專利名稱：：熒光蛋白及其應用方法熒光蛋白及其應用方法本發(fā)明涉及天然存在的四聚體美國粉紅海葵(Anemoniasulcata)綠色熒光蛋白499(AsGFP499){Wiedenmann,2000#27;Nienhaus，2006#170}的二聚突變體和單體突變體。本發(fā)明熒光蛋白的優(yōu)良特性，例如在真核細胞中高表達、寡聚趨勢降低、光譜改進、37t:時的高穩(wěn)定性、高水溶性、膨松性低，所有這些特性使其在報告基因技術和基于細胞的測定法的應用中特別具有吸引力。本發(fā)明熒光蛋白及其編碼多核苷酸還可在研究蛋白質(zhì)相關作用、診斷和醫(yī)療成像時用于蛋白質(zhì)標記。
背景技術：
：綠色熒光蛋白(GFP)家族包含越來越多的熒光蛋白(FP)和色素蛋白(CP)。截至目前已有ioo多個蛋白被克隆或修飾，其中許多由海洋無脊椎動物例如剌胞動物門(Cnidariaphylum)生物體中得到描述和表征。{Johnson,1962#174;Morin，1971#13;Wampler，1971#14;Morin，1974#16;Labas，2002#30;Matz，1999#28;Wiedenmann，2000#27;Lukyanov，2000#lll;Gurskaya，2001#97}。色素蛋白通常需要輔基例如非肽類小分子或金屬離子化iron，2003ftl69h與這些蛋白質(zhì)不同，GFP家族的蛋白除氧分子以外不需要其他外部因子就能合成它們自己的"輔基"，從而得到其光學性質(zhì)(Heim，1994#22;Cubitt，1995#20;Reid，1997#171}。1955年，Davenport等人{Davenport,1955#3}報導了用長波紫外光照射太平洋水母維多利亞多管發(fā)光水母(AequoreaVictoria)能夠引發(fā)綠色熒光。Shimomura等人{Shimomura,1962#173}在對這種生物體的藍光發(fā)射蛋白進行純化時注明了溶液中的綠色光線。藍色熒光蛋白是著名的光蛋白水母發(fā)光蛋白和綠色GFP。該光蛋白由鈣離子激活，其中鈣離子結合存在于蛋白質(zhì)中的、鈣離子結合蛋白所具有的典型的三個EF手形結構。在這些離子存在下，水母發(fā)光蛋白構象發(fā)生改變，導致結合的腔腸素(coelenterazine)的氧化，以及后續(xù)(A的釋放和470nm的藍色閃光。維多利亞多管發(fā)光水母GFP(AvGFP)是水母生物發(fā)光系統(tǒng)中的一部分，具有二次發(fā)射體(secondaryemitter)的作用，能將水母發(fā)光蛋白的藍光轉變?yōu)?08nm的綠光。實際上，通過從Ca2+活化的水母發(fā)光蛋白中吸收Amax=470nm的藍光，從而發(fā)射Amax=508nm的綠光，GFP作為能量轉移受體起作用{Morise,1974#17;Johnson，1962#174}。Prendergast等人{Prendergast,1978#18}估計GFP的分子量(Mw)在27kDa左右。在發(fā)現(xiàn)GFP40年后，野生型基因的克隆帶來了突破(Prasher，1992ft5h該基因編碼理論分子量為26.9kDa的238個氨基酸的蛋白，該蛋白隨后在不同系統(tǒng)中表達{Chalfie,1994#19}。這些結果表明由于GFP具有能夠自身形成發(fā)色團的獨特能力，使其能夠在任何生物體中應用。GFP發(fā)色團的形成不依賴于例如最初源于維多利亞多管發(fā)光水母的酶或其它蛋白質(zhì)等因素。這揭示該基因的蛋白質(zhì)序列固有地編碼強大的發(fā)色團，除了氧分子以外，不需要外部底物或輔因子。{Prasher,1992#5;Cody，1993#21;Heim，1994#22}.1996年有兩個研究組各自解出了GFP的晶體結構{Ormo，1996#25，Yang，1996#26}。發(fā)現(xiàn)了稱作P-罐(P-Can)的新型蛋白質(zhì)折疊結構{Yang,1996#26}。這種結構使人們想起P-桶形(P-barrel)結構，其由11個反平行P_折疊-sheets)形成，并與a-螺旋(a-helix)交叉。三肽序列S65_T66_G67幾乎位于螺旋的中部，通過自動催化反應作為發(fā)色團的骨架結構。發(fā)色團本身為一種P-羥基亞芐基_咪唑烷酮環(huán)結構。GFP已經(jīng)成為分子生物學和細胞生物學中的重要工具，其可作為基因表達的報告分子、作為融合標簽在活細胞中監(jiān)測蛋白質(zhì)定位、作為細胞譜系的示蹤物、熒光共振能量轉移(FRET)的配偶體及作為生物傳感器{Tsien,1998#23;Kendall，1998#24}。盡管有這些顯著的作用，野生型GFP還是有一些局限性，例如表達水平、光敏性、低亮度、不溶性以及在高濃度時有二聚化傾向等問題。為了克服這些報道的缺點，人們做了一些努力，通過誘變改善野生型GFP，以獲得具有更好溶解性、抗光性、亮度和移位的光譜特性的突變體。盡管氨基酸序列的同一性程度中等或較低，所有GFP樣蛋白質(zhì)可能都具有13_罐(e-Can)結構{Matz，2002#108}{Chudakov,2005#106}{Evdokimov,2006#103}，并且序歹lj比對進一步顯示，作為發(fā)色團的一部分的氨基酸，例如T66、G67，以及與發(fā)色團相互作用的其它氨基酸，例如R96和E222(根據(jù)GFP編號)在熒光蛋白(FP)中是保守的{Baird,2000#35}。珊瑚蟲綱GFP樣蛋白質(zhì)一個重大的缺點是它們具有寡聚的傾向{Verkhusha,2004#79}。這種寡聚反應并不會限制其作為報告基因或生物標記的應用，但是會阻礙其在融合蛋白中的應用。與其融合的靶蛋白可能形成龐大的產(chǎn)物，并干擾其在細胞中的易位或定位，尤其在靶蛋白本身也傾向于形成寡聚體的情況下。其它靶蛋白甚至可能被寡聚反應活化，其與寡聚熒光蛋白(FP)的融合會形成可能對宿主細胞有害的組成性激活突變型靶蛋白{ZaCharias，2002#59}。因此，找到或設計出能最低限度影響靶蛋白的熒光蛋白(FP)是關鍵并且必要的。發(fā)明公開內(nèi)容第一方面，本發(fā)明提供分離的熒光蛋白或多肽，其(a)在被396-490nm波長范圍的光激發(fā)后發(fā)射綠光；(b)具有與SEQIDN0°:1有至少80%同一性的氨基酸序列，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%;(c)在與SEQIDN0°:1的序列比對中，呈現(xiàn)下列多個取代之一(殘基位置參見SEQIDN0°:1):i)S103Kii)S103K，T159K和F173Eiii)S94T，S103K，T159K和F173Eiv)S103K，R150Ev)S103K，F(xiàn)173Evi)S94T，S103K，R150K，S171N和K206Rvii)S94T，S103K，R150I,S171N禾口K206R本發(fā)明還包括一種上述定義蛋白質(zhì)或多肽的片段，所述片段為水溶性，保留在被396-490nm波長范圍的光激發(fā)后發(fā)射綠光的能力，并且存在至少一種經(jīng)鑒定的突變。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的熒光蛋白或多肽選自SEQIDNO.:2_8?？梢詫Π被嵝蛄羞M行修飾而對熒光蛋白活性沒有負面影響，特別是在指定序列同一性限制之內(nèi)，通過氨基酸殘基的保守取代進行修飾。另外，該蛋白質(zhì)序列可以小部分缺失，而不會改變其熒光活性。