒光燈下(飛利浦冷白色Econowatt F40/CW/RS/EW)和Agro(PhilIips F40 Agro)(40瓦特)按照16:8小時光周期 以光強(qiáng)度90-120 uE/m2s培養(yǎng)4-6周。在這段時間后，將胚團(tuán)移至固體瓊 脂培養(yǎng)基SB166持續(xù)1-2周。團(tuán)塊隨后傳代培養(yǎng)于培養(yǎng)基SB103中，持續(xù) 3周。在這個時段期間，可以從團(tuán)塊中取出單個的胚并且篩選其ZmRR10—p 表達(dá)和/或活性的水平。
胚千燥和萌發(fā)
成熟的單個胚通過置于一個空的、小培養(yǎng)臟(35 X 10 mm)中大約4-7 日進(jìn)行干燥。平板用纖維膠帶密封(創(chuàng)造一個小濕室)。干燥的胚接種到 SB71-4培養(yǎng)基中，其中使所述胚在上文所述的相同培養(yǎng)條件下萌發(fā)。從萌 發(fā)培養(yǎng)基取出萌發(fā)的小植物并用水徹底漂洗并且隨后栽種在24穴填充盤的Redi-Earth內(nèi)，以透明塑料圓蓋覆蓋。2周后，撤去圓蓋并且使植物硬 化又一周。若小植物看上去粗壯，則將它們移植到含Redi-Earth的10英 寸花缽，每個花缽多達(dá)3林小植物。10至16周后，收獲成熟種子、切碎
并分析蛋白質(zhì)。 培養(yǎng)基配方
SB 196-FN Lite液體增殖培養(yǎng)基(每升)-
MS FeEDTA-100x原液1 10 ml
MS硫酸鹽-100x原液2 10 ml
FN Lite卣化物-100x原液3 10 ml
FN Lite P、 B、 Mo-100x原液4 10 ml
B5維生素(l ml/L) 1.0 ml
2，4-D (10 mg/L終濃度) 1.0 ml
KN03 2.83 gm
(NH4)2S04 0.463 gm
天冬酰胺 1.0 gm
蔗糖(1%) 10 gm pH 5.8
FNLite l&存液 原液#
1000 ml
1 MS Fe EDTA lOOx原液
Na2 EDTA* 3.724 g
FeS04-7H20 2.784 g *首先添加，在黑色瓶子中溶解，同時攪拌
2 MS石克酸鹽100x原液
MgS04 - 7H20 37.0 g
MnS04 - H20 1.69 g
ZnS04-7H20 0.86 g
500 ml
1.862 g 1.392 g
18.5 g 0.845 gCuS04畫5H20 FNLite卣化物100x原液
0.0025 g
0.00125 g
CaCl2 - 2H20
30.0 g 0.083 g 0.0025 g
15.0 g 0.0715 g 0.00125 g
CoCl2 - 6H20
4 FN Lite P、 B、 Mo 100x原液 KH2P04 H3B03
Na2Mo04 - 2H20
18.5 g 0.62 g 0.025 g
9.25 g 0.31 g 0.0125 g
SB1固體培養(yǎng)基(每升)包含1 pkg. MS鹽(GIBCO/BRL-目錄號 11117-066); lmlB5維生素1000x原液；31.5 g蔗糖；2 ml 2，4-D (20 mg/L 終濃度)；pH5.7和8gTC瓊脂。
SB166固體培養(yǎng)基(每升)包含1 pkg. MS鹽(GIBCOZBRL-目錄號 11117-066); 1 ml B5維生素1000x原液；60 g麥芽糖；750 mg六水合 MgCl2; 5g活性炭；pH 5.7和2 g脫乙酰吉蘭糖膠。
SB103固體培養(yǎng)基(每升)包含1 pkg. MS鹽(GIBCOZBRL-目錄號 11117-066); 1 ml B5維生素1000x原液；60 g麥芽糖；750 mg六水合 MgCl2; pH5.7;和2g脫乙酰吉蘭糖膠。
SB 71-4固體培養(yǎng)基(每升)包含1瓶Gamborg B5鹽W蔗糖 (GIBCO/BRL-目錄號21153-036); pH5.7;和5gTC瓊脂。
2，4-D原液從Phytotech目錄號D295預(yù)制獲得—濃度是1 mg/ml。
以等分試樣在-20。C貯存的B5維生素原液(每100 ml)包含10 g肌醇； 100 mg煙酸；100 mg吡噴醇HC1;和1 g硫胺素。若該溶液沒有足夠迅 速地溶解，則通過熱攪拌板施加低水平的熱。
氯磺隆原液包含0.01 N氫氧化銨中的1 mg/ml。
實施例8: ZmRR10—p序列的變體
A.不改變所編碼^J^酸序列的ZmRR10—p的變體核苷酸序列
