專利名稱：重組的北美1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及分子病毒學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)的重組核酸的構(gòu)建。
背景豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是世界范圍內(nèi)最具經(jīng)濟(jì)意義的豬的疾病。其通過(guò)母 豬的晚期生殖失敗以及仔豬的嚴(yán)重肺炎來(lái)表征。PRRS病毒(PRRSV)由兩種主要的基因型 歐洲基因型(1型)和北美基因型(2型)組成，每種基因型以前分布在不同的大陸上。近 期，1型PRRSV分離株(北美1型)已經(jīng)在美國(guó)豬群中被鑒定。這組病毒具有和典型的北 美型和歐洲型PRRSV明顯不同的獨(dú)特的抗原特性和遺傳特性。在Nsp2的免疫顯性區(qū)中鑒 定了特有的51bp的缺失。PRRS的病原體是含有單股正鏈RNA基因組的小的有包膜病毒。 PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)，該科包括馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)、乳酸脫氫酶增 高病毒(LDV)以及猴出血熱病毒(SHFV) (Snijder&Meulenberg，1998)。核苷酸序列比較顯 示PRRSV可分為不同的歐洲(1型)基因型和北美(2型)基因型(Allende等，1999 ；Nelson 等，1999)。PRRSV基因組長(zhǎng)度為約15kb，并包含九個(gè)開(kāi)放讀碼框?；蚪M的3，端編碼四個(gè)膜 締合性糖蛋白(GP2a、GP3、GP4和GP5 ；由sg mRNA 2_5編碼)，兩個(gè)非糖基化的膜蛋白(E和 M;由sg mRNA 2和6編碼)，以及一個(gè)核殼蛋白(N;由sg mRNA7編碼)(Bautista等，1996 ； Mardassi 等，1996 ;Meng 等，1996 ;Meulenberg&den Besten, 1996 ；Meulenberg 等；1995 ； Mounir等，1995 ；Wu等，2001，2005)。復(fù)制酶相關(guān)的基因，即ORFla和ORFlb，位于基因組的 5，端，其代表病毒基因組的近75%。預(yù)測(cè)ORF Iab編碼的多蛋白pplab在12個(gè)位點(diǎn)切割 形成 13 個(gè)產(chǎn)物:nspl α、nspl β，以及 nsp2 到 nspl2 (AlIende 等，1999 ；den Boon 等，1995 ； Nelsen 等，1999 ；Sni jder&Meulenberg, 1998)。針對(duì)PRRSV的改造的減毒疫苗目前可用于減少PRRSV相關(guān)的臨床疾病 (Boehringer-Ingelheim Animal Health, Inc.)。然而，它們無(wú)法在血清學(xué)上區(qū)分自然感 染痊愈的豬和已經(jīng)接種疫苗的豬。遺傳標(biāo)記的疫苗將允許區(qū)分接種疫苗的豬和自然感染的 豬，這是控制和消除PRRSV項(xiàng)目所需要的。概述重組的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)在開(kāi)放讀碼框(ORF) Ia中包括一個(gè)或多 個(gè)突變，所述突變使得重組的PRRSV不能產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于ORFla的至少一種功能性多肽。所述 突變可能是缺失。缺失可發(fā)生在nsp2區(qū)域中，并可包括表位ES4。在一實(shí)施方案中，缺失包 括ORFla的736-790位氨基酸。所述突變可包括異源DNA序列的插入。插入可在ORFla的 733位氨基酸和734位氨基酸之間。所述插入可包括綠色熒光蛋白(GFP)。重組的北美PRRS病毒由分離的多聚核苷酸分子編碼，此分子包括編碼感染性RNA 分子的DNA序列，該感染性RNA分子編碼北美PRRS病毒，并且所述DNA序列是SEQ ID NO 43或其同源序列。
疫苗包括在ORFla中具有突變的PRRSV突變體，該突變使得所述PRRSV突變體不 能產(chǎn)生功能性O(shè)RFla多肽，并且所述疫苗包括藥學(xué)可接受的運(yùn)載體。所述突變可包括nsp2 區(qū)域中的缺失，如nsp2區(qū)域中736-790位氨基酸的缺失。所述突變可包括異源DNA序列的 插入。所述插入可以在nsp2區(qū)域中的733位氨基酸和734位氨基酸之間。試劑盒包括疫苗，該疫苗包括在ORFla中具有突變的PRRSV突變體和藥學(xué)可接受 的運(yùn)載體，該突變使得所述PRRSV突變體不能產(chǎn)生功能性O(shè)RFla多肽，所述突變包括異源 DNA序列的插入。所述試劑盒還包括一種或多種第一多肽，該第一多肽由所述異源DNA序列 編碼，以及一種或多種第二多肽，該第二多肽由所述功能性O(shè)RFla編碼。PRRSV疫苗中的突 變可以是在nsp2區(qū)域中比如在ES4表位中的缺失，并且所述一種或多種第一多肽包括GFP， 且所述一種或多種第二多肽包括ES4表位。提供區(qū)分接種PRRSV標(biāo)記疫苗的動(dòng)物和自然感染PRRSV的動(dòng)物的方法，其中所述 PRRSV標(biāo)記疫苗包括插入突變和缺失突變。此方法包括以下步驟提供包括插入突變的第 一重組PRRSV蛋白，提供包括缺失突變的第二重組PRRSV蛋白，用第一重組PRRSV蛋白和 第二重組PRRSV蛋白孵育來(lái)自動(dòng)物的血清樣品，并檢測(cè)樣品中的抗體與第一重組PRRSV蛋 白和第二重組PRRSV蛋白的結(jié)合。樣品中的抗體與第一重組PRRSV蛋白的結(jié)合指示接種疫 苗的動(dòng)物，而樣品中的抗體與第二重組PRRSV蛋白的結(jié)合指示自然感染的動(dòng)物。第一重組 PRRSV蛋白可包括GFP插入，而第二重組PRRSV蛋白可包括ES4缺失。附圖簡(jiǎn)述

圖1是PRRSV基因組和克隆策略的示意圖。圖2A-2F顯示旨在檢查感染性克隆pSDOl-OS感染力的免疫熒光分析的結(jié)果。圖3是顯示克隆病毒、親本病毒和表達(dá)GFP的病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的圖。圖4顯示克隆病毒和親本病毒SD01-08的RT-PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切核酸酶片段 模式。圖5A和5B是顯示克隆病毒的體內(nèi)表征的圖。圖6A-6C顯示旨在檢查表達(dá)GFP的PRRSV的免疫熒光分析的結(jié)果。圖7是pSD01-08-GFP構(gòu)建體的示意圖。圖8是pSD01-08_GFP/AES4構(gòu)建體的示意圖。圖9是顯示GFP/Δ ES4標(biāo)記病毒生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的圖。圖10顯示GFP/ Δ ES4標(biāo)記病毒和親本病毒的噬斑形態(tài)。圖11顯示GFP表達(dá)的穩(wěn)定性。圖12顯示野生型GFP基因和Arg_97突變的GFP基因的比較。圖13是顯示GFP/AES4標(biāo)記病毒的體內(nèi)特性的圖。圖14A-14C是顯示GFP/AES4標(biāo)記病毒的病毒學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)的圖。圖15A-15C顯示基于GFP和ES4表位的ELISA結(jié)果。詳述開(kāi)發(fā)了北美1型PRRSV分離株的全長(zhǎng)cDNA克隆SD01-08。SD01-08與Lelystad病 毒相比時(shí)在核苷酸水平上擁有94. 同一性(GenBank登錄號(hào)DQ489311)。SD01-08和LV 之間的重要區(qū)別是在PAM和猴腎臟細(xì)胞中的生長(zhǎng)性質(zhì)。Meulenberg等人(15)報(bào)告的結(jié)果顯示野生型和克隆的LV病毒在PAM中生長(zhǎng)良好，但在MA-104來(lái)源的細(xì)胞系CL2621中低水 平生長(zhǎng)。親本和克隆的SDO1-08在PAM和MARC-145細(xì)胞中生長(zhǎng)一致良好，MARC-145細(xì)胞是 另外一種MA-104來(lái)源的細(xì)胞系。SD01-08克隆病毒的效價(jià)在48hpi時(shí)達(dá)到峰值，而此時(shí)LV 克隆病毒生長(zhǎng)至較低效價(jià)甚至在96hpi時(shí)仍未達(dá)到峰值。因此，SD01-08感染性克隆在連 續(xù)的細(xì)胞系中良好復(fù)制。LV和SD01-08之間的另外一個(gè)不同是在毒性水平上。在PAM中， LV克隆病毒達(dá)到IO71至107_9TCID5ciAil的高效價(jià)并在大約32hpi時(shí)達(dá)到峰值。SD01-08克 隆病毒在PAM中達(dá)到了和其親本病毒相同的效價(jià)，但是它們二者的效價(jià)都低于LV的效價(jià)， 僅達(dá)到了約104TCID5(1/ml，并且在稍后約72hpi時(shí)達(dá)到峰值。