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明經(jīng)誘變的熒光蛋白從美國粉紅?？?Anemoniasulcata)的生物體中分離。這些與已知蛋白質(zhì)具有非常低的序列同源性的蛋白質(zhì)為水溶性，具有溫度穩(wěn)定性，在細菌中可在37t:時在6小時之內(nèi)誘導，并且它們的低膨松性特別適用于易位測定。另一方面，本發(fā)明提供能特異結合目標熒光蛋白的抗體。適合的抗體通過對宿主動物免疫接種包含全部或部分本發(fā)明熒光蛋白的多肽獲得，其中宿主動物例如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、倉鼠、兔子等。該免疫原可包含完整的蛋白質(zhì)，或其片段和衍生物。抗體可為單克隆、多克隆、單鏈或多體，并可由傳統(tǒng)技術生產(chǎn)。另一方面，本發(fā)明提供編碼上述定義的蛋白質(zhì)或多肽的多核苷酸，其可通過適當修飾編碼AsGFP499的核酸分子獲得，該核酸分子從這樣的生物體中分離，其在分類學上屬于剌胞動物門(Cnidariaphylum)，珊瑚蟲綱(Anthozoaclass)，花珊瑚亞綱(Zoanthariasubclass),海葵目(Actinariaorder)，?？潭?Anemoniafamily),?？麑?Anemoniagenus)和美國粉紅?？N(Anemoniasulcata)，優(yōu)選SEQIDN0°:10(美國粉紅?？t色變種(Anemoniasulcatavarrufescens)的野生型AsGFP499編碼序列)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多核苷酸選自SEQIDNO.:11_17、其互補鏈、或嚴格條件下與其雜交的核酸。為了在哺乳動物細胞中有足夠的表達，本發(fā)明核酸序列可能需要進行密碼子使用(codonusage)的優(yōu)化。優(yōu)選地，本發(fā)明突變體從已經(jīng)對于在哺乳動物細胞中表達優(yōu)化了密碼子使用的cDNA序列中產(chǎn)生，優(yōu)選從SEQIDN0。9中產(chǎn)生，SEQIDN0°:9通過修飾SEQIDN0°:10(野生型AsGFP499編碼序列)的密碼子使用而獲得。編碼本發(fā)明熒光蛋白的cDNA片段(優(yōu)選SEQIDNO:11-17中所示的cDNA)及與其雜交的寡核苷酸可以作為針對目的靶生物體cDNA文庫的雜交探針。低嚴格性條件可表示例如在5(TC和6xSSC(0.9M氯化鈉/0.09M檸檬酸鈉)條件下雜交，在55。C于lxSSC(O.15M氯化鈉/0.15M擰檬酸鈉)條件下清洗，而嚴格條件可為例如5(TC或更高溫度和0.lxSSC(15mM氯化鈉/1.5mM擰檬酸鈉)。雜交過程在Sambrook等{Sambrook,1989#175}中有描述。如果作為引物使用，該寡核苷酸可與靶分子的不同區(qū)域雜交，以擴增期望的靶分子區(qū)域。取決于探針或引物的長度，本發(fā)明雜交核酸探針或引物可與其雜交的序列區(qū)段至少90%、95%、97%、98%或至少99%互補。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明寡核苷酸包含10至30個核苷酸。另一個方面，本發(fā)明涉及包含指定核酸分子的表達載體。適合的載體包括病毒載體和非病毒載體，優(yōu)選可用于克隆、擴增、表達或轉移核酸序列至適當宿主的質(zhì)粒。另一個方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明核酸或其載體的原核或真核宿主細胞。宿主細胞例如大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(B.subtilis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、昆蟲細胞、或高等生物如脊椎動物的細胞，特別是C0S-7細胞、HEK-293、HeLa、CH0-Kl、爪蟾卵母細胞，可用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)或用于基于細胞的測定。本發(fā)明還提供了轉基因生物，其基因組包含本發(fā)明的核酸分子。轉基因生物可為原核生物或真核生物，包括細菌、藍藻、真菌、植物和動物，其中生物體中一種或多種細胞包5含本發(fā)明的異源核酸。本發(fā)明還包括含有此處公開的核酸的胚胎干細胞(ES)。在適當?shù)某衫w維細胞飼養(yǎng)層上生長的胚胎干細胞，或是在白血病抑制因子(LIF)或其它適當生長因子存在下生長的胚胎干細胞，可用于生產(chǎn)非人轉基因動物，包括如之前報告的非人哺乳動物、鳥或兩棲動物。轉基因植物也可以按以下綜述中所述而產(chǎn)生，即PlantBiochemistryandMolecularBiology(Lea和Leegood編，JohnWiley&Sons)(1993)第275-295頁，以及PlantBiotechnologyandTransgenicPlants(Oksman-Caldentey禾口Barz編)，(2002)第719頁。另一個方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)上述定義的熒光蛋白的方法，其包含以下步驟(a)提供與表達調(diào)控元件有效連接的本發(fā)明核酸分子；(b)在允許表達的條件下，將(a)步驟中的核酸引入細胞；[OO38](c)分離表達產(chǎn)物；本發(fā)明另一方面是在細胞中檢測熒光的方法，其包含(a)提供表達本發(fā)明熒光蛋白的細胞；(b)將細胞暴露在460-490nm波長范圍的激發(fā)光中；(c)檢測熒光?！愣?，本發(fā)明熒光蛋白或其編碼序列能夠作為細胞內(nèi)熒光標記物使用，特別是在例如基于細胞的測定中，用于標記、定位或檢測細胞內(nèi)或細胞器內(nèi)的生物分子或化合物；或者它們能夠用于在無細胞制劑中進行體外測定，其中無細胞配制品優(yōu)選水溶液。在典型應用中，熒光蛋白用作自動篩選許多表達熒光報告基團的細胞的工具，或是作為與肽(例如靶向序列)或蛋白融合的標記物，以檢測它們在細胞中的定位，或是在例如信號轉導研究中作為細胞活性的指示劑。特別地，本發(fā)明蛋白質(zhì)能夠與特定區(qū)域融合，例如PKC-yCa結合結構域、PKC-yDAG結合結構域、SH2結構域或SH3結構域，以檢測參與信號傳導路徑的第二信使{ChudakOV，2005#106}。在優(yōu)選的實施方案中，涉及本發(fā)明熒光蛋白的基于細胞的測定以高通量形式進行，其使用光學篩選工具、或適合多樣品分析的設備、或通過使用顯微成像和電子分析進行。在其他實施方案中，目標蛋白質(zhì)用于篩選以發(fā)現(xiàn)藥物，以及在功能基因組學領域作為整個細胞的標記物檢測多細胞重組和遷移中的變化。發(fā)現(xiàn)目標熒光蛋白也可以在如US7，049，400所述的蛋白酶切測定中應用。在其他實施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)可以用在高內(nèi)涵篩選(highcontentscreening)中，以檢測與其它熒光融合蛋白的共定位，定位標記物作為細胞內(nèi)熒光蛋白/肽移動的指示劑，或僅作為標記物。