專利名稱：新型肽酶底物的制作方法
新型肽酶底物本發(fā)明涉及用于檢測肽酶活性的新型酶底物。這些底物可用于包括產(chǎn)生物理化 學(xué)信號的酶水解步驟的應(yīng)用，尤其用于微生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、組 織學(xué)等中。本發(fā)明還涉及含有該底物的反應(yīng)介質(zhì)、該底物或該介質(zhì)在檢測肽酶活性和/ 或區(qū)分革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌中的用途、以及使用方法。當(dāng)前存在非常多的檢測微生物的介質(zhì)。該檢測可以尤其基于使用特別的底物， 所述底物對需要檢測的微生物酶具有特異性。通常而言，合成的酶底物由對待發(fā)現(xiàn)的酶 活性具有特異性的第一部分和用作標(biāo)簽(通常為發(fā)色或熒光標(biāo)記)的第二部分。因此， 在細(xì)菌的情況下，取決于是否有反應(yīng)來選擇底物，可以表征微生物的性質(zhì)。肽酶活性可 以尤其用于發(fā)現(xiàn)一組、一種或一類細(xì)菌。因此，例如丙胺酸氨基肽酶可以區(qū)分革蘭氏陰 性菌和革蘭氏陽性菌。用于檢測肽酶活性的發(fā)色的酶底物由現(xiàn)有技術(shù)已知。尤其可以提及Manafi發(fā) 表的論文(Manafi等，Microbiol Rev 55 (3) 335-348，1991)，這是一篇關(guān)于用于微生物 學(xué)的酶底物的綜述。然而，所述的氨基肽酶底物通過水解會釋放在介質(zhì)中擴(kuò)散的化合物 (β “萘基胺，7-氨基-4-甲基香豆素)。結(jié)果導(dǎo)致在多相反應(yīng)介質(zhì)(培養(yǎng)皿上的菌落、 組織部分等)中，無法準(zhǔn)確定位水解的位置。還可以提及在由本申請人提交的專利申請 \^0 98/04735和\^099/38995中描述的底物。然而，雖然這些底物不在培養(yǎng)介質(zhì)中大量 擴(kuò)散，但是它們也具有一些缺點(diǎn)它們難以合成，純度低，產(chǎn)率低且它們對某些微生物 有毒。為此，本發(fā)明提出了用于檢測微生物的新型肽酶底物。與現(xiàn)有的底物相比，這 些新型的底物易于合成，且由于其形成一種不在反應(yīng)介質(zhì)中擴(kuò)散的顏色而可以尤其用于 膠體介質(zhì)中以檢測微生物。由此，可以從不顯示肽酶活性的菌落或細(xì)胞器中，辨別顯示 肽酶活性的菌落或細(xì)胞器。在對本發(fā)明進(jìn)行描述之前，給出如下定義以方便本發(fā)明的公開。術(shù)語“酶底物”用于指可以通過酶進(jìn)行水解以形成產(chǎn)物，從而允許微生物細(xì)胞 或細(xì)胞器的直接或間接檢測的底物。該底物尤其包含對待發(fā)現(xiàn)的酶活性具有特異性的第 一部分和用作標(biāo)簽的第二部分。本發(fā)明的底物尤其適用于流式細(xì)胞術(shù)，這是因?yàn)樗猱a(chǎn)物主要保留在表達(dá)酶活 性的細(xì)胞中，所以可以具體數(shù)出表達(dá)該活性的細(xì)胞或者甚至將其與其他樣品分開。本發(fā)明的底物還高度適用于組織酶學(xué)，這是因?yàn)樗猱a(chǎn)物主要保留在水解點(diǎn) 上，所以可以具體識別出在組織中表達(dá)該活性的細(xì)胞或細(xì)胞器。由于其具有低毒性，本發(fā)明的底物高度適于監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)肽酶的活性。本發(fā)明的底物還非常適合用于檢測和/或識別介質(zhì)中，這是因?yàn)樗鼈冃纬稍诜?應(yīng)介質(zhì)中不擴(kuò)散的顏色或熒光。在本申請中，術(shù)語“顏色”用于指顏色，其吸收可見光 譜中的光或熒光，其在一個(gè)波長(Aat)吸收且在較高的波長(λ_，Aem> λ J發(fā)光。本發(fā)明的底物可以成鹽，即呈諸如為氯化物、溴化物、鉀鹽或三氟乙酸鹽的鹽 的形式。