這一結(jié)果顯示SD01-08克隆病 毒的毒性弱于LV克隆病毒。實(shí)地(field)觀測(cè)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻擊研究支持此結(jié)論。SD01-08 不引發(fā)顯著的臨床病征，并且在實(shí)驗(yàn)感染的豬中僅觀察到輕微的病理?yè)p傷。相反，據(jù)報(bào)道LV 引發(fā)豬的顯著呼吸道問(wèn)題和母豬的流產(chǎn)(34)。 感染性克隆的主要應(yīng)用之一是用其作為構(gòu)建遺傳工程疫苗的病毒骨架。美國(guó)目前 的PRRSV疫苗主要針對(duì)北美2型分離株。北美1型PRRSV的出現(xiàn)要求疫苗對(duì)PRRSV的兩種 基因型都有效。任何活病毒疫苗的基本要求是低毒性，不引發(fā)或者至多引發(fā)極輕微的疾病 表現(xiàn)癥狀。親本病毒SD01-08是從沒(méi)有顯示臨床病征的豬群中分離得到的。發(fā)病機(jī)理研究 證實(shí)了 SD01-08在疾病急性期擁有低毒特性，這就表明PSD01-08感染性克隆是可能的低毒 性株系并且適合疫苗構(gòu)建。開(kāi)發(fā)疫苗的關(guān)鍵步驟之一是包括用于診斷區(qū)分接種疫苗的動(dòng)物和自然感染野生 型病毒動(dòng)物的標(biāo)記。標(biāo)記疫苗對(duì)于致力于控制或者消除食用動(dòng)物和伴侶動(dòng)物的病毒感染 的項(xiàng)目是重要的(Babiuk，1999 ;Babiuk 等，1999，2002 ;van Oirschot，2001)。皰疹病毒標(biāo) 記疫苗是首批被證實(shí)在實(shí)地有效的疫苗之一(Bosch等，1996 ；van Oirschot等，1996)，隨 后有各種遺傳修飾的RNA病毒，如典型性豬瘟病毒(Widjojoatmodjo等，2000 ；van Gennip 等，2002)和牛瘟病毒(Walsh等，2000)。在根除EAV項(xiàng)目中，因?yàn)轳R被廣泛用于國(guó)際貿(mào) 易和交通，標(biāo)記疫苗是一些立法機(jī)構(gòu)所需要的。區(qū)分疫苗接種和感染正成為主流論點(diǎn) (Castillo-Olivares等，2003)。同樣的，在根除PRRSV項(xiàng)目中，生豬和豬肉的國(guó)際貿(mào)易未來(lái) 也將可能需要標(biāo)記疫苗。此外，隨著世界日益走向PRRSV的消除，血清監(jiān)測(cè)是核實(shí)疾病狀況 的基本工具。目前有效的常規(guī)疫苗無(wú)法區(qū)分野生型感染和疫苗接種。因此，血清監(jiān)測(cè)在面 臨疫苗接種時(shí)或者疫苗接種結(jié)束幾個(gè)月后是無(wú)法進(jìn)行的。明顯地，標(biāo)記疫苗將會(huì)有很大優(yōu) 勢(shì)。北美1型PRRSV的感染性克隆pSD01-08被用于產(chǎn)生重組的PRRSV。和歐洲 Lelystad病毒(LV)感染性克隆相比，pSD01_08具有幾個(gè)明顯的生物學(xué)特性(1)pSD01_08 感染性克隆來(lái)源于2001年美國(guó)分離的親本株系，該親本株系代表北美1型PRRSV; (2)親本 株系SD01-08是從8周大的顯示無(wú)臨床病征的豬群中分離得到的；并且(3)SD01-08在Nsp2 的免疫顯性區(qū)域中具有特有的51bp的缺失(Fang等，2004)。nsp2在病毒復(fù)制中發(fā)揮作用。nsp2含有位于N末端的半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。這 一結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)nsp2/3切割，并且還作為輔因子和nsp4絲氨酸蛋白酶一起加工其他切割產(chǎn) 物(Snijder 等，1994，1995 ；Wassenaar 等，1997)。除了在病毒復(fù)制中的作用外，EAV和I3RRSV nsp2的半胱氨酸蛋白酶顯示屬于卵巢瘤(OTU)蛋白酶超家族。OTU蛋白酶能夠把泛素和ISG 15從細(xì)胞蛋白上解離下來(lái)，從而抑制Ub-和ISG15-依賴的先天免疫應(yīng)答(Frias-Staheli等，2007)。
標(biāo)記疫苗的開(kāi)發(fā)是基于操作cDNA感染性克隆，其中可插入外源抗原(正標(biāo)記) 或者可缺失產(chǎn)生免疫原性表位(負(fù)標(biāo)記)。針對(duì)外源抗原或者病毒表位的抗體應(yīng)答可被用 于區(qū)分接種疫苗的動(dòng)物和自然感染的動(dòng)物。PRRSV nsp2是用于標(biāo)記改造的優(yōu)秀的候選位 點(diǎn)。和標(biāo)記工程相關(guān)的最重要的nsp2性質(zhì)是nsp2耐受大的缺失和插入的能力。已報(bào)道 了蛋白質(zhì)中心區(qū)內(nèi)的核苷酸序列插入/缺失(Gao等，2004 ；Shen等，2000 ；Tian等，2007 ； Han等，2007)。與標(biāo)記工程相關(guān)的另一性質(zhì)是在這個(gè)區(qū)域中幾個(gè)免疫顯性表位的存在。丹 麥1型病毒的nsp2區(qū)域中有六個(gè)線性B-細(xì)胞表位位點(diǎn)(ES) (ES2到ES7)已被鑒定出來(lái) (Oleksiewicz等，2001)。在2型病毒中，發(fā)現(xiàn)nsp2與結(jié)構(gòu)蛋白相比時(shí)含有免疫顯性表位的 頻率最高(de Lima等，2006)。制備了在美國(guó)1型PRRSV感染性克隆的nsp2區(qū)域中的標(biāo)記修飾。正標(biāo)記GFP 被插入到nsp2區(qū)域，但是GFP基因不穩(wěn)定。隨后，位于nsp2區(qū)域中的高度免疫原性表位 ES4 (ORFla的736到790位氨基酸)被缺失然后用反向遺傳學(xué)置換入GFP基因(位于ORFla 的733/734位氨基酸)來(lái)構(gòu)建負(fù)標(biāo)記。表征得到的重組病毒的體外復(fù)制特征和體內(nèi)生物學(xué) 特性，以確定其作為標(biāo)記疫苗抗PRRSV感染的潛在用途。測(cè)試基于GFP抗原和基于ES4肽 抗原的ELISA，以確定它們作為標(biāo)記檢測(cè)和區(qū)分的伴隨診斷分析的靈敏性和特異性。I.正標(biāo)記 GFP細(xì)胞和病毒。北美1型PRRSV分離株SD01-08最早在2001年從美國(guó)的8周大的豬 群中分離得到，這個(gè)豬群沒(méi)有表現(xiàn)出PRRS的臨床病征。為從體外轉(zhuǎn)錄的RNA中復(fù)原病毒， 幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21C 13 美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)被用于起始的轉(zhuǎn)染。MARC-145細(xì) 胞被用于病毒拯救和后續(xù)的實(shí)驗(yàn)(Fang等，2006)。豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)通過(guò)對(duì)無(wú)特異病 原體無(wú)PRRSV的仔豬進(jìn)行肺灌洗獲得。RNA提取、RT-PCR和測(cè)序用MOI接近0. 1的噬斑純化的病毒感染MARC-145細(xì)胞。 三天后，將培養(yǎng)物上清液層放在0. 5M蔗糖墊上，以100，OOOxg在SW41轉(zhuǎn)頭(Beckman)中離 心14小時(shí)。使用QIAamp病毒RNA試劑盒(Qiagen)從沉淀中提取RNA。為獲得親本病毒 SDO1-08的全長(zhǎng)基因組序列，使用一系列引物進(jìn)行RT-PCR(Ropp等，2004)。每個(gè)RT-PCR產(chǎn) 物直接從兩個(gè)方向測(cè)序至少2次以獲得共有序列。為構(gòu)建感染性的克隆，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增 側(cè)翼于獨(dú)特限制性酶位點(diǎn)的覆蓋全長(zhǎng)病毒基因組的9個(gè)重疊片段(圖1)。RT-PCR擴(kuò)增所 用正向和反向寡核苷酸最開(kāi)始依據(jù)LV序列(GenBank登錄號(hào)M96262 ； 18)而設(shè)計(jì)，后來(lái)修改 為和SD01-08序列(表1)相匹配。進(jìn)行RT-PCR(Fang等，2004)。這些RT-PCR擴(kuò)增的片段 通過(guò)凝膠純化，并克隆入PCR-Blimt II-Topo載體(Invitrogen)。每個(gè)片段的三個(gè)克隆被 測(cè)序，并將含有共有序列的克隆用于感染性克隆的裝配。表1 ·用于RT-PCR擴(kuò)增的引物
