專利名稱：：免疫球蛋白純化的制作方法免疫球蛋白純化本發(fā)明屬于多肽純化領域。報導了通過將溶液中的免疫球蛋白從雜質，尤其是從免疫球蛋白聚合形式(aggregatedform)分離而提供免疫球蛋白單體形式的方法。背景纟支術蛋白質，尤其;UL疫球蛋白在當今的醫(yī)學領域中起著重要作用。對于人的應用，每一種治療蛋白質必須滿足獨特的標準。為確保生物藥劑對人的安全性，尤其要除去可導致嚴重傷害的核酸、病毒和宿主細胞蛋白質。為滿足這些質量管理規(guī)格標準，必須在生產過程之后進行一個或多個純化步驟。其中，純度、生產量和產量在確定合適的純化方法中起著重要作用。已良好地建立不同的方法并且已將其廣泛地用于蛋白質的純化，例如使用^:生物蛋白質的親和層析(例如A蛋白或G蛋白親和層析)、離子交換層析(例如，陽離子交換(磺丙基樹脂或羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合模式的離子交換)、親硫吸附(例如使用P-巰基乙醇和其他SH配體)、疏水性相互作用或芳香族化合物吸附層析(例如使用苯基-瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-親和材料)、大小排阻層析和電泳方法(例如凝膠電脈、毛細管電泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。Necina,R.等人，Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698報導了通過表現(xiàn)為高電荷密度的離子交換介質從細胞培養(yǎng)物上清液直接捕獲人單克隆抗體。在WO89/05157中，報導了通過直接對細胞培養(yǎng)基進行陽離子交換處理以純化產物免疫球蛋白的方法。Danielsson，A.等人，J.Immun.Meth.115(1988)，79-88描述了從小鼠腹水一步純化單克隆IgG抗體的方法。Mhatre，R.等人，(J.Chrom.A707(1995)225-231)探究了通過陽離子交換層析和pH梯度洗脫對抗體Fab片段進行純化。WO94/00561報導了人單克隆抗獼猴抗體和產生該抗體的細胞系。在WO2004/024866中報導了通過離子交換層析純化多肽的方法，其中使用梯度洗滌從一種或多種污染物中分離出目的多肽。Schwarz，A.等人(Laborpraxis21(1997)62-66)報導了使用CM-HyperD-柱對單克隆抗體的純化。WO2004/076485報導了使用A蛋白和離子交換層析進行抗體純化的方法。在EP0530447中報導了通過組合三個層析步驟純化IgG單克隆抗體的方法。在US4,983,722中報導了從抗體制品中除去A蛋白。重組單克隆抗體方法常使用陰離子交換層析來結合痕量級雜質和潛在污染物(如DNA、宿主細胞蛋白質和病毒)，而容許蛋白質流通(Knudsen，H丄.，等人，J.Chrom.A907(2001)145-154)。WO95/16037報導了通過A蛋白陽離子交換層析進行的從雜種雜交瘤純化抗EGF-R/抗-CD3雙特異性單克隆抗體。在EP1084136中報導了通過使用離子交換層析從抗體多聚體分離其單體。US5,429,746涉及使用疏水作用層析組合層析來純化抗體分子蛋白質。在US4，604，208中報導了用來進行流體過濾，尤其是進行帶電荷的微粒污染的腸胃外液體或生物液體過濾的陰離子修飾微孔膜。WO03/040166報導了設計用于除去包含蛋白質的流體中的痕量雜質的膜和裝置。在US6,716,598中報導了回收多肽的方法。在US2006/0194953中報法,發(fā)明簡述本發(fā)明包含免疫球蛋白純化領域的多個方面。一方面是純化免疫球蛋白的方法，其包括在免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的M6下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陽離子交換材料，并在與陽離子交換材料接觸后從溶液回收免疫球蛋白單體形式的步驟。在一個實施方案中，該步驟是以流通模式進行的層析步驟。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括陽離子交換步驟之前或之后的進一步的步驟，其是在免疫球蛋白不結合至陰離子交換材料的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和/或聚合形式的緩沖水溶液用于陰離子交換材料，并從陰離子交換材料的流通液(flow-through)回收免疫球蛋白。在一個實施方案中，該步驟是以流通模式進行的層析步驟。在另一實施方案中，本發(fā)明的方法包括陰離子交換步驟之前或之后的進一步的步驟，其是在免疫球蛋白結合至親和柱的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖7jc溶液用于親和柱，并從親和柱回收免疫球蛋白單體形式和聚合形式。在一個實施方案中，該步驟是以結合-和-洗脫模式進行的層析步驟。在本發(fā)明發(fā)法的另一實施方案中包括作為陽離子交換步驟的方法，其包括在免疫球蛋白單體形式不結合至膜陽離子交換材料的條件下，將包含免疫J求蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于膜陽離子交換材料，并從膜陽離子交換材料的流通液回收免疫球蛋白單體形式的步驟。在一個實施方案中，該陽離子交換材料M陽離子交換材料。在另一實施方案中，膜陽離子交換材料是MustangS、MustangC、SartobindS或SartobindC。在另一實施方案中，膜陽離子交換材料是用磺酸基團或羧甲基基團修飾的基于聚醚砜的膜或基于再生纖維素的膜。在一個實施方案中，溶液具有pH4-pH8的pH值，優(yōu)選pH5-pH8。