專利名稱：針對(duì)il-25的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)白介素25 (IL-25)的抗體，包括其結(jié)合片段。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施 方案使用抗體2C3的抗體VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。另一方面本發(fā)明提供了分別移植到人VH 和VL框架區(qū)域中的本文中所公開VH和VL結(jié)構(gòu)域的一種或更多種CDR。

背景技術(shù)：
哮喘是常見的氣道慢性炎癥，患者的數(shù)量在最近的數(shù)十年間急劇上升，世界衛(wèi)生 組織估算世界范圍內(nèi)有3億人患有哮喘。過敏性哮喘特征為無(wú)法控制的氣道高反應(yīng)性 (AHR)，其由多種激發(fā)性剌激誘導(dǎo)，與肺的2型炎性浸潤(rùn)有關(guān)。 2型細(xì)胞因子在介導(dǎo)寄生蠕蟲感染的保護(hù)免疫、調(diào)節(jié)效應(yīng)器功能例如B細(xì)胞生長(zhǎng) 和IgE分泌、誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生和相關(guān)的粘液生成、嗜曙紅細(xì)胞增多、肥大細(xì)胞增生病和纖 維化中起重要作用(1)。這些細(xì)胞因子在這些效應(yīng)器功能調(diào)節(jié)中的核心作用使之成為哮喘 的關(guān)鍵治療靶標(biāo)。實(shí)際上，這些細(xì)胞因子過表達(dá)的小鼠模型顯示顯著的哮喘特征。然而令 人驚訝的是，通過阻斷特異性2型細(xì)胞因子(除了抑制IL-13)改善實(shí)驗(yàn)性哮喘的努力已證 明是不成功的。 IL-13的抑制同時(shí)抑制了 AHR和氣道炎癥，但其機(jī)制仍不清楚(2， 3)。然而，由于
哮喘復(fù)雜的病理生理學(xué)和有限的病因?qū)W了解，靶向各個(gè)途徑是否能最終證明是成功的治療 是不確定的。 最近，結(jié)構(gòu)相關(guān)的IL-17細(xì)胞因子家族元件IL25/IL17E(8)的過表達(dá)已顯示能在 體內(nèi)誘導(dǎo)2型應(yīng)答(4-6)，并增加對(duì)氣道激動(dòng)劑的應(yīng)答性(7)。 1125—小鼠不能排出蠕蟲寄 生蟲，這是無(wú)效2型應(yīng)答的關(guān)鍵指標(biāo)(9， 10)。 抗體的基本結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域是公知的。天然存在的抗體通常具有四條多肽鏈兩條 相同的重鏈和兩條相同的輕鏈，其通過二硫鍵連接。重鏈和輕鏈各自具有恒定區(qū)和可變區(qū) (或結(jié)構(gòu)域)?？勺儏^(qū)主要負(fù)責(zé)抗體的結(jié)合。在每個(gè)可變區(qū)內(nèi)，三個(gè)已知為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 的亞區(qū)與抗原接觸。各個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的CDR從N端至C端編號(hào)為CDR1、CDR2和CDR3。在N 和C端與CDR之間是4個(gè)所謂的框架區(qū)，其與抗原的接觸即使有也很少。關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)的 更多詳細(xì)情況在許多下文中所引用文獻(xiàn)中進(jìn)行了闡述，其通過援引并入本文。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人們制備了針對(duì)IL-25的抗體，并鑒定了與IL-25以高度親和性和特異性 結(jié)合的抗體分子。由于人和小鼠1卜25共有80%的序列同一性，認(rèn)為不大可能通過小鼠 或大鼠常規(guī)的免疫接種產(chǎn)生有效的抗IL-25抗體，因?yàn)樵撓嗨贫饶軠p少免疫原性表位的數(shù) 目。此外，受體配體界面(interface)很可能顯示最大程度上的保守性，因此阻礙了能阻 斷IL-25與其受體相互作用的抗體的產(chǎn)生。為了解決這些問題，本發(fā)明人們對(duì)經(jīng)設(shè)計(jì)缺乏 IL-25 (IL-25-/-)表達(dá)的小鼠進(jìn)行了免疫，相信該方法能增加開發(fā)針對(duì)IL-25/IL-25R界面 抗體的可能性。 該方法在產(chǎn)生針對(duì)IL-25的抗體方面是非常成功的，其很可能源于IL-25本身增
4強(qiáng)了體液免疫應(yīng)答。然而，即使使用本方法，從70個(gè)候選物中僅鑒定到2個(gè)阻斷抗體，其中 僅有1個(gè)可被回收。 通過常規(guī)方法克服了被認(rèn)為阻礙了有效阻斷抗體的產(chǎn)生的鼠和人IL-25之間相 似性的問題后，認(rèn)為該序列相似性可產(chǎn)生等價(jià)有效阻斷小鼠和人IL-25與其受體相互作用 的抗體。本發(fā)明現(xiàn)說(shuō)明這的確如此。 盡管已有針對(duì)IL-25的其他抗體存在，相信本發(fā)明是首次說(shuō)明所述能阻斷IL-25 生物活性的抗體。具體而言，本文提供了在哮喘鼠模型中進(jìn)行的試驗(yàn)，其顯示本發(fā)明的抗體 尤其在體內(nèi)預(yù)防或降低氣道高反應(yīng)性(哮喘的關(guān)鍵癥狀)中具有優(yōu)點(diǎn)和意料不到的性質(zhì)。
雖然已報(bào)道施用可溶性IL-25R-Fc融合蛋白可降低2型氣道炎癥，其效果顯著低 于本文中報(bào)道的那些，并且關(guān)鍵是未評(píng)價(jià)AHR(ll)。我們現(xiàn)證明IL-25在氣道炎癥和AHR中 起關(guān)鍵作用，最初增強(qiáng)2型細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥，并且在誘導(dǎo)不依賴于經(jīng)典2型細(xì)胞因子的 AHR中起重要作用。IL-25依賴的AHR的鑒定使鑒別新的IL-25下游治療靶標(biāo)成為可能。目 前我們不知道IL-25是否直接作用于氣道平滑肌以誘導(dǎo)支氣管收縮，或其效果通過誘導(dǎo)已 知的支氣管收縮物例如白三烯類介導(dǎo)。然而，IL-25的雙相活性使其成為體內(nèi)抑制氣道炎 癥和抑制氣道高反應(yīng)性的出色治療靶標(biāo)。 因此，本發(fā)明涉及新的抗體，更普遍為包含所述抗體CDR序列的靶標(biāo)結(jié)合元件，以 及所述靶標(biāo)結(jié)合元件在治療狀況例如哮喘中的應(yīng)用。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括抗體VH結(jié) 構(gòu)域，所述抗體VH結(jié)構(gòu)域包括具有氨基酸序列SEQID NO. 7的VH CDR3。其為本發(fā)明抗體 2C3的VH CDR3序列。 在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件是VH結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :
7的VH CDR3，以及SEQ ID NO :5的CDR1和SEQID NO :6的CDR2。 所述VH結(jié)構(gòu)域可具有人框架區(qū)，或SEQ ID N0:2所示的框架區(qū)。所述VH結(jié)構(gòu)域可與本發(fā)明的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)，例如具有SEQ IDNO :8的CDR1、 SEQ
ID NO :9的CDR2和SEQ ID NO :10的CDR3的VL結(jié)構(gòu)域。這些CDR可位于具有人框架區(qū)的
VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)，或?yàn)镾EQID NO :4的VL結(jié)構(gòu)域。 因此在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括2C3 VH結(jié)構(gòu) 域(SEQ ID NO :2)和/或2C3 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO :4)。 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的分離的核酸，包含所述核酸的載體和 在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸以生產(chǎn)本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的方法。 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件，例如以藥物組合物形式，用于治療包括 哮喘的疾病中的用途。 本發(fā)明的這些和其他方面在下文進(jìn)一步詳細(xì)描述，參照所附的實(shí)施例。


圖1顯示了致敏前和哮喘攻擊期間IL-25的中和。(A)最后一次氣霧化抗原攻擊 一天后測(cè)定OVA-致敏的小鼠的乙酰甲膽堿敏感性。合并2次試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，其表示14-18小 鼠/組的平均值±SEM。 (*與同種型對(duì)照相比p < 0. 05， **與同種型對(duì)照相比p < 0. 01) (B)肺部切片用giemsa染色，進(jìn)行血管周圍浸潤(rùn)評(píng)分，每組n = 8。 (C)通過肺部切片高碘酸Schiff (PAS)染色測(cè)定粘液含量，每組n = 8。 (D)通過ELISA測(cè)定抗原特異性血清IgE， 0D讀取值通過與標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行比較轉(zhuǎn)化為任意單位，每組n = 8。 (E)通過用giemsa染色 的細(xì)胞離心涂片器的差別細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定BAL中嗜曙紅細(xì)胞的比例，每組n = 6。 (F)來(lái)自重 剌激縱隔淋巴結(jié)細(xì)胞的抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生成。通過ELISA測(cè)定蛋白水平，每組n = 6。 符號(hào)代表各個(gè)動(dòng)物，平均值用柱表示。數(shù)據(jù)代表至少2次獨(dú)立的試驗(yàn)。Sens二致敏前施用 的抗體，aero =每次氣霧劑攻擊前4小時(shí)施用的抗體。 圖2顯示了僅哮喘攻擊期間IL-25的中和。(A)最后一次氣霧化抗原攻擊一天后 測(cè)定OVA-致敏的小鼠的乙酰甲膽堿敏感性。合并2次試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，其表示14-18小鼠/ 組的平均值士SEM。 (*與同種型對(duì)照相比。<0.05，**與同種型對(duì)照相比。<0.01)。 (B) 肺部切片用giemsa染色，進(jìn)行血管周圍浸潤(rùn)評(píng)分，每組n = 8。 (C)通過肺部切片高碘酸 Schiff(PAS)染色測(cè)定粘液含量，每組n = 8。 (D)通過用giemsa染色的細(xì)胞離心涂片器 的差別細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定BAL中嗜曙紅細(xì)胞的比例，每組n = 6。 (E)通過ELISA測(cè)定抗原特異 性血清IgE， OD讀取值通過與標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行比較轉(zhuǎn)化為任意單位，每組n = 8。 (F)來(lái)自重 剌激縱隔淋巴結(jié)細(xì)胞的抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生成。通過ELISA測(cè)定蛋白水平，每組n = 6。 符號(hào)代表各個(gè)動(dòng)物，平均值用柱表示。數(shù)據(jù)代表至少2次獨(dú)立的試驗(yàn)。Sens二致敏前施用 的抗體，aero =每次氣霧劑攻擊前4小時(shí)施用的抗體。 圖3顯示了首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的rmlL-25施用。向野生型(A) 、 ill3—y—(B)或 i14—i15—i19—i113—(C)小鼠鼻內(nèi)施用1. 8ii g rIL-25或PBS。在攻擊后16小時(shí)測(cè)定乙 酰甲膽堿敏感性。*與同種型對(duì)照相比P < 0. 05，**與同種型對(duì)照相比p < 0. Ol，n = 4-8/ 組。數(shù)據(jù)代表至少2次獨(dú)立的試驗(yàn)。