在其他實施方案中，目標熒光蛋白在原核和真核細胞中作為生物傳感器使用，如Ca2+離子指示劑，pH值指示劑，磷酸化指示劑或其他離子如鎂、鈉、鉀、氯和鹵化物的指示劑{Chudakov，2005#106}?？稍谠S多不同應用中使用的目標蛋白質(zhì)的分泌形式，可以通過與其分泌先導序列融合來制備。在優(yōu)選的實施方案中，熒光蛋白在細胞生物學和分子生物學測定中用作體內(nèi)標記(或報告分子)，特別是對基因表達、蛋白定位和共定位、蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)_核酸相互作用、核酸_核酸相互作用，細胞和細胞器定位和相互作用的測定。6在其他優(yōu)選的實施方案中，熒光蛋白用于檢測被測底物對細胞中一個或多個目的蛋白的表達調(diào)控和/或易位的影響，或用于檢測響應測試底物的目的蛋白的表達和表達調(diào)控序列(expressioncontrolsequence)的同步活性。細胞中兩個或更多的表達調(diào)控序列對測試底物響應的活性可以使用本發(fā)明熒光蛋白進行比較。這種方法在存在或不存在測試物質(zhì)的時候都可以進行，該測試物質(zhì)對此過程的影響有待測量。在其他實施方案中，本發(fā)明熒光蛋白在熒光激活細胞分類(FACS)中用作細胞標記物，所述細胞隨后可以通過熒光激活細胞分類設備進行分類。此外，目標蛋白質(zhì)可在熒光共振能量轉移(FRET)方法中作為供體和/或受體與另一熒光蛋白或染料結合使用。使用目標熒光蛋白的FRET測定的具體例子包括檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(例如在哺乳動物雙雜交系統(tǒng)中)、轉錄因子二聚反應、膜蛋白多聚化、多蛋白復合物形成。在其他實施方案中，目標熒光蛋白用于BRET測定(生物發(fā)光共振能量轉移)。BRET是一種蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用測定，其基于從生物發(fā)光供體到熒光受體蛋白的能量轉移。BRET信號測量為受體發(fā)出的光的量對供體發(fā)出的光的量的比{Pfleger，2006#198}。這兩個值的比隨著兩種蛋白質(zhì)的接近而增加。在其他應用中，熒光蛋白用作熒光計時器，其通過熒光顏色從一種到另一種的轉變(例如綠色變成紅色)與相伴的熒光蛋白質(zhì)老化，來測定基因表達的活化/失活。熒光蛋白的使用與光學成像方法相結合能改進人們對疾病過程的認識，對藥物體內(nèi)作用的更有效的評價使得在人類醫(yī)學中新的診斷和治療應用成為可能。特別地，分子成像領域使得能夠通過使用相對簡單的設備、以非侵入性和無輻射的方式顯影和量化與疾病相關的分子事件{Licha，2005#176}{Weissleder,2002#177}。另一方面，本發(fā)明提供一種適合建立和實施本發(fā)明測定法或方法的試劑盒。該試劑盒通常包括本發(fā)明的蛋白質(zhì)或核酸，特別是SEQIDN0:2-8的蛋白質(zhì)和/或SEQIDNO:11-17的多核苷酸，或其可以包含在穩(wěn)定或誘導型啟動子控制下表達本發(fā)明熒光蛋白的載體或細胞制劑，以及適合于實施測定的試劑。該試劑盒可以包括能夠通過PCR生產(chǎn)核酸的cDNA和寡核苷酸引物。該試劑盒成分通常處于適合的存儲介質(zhì)例如緩沖溶液中，并包裝在適合的容器中。該試劑盒還可以包含對所提供蛋白質(zhì)特異的抗體。本發(fā)明將在下面的實驗部分進行更詳細的說明。附圖簡述圖1A:考馬斯染色的偽天然(pseudo-native)SDS-PAGE凝膠。圖IB:考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。圖2A:考馬斯染色的偽天然SDS-PAGE凝膠。圖2B:考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。圖3:歸一化后的wtAsGFP499的激發(fā)和發(fā)射光譜。虛線為在固定的AEm=499nm時的激發(fā)光譜，實線為AEx=483nm時的發(fā)射光譜，點線為AEm=400nm時的發(fā)射光譜。圖4:歸一化后的突變熒光蛋白AsGFP499(S103K)的激發(fā)和發(fā)射光譜。虛線為在固定的AEm=4"nm時的激發(fā)光譜，實線為AEx=483nm時的發(fā)射光譜，點線為AEm=400nm時的發(fā)射光譜。圖5:歸一化后的突變熒光蛋白AsGFP499(S103K/T159K/F173E)的激發(fā)和發(fā)射光譜。虛線為在固定的"m=499nm時的激發(fā)光譜，實線為AEx=483nm時的發(fā)射光譜，點線為入Em=400nm時的發(fā)射光譜。圖6:歸一化后的突變熒光蛋白AsGFP499(S94T/S103K/T159K/F173E)的激發(fā)和發(fā)射光譜。虛線為在固定的AEm=499nm時的激發(fā)光譜，實線為AEx=483nm時的發(fā)射光譜，點線為AEm=400nm時的發(fā)射光譜。圖7:歸一化后的突變熒光蛋白AsGFP499(S103K/R150E)的激發(fā)和發(fā)射光譜。虛線為在固定的AEm=499nm時的激發(fā)光譜，實線為AEx=483nm時的發(fā)射光譜，點線為入Em=400nm時的發(fā)射光譜。圖8:歸一化后的突變熒光蛋白AsGFP499(S94T/S103K/R150K/S171N/K206R)的激發(fā)和發(fā)射光譜。虛線為在固定的AEm=499nm時的激發(fā)光譜，實線為AEx=483nm時的發(fā)射光譜，點線為AEm=400nm時的發(fā)射光譜。圖9:歸一化后的突變熒光蛋白AsGFP499(S94T/S103K/R150I/S171N/K206R)的激發(fā)和發(fā)射光譜。虛線為在固定的AEm=499nm時的激發(fā)光譜，實線為AEx=483nm時的發(fā)射光譜，點線為AEm=400nm時的發(fā)射光譜。圖10:wtAsGFP499及其突變體歸一化后激發(fā)光譜的疊加圖。圖11:his標記的重組DsRed2的體積排阻色譜。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm時的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖12:his標記的重組EGFP的體積排阻色譜。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm時的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖13:his標記的重組wt-AsGFP499的體積排阻色譜。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm時的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖14:his標記的重組AsGFP499(S103K)的體積排阻色譜。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm時的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖15:his標記的重組AsGFP499(S103K/T159K/F173E)的體積排阻色譜。