在另一實施方案中，溶液具有1mS/cm-15mS/cm的電導率，優(yōu)選4.0mS/cm-10.0mS/cm的電導率。另一實施方案包含通過獲得濃縮溶液的方法從流通液回收免疫球蛋白單體形式，該方法選自沉淀、鹽析、超濾、滲濾、冷凍干燥、親和層析或溶劑體積減少。該回收優(yōu)選通過超濾、冷凍干燥或溶劑體積減少。在另一實施方案中，從膜陽離子交換材料的流通液獲得該免疫球蛋白，且至少95%的免疫球蛋白為單體形式。在另一實施方案中，至少90%的免諒拔恭A並汰報《X娃厶5卩B寇孚吞扭ih^—水戀^.女金罷.鍵)+7lc^:液為包含磷酸或其鹽、檸檬酸或其鹽，或組氨酸或其鹽的溶液。在另一實施方案中，緩沖水溶液包含氯化鈉或氯化鉀。在另一實施方案中，層析步驟是柱層析或盒式層析(cassettechromatography)。發(fā)明詳述本發(fā)明包含純化免疫球蛋白的方法，其包括在免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陽離子交換材料，并在與陽離子材料接觸后(即除去陽離子交換材料后)從溶液或上清液回收免疫球蛋白單體形式的步驟。本申請中所用的術語"離子交換材料"或其語法同義詞指攜帶共價結合帶電荷的取代基的固定高分子量基質。為了獲得總體電中性，將非共價結合的抗衡離子通過離子相互作用結合至帶電荷的取代基。"離子交換材料"具有將其非共價結合的抗衡離子與周圍溶液的帶相似電荷的結合配偶體或離子交換的能力。根據(jù)其可交換的抗衡離子的電荷，"離子交換材料"被稱為"陽離子交換材料"或"陰離子交換材料"。根據(jù)帶電荷基團(取代基)的性質，"離子交換材料"例如在陽離子交換材料的情況下，是指磺酸樹脂或磺丙基樹脂(S)，或羧甲基樹脂(CM)。根據(jù)帶電荷的基團/取代基的化學性質，可將"離子交換材料"另外分類為強或弱離子交換材料，這取決于于共價結合的帶電荷的取代基的強度。例如，強陽離子交換材料具有磺酸基團(優(yōu)選磺丙基基團)作為帶電荷的取代基，弱陽離子交換材料具有羧tt團(優(yōu)選羧甲基基團)作為帶電荷的取代基。強陰離子交換材料具有季銨基團，弱陰離子交換材料具有二乙氨乙基基團作為帶電荷的取代基。本申請中所用的術語"膜"指微孔或大孔膜。膜本身由聚合材料組成，如聚乙烯、聚丙烯、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺類(尼龍，如ZetaporeTM、N66Posidyne)、聚酯類、乙酸纖維素、再生纖維素、纖維素復合材料、聚砜、聚醚砜、聚芳砜個實施方案中，膜是聚醚砜膜或再生纖維素膜?？梢砸圆煌拿Q從許多公司獲得離子交換樹脂，例如陽離子交換樹脂Bio-Rex(:ft。70型)、Chelex(如100型)、Macro-Prep(如CM型、HighS型、25S型)、AG(如50W型、MP型)均可從BioRadLaboratories獲4尋，WCX2可從Ciphergen獲得，DowexMAC-3可從Dowchemicalcompany獲得,MustangC和MustangS可從PallCorporation獲得，CelluloseCM(如23型、52型)、hyper-D、partisphere可從Whatmanplc.獲得，AmberliteIRC(如76型、747型、748型)、AmberliteGT73、Toyopearl(如SP型、CM型、650M型)均可從TosohBioscienceGmbH獲得，CM1500和CM3000可從BioChromLabs獲得，SP-SepharoseTM、CM-SepharoseTM可從GEHealthcare獲得，Poros樹脂可從PerSeptiveBiosystems獲得，AsahipakES(如502C型)、CXpakP、IECCM(如825、2825、5025、LG)、IECSP(如420N型、825型)、IECQA(如LG、825型)可從ShokoAmericaInc.獲得，50W陽離子交換樹脂可從EichromTechnologiesInc.獲得；例如陰離子交換樹脂，如Dowex1可從Dowchemicalcompany獲得，AG(如1型、2型、4型)、Bio-Rex5、DEAEBio-Gel1、Macro-PrepDEAE均可從BioRadLaboratories獲得，1型陰離子交換樹脂可從EichromTechnologiesInc.獲得，SourceQ、ANXSepharose4、DEAES印harose(如CL畫6B型、FF型)、QSepharose、CaptoQ、CaptoS均可從GEHealthcare獲得，AX-300可從PerkinElmer獲得，AsahipakES-502C、AXpakWA(如624型、G型)、IECDEAE均可從ShokoAmericaInc.獲得，AmberliteIRA畫96、ToyopearlDEAE、TSKgelDEAE均可從TosohBioscienceGmbH獲得，MustangQ可從PallCorporation獲得。在膜離子交換材料中，結合位點可見于流通孔壁而不隱藏在擴散孔內，這容許通過對流而非擴散傳質?？梢砸圆煌拿Q從一些公司獲得膜離子交換材料，如Sartorius(膜陽離子交換材料SartobindCM、Sartob';ndTMS;膜陰離子交換材料SartobindQ)，或PallCorporation(膜陽離子交換材料MustangS、MustangC;膜陰離子交換材料MustangQ)，或PallBioPharmaceuticals。在一個實施方案中，膜陽離子交換材料是SartobindTMCM，或SartobindS，或MustangS，或MustangC。在另一實施方案中，膜陽離子交換材料是用磺^團或羧曱基基團修飾的基于聚醚砜的膜或基于再生纖維素的膜。在另一實施方案中，陰離子交換材料是Q-型(季銨基團-型)膜陰離子交換材料或Q-陰離子交換柱。"