專(zhuān)利名稱(chēng)：用于抑制微生物細(xì)胞的疫苗和疫苗組分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生抗體的來(lái)自微生物細(xì)胞的組分，包括肽、包含這些肽的多 肽，編碼這些肽或多肽的多核苷酸，以及針對(duì)這些肽、多肽或多核苷酸的抗體。本發(fā)明 還涉及用于產(chǎn)生這些肽、多肽、多核苷酸和抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及 使用一種或多種公開(kāi)的肽、多肽、多核苷酸、抗體、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞檢測(cè)、靶向和 抑制微生物細(xì)胞，尤其是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的方法和組合物，尤其是疫苗組合物。
背景技術(shù)：
在新西蘭，農(nóng)業(yè)活動(dòng)是溫室氣體排放的主要來(lái)源。因此，減少農(nóng)業(yè)溫室氣體排 放對(duì)于新西蘭完成京都議定書(shū)的義務(wù)是重要的。議定書(shū)要求在首次承諾期(2008-2012) 結(jié)束前溫室氣體減排至1990年水平。為此，農(nóng)業(yè)部門(mén)和新西蘭政府成立了田園溫室氣體 研究聯(lián)合會(huì)(PGGRC)尋求降低新西蘭的農(nóng)業(yè)溫室氣體排放的方法。PGGRC活動(dòng)的一個(gè)重要部分是研究減少來(lái)自新西蘭放牧反芻動(dòng)物的甲烷排放 量。出于兩個(gè)原因，減少反芻動(dòng)物甲烷排放量具有商業(yè)利益。首先，不履行京都議定書(shū) 承諾將迫使政府購(gòu)買(mǎi)碳排放額度。目前預(yù)計(jì)該項(xiàng)將花費(fèi)三億五千萬(wàn)美金。第二，甲烷的產(chǎn) 生導(dǎo)致瘤胃中產(chǎn)生的總能量損耗8-12%。可利用這種能量來(lái)提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能。甲烷在瘤胃中由稱(chēng)為產(chǎn)甲烷菌的微生物產(chǎn)生，這種微生物屬于古細(xì)菌(Archaea) 界廣古菌門(mén)(euryarchaeota)的一部分。多數(shù)產(chǎn)甲烷菌依靠CO2和H2作為它們唯一的能 量來(lái)源，但是一些能使用乙酸或甲基化合物生長(zhǎng)。瘤胃中中存在多種不同屬的產(chǎn)甲烷 古菌，但是甲烷短桿菌屬中的種，尤其是反芻甲烷短桿菌(Mraminantium)和史氏甲烷 短桿菌(M.smithii)被認(rèn)為是新西蘭反芻動(dòng)物中主要的產(chǎn)甲烷菌，反芻甲烷短桿菌目前是 PGGRC基金資助基因組測(cè)序項(xiàng)目的研究對(duì)象。該項(xiàng)目第一次對(duì)于瘤位產(chǎn)甲烷菌的基因組 進(jìn)行測(cè)序，旨在對(duì)甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)的生物學(xué)建立更好的理解，以發(fā)現(xiàn)抑 制甲烷產(chǎn)生的靶點(diǎn)。減少瘤胃中甲烷產(chǎn)生需要抑制產(chǎn)甲烷菌或使其甲烷生成通路失活。一種抑制甲 烷產(chǎn)生的方法是鑒定抑制產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的特異性分子?？赏ㄟ^(guò)(例如)使用靶向產(chǎn)甲烷 菌的試劑達(dá)到這種目的。在一種方法中，可制備疫苗來(lái)靶向微生物細(xì)胞。因此，鑒定可 用于抗微生物疫苗的微生物細(xì)胞的組分，特別是細(xì)胞表面組分，包括肽和多肽以及相關(guān) 的多核苷酸和抗體可能有用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及分離的反芻甲烷短桿菌(M.ruminantium)的肽、多肽和多核苷酸，尤其是反芻甲烷短桿菌的細(xì)胞表面組分，以及表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、抗體和其使用方法， 如本文詳述。本發(fā)明具體涉及一種分離的肽，其包含，例如，選自SEQ ID NO: 1-702的一 個(gè)氨基酸序列的至少一個(gè)片段。在一個(gè)特定方面，所述肽包含SEQ IDNO : 45-260和 332-702中任何一項(xiàng)的氨基酸序列的至少一個(gè)片段。在另一方面，所述肽包含SEQ ID NO 10-17中任何一項(xiàng)的氨基酸序列的至少一個(gè)片段。