序列 本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件參考下述序列鑒別號(hào)在本文中進(jìn)一步描述SEQIDNO. 12C3VH編碼核苷酸序列SEQIDNO. 22C3VH氨基酸序列SEQIDNO. 32C3VL編碼核苷酸序列SEQIDNO. 42C3VL氨基酸序列SEQIDNO. 52C3VH CDR1氨基酸序列SEQIDNO. 62C3VH CDR2氨基酸序列SEQIDNO. 72C3VH CDR3氨基酸序列SEQIDNO. 82C3VL CDR1氨基酸序列SEQ IDNO. 92C3VL CDR2氨基酸序列SEQIDNO. 102C3VL CDR3氨基酸序列 其他序列在所附的序列表中列出。
發(fā)明詳述
耙標(biāo)結(jié)合元件 此處描述了分子對(duì)的元件，所述分子對(duì)之間互相具有結(jié)合特異性。該特異性結(jié)合 對(duì)的元件可為天然來(lái)源的或全部或部分人工合成產(chǎn)生的。所述分子對(duì)的一個(gè)元件在其表面 具有區(qū)域，或空腔，其特異性的結(jié)合所述分子對(duì)另一元件的特定空間和極性結(jié)構(gòu)并因此與 之互補(bǔ)。因此，所述對(duì)的元件具有互相特異性結(jié)合的性質(zhì)。特異性結(jié)合對(duì)的類型的例子有抗原_抗體、生物素_抗生物素蛋白、激素_激素受體、受體_配體、酶_底物。 本申請(qǐng)與抗原-抗體類反應(yīng)有關(guān)，因此，本申請(qǐng)的靶標(biāo)結(jié)合元件將包括至少部分
的抗體分子，更具體為至少部分的所述分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 —般而言，抗體的重鏈可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)在抗體與抗原的結(jié)合中起重要作用。已 發(fā)現(xiàn)VH結(jié)構(gòu)域的CDR3區(qū)比CDR1和CDR2區(qū)更為多變，因此在大多數(shù)抗體中具有對(duì)所述抗 體靶標(biāo)的特異性。因此，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件基于2C3抗體的VH CDR3區(qū)。本發(fā)明的靶 標(biāo)結(jié)合元件更優(yōu)選包括2C3抗體VH區(qū)的所有三個(gè)CDR。 包含CDR的本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的結(jié)構(gòu)通常具有抗體分子的重鏈或輕鏈序列或 其基本部分，其中所述CDR位于相應(yīng)于重排(rearranged)免疫球蛋白基因編碼的天然存 在的VH和VL抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR的位置。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置可參 照Kabat，E. A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest.第四片反.US D印artment of Health and Human Services. 1987，及其更新版本而確定。許多學(xué)術(shù)和商用 在線資源可用于查找該數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，參見Martin，A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database byComputer PROTEINS :Structure， Function and Genetics, 25(1996) ， 130-133以及相關(guān)的在線資源，當(dāng)前的網(wǎng)址為http:〃www. bioinf. org. uk/abs/ simkab. html 。 —般而言，耙標(biāo)結(jié)合元件包括與VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)的VH結(jié)構(gòu)域，以提供抗體的抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，盡管如下文所討論的，單獨(dú)的VH結(jié)構(gòu)域也可用于結(jié)合抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，所述2C3VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO. 2)與2C3VL結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO. 4)配對(duì)，由此形成 抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其同時(shí)包括所述2C3 VH和VL結(jié)構(gòu)域。在另外實(shí)施方案中，所述2C3 VH與2C3VL以外的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)。 輕鏈混雜性在本領(lǐng)域是公知的，如本文中其他部分所討論。 根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可以與2C3基本類似，例如±10%，的親和性結(jié)合 IL_25。靶標(biāo)結(jié)合元件通常是對(duì)IL-25特異性的。因此所述靶標(biāo)結(jié)合元件不會(huì)對(duì)其特異性 結(jié)合伴侶以外的分子顯示任何顯著的結(jié)合。例如，已發(fā)現(xiàn)2C3抗體不與IL-4、IL-5和IL-13 交叉反應(yīng)。因此避免與哮喘和類似過程有關(guān)的其他細(xì)胞因子交叉反應(yīng)是本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合 元件所需要的特征。 通常，可通過結(jié)合測(cè)定的方法測(cè)定特異性，例如使用一套抗原的ELISA。根據(jù)本發(fā)
明的耙標(biāo)結(jié)合元件可識(shí)別IL-25，但不識(shí)別IL-17家族的其他元件，尤其是IL-17A、 IL-17B
和IL-17C中的任何一個(gè)，更優(yōu)選所有三種IL-17A、 IL-17B和IL-17C。根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)
結(jié)合元件與IL-25的結(jié)合可通過與重組IL-25競(jìng)爭(zhēng)而消除。 可在適宜的條件下比較不同靶標(biāo)結(jié)合元件的結(jié)合親和性和中和效價(jià)。 抗體分于 這里描述了天然或部分或全部合成產(chǎn)生的免疫球蛋白。已顯示完整抗體的片段可 行使結(jié)合抗原的功能。這樣對(duì)抗體的引用還包括任何包含抗體結(jié)合片段的多肽或蛋白質(zhì)。
結(jié)合片段的實(shí)例有(i)由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和 CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH 結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward, E. S.等，Nature 341,544-546(1989)) ; (v)分離的CDR區(qū); (vi) F (ab' ) 2片段，包含兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中
7VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽接頭連接，所述肽接頭使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域一起形成抗原結(jié)合位點(diǎn) (Bird等，Science, 242， 423-426， 1988 ;Huston等，PNAS USA， 85， 5879-5883， 1988) ;(viii) 雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)"雙抗體"，由基因融合構(gòu)成的多價(jià) 或多特異性片段(W094/13804 ;P. Holliger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA906444-6448, 1993)。 Fv、 scFv或雙抗體分子可通過引入連接VH和VL結(jié)構(gòu)域的二硫化物橋而穩(wěn)定 (Y. Reiter等，Nature Biotech, 14， 1239-1245， 1996)。還可制備包括與CH3結(jié)構(gòu)域連接的 scFv的Minibody(S. Hu等，Cancer Res. ，56,3055-3061， 1996)。 使用雙特異性抗體時(shí)，其可以是常規(guī)的雙特異性抗體，可通過多種途徑制備 (Holliger，P.禾P Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4， 446-449 (1993))，例如通過化 學(xué)方法或從雜交體雜交瘤制備，或可以是任一前述的雙特異性抗體片段。雙抗體和scFv可 不使用Fc區(qū)、僅使用可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)建，潛在減少了抗個(gè)體基因型反應(yīng)的影響。
與雙特異性完整抗體相反，雙特異性雙抗體也是特別有用的，因?yàn)樗鼈兛煞奖愕?構(gòu)建和在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)。具有適當(dāng)結(jié)合特異性的雙抗體(以及許多其他多 肽例如抗體片段)可使用噬菌體展示技術(shù)(W094/13804)從文庫(kù)中方便的選擇。如果所 述雙抗體的一條臂保持恒定，例如，具有針對(duì)IL-25的特異性，則可構(gòu)建另一條臂變化的 文庫(kù)，選擇適當(dāng)特異性的抗體。雙特異性完整抗體可通過knobs-into-holes工程制備 (J. B. B. Ridgeway等，Protein Eng. ， 9， 616-621， 1996)?？梢垣@取單克隆和其他抗體，使用 重組DNA技術(shù)產(chǎn)生保留了原始抗體特異性的其他抗體或嵌合分子。這樣的技術(shù)可包括向不 同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)引入編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)、或互補(bǔ)決定 區(qū)(CDR)的DNA。例如參見EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A_239400。