多肽，，是天然或合成產生的，通過肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。少于大約20個氨基酸殘基的多肽稱為"肽"。"蛋白質"是包含一條或多條多肽鏈的大分子，或是超過100個氨基酸殘基的多肽鏈。蛋白質也可包含非肽組分，例如糖基。糖基和其他非肽取代基可通過而加入至該蛋白質，在該細胞中產生該蛋白質，并且將隨細胞類型的變化而變化。本文根據(jù)其氨基酸主鏈結構定義蛋白質；通常不指定取代基如糖基，但它們可能是存在的?？稍诒旧暾堉锌梢曰Q使用的術語"免疫球蛋白，，及其語法同義詞包含至少兩條輕多肽鏈和兩條重多肽鏈。每條重多肽鏈和輕多肽鏈包含含有與抗原相互作用的結合結構域的可變區(qū)(一般為多肽鏈的氮基端部分)。每條重多肽鏈和輕多肽鏈還包含恒定區(qū)(一般為多肽鏈的M端部分)，其可介導抗體與宿主組織或因子(包含免疫系統(tǒng)的各種細胞、一些吞噬細胞和經典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq))的結合。通常，輕多肽鏈和重多肽鏈是各自基本上由可變區(qū)(即Vl或Vh)和恒定區(qū)(即在輕多肽鏈的情況下為Ct或在重多肽鏈的情況下為CH1、鉸合部、CH2、Ch3和可逸的Ch4)組成的鏈。本文所用的術語"免疫球蛋白，，是指由一條或多條基本上由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質。公認的免疫球蛋白基因包含不同的恒定區(qū)基因和多種免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白可以以多種形式存在，包括，例如Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈(例如Huston,J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)5879-5883;Bird,R.E.等/、，Sdenee242(1988)423-426;概述ood等人，Immunology,BenjaminN.Y"第二版(1984);Hunkapiller，T.和Hood,L.，Nature323(1986)15-16)。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫球蛋白包含單克隆抗體及其片段，例如分離的重鏈或輕鏈，或與另一種肽或多肽融合的重鏈或輕鏈及其片段。術語"免疫球蛋白單體形式"及其語法同義詞指不與第二個免疫球蛋白分子結合的免疫球蛋白分子，即免疫球蛋白分子既不共價地也不非共價地結合至第二個免疫球蛋白分子。術語"免疫球蛋白聚合形式"及其語法同義詞指共價或非共價地與至少一個額外的免疫球蛋白分子結合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白聚合形式從大小排阻層析柱洗脫為單峰。本申請中所用的術語"單體形式"并非指必需100%的免疫球蛋白分子以單體形式存在。其還指免疫球蛋白的至少90%的免疫球蛋白是單體形式，至少95%的免疫球蛋白是單體形式，至少98%的免疫球蛋白是單體形式，至少99%的免疫球蛋白是單體形式，或超過99%的免疫球蛋白是單體形式。術語"單體形式和聚合形式"指不與其他免疫球蛋白分子結合的免疫球蛋白分子和與其他免疫球蛋白分子結合的免疫球蛋白分子的混合物。在此混合物中，單體形式和聚合形式都不是特定存在。本申請中所用的術語"100%"指非指定成分的成分的量處于參考分析方法在指定條件下的檢測極限以下。本申請中所用的術語"卯％"、"95%"、"98%"、"99%，，指無精確值，而是參考分析方法在指定條件下的準確度內的值。一般的層析方法及其用途對于本領域技術人員來說是已知的。見如Chromatography,第5版，A部分FundamentalsandTechniques,Heftmann,E.(編著),ElsevierSciencePublishingCompany,NewYork,(1992);AdvancedChromatographicandElectromigrationMethodsinBiosciences,Deyl，Z.(編著)，ElsevierScienceBV,Amsterdam,TheNetherlands,(1998);ChromatographyToday,Poole,C.F"和Poole,S.K.,iiElsevierSciencePublishingCompany,NewYork,(1991);Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice(1982);Sambrook,J.,等人(編著),MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"1989;或CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel，F(xiàn).M.，等人(編著)，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYorko對于重組產生的免疫球蛋白的純化，常使用不同柱層析步驟的組合。一般在A蛋白親和層析之后有一個或兩個額外的分離步驟。最后的純化步驟是除去痕量雜質和污染物(如聚合免疫球蛋白、殘留HCP(宿主細胞蛋白質)、DNA(宿主細胞核酸)、病毒或內毒素)的所謂"則光步驟(polishingstep)"。對于此刨光步驟，常以流通模式使用陰離子交換材料。本發(fā)明中所用的術語"流通模式"及其語法同義詞指純化方法(如層析方法)的進行才莫式，其中使包含待純化的目的物質(如單體形式的免疫球蛋白)的溶液與固定相(優(yōu)選固體)接觸，其中目的物質不結合至該固定相。結果從流通液(若純化方法是層析方法)或上清液(若純化方法是分批方法)獲得目的物質。