術(shù)語“Μ”用于指能夠通過水解而斷裂出酰胺基的酶，其中所述酰胺基在肽 酶的?；鶜埢筒分g形成。術(shù)語“氨某flt_”用于指能夠通過水解而斷裂出酰胺基 的酶，其中所述酰胺基在氨基酸?；筒分g形成。在本申請中，術(shù)語“肽酶”在適 當(dāng)情況下可以指上述的肽酶以及氨基肽酶。術(shù)語“肽”用于指包含1-10個(gè)氨基酸，優(yōu)選1-4個(gè)氨基酸的肽鍵鏈。優(yōu)選， 所述肽為二-丙胺酸或三-丙胺酸。術(shù)語“氨基酸”用于指任何為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的天然或非天然氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，氨基酸為丙胺酸或L-丙 胺酸，或者為甘氨酸、焦谷氨酰等。所述肽可以包含在其N末端上的封端劑。本發(fā)明的封端劑包含任何為本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的能夠保護(hù)胺的封端劑。例如可以提及叔丁氧基羰基(N-tBOC)、9-芴基氧 羰基、助溶劑如琥珀酰，或者不可代謝的氨基酸，即非天然的氨基酸如哌可酸,或者氨 基酸的D形式如D-苯基丙胺酸。所述封端劑并不系統(tǒng)地存在于本發(fā)明的化合物中。術(shù)語“烷基”用于指基于飽和烴基團(tuán)的鏈,尤其例如C1-C6烷基，即含有1-6個(gè) 碳原子的直鏈或支鏈烷基。例如可以提及甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、 戊基、異戊基及己基。術(shù)語“M”用于指由芳環(huán)衍生的官能團(tuán)(或取代基)，例如C6-Cltl芳環(huán)，尤 其為苯基、芐基、1-萘基或2-萘基。術(shù)語“遨基”尤其指由經(jīng)由一個(gè)雙鍵而與第一個(gè)氧原子連接且經(jīng)由一個(gè)單鍵而 與第二個(gè)氧原子相連的碳原子組成的官能團(tuán)，其中所述第二個(gè)氧原子為電負(fù)性或者與氫 原子相連接。取決于分子的pKa以及介質(zhì)的pH，所述羧基可以呈離子化的形式，即第二 個(gè)氧原子未連接H，則其為電負(fù)性。術(shù)語“反應(yīng)介質(zhì)”用于指包含表達(dá)細(xì)胞或細(xì)胞器的新陳代謝和/或微生物生長 所需的所有成分的介質(zhì)。該反應(yīng)介質(zhì)可以用于流式細(xì)胞術(shù)、組織酶學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)等，或 者用作微生物檢測和/或識別介質(zhì)。所述反應(yīng)介質(zhì)可以包含一種成分或多種組合成分，例如氨基酸類、蛋白胨、 烴、核苷酸、礦物質(zhì)、維生素、抗體、表面活性劑、緩沖溶液、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽或
金屬鹽類。所述介質(zhì)還可以包含著色劑。例如作為著色劑可以提及伊文思藍(lán)、中性紅、羊 血、馬血、遮光劑例如氧化鈦、硝基苯胺、孔雀綠、亮綠等。所述反應(yīng)介質(zhì)可以為固體、半固體或液體。術(shù)語“固體介質(zhì)”用于例如指凝膠 化的介質(zhì)。瓊脂在微生物學(xué)中為用于培養(yǎng)微生物的常規(guī)凝膠劑，但是可以使用明膠或瓊 脂糖。有些制品是可商購獲得的，例如哥倫比亞瓊脂、胰酪蛋白胨大豆瓊脂、麥康基瓊 脂、沙鮑洛瓊脂，或者更通常而言描述于Microbiological Media(CRCPress)手冊中的那些。所述反應(yīng)介質(zhì)可以為“檢測和/或識別介質(zhì)”，即顯影介質(zhì)或培養(yǎng)及顯影介 質(zhì)。在第一種情況下，在接種之前培養(yǎng)微生物，并且在第二種情況下，檢測和/或識別 介質(zhì)還構(gòu)成培養(yǎng)介質(zhì)。術(shù)語“牛物樣品”用于指由生物流體試樣衍生的臨床樣品，或者由任何類型食 品衍生的食品樣品。該樣品因此可以為液體或者固體，而且可以沒有限制性地提及血