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm時的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖16:his標記的重組AsGFP499(S94T/S103K/T159K/F173E)的體積排阻色譜。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm處的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖17:his標記的重組AsGFP499(S103K/R150E)的體積排阻色譜。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm處的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖18:his標記的重組AsGFP499(S94T/S103K/R150K/S171N/K206R)的體積排阻色譜。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm處的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。8圖19:his標記的重組AsGFP499(S94T/S103K/R150I/S171N/K206R)的體積排阻色譜。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm處的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖20:his標記的重組wt-AsGFP499、AsGFP499(S103K)和AsGFP499(S103K/T159K/F173E)的體積排阻色譜的疊加圖。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm處的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖21:his標記的重組wt-AsGFP499、AsGFP499(S103K)和AsGFP499(S94T/S103K/T159K/F173E)的體積排阻色譜的疊加圖。點線為280nm處的吸收(蛋白質(zhì))，虛線為400nm處的吸收(質(zhì)子化的發(fā)色團)，實線為480nm處的吸收(去質(zhì)子化的發(fā)色團)。色譜圖以280nm處的峰值進行歸一化。圖22:穩(wěn)定轉染哺乳動物載體pcDNA3-AsGFP499、pcDNA3-hAsGFP499和pcDNA3-hAsGFP499(S103K)的CHOKl細胞。圖23:用哺乳動物表達載體pIRES2-EGFP、pIRES2-hAsGFP499、pIRES2—hAsGFP499(S103K)禾口pIRES2—hAsGFP(S94T/S103K/R150K/S171N/K206R)禾口pIRES2-hAsGFP(S94T/S103K/R150I/S171N/K206R)轉染的穩(wěn)定表達熒光蛋白的綠色CH0-K1細胞，通過FACS分析分類的數(shù)量(％)直方圖。圖24:用哺乳動物表達載體pIRES2-EGFP、pIRES2-hAsGFP499、pIRES2-hAsGFP499(S103K)和pIRES2-hAsGFP499(S94T/S103K/R150K/S171N/K206R)和pIRES2-hAsGFP499(S94T/S103K/R150I/S171N/K206R)穩(wěn)定轉染的CH0-K1細胞，通過FACS分析的熒光強度直方圖。表中為熒光強度的總結。圖25:瞬時轉染哺乳動物融合載體pNFATcl-EGFP、pNFATcl-DsRed2、pNFATcl-hAsGFP499-Nl、pNFATcl-hAsGFP499(S103K)、pNFATcl-hAsGFP499(S94T/S103K/R150K/S171N/K206R)-N1和pNFATcl-hAsGFP499(S94T/S103K/R150I/S171N/K206R)-N1的HeLa細胞。圖26:離子霉素剌激后的HeLa細胞易位測定，HeLa細胞穩(wěn)定轉染哺乳動物融合載體pNFATcl-EGFP-Nl(使用Olympus1X70熒光顯微鏡獲取圖像)、穩(wěn)定轉染pNFATcl-hAsGFP499-Nl(使用Leica共聚焦顯微鏡獲取圖像)的。圖27:在存在鈣神經(jīng)素抑制劑、CsA和FK506時，離子霉素剌激后，穩(wěn)定轉染哺乳動物融合載體pNFATcl-hAsGFP499(S103K)-N1的HeLa細胞易位測定。使用Olympus1X70熒光顯微鏡獲取圖像。圖28:在存在鈣神經(jīng)素抑制劑、CsA和FK506時，ATP剌激后，穩(wěn)定轉染哺乳動物融合載體pNFATcl-hAsGFP499(S103K)-N1的HeLa細胞易位測定。使用Olympus1X70熒光顯微鏡獲取圖像。實施例1優(yōu)化AsGFP499以用于在哺乳動物細胞中的表達改變AsGFP柳野生型基因wtAsGFP柳(SEQIDN0°:10)密碼子使用，以適應高度表達的哺乳動物基因(SEQIDN0°:9)的密碼子偏倚。另外盡可能避免GC含量非常高(>80%)或非常低(<30%)的區(qū)域。為了有效起始翻譯，在起始密碼子上游引入Kozak共有序列(GENEART公司，雷根斯堡，德國)。實施例2克隆熒光蛋白以用于在細菌和哺乳動物細胞中的表達我們使用了以下的菌株基因型為(FmcrAA(mrr-hsdRMS-mcrBC)小801acZAM15AlacX74recAlaraA139A(ara-leu)7697galUgalKrpsL(Str"endAl皿pG)的ToplO(Invitrogen)，是由于其具有高轉化效率、降低的核酸內(nèi)切酶活性，以及質(zhì)粒傳播性；以及BL21-Gold(DE3)(Stratagene)株，其基因型為(大腸桿菌BF—ompThsdS(rBmB—)dcm+Tetrgal(DE3)endAHte)，對于蛋白的高表達和克隆程序都是理想的。為了獲得轉化效率高的感受態(tài)BL21-Gold(DE3)細胞，我們按照大腸桿菌脈沖轉化儀手冊(BioRad)中所述的標準流程制備和電轉化BL21-Gold(DE3)細胞。轉化效率使用pUC18DNA和pETDNA載體測定。細菌表達載體的克隆在PCR反應中，使用PfuDNA聚合酶(Roche，瑞士)，從載體pEGFP-Nl，pDsRed2-Nl(Clontech，美國)和pcDNA3-hAsGFP柳中擴增EGFP、DsRed2和hAsGFP柳(SEQIDN0°:9)的編碼序列，所述載體的引物對(PRI匪，意大利)側翼有酶切位點。將PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶(NewEnglandBiolabs)進行消化，并克隆入預切割的pET28a(+)載體(Novagen)中。然后將此載體轉化至電感受態(tài)BL21(DE3)Gold細菌中。細菌在卡那霉素LB/瓊脂上37t:生長過夜。使用倒置熒光顯微鏡(Olympus1X70)對熒光菌落進行視檢。哺乳動物表達載體的克隆我們在哺乳動物表達載體pcDNA3(Invitrogen)中克隆了優(yōu)化的wt-AsGFP499(hAsGFP499)及其突變體AsGFP499(S103K)的編碼序列，以比較其與未優(yōu)化版本的wt-AsGFP499在細胞中的熒光強度。我們用BamHI和Notl限制酶切位點取代了具有hAsGFP499及其突變體的編碼序列的pEGFP-Nl融合載體中的EGFP。