*為產(chǎn)生Seal限制性酶位點(diǎn)而突變的核苷酸為粗斜體。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，使用GeneRACER試劑盒(Invitrogen)確定基因組序列的5’ 和3，端。通過(guò)使用引物ElGF和E2968R(表1)的RT-PCR制備代表病毒基因組5，末端的 片段，所述片段在緊接真實(shí)的5’末端核苷酸前整合T7RNA聚合酶位點(diǎn)和Ascl限制性酶位 點(diǎn)。包含3’端序列的片段通過(guò)使用引物018聚腺苷酸對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而構(gòu)建，該片段的 側(cè)翼為41個(gè)聚腺苷酸殘基和Xbal位點(diǎn)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后用引物E14059F和0183’ R(表 1)進(jìn)行PCR。北美1型PRRSV全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建及其感染力的確定。北美1型PRRSV的全 長(zhǎng)基因組cDNA克隆pSDOl-OS使用圖1所示策略進(jìn)行構(gòu)建。通過(guò)用填充片段置換BamHl 和Bgll位點(diǎn)之間的片段改造低拷貝數(shù)質(zhì)粒pACYC177 (GenBank登錄號(hào)X06402)，該填充 片段制備為含有圖1所示的限制性酶位點(diǎn)的合成基因。使用限制性酶將每個(gè)病毒片段從 PCR-BluntII-Topo上切下并連入使用同樣的限制性酶消化的pACYC177質(zhì)粒。每一個(gè)連接 步驟之后，將PACYC177構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌(E.C0li)DH5a細(xì)胞，并于37°C在卡那霉素 存在下培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)完整裝配的全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，并將全長(zhǎng)基因組序列以登錄號(hào) DQ489311 保存于 GenBank。為生成Seal限制性酶位點(diǎn)，使用位點(diǎn)定向誘變?cè)?RF7的42位核苷酸(SD01-08基 因組的14588位核苷酸)生成沉默突變(G到T突變)。位點(diǎn)定向誘變通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù) (Ho 等，1989 Jespersen 等，1997)實(shí)現(xiàn)，使用了 引物對(duì) E14059F/ScalR 和 ScalF/YFp503R。 通過(guò)DNA測(cè)序分析確認(rèn)突變產(chǎn)物。
此構(gòu)建體包含位于病毒基因組5’末端的噬菌體T7RNA聚合酶啟動(dòng)子、一個(gè)被引入 到T7啟動(dòng)子和病毒基因組第一個(gè)核苷酸之間的額外的鳥(niǎo)嘌呤核苷殘基、SD 01-08的15047 個(gè)核苷酸的全長(zhǎng)基因組和并入到基因組的3’端的41殘基的聚腺苷酸尾。與親本病毒的基 因組序列相比，PSD01-08的DNA序列包含6個(gè)核苷酸差異(表2)。表2.親本SD 01-08分離株和全長(zhǎng)cDNA克隆之間的核苷酸差異。 這些差異中的四個(gè)是沉默突變。引入14588位核苷酸的突變以在0RF7中生成用于 區(qū)分克隆病毒和親本病毒的獨(dú)特的Seal限制性酶位點(diǎn)。核苷酸突變中有兩個(gè)導(dǎo)致氨基酸 變化，包括位于NsplO的9492位核苷酸的C到T的取代(氨基酸P到L)，以及位于Nspll 的11261位核苷酸的T到C的取代(氨基酸Y到H)。pSDOl-OS質(zhì)粒通過(guò)限制性酶Xbal線性化，并用于通過(guò)T7 RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄 來(lái)合成加帽的RNA。將體外轉(zhuǎn)錄的加帽RNA轉(zhuǎn)染入BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過(guò)使 用mAb SDOffl7的熒光抗體染色來(lái)檢查細(xì)胞的N蛋白的表達(dá)(圖2A)。圖2A的結(jié)果顯示約 5%的轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)N蛋白。將來(lái)自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液在MARC-145細(xì)胞上傳代。72小時(shí) 后，使用 SD01-08 特異性抗-Nsp2mAb ES3-458-46 (圖 2B)，和抗-N mAbSD0W17 (圖 2C)對(duì) MARC-145細(xì)胞進(jìn)行染色。包括北美2型PRRSV特異性抗_N mAb MR39 (圖2D)作為負(fù)對(duì)照。 結(jié)果顯示在使用來(lái)自PSD01-08轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞的上清液接種的MARC-145細(xì)胞中，Nsp2 和N蛋白二者均被檢測(cè)到。進(jìn)一步將上清液在新鮮的MARC-145細(xì)胞上傳代時(shí)(MARC-145 細(xì)胞上的第2代)，感染后48到72小時(shí)(hpi)內(nèi)觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。對(duì)MARC-145 細(xì)胞上的第2代病毒的滴定顯示平均效價(jià)為3. 6 X 107FFU/ml。這些結(jié)果表明從使用體外轉(zhuǎn) 錄的RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中拯救了有活力且具感染力的北美1型PRRSV。GFP插入通過(guò)將GFP基因序列(Clontech)插入質(zhì)粒pSD01-08中病毒基因組的 Nsp2區(qū)域(核苷酸2420/2421)構(gòu)建pSDO 1-08-GFP克隆。用正向引物gfpF和反向引物gfpR 從pEGFP-Nl質(zhì)粒(Clontech)中擴(kuò)增GFP基因。使用引物對(duì)Nsp2Fl/Nsp2Rl和Nsp2F2/ Nsp2R2通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)(Ho等，1989，Jesperson等，1997)插入GFP。PCR產(chǎn)物使用 Rsrll和Acll限制性酶消化，并連入用相同限制性酶消化的PSD01-08質(zhì)粒中。PRRSV的體外轉(zhuǎn)錄和拯救質(zhì)粒pSD 01-08或者pSD01-08-GFP用限制性酶Xbal線性化。使用mMessage Machine試劑盒(Ambion)用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄加帽的RNA，并按照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)使用DMRIE-C試劑(Invitrogen)將所述加帽的RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞。 為了拯救病毒，將轉(zhuǎn)染后48小時(shí)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在MARC-145細(xì)胞上連續(xù)傳代。 感染性病毒的拯救通過(guò)間接的免疫熒光分析(IFA) (Ropp等，2004)來(lái)確認(rèn)。開(kāi)發(fā)單克隆抗 體(MAb)用于 IFA 檢測(cè)，包括特異識(shí)別 SD01-08 的 Nsp2 的 MAb ES3-458-46 (Fang 等，Conf. Res. Work. Anim, Dis.，abstr. 78，2004)。MAb MR39 特異性識(shí)別北美 2 型 PRRSV 的 N 蛋白， 而MAbSD0W17識(shí)別兩個(gè)基因型的PRRSV的N蛋白(Nelson等，1993 ；Ropp等，2004)。針對(duì) GFP病毒的拯救，GFP的表達(dá)也使用熒光顯微鏡直接目測(cè)。通過(guò)使用MOI為0. 1的克隆病毒和親本病毒感染MARC-145細(xì)胞來(lái)檢查生長(zhǎng)動(dòng)力 學(xué)。在感染后0、6、12、24、36、48、60和72小時(shí)收集被感染細(xì)胞，通過(guò)對(duì)嫩此-145細(xì)胞的正八 確定病毒的效價(jià)并按每毫升的熒光灶單位(fluorescent focus unit per ml, FFU/ml)定 量。通過(guò)對(duì)MARC-145細(xì)胞進(jìn)行噬斑分析來(lái)比較克隆病毒和親本病毒的噬斑形態(tài)。以0. IMOI 的病毒感染匯合的細(xì)胞單層。兩小時(shí)后，除去細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，并加上瓊脂覆蓋層。