使用ZmRR10一p核苷酸序列來產(chǎn)生變體核苷酸序歹'J,其中與相應(yīng)SEQID NO的初始的未改變的ORF核苷酸序列相比時，所述的變體核** 列具有約70%、 75%、 80%、 85%、 90%和95%核苷酸序列同一性的可讀 框的核苷酸序列。使用標(biāo)準(zhǔn)密碼子表，產(chǎn)生了這些功能性變體。盡管所述 變體的核苷酸序列是被改變了的，但由其可讀框編碼的氨基酸序列沒有變 化。
B. ZmRR10_p多肽的變體^J^,列
產(chǎn)生了 ZmRR10_p多肽的變體M酸序列。在本實施例中，改變了一 個氨基酸。具體而言，審查可讀框以確定適宜的氛基酸改變。通過參考蛋 白質(zhì)比對(與其它直向同源物和源自多個物種的其他基因家族成員)做出待 改變氨基酸的選擇。選擇了這樣的氨基酸，其中認(rèn)為所述氨基酸不處在高 選擇壓力下(不是高度保守的)并且相當(dāng)容易地被具有相似化學(xué)特征(即相似 的功能性側(cè)鏈)的M酸替換。使用圖1中所示的蛋白質(zhì)比對，可以改變適 宜的氨基酸。 一旦確定了靶氨基酸，遵循以下C部分中概述的方法。使用 這種方法，產(chǎn)生了具有約70。/。、 75%、 80%、 85%、 90%和95%序列同一 性的變體。
C. ZmRR10—p多肽的額外的變體^J^酸序列
在本實施例中，產(chǎn)生相對于參考蛋白質(zhì)序列具有80%、 85%、 90%和 95。/。同一性的人工蛋白質(zhì)序列。后一項工作要求從圖1中所示的比對鑒定 保守區(qū)和可變區(qū)并且隨后適宜地使用氨基酸置換表。這些部分將在下文更 詳細(xì)地討論。
總體上，基于ZmRR10_p蛋白中或其他ZmRR10一p多肽中的保守區(qū) 域，做出改變哪些M酸序列的決定?；谛蛄斜葘Γ孕懽帜复砜?能可以被改變的ZmRR10_p多肽的多個區(qū)域，而保守區(qū)域由大寫字母代 表。認(rèn)識到可以在下文的保守區(qū)域中進(jìn)行保守性置換而不改變功能。另夕卜， 技術(shù)人員將理解的是本發(fā)明的ZmRRl(Lp序列的功能性變體可以在保守 結(jié)構(gòu)域中具有少量的非保守氮基酸變化。
隨后產(chǎn)生了與原始序列不同在于80-85% 、 85-卯％ 、 90-95%和95-100% 同一性區(qū)間的人工蛋白質(zhì)序列。^向這些區(qū)間的中點，例如加或減1%的充分范圍。氨基酸置換將由慣用Perl script實現(xiàn)。下文在表l中提供置換 表。
表1置換表
絲酸強(qiáng)相似的和最佳的 置換改變的順序 等級評論
IL，V150:50置換
i，v250:50置換
VI，L350:50置換
AG4
GA5
DE6
ED7
WY8
YW9
ST10
TS11
KR12
RK13
NQ14
QN15
FY16
M17首個甲硫氨酸不能改變
HNa非良好的取代基
CNa非良好的取代基
PNa非良好的取代基
55首先，鑒定并且"標(biāo)出"蛋白質(zhì)中不應(yīng)當(dāng)改變的任意保守氨基酸以杜絕 置換。首個甲疏氨酸當(dāng)然將自動添加至該清單中。接下來，作出改變。
在任何情況下不改變H、 C和P。改變將首先從異亮氨酸開始，從N-末端涵蓋至C-末端。隨后是亮氨酸，并且如此沿該表格進(jìn)行下去直至它達(dá) 到所需靶標(biāo)?？梢宰鞒鲋虚g數(shù)目的置換，從而不引起改變的逆轉(zhuǎn)。該清單 分成1-17級，從而在亮氨酸之前，從所需要的盡可能多的異亮氨酸改變開 始，并且如此向下進(jìn)行直至甲硫氨酸。顯然，將不需要以這種方式改變許 多氨基酸。L、 I和V涉及兩個備選的最佳置換物的50:50置換。
變體氨基酸序列記錄為輸出形式。使Perl script來計算同一性百分?jǐn)?shù)。 使用這種方法，產(chǎn)生了與SEQIDNO: 1的初始未改變的ORF核苷酸序列 具有約80%、 85%、 90%和95%氨基酸同一性的ZmRR10—p多肽變體。
D.破壞ZmRR10—p多肽的耙結(jié)構(gòu)域或序列
產(chǎn)生了 ZmRR10一p多肽的受破壞的M酸序列。在本實施例中，特定 的結(jié)構(gòu)域被破壞或從最終的多肽中排除。若破壞N-末端結(jié)構(gòu)域或基序，則 通過插入、缺失或堿基置換改變起始ATG的DNA密碼子以防止翻譯首個 甲疏氨酸。通常，下一個可用的甲硫氨酸將決定啟動翻譯，因此越過多肽 的N-末端部分。對于ZmRR10—p基因，可以改變前12個ATG以有效地 防止在這些ATG處開始的翻譯并且在下游第328位起始從而移除SEQ ID NO:2的前381個氨基酸。若破壞C-末端結(jié)構(gòu)域，則通過插入、缺失或堿 基置換或更常見地如下文所述通過PCR在想要的位點處產(chǎn)生終止密碼子。 提前終止可能導(dǎo)致翻譯丟失C-末端結(jié)構(gòu)域的多肽。