為了研究NFATcl在與熒光蛋白(FP)融合過程中的穿梭行為，我們將NFATcl的編碼序列符合讀框地插入熒光蛋白(pcDNA3-NFATcl){Chin,1998#146}。hAsGFP499及其突變體作為FACS選擇標記物的適宜性通過用hAsGFP499及其突變體的編碼序列取代pIRES2-EGFP載體中的EGFP進行測試。然后將得到的載體轉化至化學感受態(tài)Top10細菌中。細菌在適當?shù)目股豅B/瓊脂上37°C生長過夜。至于質(zhì)粒生產(chǎn)，單個菌落在3mL包含適當抗生素的LB培養(yǎng)基中，在37°C、220rpm的振動條件下生長過夜。回收細菌沉淀后，用Mini-pr印試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒?？寺‘a(chǎn)品的精度用限制性內(nèi)切酶對DNA的消化檢測或通過交付測序進行檢測。我們在這里用于克隆的引物對(寡核苷酸)列于表1。表1在靶載體中用于AsGFP柳(SEQIDN0°:9)克隆的寡核苷酸pET28a(+)-Fw.:5，-CGGCAGCCATATGTACCCCAGCATCAAG-3，Ndel-限制位點，(SEQIDNO:18)pET28a(+)-Fw.:5，_GCGGATCCTTATCAATTGTGGCCCAG-3，BamHI-限制位點，(SEQIDNO:19)pRSETB-Fw.:5，-TAAGGATCCGATGTACCCCAGCATC-3，BamHI-限制位點，(SEQIDNO:20)pRSETB-Rev.:5'-CATGGTACCTCAATTGTGGCCCAG-3'KpnI-限制位點，(SEQIDNO:21)pcDNA3-Fw.:5，-CTTGGTACCATGTACCCCAGCATC-3，KpnI-限制位點，(SEQIDNO:22)pcDNA3-Rev.:5'-TAGAGTCGCGGCCGCTCAATTGTGcCCCAGCTTGC-3'NotI-限制位點；C代替G(發(fā)夾)(SEQIDNO:23)phAsGFP-Fw.:5'-CCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGTACCCCAGCATCAAG_3，BamHI-限制位點，(SEQIDNO:24)phAsGFP-Rev.:5'-TAGAGTCGCGGCCGCTCAATTGTGcCCCAGCTTGC-3'NotI-限制位點；C代替G(發(fā)夾)(SEQIDNO:25)pIRES2-Fw.:5，-TACCCCAGCATCAAGGAGACC-3，沒有起始密碼子(ATG)的hAsGFP柳(SEQIDNO:26)pIRES2-Rev.:5，-TAGAGTCGCGGCCGCTCAATTGTGcCCCAGCTTGC-3，NotI-限制位點；C代替G(發(fā)夾)(SEQIDNO:27)用于在phAsGFP499_Nl載體中克隆NFATcl的寡核苷酸NFATc1-Fw.:5'_GAGGTACCATGCCAAGCACCAGCTTTC-3'KpnI-限制位點，(SEQIDNO:28)NFATcl-Rev.:5，_CTGGATCCcgGAAAAAGCACCCCACGC-3'NFATcl的終止密碼子替換為GGATCCegBamHI-限制位點，(SEQIDNO:29)實施例3誘變定點誘變(SDM)技術是一種可控過程，其有意創(chuàng)建特定的基因突變，以研究對相關蛋白的影響。但是，當目的蛋白質(zhì)的晶體結構(例如在此處的情況為AsGFP499的結構)是未知的，定點突變就會具有挑戰(zhàn)性。既然GFP樣蛋白質(zhì)被認為享有相同的P-罐結構，我們利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，即GFP家族其它熒光蛋白和色素蛋白的序列和晶體結構，來預測AsGFP499寡聚化的關鍵殘基。s匿通過使用QuikChange定點誘變試劑盒(Stratagene)，并根據(jù)他們說明書進行操作。簡要概括如下，包含哺乳動物AsGFP499或其突變體的載體pET28a(+)使用PfuTurboDNA聚合酶、用匹配的突變引物對通過PCR進行完全合成(Roche，瑞士)。用DpnI除去親代模板，DpnI只選擇性消化甲基化和半甲基化DNA。隨后將由此產(chǎn)生的包含所需突變的帶切口的PCR載體轉化至電感受態(tài)BL21(DE3)Gold細菌中。所有的突變都通過測序確認。由于pET28a(+)不是隨機誘變的理想載體，使用載體pRSETB(Stratagene)。之前由SDM產(chǎn)生的突變體AsGFP499(S10;3K/RlS0E)和AsGFP499(S10I/TlSgK/Fn犯)用表1中給出的引物對(SEQIDN0:20和21)在限制位點BamHI/Kpnl之間再克隆。易錯PCR通過使用與上述相同的引物對用Genemorph試劑盒II(Stratagene){Miyazaki,2003#154}進行。具有帶切口PCR載體的轉化后的BL21(DE3)Gold細菌在氨芐青霉素LB/瓊脂板上37。C生長11過夜。將目的突變體再克隆進pET28a(+)載體。我們用于SDM的誘變引物對列于表2.表2用于定點誘變的寡核苷酸(粗體字母表示突變)S94T-Fw.:5，-GGGAGAGAGTGACCACCTACGAGGAC-3，(SEQIDNO:30)S94T-Rev.:5，-GTCCTCGTAGGTGGTCACTCTCTCCC-3，(SEQIDNO:31)E97G-Fw.:5，-GAGTGAGCACCTACGGCGACGGCGGCGTG-3，(SEQIDNO:32)E97G-Rev.:5'-CACGCCGCCGTCGCCGTAGGTGCTCACTC-3'(SEQIDNO:33)S103K-Fw.:5，-GGCGGCGTGCTGAAGGCCACCCAGGAG-3，(SEQIDNO:34)S103K-Rev.:5，-CTCCTGGGTGGCCTTCAGCACGCCGCC-3'(SEQIDNO:35)R150E-Fw.:5'-ACCGTGATCCCCGAGGATGGCGGCCTG-3'(SEQIDNO:36)R150E-Rev.:5'-CAGGCCGCCATCCTCGGGGATCACGGT-3'(SEQIDNO:37)R157G-Fw.:5，—GCCTGCTGCTGGG,CGACACCCCTGCC—3，(SEQIDNO:38)R157G-Rev.:5，-GGCAGGGGTGTCGCCCAGCAGCAGGC-3'(SEQIDNO:39)T159K-Fw.:5'-TGCTGCTTAGAGACAAACCTGCCCTCATGC-3'(SEQIDNO:40)T159K-Rev.:5，-GCATGAGGGCAGGTTTGTCTCTAAGCAGCA-3，(SEQIDNO:41)T159A-Fw.:5，-TGCTGCTTAGAGACGCACCTGCCCTCATGC-3，(SEQIDNO:42)T159A-Rev.:5，-GCATGAGGGCAGGTGCGTCTCTAAGCAGCA-3，(SEQIDNO:43)S171A-Fw.:5，-CGGCGGCCACCTaGCATGCTTTATGGAGAC-3，(SEQIDNO:44)S171A-Rev.:5'-GTCTCCATAAAGCATGCtAGGTGGCCGCCG-3'(SEQIDNO:45)F173H-Fw.:5，-CACCTGAGCTGCCACATGGAGACCACC-3'(SEQIDNO:46)F173H-Rev.:5，-GGTGGTCTCCATGTGGCAGCTCAGGTG-3，(SEQIDNO:47)F173A-Fw.:5，-CACCTGAGCTGCGCCATGGAGACCACC-3'(SEQIDNO:48)F173A-Rev.:5，-GGTGGTCTCCATGGCGCAGCTCAGGTG-3'(SEQIDNO:49)F173E-Fw.:5，-CACCTGAGCTGCGAGATGGAGACCACC-3，(SEQIDNO:50)F173E-Rev.:5，-GGTGGTCTCCATCTCGCAGCTCAGGTG-3'(SEQIDNO:51)實施例4蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和純化挑選熒光菌落，在搖床上于2mL包含適當抗生素的液體LB培養(yǎng)基中37。