37°C 下5天后，檢測(cè)噬斑，并用0. 結(jié)晶紫染色?？寺〔《镜捏w外表征。親本病毒和克隆病毒(MARC-145細(xì)胞上的第2代)在豬肺 泡巨噬細(xì)胞(PAM)中進(jìn)行滴定。使用抗-N mAb進(jìn)行的免疫熒光染色顯示兩種病毒均在PAM 中復(fù)制(圖2E和2F)，并在72hpi產(chǎn)生相似的病毒產(chǎn)量(2. 1-2. 8 X 104FFU/ml)。為進(jìn)一步比較克隆病毒和親本病毒的生長(zhǎng)特性，MARC-145細(xì)胞被MOI為0. 1的每 種病毒感染，并在6、12、24、36、48、60和721^1收獲。生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示克隆病毒擁有和親 本病毒相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)(圖3)。兩種病毒的效價(jià)均在48hpi達(dá)到峰值。克隆病毒效價(jià) 的峰值是1. 39X 107FFU/ml，相比于親本病毒效價(jià)的峰值為2. 34X 107FFU/mlo這些病毒的 噬斑形態(tài)也被檢查，克隆病毒產(chǎn)生的噬斑的大小與親本病毒的噬斑的大小相似(數(shù)據(jù)未顯 示)。這些結(jié)果表明克隆病毒具有與親本野生型病毒相似的體外特性。為區(qū)分克隆病毒和親本病毒，我們?cè)?RF7的42位核苷酸工程改造了 Seal限制性 酶位點(diǎn)。如圖4所示，克隆病毒中13875到14928位核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)生的1054bp的RT-PCR 片段被Seal切割。相反，親本病毒產(chǎn)生的RT-PCR片段不被Seal切割。pSD 01-08衍生的克隆病毒在豬模型中的病原和免疫學(xué)特性。利用看護(hù)豬模型 (nursery pig model)進(jìn)行了感染性克隆衍生病毒復(fù)制特性的體內(nèi)研究。21頭4周大的 PRRSV幼稚的豬從被證明為PRRSV陰性的豬群中獲得，并被隨機(jī)分成4組，分別圈養(yǎng)在隔離 的設(shè)施中。在4天的馴化期之后，每組的豬(對(duì)于克隆病毒感染組，η = 6 ；對(duì)于剩余組，η =5)鼻內(nèi)接種1毫升IO5TCID5tl的克隆病毒(組1)或者親本病毒(組2)。第三組動(dòng)物接 種目前的改造的活病毒(MLV) Ingelvac PRRSV疫苗。負(fù)對(duì)照組(組4)動(dòng)物使用MARC-145 細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行模擬攻擊。在感染后前7天，每天觀察豬的臨床病征并量取其體溫。在0、7、14、21、28、35和 42天從所有豬獲取血液樣品。血清樣品保存在-80°C以備進(jìn)一步的檢測(cè)。在接種后21天 (dpi)，從每組取兩頭豬，對(duì)其實(shí)施安樂(lè)死，以便進(jìn)行急性感染的事后分析。每組剩余的三頭 豬在42dpi進(jìn)行安樂(lè)死。使用以前開(kāi)發(fā)的基于每個(gè)肺葉貢獻(xiàn)給整個(gè)肺的大概容量的系統(tǒng)來(lái) 評(píng)估研究動(dòng)物的肺損傷左頂葉和右頂葉、左心葉和右心葉以及中葉各自貢獻(xiàn)了總肺容量 的10%，而左尾葉和右尾葉各自貢獻(xiàn)了 25%。然后使用這些得分基于每個(gè)肺葉的相對(duì)貢獻(xiàn)計(jì)算總的肺損傷得分(Halbur等，1995)。為檢測(cè)病毒1 離及確定病毒量，0、7、14、21、28、35和42(1 1的血清樣品使用實(shí)時(shí) 定量PCR(Tetracore VetAlert PRRS ;Wasilk等，2004)來(lái)檢測(cè)，此技術(shù)在南達(dá)科他動(dòng)物疾 病研究和診斷實(shí)驗(yàn)室(SDSU-ADRDL)是常規(guī)使用的。所有血清樣品使用IDEXXHerdChek PRRS 2XR ELISA和病毒中和分析(VN)來(lái)評(píng)估抗-PRRSV抗體。在SDSU-ADRDL，這些檢測(cè)也 是以嚴(yán)格的質(zhì)量保證方針常規(guī)實(shí)施的。
所有接受病毒的豬都被感染，這一點(diǎn)通過(guò)病毒RNA在血清中存在的陽(yáng)性RT-PCR結(jié) 果和血清學(xué)得到證實(shí)。血清中的病毒在感染后約14天(dpi)達(dá)到峰值(圖5A ；表3)。在 14dpi，克隆病毒組6頭豬中的5頭，親本病毒組5頭豬中的4頭，以及疫苗組的所有5頭豬 已血清轉(zhuǎn)變(圖5B ；表3)?？寺〔《竟艚M6頭豬中的4頭在21dpi具有可檢測(cè)的中和抗 體效價(jià)，而親本病毒攻擊組5頭豬中的1頭在21dpi發(fā)展出中和抗體。MLV疫苗攻擊組中的 2頭豬在42dpi發(fā)展出可檢測(cè)的中和抗體效價(jià)(表3)。表3.感染后不同天數(shù)(dpi)接種的豬的血清的血清學(xué)和PCR結(jié)果小結(jié)。 apCR 由實(shí)時(shí)PCR確定的每一組中PCR陽(yáng)性的豬的數(shù)量/豬的總數(shù)；bELISA 由 IDEXXHerdChekePRRS 2XR ELISA確定的每一組中血清陽(yáng)性的豬的數(shù)量/豬的總數(shù)；eVN:由 熒光灶中和分析確定的發(fā)展中和抗體應(yīng)答的豬的數(shù)量/豬的總數(shù)。結(jié)果被解釋為病毒感染 減少90%。*兩頭豬在21天被實(shí)施安樂(lè)死用于急性感染的分析。所有模擬感染的豬在整個(gè)研究期間保持RT-PCR和PRRSV抗體陰性。在任何被感 染的豬中都沒(méi)有觀察到明顯的臨床病征。僅在克隆病毒組6頭豬中的3頭，親本病毒組5 頭豬中的5頭以及疫苗組5頭豬中的2頭觀察到輕微的PRRSV特征的病理性肺損傷，例如 微弱的間質(zhì)性肺炎。其余的豬沒(méi)有表現(xiàn)出總的肺損傷(表4)。有趣的是，當(dāng)比較不同組的 豬的病理性損傷時(shí)，被親本病毒感染的豬顯示略高的損傷得分。表4.被感染的豬中具有總的肺炎損傷的肺的百分比。
*總的肺的病理學(xué)通過(guò)使用總的豬肺損傷評(píng)分系統(tǒng)來(lái)評(píng)測(cè)，這個(gè)系統(tǒng)評(píng)估肺的每 個(gè)肺葉的％肺炎，且每個(gè)肺葉的％肺炎加起來(lái)為整個(gè)肺的％肺炎(10)。將綠色熒光蛋白引入感染性克隆的Nsp2區(qū)。我們探索了利用此感染性克隆表達(dá) 外源基因的潛力。以前的研究顯示Nsp2是外源基因插入的優(yōu)秀候選位點(diǎn)。1型和2型兩者 的Nsp2的C末端區(qū)都含有高變結(jié)構(gòu)域，包括氨基酸插入和缺失(7、8、27)。SD01-08和歐洲1 型病毒的原型成員LV的主要不同之一是Nsp2中存在17個(gè)氨基酸的缺失，該缺失位于LV的 ORFl的734到750位氨基酸之間。我們將綠色熒光蛋白(GFP)插入Nsp2的這一獨(dú)特缺失 位點(diǎn)(SD01-080RFla的733/734位氨基酸，圖7)。構(gòu)建體pSD01-08-GFP被體外轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)染 進(jìn)BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后在熒光顯微鏡下直接檢查活細(xì)胞。將來(lái)自轉(zhuǎn)染的BHK細(xì) 胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在MARC-145細(xì)胞上傳代，導(dǎo)致表達(dá)GFP細(xì)胞的出現(xiàn)，這些細(xì)胞最早 在感染后6小時(shí)就可以清楚顯現(xiàn)(圖6A)。為確認(rèn)GFP-Nsp2融合蛋白的表達(dá)，在感染后48 小時(shí)，固定細(xì)胞并用Nsp2特異性mAb ES3-4 58-46染色。ES3-4 58-46通過(guò)用從ES3表位 序列制備的合成肽免疫接種小鼠產(chǎn)生，ES3表位序列位于GFP插入位點(diǎn)的緊接上游(圖7)。 紅色熒光Cy3偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG被用作二抗。共聚焦顯微鏡顯示GFP和Nsp2都定位 于核周，這與親本病毒的Nsp2定位相似(圖6B和6C)。為確定GFP的表達(dá)是否影響病毒復(fù) 制，將GFP病毒的生長(zhǎng)特性與親本野生型及克隆病毒的生長(zhǎng)特性進(jìn)行比較。PSD01-08-GFP 病毒的復(fù)制周期與其它病毒相似，包括在48hpi達(dá)到病毒效價(jià)峰值；但是，GFP病毒感染的 效價(jià)的峰值降低了約10倍(圖3)。為研究多輪病毒復(fù)制后GFP表達(dá)的穩(wěn)定性，將GFP病毒在MARC-145細(xì)胞上連續(xù)傳 代8次。