也存在于溶液中的非目的物質(如聚合形式的免疫球蛋白)結合至固定相，以這種方式從溶液中除去。這并非指必需從溶液除去100%的非目的物質，而是指基本除去了100%的非目的物質，即從溶液除去了至少50%的非目的物質，從溶液除去了至少75%的非目的物質，從溶液除去了至少90%的非目的物質，或從溶液除去了超過95。/。的非目的物質。本申請中所用的術語"用于"及其語法同義詞指純化方法的部分步驟，其中使包含待純化的目的物質的溶液與固定相接觸。這指a)將溶液加至固定相所處的裝置，或b)將固定相加至溶液。在a)的情況下，包含待純化的目的物質的溶液通過固定相，允許固定相和溶液中物質相互作用。根據(jù)諸如pH、電導率、鹽濃度、溫度和/或流速的條件，溶液的一些物質結合至固定相，從而從溶液中除去。其他物質保留于溶液中。保留于溶液中的物質可見于流通液。"流通液"指通過層析裝置后獲得的溶液。優(yōu)選的層析裝置是柱或盒。在一個實施方案中，層析步驟是柱層析(即使用柱中固定相的層析步驟)或盒式層析(即使用盒中固定相的層析步驟)。在優(yōu)選實施方案中，盒式層析使用在盒中的膜。在一個實施方案中，可通過本領域技術人員熟悉的方法(如沉淀、鹽析、超濾、滲濾、冷凍干燥、親和層析或溶劑體積減少來獲得濃縮溶液)從流通液除去不結合至固定相目的物質。在優(yōu)選實施方案中，通過冷凍干燥、超濾或溶劑體積減少從流通液回收免疫球蛋白單體形式。在b)的情況下，將固定相(如作為粉末)加至包含待純化的目的物質的溶液，使固定相和溶液中的物質間相互作用。相互作用后除去固定相(如通過過濾)，在上清液中獲得未結合至固定相目的物質。本申請中所用的術語"不結合至"及其語法同義詞指使其與固定相(如離子交換材料)接觸時保留于溶液中的目的物質(如免疫球蛋白)。這并非指必需100%的目的物質保留在溶液中，而是基本100%的目的物質保留在溶液中，即至少50%的目的物質保留在溶液中而不結合至固定相，至少65%的目的物質保留在溶液中而不結合至固定相，至少80%的目的物質保留在溶液中而不結合至固定相，至少90%的目的物質保留在溶液中而不結合至固定相，或超過95%的目的物質保留在溶液中而不結合至固定相。本申請中所用的術語"緩沖"指溶液，其中通過緩沖物質平衡因酸性或堿性物質的加入或釋放引起的pH變化。包含緩沖物質的溶液是"緩沖溶液"?？墒褂脤е逻@種結果的任一種緩沖物質。在一個實施方案中使用藥物可接受的緩沖物質，如磷酸和其鹽、檸檬酸和其鹽、嗎啉、2-(N-嗎啉)乙磺酸和其鹽、組氨酸和其鹽、甘氨酸和其鹽或三(羥甲基)氨基曱烷(TRIS)和其鹽。在優(yōu)選實施方案中，緩沖物質是磷酸和/或其鹽，檸檬酸和/或其鹽，或組氨酸和/或其鹽?？蛇x地，緩沖溶液可能包含額外的鹽，如氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。在一個實施方案中，緩沖溶液包含氯化鈉或氯化鉀。本發(fā)明中所用的術語"結合-和-洗脫模式"指純化方法的進行模式，其中使包含待純化的目的物質的溶液與固定相(優(yōu)選固體相)接觸，由此13目的物質結合至固定相。結果目的物質保留在固定相上而非目的物質隨著流通液或上清液除去。然后，任選在洗滌步驟后的第二步驟中從固定相洗脫目的物質，從而用洗脫溶液從固定相回收目的物質。對于從免疫球蛋白聚合形式分離免疫球蛋白單體形式，一般使用層析方法，其使用以結合-和-洗脫模式進行的陽離子交換材料。見如WO2006/125599?，F(xiàn)已令人驚喜地發(fā)現(xiàn)，可使用以流通才莫式進行的陽離子聚合形式。使用這種純化免疫球蛋白的方法，有可能以快速和容易的方式從包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式二者混合物的溶液中除去免疫球蛋白聚合形式。因此，本發(fā)明報導了純化免疫球蛋白的方法，其中該方法包括以下步驟a)在免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陽離子交換材料，并在與陽離子交換材料接觸后從溶液回收免疫球蛋白單體形式。更詳細地，本發(fā)明包含從包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的溶液獲得免疫J求蛋白單體形式的方法，由此該方法包括在免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的*下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陽離子交換材料，并在與陽離子交換材料接觸后從溶液回收免疫球蛋白單體形式的步驟。在一個實施方案中，該步驟是以流通模式進行的層析步驟。在另一實施方案中，該陽離子交換材料AM陽離子交換材料。本申請中所用的術語"免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的條件"及其語法同義詞指當與陽離子交換材料接觸時，免疫球蛋白單體形式保留在溶液中。這并非指必需100%的免疫球蛋白單體形式保留在溶液中，而是基本100%的免疫球蛋白單體形式保留在溶液中而不結合至陽離子交換材料，即至少50%的免疫球蛋白單體形式保留在溶液中而不結合至陽離子交換材料，至少65%的免疫球蛋白單體形式保留在溶液中而不結合至陽離子交換材料，至少80%的免疫球蛋白單體形式保留在溶液中而不結合至陽離子交換材料，至少90%的免疫球蛋白單體形式保留在溶液中而不結合至陽離子交換材料，或超過95%的免疫球蛋白單體形式保留在溶液中而不結合至陽離子交換材料。這種條件是例如在一個實施方案中緩沖水溶液pH值為pH5-pH8和/或在另一實施方案中緩沖水溶液電導率為1.0mS/cm-15mS/cm,優(yōu)選4.0mS/cm曙10.0mS/cm。