在另一方面，例如，所述肽是包 含具有SEQ ID NO 10-17、45-260和332-702中任一項(xiàng)的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)氨基酸 序列的片段。本發(fā)明具體涉及一種分離的多肽，其包含，例如，選自SEQ ID NO: 1-702的至 少一個(gè)氨基酸序列。在一個(gè)特定方面，所述多肽包含SEQ IDNO : 45-260和332-702中 任一項(xiàng)的氨基酸序列。另一方面，所述多肽包含SEQ IDNO : 10-17中任一項(xiàng)的氨基酸序 列。在另一方面，例如，所述多肽是包含具有SEQ ID NO 10-17、45-260和332-702 中任一項(xiàng)的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)氨基酸序列的片段。本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，其包含至少一種肽的編碼序列。在一個(gè)方 面，所述多核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1-702的氨基酸序列的至少一個(gè)片段的編碼序 列。在一個(gè)特定方面，所述多核苷酸包含SEQ IDNO 45-260和332-702中任一項(xiàng)的至 少一個(gè)片段的編碼序列。在一個(gè)特定方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO : 10-17中任 一項(xiàng)的至少一個(gè)片段的編碼序列。在另一方面，所述多核苷酸包含某編碼序列的片段， 該編碼序列編碼，例如，具有SEQ ID NO: 10-17、45-260和332-702中任一項(xiàng)的胞外結(jié) 構(gòu)域的至少一個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，其包含至少一種多肽的編碼序列。在一個(gè) 方面，該多核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1-702的至少一個(gè)氨基酸序列的編碼序列。在一 個(gè)特定方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO 45-260和332-702中任一項(xiàng)的編碼序列。 在一個(gè)特定方面，所述多核苷酸包含SEQ IDNO : 10-17中任一項(xiàng)的編碼序列。在另一方 面，所述多核苷酸包含某編碼序列的片段，該編碼序列編碼，例如，具有SEQ ID NO: 10-17、45-260和332-702中任一項(xiàng)的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包含，例如，選自SEQID NO 703-1373的核酸序列。在一個(gè)具體方面，所述多核苷酸包含核酸序列SEQ ID NO : 703-710。在另一方面，所述多核苷酸是某片段或寡核苷酸，其包含例如，含有SEQ ID NO 703-710、737-931和1003-1373中任一項(xiàng)編碼的胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。此 外，本發(fā)明包括一種分離的多核苷酸或其片段，該多核苷酸或其片段能與SEQ ID NO 703-1373中任一核酸序列雜交。本發(fā)明還包括一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有任 一所述核酸序列的互補(bǔ)物、反向互補(bǔ)物、反向序列或其片段。本發(fā)明還涉及一種包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體。在一個(gè)方面，所述表達(dá)載 體包含選自SEQ ID NO: 1-702的氨基酸序列的至少一個(gè)片段的編碼序列。在一個(gè)特定方 面，所述表達(dá)載體包含SEQ ID NO 45-260和332-702中至少一項(xiàng)的至少一個(gè)片段的編 碼序列。在另一方面，所述表達(dá)載體包含SEQ ID NO 10-17中至少一項(xiàng)的至少一個(gè)氨 基酸序列的編碼序列。在另一方面，所述表達(dá)載體包含具有SEQ ID NO: 10-17、45-260 和332-702中任一項(xiàng)的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)氨基酸序列的編碼序列。