到第7代，出現(xiàn)了不表達(dá)GFP的病毒的亞群體，它占總病毒群體的15%。GFP的丟 失也通過(guò)RT-PCR被分析。從用第7代的GFP病毒感染的細(xì)胞中分離總細(xì)胞RNA，并將RNA 用作RT-PCR反應(yīng)的模板，此反應(yīng)使用擴(kuò)增GFP插入?yún)^(qū)域的引物。RT-PCR產(chǎn)物被克隆和測(cè) 序。結(jié)果顯示GFP的N末端1-159位氨基酸被缺失(圖7)。更有趣的是，在1_159位氨基 酸被缺失的同時(shí)，兩個(gè)氨基酸，即甲硫氨酸(M)和谷氨酸(E)，被病毒插在GFP的160位氨基 酸前面(圖7)。因此，編碼GFP基因中的缺失的病毒基因組的選擇解釋了表達(dá)GFP的感染細(xì)胞的百分比的下降。綜合而言，這些結(jié)果表明Nsp2區(qū)能夠耐受外源基因的引入。然而， 外源基因的插入降低病毒的復(fù)制水平。因此，正標(biāo)記，即GFP基因，是不穩(wěn)定的。II.負(fù)標(biāo)記病毒 GFP/Δ ES4GFP/AES4負(fù)標(biāo)記疫苗病毒的構(gòu)建。為獲得潛在的負(fù)標(biāo)記疫苗病毒，使用引物對(duì) AES4F/E3448R 和 E1895F/AES4R (表 5)通過(guò)重疊延伸 PCR 技術(shù)(Hayashi 等，1994)缺失 位于GFP下游(在SD01-08病毒基因組的2427到2591位核苷酸)的B細(xì)胞表位ES4。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Rsrll和EcoRV限制性酶消化并連入經(jīng)過(guò)相同限制性酶消化的pSD01-08-GFP質(zhì) 粒。得到的質(zhì)粒構(gòu)建體被命名為pSD01-08-GFP/AES4(圖8)。表5.用于ES4表位缺失和ELISA抗原表達(dá)的引物。
*GFP的核苷酸為粗體，限制性酶位點(diǎn)為斜體帶下劃線；@數(shù)字對(duì)應(yīng)于SD01-08基因組內(nèi)的核苷酸位置。圖8是pSD01-08-GFP/ Δ ES4構(gòu)建體的示意圖。GFP被插入到ORFla的733和734位 氨基酸之間，而位于GFP下游的免疫原性B細(xì)胞表位ES4 (736到790位氨基酸)從SD01-08 病毒中被缺失。將此質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染入ΒΗΚ-21細(xì)胞啟動(dòng)了完整的病毒復(fù)制周期。轉(zhuǎn)染 后48小時(shí)獲得的來(lái)自ΒΗΚ-21細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在MARC-145細(xì)胞上傳代，回收感 染性后代病毒，并將得到的病毒命名為GFP/Δ ES4標(biāo)記病毒。親本病毒SDO1-08平行地從 PSD01-08 cDNA克隆中產(chǎn)生。從MARC-145細(xì)胞得到的病毒的第2代用于體外和體內(nèi)表征。生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究顯示GFP/AES4標(biāo)記病毒以較慢的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行復(fù)制，比親本病毒 SD01-08晚幾個(gè)小時(shí)達(dá)到最高效價(jià)。標(biāo)記病毒的病毒效價(jià)峰值(3. 34X 104FFU/ml)比親本病 毒的病毒效價(jià)峰值(2. 56 X 106FFU/ml)低約兩個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)(圖9)。圖9顯示GFP/ Δ ES4標(biāo)記 病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。MARC-145細(xì)胞平行地用MOI為0. 1的第三代的GFP/ Δ ES4標(biāo)記病毒和 親本病毒進(jìn)行感染。感染后0、6、12、24、36、48、60和72小時(shí)，收獲細(xì)胞并通過(guò)對(duì)MARC-145 細(xì)胞進(jìn)行IFA以確定病毒效價(jià)。這些結(jié)果是實(shí)驗(yàn)的三個(gè)重復(fù)的平均值，并且病毒的效價(jià)被 表示為每毫升的熒光灶單位(FFU/ml)。標(biāo)記病毒和親本病毒的噬斑形態(tài)通過(guò)對(duì)MARC-145 細(xì)胞進(jìn)行噬斑分析來(lái)比較。由GFP/Δ ES4標(biāo)記病毒形成的病毒噬斑的大小急劇減小，并且 大多數(shù)噬斑為針尖大小(圖10)，這暗示GFP插入/ES4缺失對(duì)于感染過(guò)程中細(xì)胞到細(xì)胞的 擴(kuò)散速率有負(fù)效應(yīng)。圖10顯示GFP/Δ ES4標(biāo)記病毒(10_1)和親本病毒(10_2)的噬斑形 態(tài)。匯合的細(xì)胞培養(yǎng)物單層用MOI為0.1的病毒進(jìn)行感染。感染2小時(shí)后，移去細(xì)胞培養(yǎng) 物上清液并加上瓊脂覆蓋層。37°C下5天后檢測(cè)噬斑，并用0. 結(jié)晶紫染色。重組病毒中GFP插入或者ES4缺失的體外穩(wěn)定性通過(guò)MARC-145細(xì)胞中的10次連 續(xù)傳代(每次傳代孵育72小時(shí))來(lái)追蹤。第十代病毒的GFP/AES4區(qū)被測(cè)序。令人驚奇 地是，與經(jīng)歷了 N末端159氨基酸缺失的先前的SD01-08-GFP病毒不同，GFP/AES4標(biāo)記病 毒中的GFP保持為完整的全長(zhǎng)基因，且ES4缺失仍然存在。這一結(jié)果表明ES4表位區(qū)的缺 失提高了插入的外源基因GFP的穩(wěn)定性。感染細(xì)胞中的一小部分被鑒定到GFP相關(guān)熒光的 丟失(圖11)。用第10代的GFP/AES4標(biāo)記病毒感染的MARC-145細(xì)胞中的GFP表達(dá)顯示 于11-1。用AlexiFluor標(biāo)記的抗核殼體單克隆抗體SD0W17 (Nelson等，1993)染色的相同 病毒灶顯示于11-2。丟失GFP熒光的病毒群體用圓圈標(biāo)出。
對(duì)于GFP/ Δ ES4區(qū)域，我們進(jìn)行了三次獨(dú)立重復(fù)的PCR和測(cè)序(正反兩個(gè)方向)。 因而，總共得到六個(gè)序列。在其中一個(gè)序列中，核苷酸C-289到Τ-289的突變被鑒定出，這個(gè) 突變引起GFP的位置97處由精氨酸到半胱氨酸的氨基酸突變，而這可能對(duì)應(yīng)于丟失GFP相 關(guān)熒光的小部分被感染細(xì)胞(圖12)。在其他5個(gè)序列上沒(méi)有檢測(cè)到突變。圖12顯示野生 型GFP基因和Arg-97突變的GFP基因相比較的電泳圖。細(xì)胞培養(yǎng)的第10代的GFP/ Δ ES4 標(biāo)記病毒的GFP插入?yún)^(qū)域被測(cè)序。氨基酸由單字母符號(hào)表示，粗體字母指示從CGC(Arg)到 TGC(Cys)的突變氨基酸。ES4和GFP抗原的表達(dá)。ES4抗原使用以前描述的改良方法(Sun等，2004)表達(dá) 為串聯(lián)重復(fù)的ES4表位。簡(jiǎn)述之，將三個(gè)拷貝的ES4表位(SD01-08的ORFla的736-790位 氨基酸)構(gòu)建進(jìn)蛋白表達(dá)載體pET_28a(+) (Novagen)。在表位之間加入柔性肽連接體，即 GGTGGTGGTGGTTCC，以幫助展示表位。有兩個(gè)正向引物。正向引物1 pET_ES4Fl含有BglII 限制性位點(diǎn)，但是沒(méi)有連接體序列，而正向引物2pET-ES4F2不僅包含BglII限制性位點(diǎn)， 而且包含連接體序列。ES4基因片段首先用正向引物1和反向引物pET-ES4R擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物用BglII和HindIII消化，然后克隆進(jìn)用BamHI和HindIII消化的pET_28a。這個(gè)克 隆被命名為pET-28a-ES4(+l)。ES4的第二個(gè)拷貝用正向引物2和反向引物pET ES4R進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用BglII和HindIII消化，然后克隆進(jìn)用BamHI和HindIII消化的 pET-28a-ES4(+l)。ES4的第三個(gè)拷貝利用和第二個(gè)拷貝同樣的策略插入。最終的構(gòu)建體被 命名為 pET-28a-ES4 (+3)。用引物對(duì) pET-EGFP-F/pET-EGFP-R 從 pEGFP-附質(zhì)粒(Clontech) 擴(kuò)增GFP基因。PCR產(chǎn)物用BamHI和HindIII限制性酶消化并連入用相同酶消化的pET_28a 載體。重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，從而生成N末端帶有6個(gè)組氨酸殘基的融 合蛋白。