在本發(fā)明的一個實施方案中，純化免疫球蛋白的方法包括在免疫球蛋白單體形式不結合至膜陽離子交換材料的^下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于膜陽離子交換材料，并從膜陽離子交換材料的流通液回收免疫球蛋白單體形式的步驟。在這個實施方案中，純化方法是以流通模式進行的層析方法，其容許免疫球蛋白的快速純化，因為可容易地從(層析)柱的流通液獲得想得到的免疫球蛋白單體形式，使得不必進行其他步驟，如柱洗滌、結合物質洗脫或洗脫的免疫球蛋白溶液脫鹽。本發(fā)明的方法可作為單步驟方法使用或與其他步驟組合使用，如在一個實施方案中與陰離子交換層析步驟組合，或在另一實施方案中與親和層析步驟組合。因此，本發(fā)明的一個實施方案是純化免疫球蛋白的方法，其中該方法包括以下連續(xù)步驟b)在免疫球蛋白不結合至陰離子交換材料的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陰離子交換層析柱，并從陰離子交換柱的流通液將免疫球蛋白單體形式和聚合形式回收為緩沖水溶液，并a)在免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的條件下，將步驟b)中獲得的包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陽離子交換材料，并在與陽離子交換材料接觸后從溶液回收免疫球蛋白單體形式。在一個實施方案中，步驟b)是以流通4莫式進行的層析方法。在另一實施方案中，步驟a)是以流通模式進行的層析方法。在另一實施方案中，步驟a)中的陽離子交換材料，陽離子交換材料。步驟b)的條件是本領域技術人員已知的。使用步驟b)有可能降低包含免疫球蛋白的溶液中宿主細胞蛋白質(HCP)、A蛋白、內毒素和/或病毒的量。還可能顛倒兩個離子交換步驟的順序。在將溶液用于純化方法的一個步驟(或用于隨后的步驟)前必須調整參數(shù)，如溶液的pH值或電導率。在一個實施方案中，用于步驟a)的水溶液的pH值是pH4-pH8，優(yōu)選pH5-pH8。在另一實施方案中，水溶液的電導率是4.0mS/cm-10.0mS/cm。此外，在本發(fā)明一個實施方案中包含純化免疫球蛋白的方法，其中該方法包括以下連續(xù)步驟a)在免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的M下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陽離子交換材料，并在與陽離子交換材料接觸后從溶液回收免疫球蛋白單體形式，并c)在免疫球蛋白不結合至陰離子交換材料的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式的步驟a)的緩沖水溶液用于陰離子交換層析柱，并從陰離子交換層析柱的流通液回收免疫球蛋白單體形式。在一個實施方案中，步驟c)是以流通模式進行的層析方法。在另一實施方案中，步驟a)是以流通模式進行的層析方法。在另一實施方案中，步驟a)中的陽離子交換材料是膜陽離子交換材料。使用親和層析在最初的純化步驟中除去例如大部分宿主細胞蛋白質和培養(yǎng)副產物可能是有益的。本發(fā)明的一個實施方案是包含下述順序的以下步驟的方法d)在免疫球蛋白結合至親和柱的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于親和柱，并從親和柱將免疫球蛋白單體形式和聚合形式回收為緩沖水溶液，并b)可選地在免疫球蛋白不結合至陰離子交換材料的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的步驟d)的緩沖水溶液用于陰離子交換層析柱，并從陰離子交換層析柱的流通液將免疫球蛋白單體形式和聚合形式回收為緩沖水溶液，并a)在免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的條件下，將步驟d)中獲得的或步驟b)中獲得的包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陽離子交換材料，并在與陽離子交換材料接觸后從溶液回收免疫球蛋白單體形式。在一個實施方案中，步驟b)是以流通模式進行的層析方法。在另一實施方案中，步驟a)是以流通模式進行的層析方法。在另一實施方案中，步驟d)以結合-和-洗脫模式進行。在另一實施方案中，該陽離子交換材料M陽離子交換材料。親和柱可能是例如A蛋白親和柱、G蛋白親和柱、疏水性電荷誘導層析柱(HCIC)或疏7JC作用層析柱(HIC,例如用苯基-瓊脂糖，氮雜-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸)。優(yōu)選的親和柱是A蛋白柱或HCIC柱。在另一實施方案中，在免疫球蛋白不結合至陰離子交換材料的條件下，將步驟b)中包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液和/或步驟c)中包含免疫球蛋白單體形式的緩沖水溶液用于陰離子交換層析柱，并從陰離子交換材料回收為緩沖水溶液。本發(fā)明的一個方面是從包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的溶液獲得免疫球蛋白單體形式的方法，其中該方法包括以下步驟a)以流通模式進行的層析步驟，其包含在免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于膜陽離子交換材料，從膜陽離子交換材料的流通液回收免疫球蛋白單體形式。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法在步驟a)前包括以下步驟b)以流通模式進行的層析步驟，其包含在免疫球蛋白不結合至陰離子交換材料的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陰離子交換層析柱，并從陰離子交換柱的流通液將免疫球蛋白單體形式和聚合形式回收為緩沖水溶液。