本發(fā)明還涉及包含至少一種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，例如微生物宿主細(xì)胞。本發(fā)明具體涉及本文所述的肽、多肽或多核苷酸的抗體。在某些方面，所述抗 體針對(duì)選自SEQIDNO : 1-702的氨基酸序列。在另外方面，所述抗體針對(duì)選自SEQID NO: 10-17、45-260和332-702的多肽序列的至少一個(gè)片段。在一個(gè)特定方面，所述抗 體與選自SEQ ID NO: 10-17中任一項(xiàng)的多肽序列的至少一個(gè)片段結(jié)合。在另一方面，所 述抗體與選自SEQ ID NO 45-260和332-702中任一項(xiàng)中的多肽序列的至少一個(gè)片段結(jié) 合。在另一方面，所述抗體與包含NO: 10-17、45-260和332-702中任一項(xiàng)的胞外結(jié)構(gòu) 域的肽或多肽的至少一個(gè)片段結(jié)合。另一方面，所述抗體包括與至少一種細(xì)胞抑制劑形 成的一種或多種融合物或偶聯(lián)物，所述細(xì)胞抑制劑包括例如，抗甲烷生成化合物(如溴 代乙磺酸)、抗體和抗體片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和本文詳述的其他抗生素。本發(fā)明還涉及例如SEQ IDNO 1_702中至少一項(xiàng)的修飾的肽或多肽，其包括如 本文所述的生物學(xué)活性變化形式、片段、變體和衍生物。還涉及編碼這些修飾的肽或多 肽的多核苷酸，以及所公開(kāi)多核苷酸的變化形式、片段、變體和衍生物；用這些修飾的 肽、多肽或多核苷酸產(chǎn)生的抗體；包含這些多核苷酸的表達(dá)載體以及包含這些載體的宿 主細(xì)胞。其它還涉及修飾的抗體，包括本文所述的生物學(xué)活性變化形式、片段、變體和 衍生物。在具體方面，本發(fā)明的組合物和方法使用這些修飾的肽、多肽、多核苷酸、抗 體或?qū)?yīng)的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。本發(fā)明涉及一種組合物，其包含分離的肽或多肽，如SEQ ID NO: 1_702中至 少一項(xiàng)。還涉及一種組合物，其包含分離的多核苷酸，如SEQ IDNO 703-1373中至 少一項(xiàng)。本發(fā)明還涉及一種組合物，其包含例如針對(duì)本文公開(kāi)的肽、多肽或多核苷酸序 列的抗體。本發(fā)明還涉及一種組合物，該組合物包含表達(dá)載體或包含表達(dá)載體的宿主細(xì) 胞。所述組合物可包含本文所述的生物學(xué)活性變化形式、片段、變體和衍生物中的任何 一種。所述組合物可包含至少一種細(xì)胞抑制劑(如，作為融合物或偶聯(lián)物)，并可配制成 (例如)藥物組合物，具體是疫苗組合物。本發(fā)明還涉及作為按照所公開(kāi)方法靶向和/或抑制微生物細(xì)胞，特別是產(chǎn)甲烷 菌細(xì)胞的試劑盒的一部分的本發(fā)明組合物。該試劑盒包括a)至少一種本文所列的組合 物；以及b)任選地包括，用其(例如)靶向細(xì)胞或抑制產(chǎn)甲烷菌或其他微生物的細(xì)胞生 長(zhǎng)或復(fù)制的使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生肽或多肽，例如，SEQ ID NO: 1_702中任一項(xiàng)的至少一 個(gè)片段的方法，該方法包括a)在適合肽或多肽表達(dá)條件下培養(yǎng)表達(dá)載體或含有表達(dá)載 體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含至少一種肽或多肽的編碼序列的至少一部分；以及b) 從培養(yǎng)物中回收所述肽或多肽。在某些具體方面，所述肽或多肽包含選自SEQ ID NO: 1-702的至少一個(gè)氨基酸序列或其修飾序列。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生抗體，例如，SEQ ID NO: 1_702中任一項(xiàng)的至少一個(gè)片 段的抗體的方法，該方法包括a)在適合抗體或抗體片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)表達(dá)載體或 含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含至少一種抗體或抗體片段的編碼序列的至 少一部分；以及b)從培養(yǎng)物中回收該氨基酸序列。在某些具體方面，所述抗體或抗體片 段針對(duì)選自SEQ ID NO: 1-702的至少一個(gè)氨基酸序列或其修飾序列。在另一方面，如 本文詳述，通過(guò)給予宿主動(dòng)物產(chǎn)生抗體。