優(yōu)選地，所述CDR區(qū)被移植到人框架區(qū)。人框架區(qū)可通過多種方法選擇，例如，通 過比較小鼠框架區(qū)或小鼠V區(qū)序列與已知的人框架或V區(qū)序列，選擇氨基酸相似性或同一 性程度最高或最高之一的人框架區(qū)。對(duì)天然的人序列框架區(qū)可進(jìn)行修飾，以進(jìn)一步優(yōu)化得 到的CDR移植抗體。 雖然在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，優(yōu)選包括一對(duì)VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體分子，但基 于VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的單個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了本發(fā)明的其他方面。已知單個(gè)免疫球蛋白 結(jié)構(gòu)域，尤其是VH結(jié)構(gòu)域能以特定的方式結(jié)合靶標(biāo)抗原。 在任一單鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域的情況下，這些結(jié)構(gòu)域可用于篩選能形成可結(jié)合IL-25的 雙結(jié)構(gòu)域靶標(biāo)結(jié)合元件的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域，如下文進(jìn)一步所述。 本發(fā)明的抗體分子可進(jìn)一步包括抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL結(jié)構(gòu)域可在其C 末端與抗體輕鏈恒定區(qū)連接，所述恒定區(qū)包括人CK或CA鏈，優(yōu)選CA鏈。類似的，基于 VH結(jié)構(gòu)域的靶標(biāo)結(jié)合元件可在其C末端與衍生自任何抗體同種型的完整免疫球蛋白重鏈 或其部分連接，所述抗體同種型例如IgG、IgA、IgE和IgM以及任何同種型亞類，尤其是IgGl 和IgG4。優(yōu)選IgG4。也可采用W099/58572中公開的Fc區(qū)，例如Anab禾口 Anac。
因此包括與另一多肽融合的靶標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其等價(jià)物的嵌合分子。嵌合抗體的 克隆與表達(dá)描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023中。 本發(fā)明抗體分子的框架區(qū)還可包括糖基化序列，其包括一個(gè)或更多個(gè)糖基化位 點(diǎn)。糖基化模式可依賴于耙標(biāo)結(jié)合元件表達(dá)的宿主細(xì)胞而不同。因此，編碼糖基化位點(diǎn)的 核酸構(gòu)建體可進(jìn)行修飾以除去所述位點(diǎn)或可在蛋白內(nèi)引入此類位點(diǎn)。例如，真核蛋白中的N-糖基化位點(diǎn)特征為氨基酸三聯(lián)體Asn-X-Y，其中X是除Pro外的任何氨基酸，Y是Ser或 Thr。對(duì)編碼所述三聯(lián)體的核苷酸序列的適當(dāng)取代、添加或缺失可預(yù)防Asn側(cè)鏈上附著糖殘 基。選擇改變單個(gè)核苷酸，使得Asn被不同的氨基酸替換，例如足以滅活N-糖基化位點(diǎn)。滅 活蛋白質(zhì)中N-糖基化位點(diǎn)的已知方法包括美國(guó)專利號(hào)5，071，972和EP 276,846中描述的 那些。 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 此處描述了抗體分子的一部分，其包括與抗原的部分或全部特異性結(jié)合并與之互 補(bǔ)的區(qū)域。在抗原較大的情況下，抗體可能僅與該抗原的特定部分結(jié)合，該部分稱為表位。 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可通過一個(gè)或更多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域提供(例如由VH結(jié)構(gòu)域組成的所謂 的Fd抗體片段)。優(yōu)選地，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括至少抗體輕鏈可變區(qū)(VL)的基本部分和至 少抗體重鏈可變區(qū)(VH)的基本部分。 免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的基本部分包括至少三個(gè)CDR區(qū)以及其間插入的框架區(qū)。 優(yōu)選地，該部分還包括至少50%第一和第四框架區(qū)之一或兩者，所述50%為第一框架區(qū)的 C末端50%和第四框架區(qū)的N末端50% 。所述可變結(jié)構(gòu)域基本部分的N末端或C末端其他 殘基可以是與天然存在的可變結(jié)構(gòu)域區(qū)非通常相關(guān)的那些。例如，通過重組DNA技術(shù)制備 的本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件構(gòu)建可引入引入的接頭編碼的N或C末端殘基以利于克隆或其他 操作步驟。其他操作步驟包括引入接頭以連接本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域和其他蛋白序列，其包 括免疫球蛋白重鏈、其他可變結(jié)構(gòu)域(例如在制備雙抗體中)或蛋白標(biāo)簽，如下文更詳細(xì)討 論的。 包括 其通常以包含的意義使用，即允許一個(gè)或更多特征或成分的存在。
分離的 其是指根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件或編碼所述結(jié)合元件的核酸通常存在的 狀態(tài)。元件和核酸不含或基本不含其天然相關(guān)的物質(zhì)，例如在其天然環(huán)境或當(dāng)在體外或體 內(nèi)通過重組DNA技術(shù)制備時(shí)在其制備環(huán)境中(例如細(xì)胞培養(yǎng)物)中與其一起發(fā)現(xiàn)的其他多 肽或核酸。 靶標(biāo)結(jié)合元件和核酸可與稀釋劑或佐劑一起配制，為了實(shí)踐目的仍然是分離 的——例如所述元件如果用于在免疫測(cè)定中包被微量滴定板時(shí)通常與明膠或其他載體混 合；或當(dāng)用于診斷或治療時(shí)與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合。靶標(biāo)結(jié)合元件可以天然 被糖基化或通過異源真核細(xì)胞(例如CH0或NS0(ECACC 85110503)細(xì)胞)糖基化，或者其 可以是(例如通過在原核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生時(shí))未糖基化的。
耙標(biāo)結(jié)合元件的其他特征 除了抗體序列外，根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可包括其他氨基酸，例如形成肽或 多肽諸如折疊結(jié)構(gòu)域，或使該分子具有除結(jié)合抗原的能力外的其他功能性特征。本發(fā)明的 靶標(biāo)結(jié)合元件可攜帶可檢測(cè)的標(biāo)記，或可與毒素或酶綴合(例如通過肽基鍵或接頭)。
可檢測(cè)的標(biāo)記包括放射性標(biāo)記，例如1311或"Tc，其可使用抗體成像領(lǐng)域中已知的 常規(guī)化學(xué)方法與本發(fā)明的抗體連接。標(biāo)記還可包括酶標(biāo)記，例如辣根過氧化物酶。標(biāo)記還 可包括化學(xué)部分，例如生物素，其可通過與特異性同源檢測(cè)部分例如標(biāo)記的抗生物素蛋白 結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。
在所述其他特征是多肽結(jié)構(gòu)域或標(biāo)記的情況下，所述靶標(biāo)結(jié)合元件可通過重組技 術(shù)產(chǎn)生，即通過表達(dá)編碼所述靶標(biāo)結(jié)合元件和其他結(jié)構(gòu)域的融合物的核酸產(chǎn)生。
本發(fā)明的其他靶標(biāo)結(jié)合元件
序列變體 本文列出了其序列的VH和VL結(jié)構(gòu)域和CDR的，并且可用于IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元 件的變體可通過序列改變或突變和篩選的方法獲得。本發(fā)明同樣提供了此類方法。
根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件也可以與任何靶標(biāo)結(jié)合元件競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原，所述任何 靶標(biāo)結(jié)合元件結(jié)合抗原并包括本文中公開的靶標(biāo)結(jié)合元件，VH和/或VL結(jié)構(gòu)域，或2C3的 VH CDR3，或任何序列基本上如本文中所列出的這些的變體。因此，本發(fā)明的另一方面提供 了包含人抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的靶標(biāo)結(jié)合元件，其與2C3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-25。結(jié)合元件間的競(jìng) 爭(zhēng)可在體外方便地測(cè)定，例如采用ELISA和/或通過向一個(gè)結(jié)合元件標(biāo)記特定的報(bào)告分子， 其可在其他未標(biāo)記結(jié)合元件存在下檢測(cè)，進(jìn)而能鑒定結(jié)合同一表位或重疊表位的靶標(biāo)結(jié)合 元件。 本領(lǐng)域中有多種方法可用于獲得針對(duì)IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，其可與2C3競(jìng)爭(zhēng)結(jié) 合IL-25。 根據(jù)本發(fā)明，可使用其序列在本文中具體公開的任何VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu) 域氨基酸序列變體，如前面所討論的。具體的變體可包括一個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列的改變 (添加、缺失、取代和/或插入氨基酸殘基)，可能低于約20個(gè)改變、低于約15個(gè)改變、低于 約10個(gè)改變或低于約5個(gè)改變、4、3、2或1個(gè)改變。改變可在一個(gè)或更多個(gè)框架區(qū)和/或 一個(gè)或更多個(gè)CDR中進(jìn)行。 —方面，基本上如本文所示的CDR氨基酸序列是人可變結(jié)構(gòu)域的CDR或其基本部 分。基本上如本文所示的VH CDR3序列代表了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選地，每一所述序 列為人重鏈可變結(jié)構(gòu)域的VH CDR3或其基本部分。"基本上如......所示"表示本發(fā)明有關(guān)的CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域與其序列在本