所述蛋白用鎳親和層析純化，并用SDS-PAGE分析，如我們以前的出版物中所述 (Ferrin 等，2004)。GFP/Δ ES4標(biāo)記病毒的體內(nèi)表征。GFP/Δ ES4標(biāo)記病毒的體內(nèi)特性在看護(hù)豬疾病 模型中進(jìn)行研究。18頭4周大的豬購(gòu)自無(wú)PRRSV的豬群。動(dòng)物被隨機(jī)分成三組(η = 6/ 組)，在BL2隔離條件下圈養(yǎng)，在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)接種前先馴化7天的時(shí)間。組1的豬用GFP/AES4 標(biāo)記病毒感染，組2的豬用親本SD01-08病毒感染作為正對(duì)照，組3的豬用細(xì)胞培養(yǎng)基模擬 感染。組1和組2的豬用1χ10650%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)的病毒(每個(gè)部位1毫升) 通過(guò)鼻內(nèi)和肌肉內(nèi)兩個(gè)部位進(jìn)行接種。感染后42天(dpi)，組1和組2的豬用異源的1型 株系即SD03-15病毒攻擊。SD03-15是另一個(gè)美國(guó)1型株系，是在2003年提交到我們?cè)\斷實(shí)驗(yàn)室的臨床樣品 中分離得到的。在實(shí)地報(bào)告中，感染了SD03-15的豬經(jīng)歷了 3周時(shí)間內(nèi)80-90%的斷奶前 死亡率。減少的表現(xiàn)持續(xù)到肥育期。在成年母豬群體中，和以前的美國(guó)PRRSV爆發(fā)相比具 有輕微的流產(chǎn)發(fā)作。我們以前的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究也證明了這種病毒的致病本質(zhì)(Lawson等， Proc. Conf. Res. Work. Anim. Dis.，abstr. 99，2005)。組3中的三頭豬用SD03-15病毒進(jìn)行攻擊，另外三頭豬保持為模擬感染對(duì)照。在 感染后的前7天和攻擊后的前7天每日觀測(cè)豬的臨床病征和體溫。比較不同攻擊組之間的 平均溫度應(yīng)答。在攻擊前一天和攻擊后7天測(cè)量直腸溫度。在最初感染之后沒(méi)有在任何豬 中檢測(cè)到溫度升高并且沒(méi)有觀察到臨床病征。攻擊后，組3(最初模擬感染)中的三頭被攻 擊的豬中的直腸溫度在攻擊后一天和兩天升高(圖13)。在這三頭豬中也觀測(cè)到了臨床病征(咳嗽和鼻分泌物)。剩余的豬依舊無(wú)癥狀。每周一次從所有豬獲取血液樣品。在攻擊 后21天豬被實(shí)施安樂(lè)死。使用以前開(kāi)發(fā)的基于每個(gè)肺葉貢獻(xiàn)給整個(gè)肺的大概容量的系統(tǒng) 來(lái)評(píng)估研究動(dòng)物的總的肺損傷左頂葉和右頂葉、左心葉和右心葉以及中葉各自貢獻(xiàn)了總 肺容量的10%，而左尾葉和右尾葉各自貢獻(xiàn)了 25%。然后使用這些得分基于每個(gè)肺葉的相 對(duì)貢獻(xiàn)計(jì)算總的肺損傷得分(Halbur等，1995)。驗(yàn)尸時(shí)，在組1、組2和所述的三頭嚴(yán)格負(fù) 對(duì)照的豬中沒(méi)有觀察到總的病理學(xué)損傷。相反，在組3中的最初模擬感染后來(lái)用SD03-15 攻擊的那三頭豬中觀察到了輕微的PRRSV特征性的總的病理學(xué)肺損傷。
病毒學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)。確定了標(biāo)記病毒的體內(nèi)病毒學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)。豬在42dpi 時(shí)接受攻擊，在圖14A-14C中被顯示為垂直虛線。病毒血癥的持續(xù)時(shí)間和高度用實(shí)時(shí)PCR 確定，并且結(jié)果被解釋為每毫升的RNA拷貝數(shù)。在感染后的每一天，具有不同大寫(xiě)字母(A、 B或C)的平均病毒量差異顯著(P < 0. 05)。與組2用親本病毒感染的豬(平均病毒效價(jià) 的峰值=5. 9xl07拷貝/毫升)相比，用GFP/AES4標(biāo)記病毒感染的豬具有較低的病毒量 峰值(平均病毒效價(jià)的峰值=2. OSxlO5拷貝/毫升，圖14A)。在攻擊后7天，接種疫苗的 豬比最初模擬感染然后用SD03-15病毒攻擊的那些豬的病毒量低二到三個(gè)對(duì)數(shù)。到攻擊后 21天，GFP/AES4標(biāo)記病毒感染組的豬與親本組相比具有低10倍的病毒量，并且3/5的豬 消除了血清中的病毒(圖14A;表6)。表6.通過(guò)定量PCR測(cè)定的用遺傳不同的株系SD03-15攻擊后21天血清中的病毒量。 *負(fù)對(duì)照組中的三頭豬在42dpi時(shí)用異源株系SD 03-15進(jìn)行攻擊。到14dpi時(shí)，感染組中的所有豬已血清轉(zhuǎn)變。PRRSV特異性血清抗體通過(guò) IDEXX HerdChek PRRSV ELISA 2XR試劑盒測(cè)定。S/P比率大于0. 4被認(rèn)為是陽(yáng)性。抗體 應(yīng)答在21dpi后達(dá)到近似水平(圖14B)。病毒中和抗體應(yīng)答通過(guò)熒光灶中和分析確定(圖14C)。結(jié)果被解釋為病毒感染有 90%的減少，并且中和抗體效價(jià)表達(dá)為平均值(η = 6)并表示為log2標(biāo)度。親本的SD01-08 病毒被用于病毒中和分析。在感染后的每一天，具有不同大寫(xiě)字母(A、B或者C)的平均值 差異顯著(P <0.05)。血清中和(SN)抗體水平的進(jìn)一步測(cè)量顯示，在感染親本病毒的豬 中，到感染后21天從六頭豬中的一頭豬中檢測(cè)出SN抗體，并且到感染后35天，3/6的豬發(fā) 展出可檢測(cè)的SN效價(jià)，其幾何平均效價(jià)(GMT)達(dá)到了 2。相反，在感染了 GFP/AES4標(biāo)記病毒的豬中，中和抗體應(yīng)答發(fā)展得更快且更高。到感染后14天，從六頭豬中的一頭豬中檢測(cè)出SN抗體，并且到感染后35天，在這個(gè)組中的所有豬中檢測(cè)到SN效價(jià)，其達(dá)到了 9. 2的平 均GMT。在用SD03-15攻擊后，觀察到增強(qiáng)的效應(yīng)，在49dpi (攻擊后一周)時(shí)GFP/ Δ ES4標(biāo) 記病毒感染組的GMT為18. 4，與之相比親本病毒感染組的GMT為5. 7。兩組在62dpi (攻擊 后三周)達(dá)到了相似的SN效價(jià)(圖14C)。這些數(shù)據(jù)表明在最初感染時(shí)，感染了 GFP/AES4 標(biāo)記病毒的豬比親本病毒感染的豬產(chǎn)生更高的中和抗體效價(jià)。病毒分離和測(cè)序。來(lái)自7、14、21和28dpi的血清樣品被用于如前所述的病毒分離 (Wasilk等，2004)。病毒的存在通過(guò)使用PRRSV特異性抗體SD0W17 (Nelson等，1993)的 IFA證實(shí)。為確定GFP插入和ES4表位缺失的穩(wěn)定性，利用QIAamp Viral RNA微量試劑盒 (Qiagen)按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)從血清分離的病毒中提取病毒RNA。使用如前所述的方法 (Fang等，2004)進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR擴(kuò)增的片段被凝膠純化，并在愛(ài)荷華州立大學(xué)測(cè)序機(jī) 構(gòu)(Ames，IA)確定序列。引物對(duì)nsp2-2144F/nsp2_2694R(表5)被用于RT-PCR和測(cè)序，并 擴(kuò)增包含GFP插入和ES4缺失的核苷酸區(qū)域(SD01-08基因組的2144到2694)。GFP/ Δ ES4 標(biāo)記病毒的全長(zhǎng)序列被提供在SEQ ID NO. 43中(表7)。GFP/ Δ ES4標(biāo)記的體內(nèi)穩(wěn)定性。為確定GFP/ Δ ES4標(biāo)記的穩(wěn)定性，來(lái)自7到28dpi 的血清樣品被用于MARC-145細(xì)胞中的病毒分離。從7、14和21dpi收集的血清樣品中回收 病毒，但從28dpi收集的血清樣品中沒(méi)有分離出病毒。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，我們僅觀察到一小 部分用7和14dpi分離的病毒感染的細(xì)胞顯示微弱的GFP熒光，用21dpi分離的病毒感染 的細(xì)胞中沒(méi)有觀察到GFP熒光。但是，使用核殼蛋白特異性單克隆抗體SD0W17的免疫熒光 染色證實(shí)大量病毒的存在，這與體外研究中觀察到的相似(圖11)。GFP插入/AES4缺失 的穩(wěn)定性通過(guò)對(duì)相應(yīng)區(qū)域的測(cè)序來(lái)確定。結(jié)果證實(shí)ES4缺失的存在，并且GFP完整的保持 為全長(zhǎng)基因。