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法在步驟a)后包括以下步驟C)以流通才莫式進行的層析步驟，其包含在免疫球蛋白不結合至陰離子交換材料的條件下，將步驟a)中獲得的包含免疫球蛋白單體形式的緩沖水溶液用于陰離子交換層析柱，并從陰離子交換層析柱的流通液回收免疫球蛋白單體形式。在另一實施方案中，本發(fā)明的方法在步驟a)或步驟b)前包括以下步驟d)以結合-和-洗脫模式進行的層析步驟，其包含在免疫球蛋白結合至親和柱的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于親和柱，并從親和柱將免疫球蛋白單體形式和聚合形式回收為緩沖水溶液。在另一實施方案中，通過獲得濃縮溶液的方法從流通液回收該免疫球蛋白單體形式，該方法選自沉淀、鹽析、超濾、滲濾、冷凍干燥、親和層析或溶劑體積減少。優(yōu)選通過超濾、冷凍干燥或溶劑體積減少回收進行該回收。在一個實施方案中，從膜陽離子交換材料的流通液獲得的免疫球蛋白至少95%是免疫球蛋白單體形式。在另一實施方案中，至少90%的免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料。在另一實施方案中，緩沖水溶液的pH值是pH5-pH8。在另一實施方案中，緩沖水溶液的電導率是4.0mS/cm-10.0mS/cm。在一個實施方案中，緩沖溶液是包含磷酸或其鹽、杵檬酸或其鹽、或組氨酸或其鹽的溶液。在另一實施方案中，水溶液包含氯化鈉或氯化鉀。在一個實施方案中，膜陽離子交換材料是用磺g團或羧曱基基團修飾的基于聚醚砜的膜或基于再生纖維素的膜。在另一實施方案中，層析步驟是柱層析或盒式層析。提供下列實施例和圖以幫助理解本發(fā)明，而本發(fā)明真正的范圍示于所附的權利要求中。要理解可在不背離本發(fā)明精神的方法中產生改變。附圖簡述圖1:使用Mustang膜的mAbIL13流通模式純化圖。圖2:a)樣品材料mAbIL13的SEC(大小排阻層析)分析；b)流通液級分2的SEC分析。圖3:包含mAbIL13的樣品材料的SartobindC膜方法的流通液級分2的SEC分析。圖4:包含mAbHer2的樣品材料的SartobindC膜方法的流通液級分2的SEC分析。實施例材料和方法條件A蛋白洗脫物在第一個步驟中用A蛋白親和層析純化抗-IL-13Rotl抗體(在下文中稱為mAbIL13，見如WO2006/072564)和抗-Her2抗體(在下文中稱為mAbHer2，見如US5,677,171)。在酸性條件下(3.5mM鹽酸，pH值2.7±0.2)從A蛋白柱洗脫mAbIL13。在過濾步驟之前，用濃縮的例如1M、pH9.0的緩沖溶液(例如三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)或磷酸鹽緩沖液)將包含免疫球蛋白的級分的pH值調節(jié)至pH5.0。在下文中將該材料稱為mAbIL13的條件A蛋白洗脫物。在第一個步驟中用A蛋白親和層析純化mAbHer2。在酸性條件下(10mM檸檬酸鈉緩沖液，pH值3.0±0.5)從A蛋白柱進行洗脫。在過濾步驟之前，用濃縮三的(羥甲基)氨基曱烷(TRIS)緩沖液將包含免疫球蛋白的級分的pH值調節(jié)至pH5.6。在下文中將該材料稱為mAbHer2的條件A蛋白洗脫物。分析方法大小排阻層析樹脂TSK3000(Tosohaas)柱子300x7.8mm19流速0.5ml/分鐘緩沖液包含250nM氯化鉀的200mM磷酸鉀，調節(jié)至pH7.0。波長280nmDNA-閾值-系統(tǒng)見如Merrick，H.和Hawlitschek，G，BiotechForumEurope9(1992)398-403A蛋白ELISA:用來源于雞的多克隆抗A蛋白-IgG包被微量滴定板的孔。在結合后，通過用樣品緩沖液洗滌來除去未反應的抗體。對于A蛋白的結合，向孔中加入確定的樣品體積。樣品中的A蛋白^皮雞抗體結合且保留在平板的孔中。在孵育后，移出樣品溶液并對孔進行洗滌。為了檢測，隨后加入來源于雞的多克隆抗A蛋白-IgG-生物素綴合物和鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶綴合物。在進一步的洗滌步驟后，加入底物溶液，從而導致顯色反應產物形成。顏色的強度與樣品中A蛋白含量成比例。在確定的時間后，終止反應并測量吸光度。宿主細胞蛋白質(HCP)ELISA:用血清白蛋白和鏈霉抗生物素蛋白的混合物包被微量滴定板的孔壁。將來源于山羊的抗HCP多克隆抗體結合至微量滴定板的孔壁。在洗滌步驟后，將微量滴定板的不同孔與不同濃度的HCP校準序列和樣品溶液一起溫育。在溫育后，通過用緩沖溶液洗滌來除去未結合的樣品材料。為進行檢測，用抗體過氧化物酶綴合物溫育孔以檢測結合的宿主細胞蛋白質。通過與ABTS—起溫育和在405nm處檢測來檢測被固定的過氧化物酶的活性。實施例1純化mAbIL13為單體形式-條件的比較在將mAbIL13純化至單體形式中評估了不同的條件。將純化方法作為層析純化方法以流通;f莫式進行。評估了流通純化mAbIL13的不同^f。使用了MustangS-AdsorberSystem(MustangSCoin,1.5cm2膜面積，PallCorporation,美國)作為膜陽離子交換材料。20條件A蛋白洗脫物具有7.1g/1濃度的mAbIL13，其中具有90.9%的免疫球蛋白單體形式和9.1%的免疫球蛋白聚合形式。條件A蛋白洗脫物在實驗前已進行病毒滅活并濾過0.2nm微孔濾器。在用對應的緩沖液稀釋至蛋白質濃度為約lmg/ml(比率約為1:7(v/v))、調節(jié)pH和電導率后，將溶液用于膜陽離子交換材料。若有必要，用磷酸氫鉀或磷酸二氫鉀進行pH調節(jié)，并通過加入KC1或去離子水(pH分別為約5.5和7.5)進4亍電導率調節(jié)。