C生長過夜。將5mL新鮮培養(yǎng)基接種過夜細菌培養(yǎng)物并生長至Ae。。為0.6-0.8。熒光蛋白的表達通過在23、30或37°C(溫度選擇取決于突變體)時增加IPTG至0.5mM而誘導。在過夜孵育細胞后，將小等分(50uL)懸浮液轉移至96孔板(MTP)中進行熒光測量(Safire2，Tecan)，以確定適當?shù)牡鞍踪|(zhì)產(chǎn)量和/或光譜遷移的變種。離心4mL培養(yǎng)物，然后將沉淀用加入30mMpH8的Tris-HCl、300mMNaCl、10iig/mLDNAse和無EDTA的蛋白酶抑制劑(BoehringerMannheim，德國)200iiLBPER-II(Pierce)溶液裂解。最后將細菌裂解液離心，將上清液用偽天然SDS-PAGE分析{Baird,2000#35}。為了大規(guī)模純化蛋白質(zhì)，在200mL包含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中接種熒光細菌的過夜培養(yǎng)物，并且在371:生長直至006。。達到0.6-0.8。蛋白質(zhì)生成由500iiMIPTG誘導。樣品根據(jù)上面的描述進行裂解和離心，然后用AKTAexplorer100(GEHealthcare)進行蛋白質(zhì)純化。將上清液上樣至lmLHis-Tr即柱(GEHealthcare)。這些包含與固定Ni2+離子結合的his標記蛋白質(zhì)的柱子用包含不同咪唑濃度(10-400mM)的10mMTris-HCl+150mMNaClpH8緩沖液進行多步驟程序洗滌。在蛋白質(zhì)洗脫后，咪唑緩沖液通過Amicon10過濾元件對于10mMTris-HCl+150mMNaClpH7.4溶液進行交換。蛋白質(zhì)濃度通過使用BCA測定試劑盒(Pierce)確定并進一步用于生化表征。實施例5SDS-PAGE加熱(SDS-PAGE)或不加熱的(偽天然SDS-PAGE)的蛋白質(zhì)樣品與包含200mMDTT的5xSDS樣品緩沖液以1:5的比例混合，并上樣至16XTris-甘氨酸凝膠(Invitrogen)上，然后在pH8于lxTris-甘氨酸-SDS緩沖液中分離。使用預染色的SeaBlueplus2(Invitrogen)和(His6)標記的DsRed2(四聚體)和EGFP(單體)作為蛋白質(zhì)重量標記物。分離后，凝膠用紫外線照亮，以確定熒光帶，然后用考馬斯亮藍染色。染色凝膠在圖1和圖2中顯示。結果與結論野生型AsGFP499作為四聚體遷移，其分子量〉64kDa(圖2A泳道4)。相反的，AsGFP499(S103K)作為二聚體遷移，其分子量《50kDa，并且顯示有微弱的向更低分子量方向的蛋白質(zhì)拖尾(圖2A泳道5)。突變體AsGFP499(S103K/T159K/F173E)、AsGFP499(S94T/13S103K/T159K/F173E)和AsGFP499(S94T/S103K/R150I/S171N/K206R)具有與單體EGFP可比較的遷移(圖2A泳道3、6、7和10)，與單體蛋白質(zhì)的預計理論分子量"28kDa相符，證實了突變體為單體變種。AsGFP499(S103/R150E)和AsGFP499(S103/F173E)具有部分單體特征(圖2A泳道8和圖1A泳道4)。二聚體高度的條帶在紫外線照射下有明顯的熒光。隨機突變體AsGFP499(S94T/S103K/R150K/S171N/K206R)觀察不到清晰的條帶(圖2A泳道9)，從二聚體高度到單體高度可見蛋白質(zhì)拖尾，這說明有部分單體特征。將蛋白質(zhì)樣品在上樣到凝膠前進行加熱，則見不到熒光條帶。在用考馬斯亮藍染色以后，分子量>22kDa的單體蛋白質(zhì)條帶可以被檢測到(圖1B和2B)。實施例6光譜研究熒光光譜在室溫下使用TECANSafire2分光熒光計獲取，固定發(fā)射波長為499nm，測量350nm到490nm范圍內(nèi)的激發(fā)掃描，固定激發(fā)波長為400和483nm，測量450nm到600范圍內(nèi)的發(fā)射掃描。結果與結論所有的熒光蛋白的激發(fā)光譜都有兩個Amax(圖3-9)。第一個峰在400nm，第二個峰在483nm。400nm的激發(fā)峰是發(fā)色基團質(zhì)子化狀態(tài)的結果，483nm的激發(fā)峰是發(fā)色基團去質(zhì)子化狀態(tài)的結果{NienhauS，2006#170}。與野生型蛋白質(zhì)比較，突變體具有改進的光譜特性。它們利于去質(zhì)子化狀態(tài)。單體突變體AsGFP499(S103K+T159K+F173E)似乎利于兩個過渡態(tài)(圖10)。實施例7體積排阻色譜(SEC)純化的(His6)標記的熒光蛋白的表觀分子量通過在連接到AKTAexplorer100(GEHealthcare)的預校準的Superdex200HR10/30柱(GEHealthcare)上使用SEC進行測定。使用UV-900檢測器同時在三個波長(280,400和480)記錄吸收。100yL純化的蛋白質(zhì)溶液(2mg/mL)在pH為8的包含200mMNaCl的10mMTris緩沖液中分離，流速為0.5mlVmin。結果與結論SEC實驗表明，所有過濾的突變體和EGFP的體積要小于野生型蛋白質(zhì)和DsRed2(圖11-21)，從而表現(xiàn)出二聚體和/或單體性質(zhì)。在偽天然SDS-PAGE上顯示有二聚體和單體的條帶或蛋白質(zhì)拖尾的突變體AsGFP499(S103/R150E)和AsGFP499(S94T/S103K/R150K/S171N/K206R)在這里被分離開，并且似乎以部分單體存在。令人驚訝的是，在偽凝膠上作為單體遷移的AsGFP499(S94T/S103K/R150I/S171N/K206R)，顯示類似的洗脫性質(zhì)，表明在此也有二聚體和單體的存在(圖17-19)?？赡茉谝欢ǖ牡鞍踪|(zhì)濃度時，這些蛋白質(zhì)就趨向于二聚化，就像對源自維多利亞多管發(fā)光水母野生型GFP所報告一樣。洗脫體積和計算的表觀分子量總結在下面的表3中表314<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例8哺乳動物細胞轉染CH0-K1細胞用于克隆進pcDNA3或pIRES2載體的熒光蛋白的表達。細胞使用FuGENES6試劑(Roche)進行轉染。在轉染8小時后，細胞內(nèi)瞬時表達的熒光蛋白可通過倒置顯微鏡1X70(Olympus)觀察到。穩(wěn)定表達熒光蛋白的細胞通過FACS(Becton和Dickinson)分類，并至少在培養(yǎng)物中保持3個月。HeLa細胞用于克隆進含有hAsGFP499或其突變體的融合載體的NFATc1的表達。