文中所示的特定區(qū)域相同或高度相似。"高度相似"理解為在CDR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)域中 可進(jìn)行1至5、優(yōu)選1至4，例如1至3或1或2，或3或4個(gè)氨基酸的取代。
本發(fā)明耙標(biāo)結(jié)合元件的序列變體可通過2C3 VH和/或VL基因之一或兩者的隨機(jī) 誘變?cè)谡麄€(gè)可變結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生突變產(chǎn)生。這樣的技術(shù)由Gram等人描述(1992，Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA， 89 :3576-3580)，其使用了易錯(cuò)PCR。 另一種可使用的方法是VH或VL基因CDR區(qū)的定向誘變。此類技術(shù)由Barbas等人 (1994， Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA， 91 :3809-3813)和Schier等人(1996， J. Mol. Biol. 263 : 551-567)所公開。 所有上述技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，其本身不構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)
人員能使用此類技術(shù)通過本領(lǐng)域常規(guī)方法提供本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件。 因此，另一方面本發(fā)明提供了一種獲得針對(duì)IL-25抗體的方法，其包括 提供編碼靶標(biāo)結(jié)合元件的起始核酸，其具有一種或更多種SEQ IDN0:2或SEQ ID
NO :4的CDR序列； 修飾所述核酸，改變所述CDR序列；
表達(dá)所述修飾的靶標(biāo)結(jié)合元件；以及
10
測(cè)試所述修飾的靶標(biāo)結(jié)合元件與IL-25的結(jié)合。 優(yōu)選地，所述修飾可在復(fù)數(shù)種起始核酸分子上進(jìn)行，以提供具有不同結(jié)合親和性 的修飾的序列庫(kù)。 —方面，所述起始核酸包括SEQ ID NO :2的所有三種重鏈CDR，其以SEQ ID NO :2 本身的形式或在其他框架序列中的形式存在。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾可針對(duì)單種CDR，例如CDR3，或所述修飾可同時(shí)針對(duì) 兩種或三種CDR區(qū)。 某于CDR3靶標(biāo)結(jié)合元件的牛產(chǎn) 本發(fā)明中采用的可變結(jié)構(gòu)域可從任何種系或重排的人可變結(jié)構(gòu)域獲得，或可以是 基于已知的人可變結(jié)構(gòu)域共有序列的合成可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的CDR序列(例如CDR3)可 通過重組DNA技術(shù)引入缺乏CDR(特別是CDR3)的可變結(jié)構(gòu)域庫(kù)。 例如，Marks等人(Bio/Technology， 1992， 10 :779-783)描述了生產(chǎn)抗體可變結(jié)構(gòu) 域庫(kù)的方法，其中使用針對(duì)可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域5'端或鄰近的通用引物和針對(duì)人VH基因第三 框架區(qū)的通用引物，以提供缺乏CDR3的VH可變結(jié)構(gòu)域庫(kù)(r印ertoire) 。 Marks等人還描 述了該庫(kù)如何與特定抗體的CDR3組合。使用類似的技術(shù)，本發(fā)明的CDR3衍生的序列可與 缺乏CDR3的VH或VL結(jié)構(gòu)域庫(kù)改組(shuffle)，改組的完整VH或VL結(jié)構(gòu)域與同源的VL或 VH結(jié)構(gòu)域組合以提供本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件。所述庫(kù)可隨后在適宜的宿主系統(tǒng)中展示，例 如W092/01047的噬菌體展示系統(tǒng)，由此選擇適宜的耙標(biāo)結(jié)合元件。庫(kù)可由超過104個(gè)元件 組成，例如106至108或101Q個(gè)元件。 類似的改組或組合技術(shù)同樣由Stemmer公開(Nature, 1994,370 :389-391)，其描 述了與內(nèi)酰胺酶基因相關(guān)的技術(shù)，但發(fā)現(xiàn)所述方法可用于產(chǎn)生抗體。
因此，本發(fā)明另一方面提供了一種制備對(duì)IL-25特異性的靶標(biāo)結(jié)合元件的方法， 該方法包括 (a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸起始庫(kù)，所述核酸包括將被替換的CDR3或缺乏 CDR3編碼區(qū)； (b)使所述庫(kù)與編碼基本上如本文所示VH CDR3的氨基酸序列的供體核酸組合，
這樣所述供體核酸插入到上述庫(kù)的CDR3區(qū)，從而提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸產(chǎn)物庫(kù)； (c)表達(dá)所述產(chǎn)物庫(kù)的核酸； (d)選擇對(duì)IL-25特異性的靶標(biāo)結(jié)合元件；并且 (e)回收所述靶標(biāo)結(jié)合元件或編碼其的核酸。 所述產(chǎn)物庫(kù)可從相同載體或不同載體中與VL結(jié)構(gòu)域共表達(dá)。該VL結(jié)構(gòu)域可以是 本發(fā)明的VL結(jié)構(gòu)域，或可以是一種或更多種如下文所述與鏈改組有關(guān)的不同VL結(jié)構(gòu)域。
可采用類似的方法，其中本發(fā)明的VL CDR3與編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸庫(kù)組合，所述 核酸包括將被替換的CDR3或缺失CDR3編碼區(qū)。使用前述方法，該VL產(chǎn)物庫(kù)可從相同載體 或不同載體中與VH結(jié)構(gòu)域共表達(dá)。該VH結(jié)構(gòu)域可以是本發(fā)明的VH結(jié)構(gòu)域，或可以是一種 或更多種如下文所述與鏈改組有關(guān)的不同VH結(jié)構(gòu)域。 類似地， 一種或更多種，或所有三種CDR均可被移植到VH或VL結(jié)構(gòu)域的庫(kù)中，隨 后篩選該庫(kù)中對(duì)IL-25特異性的靶標(biāo)結(jié)合元件。 通過這種方式獲得的靶標(biāo)結(jié)合元件構(gòu)成了本發(fā)明的另 一個(gè)方面。
鏈改組 本發(fā)明的另一方面提供了獲得針對(duì)IL-25的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，該方 法包括使本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件的VH結(jié)構(gòu)域(包括前述討論的變體)與一種或更多種VL 結(jié)構(gòu)域組合，以及測(cè)試所述VH/VL組合的針對(duì)IL-25的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
所述VL結(jié)構(gòu)域可具有基本上如本文所列出的氨基酸序列。 可采用類似的方法，其中將本文中公開的VL結(jié)構(gòu)域的一種或更多種序列變體與 一種或更多種VH結(jié)構(gòu)域組合。 這可以通過噬菌體展示篩選方法完成、使用如W092/01047中公開的所謂的等級(jí) 二元組合方法(hierarchical dual combinatorialapproach)，其中使用含有H或L鏈克隆 的單個(gè)菌落感染編碼另一條鏈(L或H)的完整克隆庫(kù)，根據(jù)例如該參考文獻(xiàn)中描述的那些 的噬菌體展示技術(shù)選擇得到的雙鏈靶標(biāo)結(jié)合元件。 因此，本發(fā)明提供了選擇針對(duì)IL-25抗體分子的方法，該方法包括 (a)提供包括靶標(biāo)結(jié)合元件的VH結(jié)構(gòu)域，所述靶標(biāo)結(jié)合元件結(jié)合IL-25并且包括
抗體VH結(jié)構(gòu)域，所述抗體VH結(jié)構(gòu)域包含具有SEQID NO. 7氨基酸序列的VH CDR3 ; (b)使所述VH結(jié)構(gòu)域與復(fù)數(shù)種抗體VL結(jié)構(gòu)域組合，獲得抗體分子； (c)篩選所述抗體分子與IL-25的結(jié)合；并且 (d)選擇與IL-25結(jié)合的抗體分子。 所述VH和VL結(jié)構(gòu)域可以以通過重組DNA、尤其是通過噬菌體或噬菌粒DNA表達(dá)的 蛋白的形式提供。 所述復(fù)數(shù)種VL結(jié)構(gòu)域可由超過104種各個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，例如106至108或101Q種 結(jié)構(gòu)域。 抗體分子和編碼這些分子的核酸可構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。IL-25
11-25，在本領(lǐng)域中同樣指IL-17E，可從商業(yè)來(lái)源獲得(例如R&DSystems， MN， USA)，或可參考本領(lǐng)域中已有的IL-25序列克隆或合成。Hurst等人，2002 (下文參考文獻(xiàn) 7)描述了鼠IL-25 (NCBI蛋白NP_542767) 。 Fort等人描述了人IL_25(NCBI蛋白Q9H293) (下文參考文獻(xiàn)4)。為生產(chǎn)抗體或在免疫測(cè)定中使用，可使用重組IL-25的片段，尤其 是N末端截短的那些。例如，可商業(yè)獲得的重組人IL-25 (IL-17E)包括登記號(hào)Q9H293的 Tyr33-Gly177成熟蛋白序列，可商業(yè)獲得的鼠IL-25包括小鼠IL_17E(登記號(hào)NP_542767) 的殘基Vall7-Alal69。