用于選擇性分離所靶向結(jié)構(gòu)域以表達(dá)的備選方法是設(shè)計引物以通過 PCR擴(kuò)增想要的結(jié)構(gòu)域，其中所述的結(jié)構(gòu)域在克隆的5，端具有天然存在的 或工程化設(shè)計的ATG序列并在克隆的3'端具有天然存在的或工程化設(shè)計 的終止密碼子。所得的片段具有待克隆到表達(dá)載體中的想要的結(jié)構(gòu)域(見實 施例2)。對于SEQIDNO:2， 對核苷酸i殳計5，引物，其對應(yīng)于氨基酸382 并且包含在符合讀框的ATG密碼子中，而3'引物,皮i殳計為在對應(yīng)于^J^ 酸殘基686的核苷酸位置處的終止密碼子。使用這些方法，產(chǎn)生了分離的多肽結(jié)構(gòu)域或基序的變體，其中所述變體如實施例A、 B或C中所述產(chǎn)生 并且具有約70。/。、 75%、 80%、 85%、卯％和95。/o核酸序列同一性。
冠詞"一個"和"一種"在本文中用來指該冠詞的一個或多于一個(即至 少一個)的語法對象。例如，"一種要素"意指一種或多種要素。
本說明書中提到的全部出版物及專利申請說明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技 術(shù)人員的水平。全部出版物及專利申請通過^ j用的方式以相同程度并入本 文，如同專門且個別地說明通過S1用方式并入每份單獨的出版物或?qū)＠?請。
盡管已經(jīng)通過旨在闡明理解的目的以說明和舉例方式詳細(xì)描述了前述 發(fā)明，然而可以在所附帶權(quán)利要求書的范圍內(nèi)實施某些變化和修改。
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸，其包含選自以下的核苷酸序列(a)SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列；(b)編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQ ID NO1具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列編碼具有ZmRR10_p蛋白活性的多肽；(d)包含SEQ ID NO1的至少50個連續(xù)核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；和，(e)編碼與SEQ ID NO2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列編碼具有ZmRR10_p蛋白活性的多肽。
2. 表達(dá)盒，其包含權(quán)利要求1的多核苷酸。
3. 權(quán)利要求2的表達(dá)盒，其中所述的多核苷酸與驅(qū)動在植物中表達(dá)的 啟動子有效連接，優(yōu)選地其中所述的多核苷酸與組成型啟動子有效連接。
4. 植物，其包含權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的表達(dá)盒，優(yōu)選地其中所述 的植物是單子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選地其中所述的單子葉植物是玉米、小麥、 稻、大麥、高粱或黑麥。
5. 權(quán)利要求4的植物，其中所述的植物具有選自以下的多肽提高的水平(a) 包含SEQ ID NO: 2的^J^,列的多肽；(b) 與SEQ ID NO: 2具有至少卯％序列同一性的多肽，其中所述的 多肽具有ZmRRlO—p蛋白活性；和(c) 包含SEQ ID NO: 8中所示結(jié)構(gòu)域的多肽。
6. 權(quán)利要求4或5的植物，其中所述的植物具有選自以下的表型(a) 提高的總種子數(shù)；(b) 提高的總種子重量；(c) 提高的收獲指數(shù)；和(d)增加的根生物量。
7. 提高植物中多肽水平的方法，所述方法包括將權(quán)利要求2或權(quán)利要 求3的表達(dá)盒導(dǎo)入所述的植物。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中植物的產(chǎn)量提高。
9. 權(quán)利要求7或8的方法，其中提高所述多肽的水平在植物中產(chǎn)生選 自以下的表型(a) 提高的總種子數(shù)； b) 提高的總種子重量；(c) 提高的收獲指數(shù)；和(d) 增加的根生物量。