細胞轉染如上所述。24小時以后，細胞內(nèi)瞬時表達的融合蛋白可通過倒置顯微鏡1X70(Olympus)觀察到。選出2mg/ml抗生素抗藥性克隆，并保持在0.8mg/mL慶大霉素(G418)中。穩(wěn)定表達融合蛋白的細胞在前一天用組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA(TrichostatinA，Sigma-Aldrich)處理，以增強基因表達和用于FACS分類。結果與結論穩(wěn)定轉染pcDNA3-AsGFP499(S103K)的CH0-K1細胞似乎要比wt-AsGFP499和hAsGFP499具有更多熒光(圖22)。顯然，在細胞中哺乳動物版hAsGFP499要比野生型wt-AsGFP499高表達。但是如果我們比較突變體hAsGFP499(S103K)和哺乳動物版hAsGFP499，則似乎突變體具有更多熒光。我們認為可能是其更多表達、更溶于水，或是其量子產(chǎn)率比hAsGFP499高。FACS分類結果(圖23和24)顯示，與hAsGFP499相比，突變體更適合作為選擇標記物。穩(wěn)定表達哺乳動物載體pIRES2-hAsGFP(S103K)、pIRES2-hAsGFP(S94T/S103K/R150K/S171N/K206R)和pIRES2-hAsGFP(S94T/S103K/R150I/S171N/K206R)的CHOKl細胞顯示，分類后細胞的數(shù)量比表達hAsGFP499蛋白質(zhì)的細胞高3-10倍。而且如果我們比較其熒光強度，突變體似乎比hAsGFP499具有更多熒光(圖24)。瞬時表達融合蛋白NFATcl-DsRed2和NFATcl-AsGFP499的HeLa細胞顯示在細胞質(zhì)中聚集(圖25)。相反，突變體與EGFP顯示相似的分布模式。在這些細胞中，融合蛋白均勻地分散在細胞質(zhì)中。就像以前報導的那樣，寡聚的熒光蛋白在與靶蛋白融合中能夠改變它們的生理定位。雖然我們的突變體顯示二聚體和部分單體的特征，NFATcl的定位似乎沒受到它們的影響。實施例9NFATcl與熒光蛋白融合的易位測定第一天，用TSA處理穩(wěn)定表達融合蛋白的HeLa細胞，第二天，在存在或不存在鈣神經(jīng)素(CaN)抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)(Sigma-Aldrich)或FK506(Sigma-Aldrich)的情況下，用離子霉素(Sigma-Aldrich)或ATP(Sigma-Aldrich)剌激細胞。我們使用共聚焦顯微鏡監(jiān)測NFATcl的易位，或是使用倒置熒光顯微鏡1X70(Olympus)獲取圖像。細胞內(nèi)f丐離子水平的增加會剌激NFATcl{Rao，1997#50}從細胞質(zhì)易位到細胞核。作為陽性對照，我們使用融合NFATcl的EGFP。就像在瞬時表達(圖25)中那樣，穩(wěn)定表達的融合蛋白很好地分布在細胞質(zhì)中。在用1PM離子霉素剌激后，融合產(chǎn)品易位到細胞核中(圖26)。這個過程需要大約20分鐘。但是表達帶有hAsGFP499的融合蛋白的細胞顯現(xiàn)聚集。在用1PM離子霉素剌激后沒有可見易位(圖26)。穩(wěn)定表達融合蛋白NFATcl-hAsGFP499(S103K)的HeLa細胞顯示為在細胞質(zhì)中均勻分布。使用1PM離子霉素或100iiMATP剌激會導致NFATcl向細胞核易位。為了測試是否由于NFATcl發(fā)生易位，我們提前1小時使用5iiM的抑制劑CsA或FK506孵育細胞，然后將處理過的細胞再用1PM離子霉素或100iiMATP孵育。即使存在剌激物，兩種抑制劑都能完全阻斷融合蛋白的易位(圖27和28)。試劑所有其他化學品都來自標準來源，都為試劑級或更好等級。參考文獻1.Wiedenma皿，J.;Elke，C.;Spindler，K.D.;F皿ke，W.Cracksinthebeta-can:fluorescentproteinsfromAnemoniasulcata(Anthozoa，Actinaria).ProcNatlAcadSciUSA2000,97，14091-6.2.Nienhaus，K.;Renzi，F(xiàn).;Vallone，B.;Wiedenmann，J.;Nienhaus，G.U.Chromophore—proteininteractionsintheanthozoangreenfluorescentproteinasFP499.BiophysJ2006，91，4210-20.3.Johnson,F.H.;Gershman，L.C.;Waters，J.R.;Reynolds，G.T.;Saiga，Y.;Shimomura，0.QuantumefficiencyofCypridinaluminescence，withanotethatofAequorea.JCellCompPhysiol1962,60,85-104.4.Morin，J.G.;Hastings，J.W.Energytransferinabioluminescentsystem.JCellPhysiol1971，77，313-8.5.Wampler，J.E.;Hori，K.;Lee，J.W.;Cormier，M.J.Structuredbioluminescence.Twoemittersduringboththeinvitroandtheinvivobioluminescenceoftheseapansy，Renilla.Biochemistry1971，10，2903—9.6.Morin，J.G.;Reynolds，G.T.ThecellularoriginofbioluminescenceinthecolonialhydroidObelia.BiolBull1974，147，397—410.7丄abas，Y.A.;Gurskaya，N.G.;Yanushevich，Y.G.;Fradkov，A.F.山ukyanov，K.A.;Lukyanov，S.A.;Matz，M.V.Diversityandevolutionofthegreenfluorescentproteinfamily.ProcNatlAcadSciUSA2002，99，4256-61.8.Matz，M.V.;Fradkov，A.F.;Labas，Y.A.;Savitsky，A.P.;Zaraisky，A.G.;Markelov，M丄；Lukyanov，S.A.FluorescentproteinsfromnonbioluminescentAnthozoaspecies.NatBiotechno11999，17,969-73.9丄ukya麗，K.A.;Fradkov，A.F.;Gurskaya，N.G.;Matz，M.V.;Labas，Y.A.;Savitsky，A.P.;Markelov，M.L.;Zaraisky，A.G.;Zhao，X.;Fang，Y.;Tan，W.;Lukyanov，S.A.NaturalanimalcolorationcanBedeterminedbyanonfluorescentgreenfluorescentproteinhomolog.JBiolChem2000，275，25879-82.10.Gurskaya，N.G.;Fradkov，A.F.;Terskikh，A.;Matz，M.V.;Labas，Y.A.;Martynov，V.I.;Yanushevich，Y.G.丄ukyanov，K.A.