核酸和載體 在其他方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其包括編碼根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件、 VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的序列；本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件、VH結(jié)構(gòu)域或 VL結(jié)構(gòu)域的方法，其包括在條件下表達(dá)所述核酸，生產(chǎn)所述靶標(biāo)結(jié)合元件、VH結(jié)構(gòu)域或VL 結(jié)構(gòu)域，以及回收上述物質(zhì)。 本發(fā)明的另一方面提供了通常分離的核酸，其編碼本文中公開的VH CDR或VL CDR 序列，尤其是選自SEQ ID NOs :5、6和7的VHCDR，選自SEQ ID NOs :8、9禾P 10的VL CDR，最 優(yōu)選2C3 VHCDR3 (SEQ ID NO. 7)。 本發(fā)明的核酸可包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的序列或其相關(guān)部分(例如 CDR編碼區(qū))。然而，密碼子使用可以不同，例如為在所需要的宿主細(xì)胞中優(yōu)化所述序列的表達(dá)。 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件的分離的核酸。核酸包括DNA和RNA。 在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了編碼如前文所定義的本發(fā)明CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域的核酸。 根據(jù)本發(fā)明的核酸可包括DNA或RNA，可以是完全或部分合成的。除非上下文中另 外要求，本文中列出的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA，也包括具有指定序列的RNA， 其中用U代替T。 本發(fā)明還提供了載體，例如以質(zhì)粒、病毒，例如噬菌體、或噬菌粒、粘粒、轉(zhuǎn)錄或表 達(dá)盒的形式，其包括至少一種上述核酸。 可選擇或構(gòu)建適宜的載體，包含適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，包括啟動(dòng)子序列，終止子序 列，多腺苷酸序列，增強(qiáng)子序列，標(biāo)記基因和其他適宜的序列。更多詳細(xì)情況參見例如 Molecular Cloning :a LaboratoryMa皿al : 第二片反，Sambrook等，1989， Cold Spring Harbor LaboratoryPress。 本發(fā)明的載體還包括能在體內(nèi)感染人細(xì)胞的病毒載體，例如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒 或腺相關(guān)病毒載體。此類載體可用于在人或動(dòng)物受試者細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元 件，以生產(chǎn)和向所述受試者遞送該靶標(biāo)結(jié)合元件。 編碼本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的核酸序列在一個(gè)方面可操作地與啟動(dòng)子連接，以在宿 主細(xì)胞中表達(dá)該靶標(biāo)結(jié)合元件。所述序列可在5'端包括先導(dǎo)序列以促進(jìn)靶標(biāo)結(jié)合元件在 宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和/或從宿主細(xì)胞分泌。本領(lǐng)域已知多種適宜的先導(dǎo)序列，可由本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員根據(jù)宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。 許多用于操作核酸的已知技術(shù)和方法，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、測(cè)序、將DNA 引入細(xì)胞和基因表達(dá)，以及蛋白分析，詳細(xì)描述于Current Protocols in Molecular Biology,第二版，Ausubel等eds. ， John Wiley & Sons，1992中。Sambrook等人和Ausubel 等人的公開通過援弓I并入本文。
宿主細(xì)胞和靶標(biāo)結(jié)合元件的產(chǎn)生 另一方面提供了用本發(fā)明核酸(例如以載體形式的核酸序列)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸被整合至宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。 按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可通過包含促進(jìn)與基因組重組的序列促進(jìn)所述整合。 另一方面提供了生產(chǎn)本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的方法，該方法包括引發(fā)編碼核酸的表
達(dá)。這樣的方法可包括在用于生產(chǎn)所述靶標(biāo)結(jié)合元件的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。 通過表達(dá)生產(chǎn)后，VH或VL結(jié)構(gòu)域或靶標(biāo)結(jié)合元件可使用任何適宜的技術(shù)分離和/
或純化，隨后適當(dāng)時(shí)使用。生產(chǎn)的方法可包括分離和/或純化所述產(chǎn)品的步驟。 純化產(chǎn)品后，所述靶標(biāo)結(jié)合元件可通過物理或化學(xué)方法修飾，例如引入改變、例如
增加所述蛋白穩(wěn)定性或生物半衰期的保護(hù)基團(tuán)。例如，PEG化蛋白以獲得所述效果在本領(lǐng)
域是已知的，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可以是PEG化的形式。 制備方法可包括將產(chǎn)品制成組合物，其包括至少一種附加成分，例如藥學(xué)上可接 受的賦形劑。 本發(fā)明還提供了重組宿主細(xì)胞，其包括一種或更多種上述核酸或載體。所提供的 編碼任何CDR、 VH或VL結(jié)構(gòu)域或靶標(biāo)結(jié)合元件的核酸本身構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面，包括
13從其編碼核酸表達(dá)的生產(chǎn)所述編碼的產(chǎn)物的方法也是如此。 在多種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是公知的。適宜的宿主細(xì)胞包括細(xì) 菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域中可獲得的用于表達(dá)異源性多肽的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼侖鼠腎細(xì)胞、NS0小鼠黑色素瘤細(xì)胞、YB2/0 大鼠骨髓瘤細(xì)胞和多種其他細(xì)胞。通常優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌。 抗體和抗體片段在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中的表達(dá)在本領(lǐng)域已非常成熟。綜述 例如參見Pliickthun， A. Bio/Technology 9:545-551(1991)。作為生產(chǎn)耙標(biāo)結(jié)合元件的一 種選擇，在培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的。最近的綜述例如參見 Ref，M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4 :573-576 ;Trill J.J.等(1995) Curr. Opinion Biotech 6 :553-560。
組合物 因此，根據(jù)本發(fā)明，以及用于根據(jù)本發(fā)明的用途，的藥物組合物除活性成分外，可 包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的物質(zhì)。這 些物質(zhì)必須是無(wú)毒的，并且不應(yīng)干擾所述活性成分的功效。載體或其他物質(zhì)的精確性質(zhì)將 依賴于施用的途徑，其可以口服或注射，例如靜脈內(nèi)注射。 靶標(biāo)結(jié)合元件的治療劑可通過將所需純度的靶標(biāo)結(jié)合元件與任選生理上可 接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合制備成凍干粉或水溶液的形式用于儲(chǔ)存(參見例如 "Remington :The Science and Practice ofPharmacy ，，， 20片反，2000， pub丄ippincott， Williams & Wilkins.)?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度下對(duì)接受者 是無(wú)毒的，包括緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽，以及其他有機(jī)酸；包括抗壞血酸的抗氧化 劑；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水 聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸； 單糖、二糖和其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA;糖醇，例如甘露醇 或山梨醇；成鹽平衡離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫(Tween)、普郎尼克
(Pluronics)或聚乙二醇(PEG)。 用于體內(nèi)施用的靶標(biāo)結(jié)合元件必須是無(wú)菌的。這可以在凍干和重構(gòu)前后用無(wú)菌過
濾膜過濾方便的完成。所述靶標(biāo)結(jié)合元件通常以凍干形式或溶液存儲(chǔ)。 用于口服施用的藥物組合物可以是片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可包括固相
載體，例如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包括液相載體，例如水、石油、動(dòng)物或植物油、 礦物油或合成油。也可包括生理鹽水溶液、右旋糖或其他糖溶液，或二醇類，例如乙二醇、丙 二醇或聚乙二醇。 對(duì)于靜脈內(nèi)注射，或在痛苦(affliction)位點(diǎn)的注射來(lái)說(shuō)，活性成分可以是腸胃 外可接受的水溶液形式，其是無(wú)熱原的，并且具有適宜的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可使用例如等滲載體例如氯化鈉注射液、林格(Ringer' s)注射液、乳酸林格注射液制 備適宜的溶液。如果需要，可加入防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。
本發(fā)明的治療用途 本發(fā)明首次提供了針對(duì)IL-25的抗體能有效體內(nèi)預(yù)防或降低氣道高反應(yīng)性(哮喘 的主要癥狀)的證明。因此，一方面本發(fā)明提供了一種預(yù)防或降低需要治療的受試者(例 如人)的氣道高反應(yīng)性的方法，其包括向所述受試者施用與IL-25結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合元件，尤
14其是抗體分子。另一方面本發(fā)明提供了一種預(yù)防、降低或治療需要治療的受試者中哮喘的 方法，其包括向所述受試者施用與IL-25結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合元件，尤其是抗體分子。
上述方法可采用本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件(包括其組合物)，其能有效結(jié)合，并優(yōu)選 拮抗IL-25的作用，在多種IL-25起作用的疾病和病癥中具有治療潛能。所述方法也可采 用其他與IL-25結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合元件(包括其組合物)，其可如下文所附實(shí)施例所述獲得。