下文中將這種經稀釋、調節(jié)的條件A蛋白洗脫物稱為樣品材料。變化的參數(shù)是電導率和pH。觀測的參數(shù)是樣品材料的流通免疫球蛋白單體形式的產量和純度。樣品材料的變化的參數(shù)總結于表l中。表l:樣品材料參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>為了測定免疫球蛋白單體形式和聚合形式的量，已通過大小排阻層析分析了流通液。選擇第二級分進行分析，因為在方法的開始階段(第一級分)未建立起穩(wěn)定的純化方法，這是因為由于層析系統(tǒng)的固定體積而不存在穩(wěn)定流動，從而發(fā)生未知的第一級分的稀釋。圖l描述了示例性流通圖。結果總結于表2中。圖2a)和2b)顯示了樣品材料和級分2(pH6.5，5.8mS/cm)的大小排阻層析，表2:使用MustangS膜的mAbIL13免疫球蛋白單體形式(作為SEC層析的面積百分數(shù))和產量。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>-表2所示數(shù)據(jù)顯示，可調節(jié)具有良好產量的適合于mAbIL3純化(即從免疫球蛋白聚合形式分離免疫球蛋白單體形式)的M(即免疫球蛋白單體形式不結合至膜陽離子交換材料的條件)，如電導率為5.8mS/cm和pH為6.5。實施例2純化mAbIL13為單體形式-膜的比較實施例1中獲得的結果一般適用且已用于膜陽離子交換材料SartobindS(75112膜面積，SartoriusAG，G6ttingen,德國)。還已將MustangS的優(yōu)選條件(即在pH6.5電導率為5.8)用于Sartobind材料。包含mAbIL13的樣品材料具有1.34mg/ml的蛋白質濃度，其中具有94.8%的免疫球蛋白單體形式和5.2%的免疫球蛋白聚合形式。按實施例1中所^^導將樣品材料用于膜。純化方法的結果總結于表3中。表3:使用SartobindS膜的mAbIL13免疫球蛋白單體形式和聚合形式(作為SEC層析的面積百分數(shù))和產量。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>bdt檢測極限以下還將相同的樣品材料用于SartobindTMC膜。結果示于表4，圖3顯示了第三級分的示例性大小排阻層析。表4:使用SartobindC膜的mAbIL13免疫球蛋白單體形式和聚合形式(作為SEC層析的面積百分數(shù))和產量。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>bdl-檢測極限以下-=未測定通過在所有實驗中使用一種膜材料確定的條件，所示的所有陽離子膜吸附體以流通模式用相同條件進行，都將具有除去聚合物和獲得單體IgG的能力。實施例3純化mAbHer2為單體形式-膜的比較A蛋白洗脫物具有7.61g/1的mAbHer2濃度，純度為98.8%。通過將mAbHer2溶液加熱至37°C保持3天產生/獲得免疫球蛋白聚合形式。不考慮存在于經加熱處理的樣品中的低分子量物質，加熱處理后溶液包含99,0%的免疫球蛋白單體形式和1.0%的免疫球蛋白聚合形式。條件A蛋白洗脫物在實驗前已進行病毒滅活并濾過0.2jun^L孔濾器。在稀釋至蛋白質濃度為1.03mg/ml、調節(jié)pH和電導率后，分別將溶液用于膜陽離子交換材料SartobindTMS和C。通過加入NaCl(5mol/1)進行電導率調節(jié)。結果顯示于表5和表6。表5:使用SartobindTMS膜的mAbHer2免疫球蛋白單體形式和聚合形式(作為SEC層析的面積百分數(shù))和產量。樣品編<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>可從上文總結出，pH值與以mS/cm表示的電導率之和優(yōu)選在9-18的范圍內，更優(yōu)選在10-15的范圍內。實施例4A蛋白、DNA和HCP含量的分析已分析了實施例2中獲得的級分的A蛋白、DNA和HCP含量。在表7和表8中給出了結果。在用于SartobindTMS膜前，溶液中A蛋白的含量是2.6ng/ml，DNA含量是小于0.3pg/mg，宿主細胞蛋白質(HCP)含量是1791ng/mg。表7:用SartobindTMS膜獲得的包含mAbIL13免疫球蛋白的級分的A蛋白、DNA和HCP含量。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>-=未測定在用于SartobindC膜前，溶液中A蛋白的含量是3,0ng/ml，DNA含量是小于0.4pg/mg，宿主細胞蛋白質(HCP)含量是5250ng/mg。表8:用SartobindC膜獲得的包含mAbIL13免疫球蛋白的級分的A蛋白、DNA和HCP含量。樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>權利要求1.從包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的溶液獲得免疫球蛋白單體形式的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a)在所述免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的條件下，將包含所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于所述陽離子交換材料，并在與所述陽離子交換材料接觸后從所述溶液回收所述免疫球蛋白單體形式。2.權利要求1的方法，其特征在于所述步驟a)是以流通模式進行的層析步驟，其包含在所述免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的條件下，將包含所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陽離子交換材料，并在與所述陽離子交換材料接觸后從所述溶液回收所述免疫球蛋白單體形式。