10. 權(quán)利要求7至9中任一項所述的方法，其中所述的表達(dá)盒穩(wěn)定地 整合到植物的基因組中，優(yōu)選地其中所述的植物是單子葉植物，進(jìn)一步優(yōu) 選地其中所述的單子葉植物是玉米、小麥、稻、大麥、高粱或黑麥。
11. 提高植物中產(chǎn)量的方法，所述方法包括增加ZmRR10一p多肽在 所述植物中的表達(dá)，其中所述的ZmRR10一p多肽具有ZmRRlO—p蛋白活 性并且選自以下多肽(a) 包含與SEQ ID NO: 2中所示的序列具有至少80%序列同一性的 氨基私宇列的多肽；(b) 包含SEQIDNO: 7中所示結(jié)構(gòu)域的多肽；和，(c) 包含SEQ ID NO: 7中所示結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO: 8中所示結(jié)構(gòu) 域的多肽。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述的多肽包含與SEQ ID NO: 2中所 示序列具有至少95%序列同 一性的氨基酸序列或其中所述的多肽包含 SEQ ID NO: 2中所示的^J^酸序列。
13. 權(quán)利要求7至12中任一項所述的方法，所述方法包括將表達(dá)盒 導(dǎo)入所述的植物，所述的表達(dá)盒包含與驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子有 效連接的編碼所述ZmRR10一p多肽的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含 選自以下的核苷酸序列(a) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；(b) 編碼SEQ ID NO: 2的多肽的核苷酸序列；(c) 包含與SEQ ID NO: 1中所示序列至少95%序列同 一性的核苷酸 序列；(d) 編碼包含SEQ ID NO: 2中所示M酸序列的多肽的核苷^ 列；和，(e) 編碼與SEQ ID NO: 2中所示序列具有至少90%序列同一性的氨 基酸序列的核苷酸序列。
14. ;f又利要求13的方法，所述方法包括(a) 用所i^達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞;和(b) 從步驟(a)的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)化的植物。
15. 權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的方法，其中所述的表達(dá)盒穩(wěn)定地并 入植物的序列中。
16. 權(quán)利要求13至15中任一項的方法，其中所述啟動子是組成型啟 動子。
17. 分離的多肽，其包含選自以下的M酸序列(a) 包含SEQ ID NO: 2的^J^^列；(b) 包含與SEQ ID NO: 2至少卯％序列同一性的^J^紗列，其中 所述的多肽具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力；和，(c) 包含SEQ ID NO: 2的至少50個連續(xù)#^酸的#^紗列，其中 所述的多肽保留調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力。
全文摘要
提供了用于調(diào)節(jié)花器官發(fā)育、葉形成、向光性、頂端優(yōu)勢、果實發(fā)育、根發(fā)端和用于提高植物中產(chǎn)量的組合物和方法。所述組合物包括ZmRR10_p序列。本發(fā)明的組合物包含選自SEQ ID NO2及其變體和片段的氨基酸序列和核苷酸序列。在用于目的植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體中提供了編碼ZmRR10_p的核苷酸序列，用來調(diào)節(jié)植物或植物部分中ZmRR10_p序列的水平。所述方法包括將包含本發(fā)明ZmRR10_p序列的異源多核苷酸導(dǎo)入植物或植物部分。能夠提高或降低ZmRR10_p多肽的水平。此種方法可以用來提高植物中的產(chǎn)量；在一個實施方案中，所述方法用來提高谷類中的谷粒產(chǎn)量。
文檔編號C07K14/415GK101688215SQ200880017709
公開日2010年3月31日 申請日期2008年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日
發(fā)明者S·西瓦?？? W·布魯斯 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司