根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件(包括其組合物)可用于人或動(dòng)物受試者的治療(包 括預(yù)防性治療)或診斷方法中。所述治療或診斷方法(其可包括預(yù)防性治療)可包括向所 述受試者施用有效量的本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件。示范性的疾病和病癥在下文進(jìn)一步討論。
還提供了本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件(包括其組合物)在制備用于向人或動(dòng)物受試者 施用的藥劑中的用途。 抗IL-25靶標(biāo)結(jié)合元件可用于提供治療益處的臨床適應(yīng)癥包括任何IL-25具有病 理學(xué)后果的狀況。因此，通常本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可用于治療與不必要的Th-2應(yīng)答相關(guān) 的任何狀況。例如，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可用于治療過敏和哮喘，尤其是哮喘。
抗IL-25治療可通過注射(例如靜脈內(nèi))或局部遞送方法給予?？笽L-25可通過 基因介導(dǎo)的技術(shù)遞送。備選的制劑策略可提供適于口服或栓劑途徑的制劑。施用的途徑取 決于治療的理化性質(zhì)和疾病的特殊考慮，以優(yōu)化功效或最小化副作用。
根據(jù)本發(fā)明，可向個(gè)體施用組合物。優(yōu)選以"治療有效量"施用，其足以顯示對(duì)患 者的益處。所述益處可至少為至少一種癥狀的改善。施用的實(shí)際量，以及施用率和時(shí)間過 程將取決于所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療處方，例如關(guān)于劑量等的決定在普通從業(yè)醫(yī) 師和其他醫(yī)生的職責(zé)范圍內(nèi)?？贵w的適宜劑量在本領(lǐng)域是公知的，參見Lederma皿J.A.等， (1991)Int. J. Cancer 47 :659-664 ;Bagshawe K. D.等，(1991)Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4 :915—922。 精確的劑量依賴于多種因素，包括該抗體用于診斷還是治療，所治療區(qū)域的尺寸
和位置，所述抗體的精確性質(zhì)(例如全抗體、片段或雙抗體)，以及任何可檢測(cè)標(biāo)記或其他
與抗體連接的分子的性質(zhì)。典型的抗體劑量范圍為0.5mg-1.0g，可通過靜脈推注施用。其
他施用模式包括數(shù)小時(shí)內(nèi)的靜脈內(nèi)輸注以獲得類似的總累積劑量。這是對(duì)于成年患者的單
次治療劑量，對(duì)于兒童和嬰兒可按比例調(diào)節(jié)，對(duì)于其他抗體形式也可按分子量比例調(diào)節(jié)?？?br> 按每日一次、每周兩次、每周一次或每月一次的間隔重復(fù)治療，由醫(yī)師判定。 另一種給藥模式采用預(yù)涂布或整合入內(nèi)在的(indwelling)裝置，其抗體的最佳
量通過適當(dāng)試驗(yàn)確定。 在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體分子是單體的片段，例如F(ab)或scFv。
此類抗體片段可具有半衰期相對(duì)較短、血小板活化風(fēng)險(xiǎn)(其可由受體群集引起)較低的優(yōu)
點(diǎn)。導(dǎo)致血小板活化的群集例如可為IL-25分子的或IL-25與Fc y RII分子的。 如果使用全抗體，優(yōu)選以不能活化和/或破壞血小板的形式使用。優(yōu)選使用IgG4
同種型或衍生自IgGl骨架的"設(shè)計(jì)者"同種型(新的Fc基因構(gòu)建體，W099/58572， Clark，
Armour，Williamson)?？墒褂幂^小的抗體片段，例如F(ab') 2。此外，可使用具有雙表位特
異性(例如由scFv2C3識(shí)別的表位)的全抗體或片段(例如F(ab')2或雙抗體)。盡管這
樣的實(shí)施方案可促進(jìn)受體群集，與各個(gè)受體的高締合速率可排除這一問題。 本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件通常以藥物組合物的形式施用，其可包括除靶標(biāo)結(jié)合元件外的至少一種成分。 依賴于所治療的狀況，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可單獨(dú)或與其他治療同時(shí)或順序組 合施用。其他治療可包括施用適當(dāng)劑量的鎮(zhèn)痛藥物，例如非甾體抗炎藥(例如阿司匹林、醋 氨酚(paracetamol)、布洛芬或酮洛芬)或麻醉劑例如嗎啡，施用抗催吐藥，或施用至少另 一種對(duì)哮喘有活性的化合物，通常為支氣管擴(kuò)張劑，其導(dǎo)致氣道舒張或增強(qiáng)粘液清除，例如 P激動(dòng)劑(例如沙丁胺醇、沙美特羅)，色甘酸二鈉、類固醇或PDEIV抑制劑。
測(cè)定方法 本發(fā)明提供了一種包括引發(fā)或允許本文中所提供的靶標(biāo)結(jié)合元件與IL-25結(jié)合 的方法。如前所述，該結(jié)合可以在體內(nèi)發(fā)生，例如在施用靶標(biāo)結(jié)合元件、或編碼靶標(biāo)結(jié)合元 件的核酸后發(fā)生結(jié)合，或者在體外發(fā)生，例如在ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉 淀或親和色譜中。 可測(cè)定靶標(biāo)結(jié)合元件與IL-25的結(jié)合量。定量可以是關(guān)于測(cè)試樣品中抗原的量， 其可能是診斷相關(guān)的。 抗體對(duì)樣品的反應(yīng)性可通過任何適宜的方法測(cè)定。放射免疫測(cè)定(RIA)是一種可 能的選擇。放射性標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原(測(cè)試樣品)混合，與所述抗體結(jié)合。從未 結(jié)合抗原中物理分離結(jié)合的抗原，測(cè)定與抗體結(jié)合的放射性抗原的量。測(cè)試樣品中存在的 抗原越多，與抗體結(jié)合的放射性抗原越少。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定也可使用非放射性抗原，其使用 與報(bào)告分子連接的抗原或類似物。所述報(bào)告分子可以是熒光染料、磷光劑或激光染料，其具 有光譜分離的吸收或發(fā)射特性。適宜的熒光染料包括熒光素、若丹明、藻紅蛋白和得克薩斯 紅。適宜的發(fā)色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。 其他報(bào)告物包括大分子膠?；蝾w粒物例如乳膠珠，其為染色的、磁性或順磁性的； 能直接或間接引起可檢測(cè)信號(hào)用于視覺觀察、電子檢測(cè)或其他記錄的生物或化學(xué)活性劑。 例如，這些分子可以是酶類，其催化產(chǎn)生或改變顏色、或引起電性質(zhì)變化的反應(yīng)。它們可以 是分子可激發(fā)的，這樣不同能級(jí)之間的電子躍遷導(dǎo)致特征性光譜吸收或發(fā)射。它們也可以 包括與生物傳感器聯(lián)用的化學(xué)實(shí)體?？墒褂蒙锼?抗生物素蛋白或生物素/鏈霉抗生物 素蛋白和堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)。 各個(gè)抗體_報(bào)告物綴合物產(chǎn)生的信號(hào)可用于衍生樣品(標(biāo)準(zhǔn)和試驗(yàn))中結(jié)合的相 關(guān)抗體的可定量絕對(duì)或相對(duì)數(shù)據(jù)。 本發(fā)明還提供了上述靶標(biāo)結(jié)合元件在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中測(cè)定抗原水平中的用途，即通 過在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中應(yīng)用本發(fā)明提供的靶標(biāo)結(jié)合元件測(cè)定樣品中抗原水平的方法。這可以是 不需要結(jié)合與未結(jié)合抗原物理分離的情況。連接報(bào)告分子和靶標(biāo)結(jié)合元件，使得結(jié)合時(shí)發(fā) 生物理或視覺變化是一種可能。報(bào)告分子可直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的、優(yōu)選可測(cè)量的信號(hào)。 報(bào)告分子的連接可直接或間接，共價(jià)(例如通過肽鍵)或非共價(jià)。通過肽鍵的連接可以是 編碼抗體和報(bào)告分子的基因融合物重組表達(dá)的結(jié)果。 本發(fā)明還通過例如在生物傳感器系統(tǒng)中使用根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件直接測(cè) 定抗原水平。 測(cè)定結(jié)合的模式不是本發(fā)明的特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員能根據(jù)其偏好和常識(shí)選擇適 宜的模式。 本發(fā)明還擴(kuò)展至與任何靶標(biāo)結(jié)合元件競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，所述任何靶標(biāo)結(jié)合元件結(jié)合抗原并且包含包括CDR的V結(jié)構(gòu)域，所述CDR具有基本上如本文所示氨 基酸，或包含具有基本上如本文所示的氨基酸序列的V結(jié)構(gòu)域。結(jié)合元件間的競(jìng)爭(zhēng)可在體 外方便地測(cè)定，例如通過在一個(gè)結(jié)合元件上標(biāo)記特異性報(bào)告分子，其可在其他未標(biāo)記結(jié)合 元件存在下檢測(cè)，以鑒別結(jié)合同一表位或重疊表位的靶標(biāo)結(jié)合元件。競(jìng)爭(zhēng)可使用ELISA或 流式細(xì)胞法測(cè)定。 競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)可用于選擇一種或更多種靶標(biāo)結(jié)合元件，例如2C3的衍生物，其可具 有一種或更多種額外的或改善的性質(zhì)。這類似于根據(jù)本發(fā)明的2C3選擇方法，除了 IL-25 并非從其微配體洗脫，而是從抗體分子洗脫。這是重要的，因?yàn)槠鋾?huì)產(chǎn)生直接與母體競(jìng)爭(zhēng)的 更高比例的子代抗體。實(shí)際上如此選擇的所述子代抗體可能具有比母體更高的抗原親和性 (允許增強(qiáng)親和力，其可能是由于每個(gè)噬菌體展示超過1個(gè)抗體分子)。選擇具有改進(jìn)的親 和性的"子代"噬菌體抗體的現(xiàn)有方法包括 使用低于原始母體抗體的解離常數(shù)的(標(biāo)記)靶抗原的濃度； 使用過量未標(biāo)記的靶抗原作為競(jìng)爭(zhēng)者，如Hawkins等人所述(1992)。然而，他們并
沒有必要地規(guī)定"改進(jìn)的"抗體必須替換/占據(jù)母體的同一表位。加入洗脫步驟可產(chǎn)生更
高比例的替換母體的子代抗體。通過這種方法選擇的子代抗體可結(jié)合與其母體抗體非常類