權(quán)利要求
1. 一種具有下式⑴的用于檢測肽酶活性的酶底物
2.權(quán)利要求1所述的酶底物，其中 X為 O ； Rl禾口 R2不存在； P為肽。
3.權(quán)利要求1所述的酶底物，其中 X為 O ； Rl 為 Cl ； R2不存在； P為肽。
4.權(quán)利要求1所述的酶底物，其中 X為 S ； Rl不存在； R2不存在； P為肽。
5.權(quán)利要求1所述的酶底物，其中 X為 S ； Rl不存在； R2 為 Cl ； P為肽。
6.一種包含至少一種權(quán)利要求1-5中任一所述的酶底物的反應(yīng)介質(zhì)。
7.一種包含至少一種權(quán)利要求1-5中任一所述的酶底物的微生物檢測和/或識別介質(zhì)。
8.權(quán)利要求7所述的檢測介質(zhì)，其還包含至少一種對與通過權(quán)利要求1-5任一所述的 底物所檢測到的酶活性不同的酶活性具有特異性的其他酶底物。
9.權(quán)利要求7或8所述的檢測介質(zhì)，其還包含至少一種對通過權(quán)利要求1-5任一的底 物所檢測到的酶活性具有特異性的其他酶底物。
10.權(quán)利要求1-5中任一所述的酶底物或者權(quán)利要求7-9中任一所述的檢測和/或識 別介質(zhì)用于檢測微生物中的至少一種肽酶活性的用途。
11.權(quán)利要求1-5中任一所述的酶底物或者權(quán)利要求7-9中任一所述的檢測和/或識 別介質(zhì)用于分離革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的用途。
12.一種檢測微生物中的至少一種肽酶活性的方法，其特征在于其包含如下步驟a)提供權(quán)利要求7-9中任一所述的檢測和/或識別介質(zhì)，b)以待測試的生物樣品接種所述介質(zhì)，c)對其進(jìn)行溫育，并且d)發(fā)現(xiàn)至少一種肽酶活性的存在。
13.—種區(qū)分細(xì)菌屬于革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌的方法，其特征在于其包含如下 步驟a)提供權(quán)利要求7-9中任一所述的檢測和/或識別介質(zhì)，b)以待測試的生物樣品接種所述介質(zhì)，c)對其進(jìn)行溫育，并且d)發(fā)現(xiàn)至少一種肽酶活性的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有下式(I)的用于檢測微生物中肽酶活性的酶底物，其中□X為S、NX1、O或NX1-CO；□R1不存在或者為如下取代基之一Cl、Br、F、I、OH或烷基、芳基或羧基；□R2不存在或?yàn)槿缦氯〈籆l、O-CH2-O、O-CH3、F、二亞乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、OH、烷基、芳基或羧基、NO2-CO2Hα；□X1選自H、C2H4Ph、OH、烷基和芳基；□R3和R4獨(dú)立地為H或者含有1-4個(gè)碳原子的烷基；P為肽；
文檔編號C07D277/66GK102016061SQ200880018135
公開日2011年4月13日 申請日期2008年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日
發(fā)明者A·詹姆斯, O·法布雷加, S·斯坦福斯, S·歐倫加, V·L·薩爾瓦圖拉 申請人:生物梅里埃公司