然而，測(cè)序結(jié)果揭示出位于GFP的144位核苷酸(C到T)和289位核苷酸(C 到T)的兩個(gè)點(diǎn)突變。144位核苷酸突變是沉默的，但是289位核苷酸突變引起GFP的97位 由精氨酸(R)到半胱氨酸(C)的氨基酸突變，這和我們的體外測(cè)序分析是一致的(圖12)。 有趣的是，在7和14dpi分離的病毒中還檢測(cè)到小部分無(wú)突變的GFP基因。對(duì)于每個(gè)dpi， 我們對(duì)從三頭豬分離的病毒進(jìn)行了測(cè)序，并且測(cè)序使用正向和反向兩種引物來(lái)進(jìn)行，對(duì)于 每個(gè)dpi得到總共六個(gè)序列。對(duì)于7dpi分離的病毒，1/6序列被發(fā)現(xiàn)沒(méi)有97位的突變，而 其他五個(gè)序列被確定包含所述R到C的突變。對(duì)于14dpi分離的病毒，2/6序列被鑒定為無(wú) 突變，而這兩個(gè)序列是從兩頭不同的豬而來(lái)。其他4個(gè)序列也被鑒定為包含所述R到C的 突變。所有從21dpi的病毒產(chǎn)生的序列包含所述R到C的突變。這一數(shù)據(jù)與GFP熒光的丟 失是因?yàn)镽到C突變的先前報(bào)道(Kim等，2007)是一致的。小部分的無(wú)突變的GFP的存在 可以解釋在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到的微弱地發(fā)熒光的細(xì)胞。這些結(jié)果暗示選擇可能是逐漸地 發(fā)生的，以產(chǎn)生有利于提高的病毒復(fù)制的突變。基于GFP和ES4表位的ELISA。ELISA使用Immulon II HB 96孔微量滴定板 (Thermo Labsystems,Franklin,ΜΑ)進(jìn)行。重組蛋白在包被緩沖液(15mM碳酸鈉_35mM碳 酸氫鈉，PH9. 6)中進(jìn)行稀釋，并在第1、3、5、7、9和11列用100微升稀釋的抗原包被所述板。 用100微升包被緩沖液對(duì)第2、4、6、8、10和12列進(jìn)行處理以作為背景對(duì)照。將板在37°C 孵育1個(gè)小時(shí)，然后用于PBST緩沖液(具有0.05% Tween 20的Ix PBS)中的10%牛奶在 4°C過(guò)夜封閉多余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。所測(cè)試的血清按照于具有5%牛奶的PBST緩沖液中的1 5的稀釋度應(yīng)用。在37°C孵育1小時(shí)后，板用PBST洗滌，并加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的 山羊抗豬 IgG (Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)以結(jié)合任何 PRRSV 血 清抗體，所述PRRSV血清抗體結(jié)合板上的抗原。板在37°C孵育另一個(gè)小時(shí)，洗滌，并加入過(guò) fl^^BI/ ^ABTS(Kirkegaard&Perry Laboratories,Gaithersburg,MD) UitifUfe。 H 色通過(guò)用XChek軟件(IDEXXLaboratories)控制的EL800微板讀數(shù)器(BioTek Instruments Inc.，Winooski, VT.)在 405nm 讀數(shù)來(lái)量化。 開(kāi)發(fā)了伴隨區(qū)分診斷分析以區(qū)分接種標(biāo)記疫苗的動(dòng)物和那些自然感染野生病毒 的動(dòng)物。因?yàn)槭褂昧藘蓚€(gè)標(biāo)記GFP插入(正標(biāo)記)和ES4缺失(負(fù)標(biāo)記)，所以我們開(kāi)發(fā)了 基于GFP和ES4表位的兩種ELISA分析來(lái)檢測(cè)標(biāo)記。GFP和ES4表位二者都被表達(dá)為可溶 性重組蛋白。我們?cè)u(píng)估這兩種ELISA測(cè)試來(lái)檢測(cè)特異性抗體。圖15A顯示來(lái)自基于ES4表 位的ELISA的結(jié)果，而圖15B顯示來(lái)自基于GFP抗原的ELISA的結(jié)果。豬在感染后42天被 攻擊，顯示為圖15A中的垂直虛線。如所預(yù)期的，用GFP/Δ ES4標(biāo)記病毒對(duì)組1的豬的感染 沒(méi)有誘導(dǎo)可檢測(cè)的抗缺失的ES4表位的抗體應(yīng)答(圖15Α)，但是誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的抗GFP抗原 的抗體應(yīng)答，該應(yīng)答從14dpi開(kāi)始并持續(xù)至研究的持續(xù)時(shí)間到62dpi (圖15B)。相反地，組 2的豬用親本病毒感染，對(duì)ES4重組蛋白特異性抗體能夠在21dpi被檢測(cè)到，并同樣地持續(xù) 到62dpi (圖15A)，但沒(méi)有檢測(cè)到抗GFP抗原的特異性抗體應(yīng)答(圖15B)。在周03-15攻 擊之后，組1的豬在攻擊后一周表現(xiàn)出對(duì)ES4表位的可檢測(cè)的抗體應(yīng)答，因?yàn)?3-15病毒包 含ES4表位(圖15A)。對(duì)于來(lái)自三個(gè)嚴(yán)格負(fù)對(duì)照的豬的血清樣品，基于GFP和ES4表位的 兩種ELISA均沒(méi)有檢測(cè)到特異性抗體應(yīng)答(圖15A和15B)。來(lái)自其他1型和2型PRRSV感染動(dòng)物的血清樣品。對(duì)于負(fù)標(biāo)記的基本要求是其抗 原區(qū)域應(yīng)該能夠和一大組野生病毒反應(yīng)。為確保ES4表位在各種病毒的株系中能夠是反 應(yīng)的，我們使用來(lái)自感染美國(guó)1型病毒的四種代表性株系，即SD01-07、SDO1-08, SD02-11 和 SD03-15 (Lawson 等，Proc. Conf. Res. Work. Anim. Dis.，abstr. 99,2005)中的每個(gè)的豬 的血清樣品。SD01-07和SD01-08分離株從沒(méi)有表現(xiàn)臨床疾病的豬群獲得，而SD02-11和 SD03-15從幼豬有顯著發(fā)病率和死亡率的豬群中獲得。這四個(gè)分離株也被歸入針對(duì)美國(guó) 起源的1型PRRSV分離株(Fang等，2007)開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)樹(shù)的不同分支。來(lái)自感染2型病毒 VR2332的實(shí)驗(yàn)豬的血清樣品，是從PRRSV合作農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(CAP)的共享試劑資源中獲得的。 如圖15C所示，ES4表位與來(lái)自感染這四個(gè)病毒株系的所有豬的抗血清反應(yīng)。結(jié)果被表示 為平均值(n = 6)?？贵w應(yīng)答在14dpi被檢測(cè)，并持續(xù)超過(guò)62dpi。然而，來(lái)自感染2型原 型株系VR2332的實(shí)驗(yàn)豬組的血清樣品的進(jìn)一步檢驗(yàn)，顯示與ES4表位在ELISA上沒(méi)有反應(yīng) 性(數(shù)據(jù)未顯示)。因而，需要另一血清學(xué)測(cè)試以區(qū)分感染1型病毒的動(dòng)物和那些感染2型 病毒的動(dòng)物。III.討論在PRRS病毒nsp2區(qū)域中的兩個(gè)遺傳標(biāo)記被構(gòu)建。正標(biāo)記(GFP插入)將允許已 經(jīng)接種疫苗的動(dòng)物的檢測(cè)，而負(fù)標(biāo)記(ES4表位缺失)將允許檢測(cè)動(dòng)物中野生型病毒的存 在。與由傳統(tǒng)的多輪細(xì)胞培養(yǎng)傳代技術(shù)制備的MLV相比，使用這種精確限定的減毒的缺失 /插入類型構(gòu)建的疫苗以及反向遺傳學(xué)技術(shù)的使用降低了回復(fù)突變成毒性的野生型病毒的 潛在危險(xiǎn)。標(biāo)記疫苗僅在適合的測(cè)試(伴隨診斷測(cè)試)可用于監(jiān)控疫苗接種水平和跟蹤感染的空間過(guò)程時(shí)是有用的?；贕FP抗原的ELISA在感染標(biāo)記病毒的豬的組中檢測(cè)到高水平 的抗-GFP應(yīng)答?；贓S4表位的ELISA在感染親本病毒的豬的組中也檢測(cè)到高水平的抗 體應(yīng)答，但表現(xiàn)出比抗-GFP應(yīng)答的水平發(fā)展得更慢。高水平、穩(wěn)健的抗-GFP應(yīng)答能夠在 14dpi時(shí)在感染標(biāo)記病毒的豬中檢測(cè)到，而在感染野生型病毒的豬中，抗-ES4抗體應(yīng)答在 21dpi時(shí)被檢測(cè)到并在28dpi時(shí)達(dá)到更高水平。ES4表位在1型病毒的nsp2鑒定出的六個(gè) B-細(xì)胞表位(Oleksiewicz等，2001)中具有最高的親水性值(Hopp&Woods，1981)。