似的表位，但具有更高的親和性。 在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試中可使用所述抗原的肽片段，尤其是包括感興趣表位的肽?？墒褂?具有表位序列加上任一端一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽。這樣的肽可稱為"基本上由所述的指 定序列組成"。根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可以使得其與抗原的結(jié)合被具有或包括上述序 列的肽所抑制。在該測(cè)試中，可使用具有任一序列加上一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽。
通過用所述肽淘選(pan)，可例如從噬菌體展示文庫(kù)中分離結(jié)合特定肽的靶標(biāo)結(jié) 合元件。
實(shí)施例 本發(fā)明的方面和實(shí)施方案現(xiàn)通過參考下述實(shí)驗(yàn)的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。
實(shí)施例1 :針對(duì)IL-25抗體的產(chǎn)生 對(duì)在針對(duì)鼠IL-25 (R&D Systems)免疫的il25—y—小鼠中產(chǎn)生的一大組抗體進(jìn)行 篩選。在體外生物測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)這些抗IL-25抗體其中之一 (2C3)能劑量依賴性地抑制 rmIL-25和可溶性mlL-25R-Fc融合蛋白的相互作用以及抑制原始小鼠非B、非T細(xì)胞的 IL-25依賴性的IL-13生成。該抗體還抑制hIL-25和可溶性hIL_25R_Fc融合物的相互作 用。這些性質(zhì)的組合進(jìn)一步在體內(nèi)系統(tǒng)中進(jìn)行了研究，以證明能有效用于治療哮喘。
實(shí)施例2 :過敏性哮喘的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在用氣霧化OVA攻擊前，BALB/c小鼠首先用抗原卵清蛋白(OVA)致敏，致敏和攻 擊的BALB/c小鼠發(fā)展了特征性的哮喘表型。上述特征表現(xiàn)為與用PBS攻擊的對(duì)照BALB/c 小鼠相比，在暴露于剌激物乙酰甲膽堿后AHR增加、氣道嗜曙紅細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生和 血清IgE分泌(圖1)。 作為對(duì)比，在每次致敏和用OVA氣霧化前施用抗IL-25mAb導(dǎo)致用氣霧化的乙酰甲 膽堿攻擊后AHR的顯著消除，其具有與PBS對(duì)照小鼠相當(dāng)?shù)牡挚怪?圖1A)。施用同種型匹 配的對(duì)照mAb并沒有抑制AHR(圖1A)。
該抗IL-25mAb還顯著降低了肺部脈管系統(tǒng)周圍細(xì)胞浸潤(rùn)的水平(圖1B和3A)、氣 道杯狀細(xì)胞增生(圖1C和3B)和抗原特異性血清IgE水平(圖1D)。 支氣管肺泡灌洗(BAL)分析表明，在施用抗IL-25mAb后，與同種型對(duì)照處理的小 鼠相比，嗜曙紅細(xì)胞浸潤(rùn)同樣被顯著抑制(圖1E)。由于已知2型細(xì)胞因子能調(diào)節(jié)這些效 應(yīng)子作用，我們測(cè)定了從分離自抗原重剌激后引流(draining)縱隔淋巴結(jié)的細(xì)胞分泌的 細(xì)胞因子水平。與通過BALB/c小鼠中0VA致敏和攻擊誘導(dǎo)的2型細(xì)胞因子，IL-4、IL-5和 IL-13的水平升高相比，抗IL-25mAb的施用導(dǎo)致了這些細(xì)胞因子水平顯著下降(圖1F)。
這些數(shù)據(jù)支持了下述假設(shè)阻斷IL-25信號(hào)傳導(dǎo)可抑制2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致 消除了 2型效應(yīng)子作用，包括炎癥和AHR。因此，若從應(yīng)答起始就開始施用，IL-25的拮抗劑 能有效抑制2型炎癥。
材料和方法:
小鼠 BALB/c小鼠獲自Harlan區(qū)，并且在SABU/CBS或國(guó)立心肺研究所實(shí)驗(yàn)室中于無(wú)特 異病原體環(huán)境下飼養(yǎng)。本報(bào)告中列出的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)UK內(nèi)政部批準(zhǔn)進(jìn)行。
致敏和變應(yīng)原暴露 在第0天和第12天，向BALB/c小鼠(6_12周)腹膜內(nèi)施用鋁絡(luò)合卵清蛋白 (20iig/注射)或僅僅鋁(對(duì)照)進(jìn)行致敏。隨后在第19、20、21天氣霧劑施用1%的卵清 蛋白，每天20分鐘。在第22天使用體積描記法分析動(dòng)物，評(píng)價(jià)AHR。
抗rmIL-25單克隆抗體的施用 如前所述誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性(AHR)，在每次腹膜內(nèi)OVA致敏前一天、向肺中起始 OVA攻擊和每次OVA氣霧化前4小時(shí)腹膜內(nèi)施用抗IL-25mAb (500 P g/劑)。在其他實(shí)驗(yàn)中， 僅在每次氣霧化前當(dāng)天腹膜內(nèi)施用抗IL-25mAb(500ii g/劑)。對(duì)照小鼠接受鹽水或同種型 對(duì)照(500iig/劑)代替抗IL-25單抗。同種型對(duì)照為抗-c-myc(小鼠IgGl，克隆9E10. 2)。
氣道反應(yīng)性的測(cè)量 麻醉動(dòng)物，切開氣管置于通風(fēng)機(jī)上(SAR-830系列，CWE公司)，頻率為150次 (breath)/分，潮氣量0. 2ml。在全身體體積描記器(EMKATechnologies， Paris)中監(jiān)測(cè)小 鼠，通過線內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)器評(píng)價(jià)經(jīng)肺壓。記錄穩(wěn)定的基線肺阻力后，通過氣霧劑施用增加濃度的乙 酰-e-碘甲膽堿氯化物(乙酰甲膽堿)(Sigma， Dorset,區(qū))，每個(gè)濃度下使用超聲噴霧器 施用15秒，記錄5分鐘內(nèi)的肺阻力。使用10X軟件分析氣道阻力、順應(yīng)性和標(biāo)準(zhǔn)肺參數(shù)。
支氣管肺泡灌洗(BAL) 頸脫位法處死小鼠，通過氣管造口術(shù)注入4X500ii1等分量PBS并回收。在用 giemsa染色的細(xì)胞離心涂片器上進(jìn)行150細(xì)胞的差別細(xì)胞計(jì)數(shù)。
實(shí)施例3 :攻擊之前施用 我們還評(píng)價(jià)了僅在0VA氣霧化攻擊前施用時(shí)抗IL-25mAb是否有效。使用抗 IL-25mAb的治療顯著減少了乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)誘導(dǎo)的氣道阻力，即使在應(yīng)答之后施用也 是如此(圖2A)。作為對(duì)比，施用對(duì)照同種型匹配的mAb并沒有消除AHR。
顯著地，肺部組織切片分析表明，抗IL-25mAb治療的小鼠和OVA攻擊的BALB/c對(duì) 照或同種型匹配的mAb治療的對(duì)照之間血管周圍的細(xì)胞浸潤(rùn)水平(圖2B)或氣道杯狀細(xì)胞 增生(圖2C)沒有顯著變化。
此夕卜，施用抗IL-25mAb后，嗜曙紅細(xì)胞在BAL液中的比例(圖2D)或抗原特異性血 清IgE的水平(圖2E)均沒有顯著的下降。令人驚訝的是，在抗原重剌激后，2型細(xì)胞因子 IL-5和IL-13的水平仍然維持與OVA攻擊的BALB/c對(duì)照或同種型匹配的mAb治療的對(duì)照 相當(dāng)(圖2F) ， BAL中的IL-13水平也沒有變化。這樣，在應(yīng)答的攻擊期間施用抗IL-25可 特異性的消除AHR，即使2型細(xì)胞因子及其下游效應(yīng)子并沒有被下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明IL-25 可通過獨(dú)立于經(jīng)典2型應(yīng)答的途徑啟動(dòng)AHR。
材料和方法 材料和方法如實(shí)施例2所述，外加
肺組織收集和組織學(xué) 將肺在福爾馬林(在0.9%鹽溶液中的10%甲醛)中固定以供組織學(xué)分析。肺部 切片用giemsa染色用于杯狀細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)和過碘酸-Schiff (PAS)。使用數(shù)字評(píng)分系統(tǒng)
盲法測(cè)定氣道上皮中PAS染色的杯狀細(xì)胞(0 :< 5%杯狀細(xì)胞；1 :5-25% ;2 :25_50% ;3 :
50-75%;4 :> 75% )。將各個(gè)肺氣道評(píng)分總和除以檢測(cè)的氣道數(shù)，20-40氣道/小鼠，以任
意單位的PAS評(píng)分表示。使用數(shù)字評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)炎癥以評(píng)估血管周圍的浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)(0:血 管周圍的浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞層<2個(gè)細(xì)胞厚度；1 :2-4個(gè)細(xì)胞厚度；2 :5_8個(gè)細(xì)胞厚度；3>8個(gè)
細(xì)胞厚度)。將各個(gè)肺氣道評(píng)分總和除以檢測(cè)的血管數(shù)，20-40氣道/小鼠，以任意單位表 示。 實(shí)施例4 :IL-25通過獨(dú)立于2型的途徑作用 我們對(duì)在缺乏抗原致敏或攻擊的情況下外源性施用rmIL-25是否能增強(qiáng)AHR進(jìn)行 了評(píng)價(jià)。向BALB/c小鼠鼻內(nèi)施用rmIL-25后16小時(shí)我們檢測(cè)到氣道阻力顯著上升(圖 3A)。之前的報(bào)道表明IL-13在哮喘表型、尤其是AHR中起中心作用。為確定IL-25是否 通過IL-13在AHR中起作用，我們向i113——小鼠施用了 rmIL-25。我們?cè)僖淮斡^察到使用 rmIL-25處理后AHR升高(圖3B)。由于其他2型細(xì)胞因子同樣顯示對(duì)哮喘表型起作用，我 們同樣評(píng)估了 i14——i15—i19——i113——對(duì)鼻內(nèi)施用rmIL-25的應(yīng)答。即使在缺乏所有經(jīng)典 2型細(xì)胞因子的情況下，用IL-25處理增強(qiáng)了乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)后的AHR(圖3C)。這些 數(shù)據(jù)支持了 IL-25通過獨(dú)立于2型細(xì)胞因子的途徑加劇AHR的作用。
材料和方法 材料和方法如實(shí)施例2和3所述，外加
小鼠 BALB/c背景下的轉(zhuǎn)基因i14-八i15-7-i19-7-i113-八小鼠(P. G. Fallon等，2002. Immunity 17，7)和i113—y—小鼠(G. J. McKenzie等，1998. Curr Biol.8，339)如前所述。 C57BL/6x129 F2背景下的1125+小鼠如前所述(P. G. Fallon等2006. J. Exp. Med. 203， 1105)。 鼻內(nèi)IL-25施用 在第0天向小鼠鼻內(nèi)施用1.8iig rIL-25(R&D Systems)或 1. 8ii grlL-13(P印rotech)的40 PBS/鼠。對(duì)照動(dòng)物僅接受PB S。