丄ukyanov，S.A.GFP—likechromoproteinsasasourceoffar—redfluorescentproteins.FEBSLett2001,507，16-20.ll.Heim，R.;Prasher，D.C.;Tsien，R.Y.Wave1engthmutationsandposttranslationalautoxidationofgreenfluorescentprotein.ProcNatlAcadSciUSA1994,91，12501-4.12.Cubitt，A.B.;Heim，R.;Adams，S.R.;Boyd，A.E.;Gross，L.A.;Tsien，R.Y.Understanding,improvingandusinggreenfluorescentproteins.TrendsBiochemSci1995,20,448-55.13.Reid，B.G.;Flynn，G.C.Chromophoreformationingreenfluorescentprotein.Biochemistry1997，36，6786_91.14.Biron，K.Fireflies,DeadFishandaGlowingBunny:aprimeronBioluminescence.BioTeachOnline2003，1，19_26.15.Davenport,D.;Nicol，J.A.C.LuminescenceinHydromedusae.ProceedingsoftheRoyalSocietyofLondon.SeriesB，BiologicalSciences1955，144，399_411.16.Shimomura，0.;Johnson，F(xiàn).H.;Saiga，Y.Extraction,purificationandpropertiesofaequorin，abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea.JCellCompPhysiol1962，59，223-39.17.Morise，H.;Shimomura，0.;Johnson,F.H.;Winant，J.IntermolecularenergytransferinthebioluminescentsystemofAequorea.Biochemistry1974，13，2656—62.18.Prendergast，F(xiàn).G.;Mann，K.G.ChemicalandphysicalpropertiesofaequorinandthegreenfluorescentproteinisolatedfromAequoreaforskalea.Biochemistry1978，17，3448—53.19.Prasher，D.C.;Eckenrode，V.K.;Ward，W.W.;Prendergast，F(xiàn).G.;Cormier，M.J.PrimarystructureoftheAequoreavictoriagreen_fluorescentprotein.Gene171992，111,229-33.20.Chalfie，M.;Tu，Y.;Euskirchen，G.;Ward，W.W.;Prasher，D.C.Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression.Science1994，263，802_5.21.Cody，C.W.;Prasher，D.C.;Westler，W.M.;Prendergast，F(xiàn).G.;Ward，W.W.ChemicalstructureofthehexapeptidechromophoreoftheAequoreagreen-fluorescentprotein.Biochemistry1993，32，1212_8.22.O擺，M.;Cubitt，A.B.;Kallio，K.;Gross，L.A.;Tsien，R.Y.;Remington，S.J.CrystalstructureoftheAequoreavictoriagreenfluorescentprotein.Science1996，273，1392-5.23.Yang，F(xiàn).;Moss，L.G.;Phillips，G.N.，Jr.Themolecularstructureofgreenfluorescentprotein.NatBiotechnol1996，14，1246—51.24.Tsien，R.Y.Thegreenfluorescentprotein.A皿uRevBiochem1998，67，509-44.25.Kendall,J.M.;Badminton，M.N.Aequoreavictoriabioluminescencemovesintoanexcitingnewera.TrendsBiotechno11998，16，216_24.26.Baird，G.S.;Zacharias，D.A.;Tsien，R.Y.Biochemistry,mutagenesis,andoligomerizationofDsRed，aredfluorescentproteinfromcoral.ProcNatlAcadSciUSA2000,97，11984-9.27.Verkhusha，V.V.;Lukyanov，K.A.ThemolecularpropertiesandapplicationsofAnthozoafluorescentproteinsandchromoproteins.NatBiotechnol2004,22,289-96.28.Sambrook，J.;Russell，D.W.MOLECULARCLONINGALAB0RAT0RYMANUAL2ed.;ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989.29.Chudakov，D.M.;Lukyanov，S.;Lukyanov，K.A.Fluorescentproteinsasatoolkitforinvivoimaging.TrendsBiotechnol2005，23，605_13.30丄icha，K.;01brich，C.Opticalimagingindrugdiscoveryanddiagnosticapplications.AdvDrugDelivRev2005，57，1087—108.31.Weissleder，R.Scalingdownimaging:molecularmappingofcancerinmice.NatRevCancer2002,2，11-8.32.Campbell,R.E.;Tour，0.;Palmer，A.E.;Steinbach，P.A.;Baird，G.S.;Zacharias，D.A.;Tsien，R.Y.Amonomericredfluorescentprotein.ProcNatlAcadSciUSA2002，99，7877-82.33.Yarbrough，D.;Wachter，R.M.;Kallio，K.;Matz，M.V.;Remington，S.J.RefinedcrystalstructureofDsRed，aredfluorescentproteinfromcoral，at2.O-Aresolution.ProcNatlAcadSciUSA2001，98，462_7.34.Miyazaki，K.Creatingrandommutagenesislibrariesbym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