3.權利要求1或2的方法，其特征在于所迷方法在步驟a)之前包括以下步驟b)在所述免疫球蛋白不結合至所述陰離子交換材料的條件下，將包含所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陰離子交換材料，并在與所述陰離子交換材料接觸后從所述溶液回收所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式。4.權利要求3的方法，其特征在于所述步驟b)是以流通模式進行的層析步驟，其包含在所述免疫球蛋白不結合至所述陰離子交換材料的M下，將包含所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陰離子交換材料，并在與所述陰離子交換材料接觸后從所述溶液回收所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式。5.權利要求1-4中任一項的方法，其特征在于所述方法在步驟a)之后包括以下步驟c)在所述免疫球蛋白不結合至所述陰離子交換材料的條件下，將包含所述免疫球蛋白單體形式的緩沖水溶液用于陰離子交換材料，并在與所述陰離子交換材料接觸后從所述溶液回收所述免疫球蛋白單體形式。6.權利要求5的方法，其特征在于所述步驟c)是以流通模式進行的層析步驟，其包含在所述免疫球蛋白不結合至所述陰離子交換材料的條件下，將包含所述免疫球蛋白單體形式的緩沖水溶液用于陰離子交換材料，并在與所述陰離子交換材料接觸后從所述溶液回收所述免疫球蛋白單體形式。7.權利要求1-6中任一項的方法，其特征在于所述方法在步驟a)之前或步驟b)之前包括以下進一步的步驟d)在所述免疫球蛋白結合至所述親和柱的條件下，將包含所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于親和柱，并從所述親和柱回收所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式。8.權利要求7的方法，其特征在于所述步驟d)是以結合-和-洗脫模式進行的層析步驟,其包含在所述免疫球蛋白結合至所述親和柱的條件下，將包含所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于親和柱，并從所述親和柱回收所述免疫球蛋白單體形式和聚合形式。9.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述步驟a)中的陽離子交換材料是膜陽離子交換材料。10.權利要求9的方法，其特征在于所述膜陽離子交換材料是MustangS，MustangC，或SartobindTMS,或SartobindTMC。11.權利要求9的方法，其特征在于所述膜陽離子交換材料是用磺酸基團或羧甲基基團修飾的基于聚醚砜的膜或基于再生纖維素的膜。12.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于步驟a)的所迷緩沖水溶液具有pH5-pH8的pH值。13.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于步驟a)的所述緩沖水溶液具有1.0-15.0mS/cm的電導率。14.權利要求13的方法，其特征在于步驟a)的所述緩沖水溶液具有4.0-10.0mS/cm的電導率。15.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述從流通液回收所述免疫球蛋白單體形式是通過獲得濃縮溶液的方法，所述方法選自沉淀、鹽析、超濾、滲濾、冷凍干燥、親和層析或溶劑體積減少。16.權利要求15的方法，其特征在于所述回收是通過超濾、冷凍干燥或溶劑體積減少。17.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于從膜陽離子交換材料的流通液獲得的所述免疫球蛋白中至少95%的免疫球蛋白是單體形式。18.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于至少90%的免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料。19.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述緩沖水溶液是包含磷酸或其鹽，檸檬酸或其鹽，或組氨酸或其鹽的溶液。20.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述緩沖水溶液包含氯化鈉或氯化鉀。21.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述層析步驟是柱層才斤或盒式層才斤。22.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于步驟a)中的緩沖水溶液的pH值和以mS/cm表示的電導率之和在9-18的范圍內。23.庫又利要求22的方法，其特征在于所述和在10-15的范圍內。全文摘要本發(fā)明報導純化免疫球蛋白的方法，其中該方法包括在免疫球蛋白單體形式不結合至陽離子交換材料的條件下，將包含免疫球蛋白單體形式和聚合形式的緩沖水溶液用于陽離子交換材料，并在與陽離子交換材料接觸后從溶液回收免疫球蛋白單體形式。文檔編號C07K16/00GK101679509SQ200880018398公開日2010年3月24日申請日期2008年5月28日優(yōu)先權日2007年6月1日發(fā)明者C·吉賽爾,R·法爾肯施泰因申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司