實(shí)施例5 :克隆2C3的可變結(jié)構(gòu)域 分離來(lái)自3個(gè)2c3亞克隆的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA。 使用保守的5'VH區(qū)引物MHV7(SEQ ID NO :11)與IgGl恒定區(qū)引物MHCG1 (SEQ IDNO :12)的組合通過PCR擴(kuò)增免疫球蛋白的重鏈(IgH)cDNA。 類似的，使用保守的5' IgK區(qū)引物MKV9(SEQ ID NO : 13)與k即pa恒定區(qū)引物
MKC(SEQ ID NO :14)的組合擴(kuò)增免疫球蛋白輕鏈(IgK)。在整個(gè)PCR反應(yīng)中使用耐熱聚合酶Phusion(NEB F-531L)。 使用TOPO-blunt cloning⑧試劑盒(Cat 45-0245)，將來(lái)自3個(gè)獨(dú)立的cDNA的采 用VH7+MHCG1作為引物的PCR反應(yīng)的2c3擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接到pCRI1⑧Blunt- T〇p〇
載體中，同樣處理輕鏈擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物。通過將白色菌落挑取到瓊脂網(wǎng)格上的PCR篩選 混合物中，將用所述連接的pCRII-bl皿t載體構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌T0P10細(xì)菌克隆至 LB-氨芐西林-XGal瓊脂平板上。PCR擴(kuò)增克隆的質(zhì)粒插入物。凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定預(yù) 測(cè)的產(chǎn)物。產(chǎn)生正確大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的每一克隆的過夜培養(yǎng)物(5ml)用QIApr印Spin Minipr印試劑盒方案(cat 27106)處理，產(chǎn)生小量制備的DNA質(zhì)粒。 使用BigDye⑧Terminator v3. 0循環(huán)測(cè)序快速反應(yīng)試劑盒(ABI cat. 4390242)
對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。每一選擇的質(zhì)粒使用M13正向和反向引物從兩個(gè)方向測(cè)序，在
GeneAmp9600 PCR儀上循環(huán)。電泳序列分析在ABI毛細(xì)管測(cè)序儀上進(jìn)行。 重復(fù)進(jìn)行RT-PCR、克隆、DNA序列分析的完整循環(huán)以獲得每一免疫球蛋白鏈三套
完全獨(dú)立的序列信息。 VH和Vka卯a(chǎn)基因的全推斷核苷酸序列分別如SEQ ID NO :15和SEQ ID NO :16所 示。這些序列包括每一可變基因片段頭部的先導(dǎo)序列，其編碼用于將新合成的抗體鏈轉(zhuǎn)運(yùn) 至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列；它們并不出現(xiàn)在最終的重鏈和輕鏈中。
參考文獻(xiàn) 1. P. G. Fallon等，Immunity 17， 7 (Jul, 2002)。
2. G.G進(jìn)ig等，Science 282,2261(1998)。
3.M.Wills_Karp等，Science 282,2258(1998)。
4. M. M. Fort等，Immunity 15， 985 (Dec, 2001)。
5.]\1尺.1(1111等，8100(1 100， 2330 (Oct 1,2002)。
6.G.Pan等，J Immunol 167， 6559 (Dec 1,2001)。
7. S. D. Hurst等，J Immunol 169， 443 (Jul 1,2002)。 8. T. A. Moseley， D. R. Haudenschild， L Rose, A. H. Reddi， CytokineGrowth Factor Rev 14，155 (Apr,2003)。 9. P. G. Fallon等，J Exp Med 203， 1105 (Apr 17,2006)。
10. A.M. 0wyang等，J Exp Med 203， 843 (Apr 17,2006)。
11. T. Tamachi等，J Allergy Clin Immunol 118， 606 (S印，2006)。
20
權(quán)利要求
結(jié)合IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，該抗體VH結(jié)構(gòu)域包括具有基本上如SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的VHCDR3。
2. 權(quán)利要求1所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VH結(jié)構(gòu)域還包括具有基本上如SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的CDRl，和具有基本上如SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的CDR2。
3. 權(quán)利要求1或2所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包括人框架區(qū)。
4. 權(quán)利要求1或2所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO :2。
5. 前述任一權(quán)利要求所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其還包括VL結(jié)構(gòu)域，該VL結(jié)構(gòu)域包含具有 基本上如SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的CDR1，具有基本上如SEQ ID N0:9所示氨基酸序 列的CDR2，以及具有基本上如SEQ ID NO :10所示氨基酸序列的CDR3。
6. 權(quán)利要求5所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VL結(jié)構(gòu)域包括人框架區(qū)。
7. 權(quán)利要求5所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VL結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO :4。
8. 前述任一權(quán)利要求所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其為Fab、F(ab' )2、scFv抗體片段。
9. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括抗體恒定區(qū)。
10. 權(quán)利要求9所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述恒定區(qū)是IgGl或IgG4恒定區(qū)。
11. 權(quán)利要求9所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括全抗體。
12. 分離的核酸，其包括編碼前述任一權(quán)利要求所述的靶標(biāo)結(jié)合元件的核苷酸序列。
13. 用于表達(dá)前述任一權(quán)利要求所述的靶標(biāo)結(jié)合元件的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括可 操作地與啟動(dòng)子連接的權(quán)利要求12的核酸。
14. 攜帶權(quán)利要求13所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
15. 生產(chǎn)靶標(biāo)結(jié)合元件的方法，該方法包括在用于生產(chǎn)所述靶標(biāo)結(jié)合元件的條件下培 養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，還包括分離所述靶標(biāo)結(jié)合元件。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的方法，其還包括將所述靶標(biāo)結(jié)合元件制成包 括至少一種附加成分的組合物。
18. 組合物，其包含權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的靶標(biāo)結(jié)合元件和藥學(xué)上可接受的載體。
19. 凍干粉形式的權(quán)利要求18所述的組合物。
20. 治療或預(yù)防哮喘的方法，所述方法包括向需要治療的受試者施用有效量的權(quán)利要 求1-11任一項(xiàng)所述的靶標(biāo)結(jié)合元件或權(quán)利要求18的組合物。
21. 用于治療或預(yù)防哮喘的權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的靶標(biāo)結(jié)合元件或權(quán)利要求18 的組合物。
22. 生產(chǎn)針對(duì)IL-25抗體的方法，該方法包括(a) 提供VH結(jié)構(gòu)域，其包括靶標(biāo)結(jié)合元件，所述靶標(biāo)結(jié)合元件結(jié)合IL-25并且包括抗體 VH結(jié)構(gòu)域，所述抗體VH結(jié)構(gòu)域包含VHCDR3，所述VH CDR3具有基本上如SEQ ID NO. 7所示 氨基酸序列；(b) 使所述VH結(jié)構(gòu)域與復(fù)數(shù)種抗體VL結(jié)構(gòu)域組合以提供抗體分子；(c) 篩選所述抗體分子與IL-25的結(jié)合；并且(d) 選擇與IL-25結(jié)合的抗體分子。
23. 權(quán)利要求22所述的方法，其中所述VH結(jié)構(gòu)域如權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所定義。
24. 生產(chǎn)針對(duì)IL-25的抗體的方法，該方法包括(a) 提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸起始庫(kù)，所述核酸包括將被替換的CDR3或缺乏CDR3編 碼區(qū)；(b) 使所述庫(kù)與供體核酸組合，所述供體核酸編碼具有基本上如SEQ ID N0:7所示氨 基酸序列的VH CDR3，這樣所述供體核酸插入到上述庫(kù)的CDR3區(qū)，從而提供編碼VH結(jié)構(gòu)域 的核酸產(chǎn)物庫(kù)；(c) 表達(dá)所述產(chǎn)物庫(kù)的核酸；(d) 選擇對(duì)IL-25特異性的靶標(biāo)結(jié)合元件；并且(e) 回收所述靶標(biāo)結(jié)合元件或編碼其的核酸。
25. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述產(chǎn)物庫(kù)與VL結(jié)構(gòu)域共表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗體2C3和結(jié)合白介素25的基于2C3的靶標(biāo)結(jié)合元件。它們?cè)谥委?、例如治療哮喘中是有效的?br> 文檔編號(hào)C07K16/24GK101711256SQ200880020620
公開日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2008年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日
發(fā)明者A·N·J·麥肯茲, S·巴蘭坦 申請(qǐng)人:醫(yī)療研究局