對(duì)現(xiàn)在 可利用的1型PRRSV的nsp2氨基酸序列(Meulenberg等，1993 ；Fang等，2007)的分析顯 示這個(gè)區(qū)域在1型基因型內(nèi)擁有63. 6%到100%的氨基酸序列同一性。蛋白序列分析顯示 ES4表位區(qū)，AA736-AA790，實(shí)際上包含7個(gè)小的B-細(xì)胞表位(Pep Tool, Bio Tools, Inc.， Edmonton, Alberta, Canada)。表位 AA745-AA754 和 AA7 68-AA780 在 1 型基因型中是相當(dāng) 保守的。我們的ES4 ELISA數(shù)據(jù)與蛋白序列分析是一致的，表明ES4表位能夠與感染1型 PRRSV的4個(gè)代表性野生株系的動(dòng)物的血清樣品反應(yīng)。然而，ES4表位不和感染2型分離 株的動(dòng)物的血清樣品反應(yīng)。在nsp2區(qū)域鑒定出的B-細(xì)胞表位(Oleksiewicz等，2001 ；de Lima等，2006)的比較中，nsp2區(qū)域中鑒定出的表位沒(méi)有一個(gè)是在1型和2型分離株之間 保守的。因而，需要另一診斷分析以區(qū)別接種ES4表位缺失的突變體的豬和那些感染2型 野生株系的豬。nsp2區(qū)域中的ES4表位看起來(lái)對(duì)于PRRSV復(fù)制不是必須的，但可能在體內(nèi)的病毒 衰減和致病中起重要的作用。單獨(dú)的GFP插入沒(méi)有大量地減弱病毒的體外生長(zhǎng)特性，然而， 當(dāng)GFP下游的ES4表位被缺失掉時(shí)，病毒效價(jià)與親本病毒的效價(jià)相比被降低了至少兩個(gè)對(duì) 數(shù)。噬斑形態(tài)也顯示標(biāo)記對(duì)于病毒生長(zhǎng)的負(fù)效應(yīng)。體內(nèi)表征進(jìn)一步顯示GFP/Δ ES4標(biāo)記病 毒被減毒，其比野生型病毒具有更低水平的病毒血癥和更高水平的中和抗體應(yīng)答。蛋白質(zhì) 序列分析顯示ES4表位區(qū)包含nsp2上最高的親水性值(Hopp&Woods，1981)。令人驚奇的是，ES4表位的缺失提高了 nsp2中GFP插入的穩(wěn)定性。另一個(gè)有趣的 觀察結(jié)果是體外和體內(nèi)的GFP熒光丟失，盡管GFP基因保持完整。序列分析鑒定出在GFP 中Arg-97到Cys的突變。所述Arg-97到Cys的突變正是從插入2型病毒nsp2區(qū)的GFP 中鑒定出的相同的氨基酸突變(Kim等，2007)。如Kim等(2007)所示，Arg-97在GFP發(fā)色 團(tuán)的形成中起關(guān)鍵作用，這暗示發(fā)色團(tuán)的形成可能影響nsp2的功能。此外，因?yàn)镃ys是通 常參與形成蛋白質(zhì)中二硫鍵的氨基酸，額外的二硫鍵可能是維持nsp2的正確構(gòu)象以行使 功能所需要的。盡管如此，GFP在體內(nèi)保持它的免疫原性，并且用作區(qū)別接種疫苗的動(dòng)物和 野生型病毒感染的動(dòng)物的優(yōu)秀的正標(biāo)記。本說(shuō)明書(shū)中的所有出版物和專利申請(qǐng)表明此項(xiàng)發(fā)明所屬的領(lǐng)域中的普通技術(shù)水 平。所有出版物和專利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文，如同每個(gè)個(gè)體出版物或者專利申請(qǐng)被特別 地且單獨(dú)地通過(guò)引用而指出的程度。本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)參考各種實(shí)施方案和技術(shù)來(lái)描述。但是，應(yīng)該理解的是可進(jìn)行許 多變化和修改，而仍保持在本發(fā)明的精神和范圍中。表7GFP/AES4標(biāo)記病毒的全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO 43) 參考文獻(xiàn)1. 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權(quán)利要求
一種重組的北美1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，其在開(kāi)放讀碼框(ORF)1a中包括一個(gè)或多個(gè)突變，其中所述突變使得所述重組的PRRSV不能產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于ORF1a的至少一種功能性多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的重組的PRRSV，其中所述突變包括缺失。
3.如權(quán)利要求2所述的重組的PRRSV，其中所述缺失是在nsp2區(qū)域中。
4.如權(quán)利要求3所述的重組的PRRSV，其中所述缺失包括表位ES4。
5.如權(quán)利要求4所述的重組的PRRSV，其中所述缺失包括ORFla的736-790位氨基酸。
6.如權(quán)利要求3所述的重組的PRRSV，其中所述突變包括異源DNA序列的插入。
7.如權(quán)利要求6所述的重組的PRRSV，其中所述插入是在ORFla的733位氨基酸和734 位氨基酸之間。
8.如權(quán)利要求6所述的重組的PRRSV，其中所述插入是綠色熒光蛋白(GFP)。
9.一種重組的北美PRRS病毒，其由分離的多聚核苷酸分子編碼，該多聚核苷酸分子包 括編碼感染性RNA分子的DNA序列，所述感染性RNA分子編碼北美PRRS病毒，其中所述DNA 序列是 SEQ ID NO :43ο
10.一種北美1型PRRSV疫苗，其包括在ORFla中具有突變的重組的PRRSV和藥學(xué)可接 受的運(yùn)載體，所述突變包括在ORFla中的缺失、插入或者兩者。
11.如權(quán)利要求10所述的疫苗，其中所述突變包括nsp2區(qū)域中的缺失。
12.如權(quán)利要求11所述的疫苗，其中所述缺失是在所述nsp2區(qū)域中的736-790位氨基酸。
13.如權(quán)利要求11所述的疫苗，其中所述突變還包括異源DNA序列的插入。
14.如權(quán)利要求13所述的疫苗，其中所述插入是在所述nsp2區(qū)域中的733位氨基酸和 734位氨基酸之間。
15.一種試劑盒，其包括疫苗，該疫苗包括在ORFla中具有突變的PRRSV突變體和藥學(xué)可接受的運(yùn)載體，所述突 變使得所述PRRSV突變體不能產(chǎn)生功能性O(shè)RFla多肽，所述突變包括異源DNA序列的插入； 一種或多種第一多肽，該第一多肽由所述異源DNA序列編碼；以及 一種或多種第二多肽，該第二多肽由所述功能性O(shè)RFla編碼。
16.如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中PRRSV疫苗中的所述突變是在nsp2區(qū)域中的缺失。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述缺失是ES4表位，其中所述一種或多種第一 多肽包括GFP并且所述一種或多種第二多肽包括所述ES4表位。
18.一種區(qū)分接種PRRSV標(biāo)記疫苗的動(dòng)物和自然感染PRRSV的動(dòng)物的方法，其中所述 PRRSV標(biāo)記疫苗包括插入突變和缺失突變，所述方法包括提供包括所述插入突變的第一重組PRRSV蛋白； 提供包括所述缺失突變的第二重組PRRSV蛋白；用所述第一重組PRRSV蛋白和第二重組PRRSV蛋白孵育來(lái)自動(dòng)物的血清樣品；以及 檢測(cè)樣品中的抗體與所述第一重組PRRSV蛋白和第二重組PRRSV蛋白的結(jié)合； 其中所述樣品中的抗體與所述第一重組PRRSV蛋白的結(jié)合指示接種疫苗的動(dòng)物，而所 述樣品中的抗體與所述第二重組PRRSV蛋白的結(jié)合指示自然感染的動(dòng)物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一重組PRRSV蛋白包括GFP插入。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第二重組PRRSV蛋白包括ES4缺失。
全文摘要
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是全世界豬肉工業(yè)的一個(gè)主要問(wèn)題。在疫苗中包含標(biāo)記將允許診斷區(qū)分接種疫苗的動(dòng)物和自然感染野生型病毒的那些動(dòng)物。使用北美1型PRRSV的cDNA感染性克隆，制備了重組綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽化的PRRSV，其包含免疫原性表位ES4在nsp2區(qū)域的缺失?；贕FP和ES4表位的ELISA肯定了標(biāo)記鑒定。
文檔編號(hào)C07K14/08GK101848995SQ200880104270
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月25日
發(fā)明者埃里克·A·納爾遜, 方穎, 簡(jiǎn)·亨寧斯 申請(qǐng)人:南達(dá)科他州立大學(xué)