本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生抗體，例如，針對(duì)SEQ ID NO: 1_702中任一項(xiàng)的至少一 個(gè)片段的抗體的方法，所述抗體包括與至少一種細(xì)胞抑制劑形成的融合物或偶聯(lián)物。這 種方法包括a)在適合表達(dá)抗體或抗體片段的條件下培養(yǎng)表達(dá)載體或包含表達(dá)載體的宿 主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含至少一種抗體或抗體片段的編碼序列；b)與抗體或抗體片段 形成融合物或偶聯(lián)物(例如，通過(guò)表達(dá)融合序列或與細(xì)胞抑制劑化學(xué)偶聯(lián))；和c)回收 所述融合物或偶聯(lián)物。在特定方面，所述抗體針對(duì)SEQ ID NO: 1_702中任一項(xiàng)的至少一個(gè)片段或其修 飾序列。另一方面，所述細(xì)胞抑制劑選自抗甲烷生成化合物(如溴代乙磺酸)、抗體和抗 體片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和本文詳述的其他抗生素。在另一方面，如本文 詳述，通過(guò)給予宿主動(dòng)物產(chǎn)生抗體，然后偶聯(lián)。此外，本發(fā)明涉及一種抑制微生物細(xì)胞(如抑制其生長(zhǎng)或復(fù)制)，具體是產(chǎn)甲烷 菌細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞接觸抗體或抗體片段，例如針對(duì)SEQ ID NO: 1-702 中任一項(xiàng)的至少一個(gè)片段的抗體，或抗體融合物或偶聯(lián)物，或任何修飾抗體。作為另一 種方法，通過(guò)給予本文所述的疫苗組合物抑制細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種抑制微生物細(xì)胞(如抑制其生長(zhǎng)或復(fù)制)，具體是產(chǎn)甲烷菌細(xì) 胞的方法，該方法包括a)任選產(chǎn)生或分離至少一種本文所述抗體；以及b)將所述細(xì)胞 與所述抗體接觸。在特定方面，所述抗體針對(duì)SEQ IDNO : 1-702中任一項(xiàng)的至少一個(gè)片 段或其修飾序列。在某些方面，所述抗體還包含至少一種以融合物或偶聯(lián)物形式連接的 細(xì)胞抑制劑。在其它方面，以組合物如疫苗組合物的形式將所述抗體給予對(duì)象。此外，本發(fā)明涉及一種抑制微生物細(xì)胞(如抑制其生長(zhǎng)或復(fù)制)，具體是產(chǎn)甲烷 菌細(xì)胞的方法，該方法包括a)任選產(chǎn)生或分離至少一種本文所述的肽或多肽；b)將所 述肽或多肽給予對(duì)象以誘導(dǎo)對(duì)它的免疫應(yīng)答。在一個(gè)具體方面，所述肽或多肽包含選自 SEQ ID NO 1-702的至少一個(gè)氨基酸序列或其修飾序列。在其它方面，以組合物如疫苗 組合物的形式將所述肽或多肽給予對(duì)象。本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)和/或測(cè)定多肽，尤其是細(xì)胞表面多肽或?qū)?yīng)肽或多核 苷酸水平的方法，所述方法包括1)將來(lái)自對(duì)象的樣品與針對(duì)多肽(如SEQ ID NO: 1-702中任一項(xiàng)的至少一個(gè)片段或其修飾序列)或者對(duì)應(yīng)的肽或多核苷酸(如SEQ ID NO 703-1373中任一項(xiàng)的至少一個(gè)片段或其修飾序列)的抗體接觸；2)測(cè)定與樣品中對(duì) 應(yīng)多肽、肽或多核苷酸形成的抗體復(fù)合物的存在或水平。此類(lèi)方法還可用于檢測(cè)和/或 測(cè)定微生物細(xì)胞，具體是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的水平。本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)和/或測(cè)定多核苷酸，具體是編碼細(xì)胞組分的多核苷酸 的水平的方法，該方法包括1)將來(lái)自對(duì)象的樣品與互補(bǔ)多核苷酸(如與SEQ ID NO 703-1373中任一項(xiàng)互補(bǔ)的序列或其修飾序列)接觸；以及2)測(cè)定與樣品中多核苷酸形成 的雜交復(fù)合物的出現(xiàn)或水平。此類(lèi)方法還可用于檢測(cè)和/或測(cè)定微生物細(xì)胞，具體是產(chǎn) 甲烷菌細(xì)胞的水平。在特定方面，本發(fā)明的方法使用體內(nèi)或體外表達(dá)組件。在其它方面，所述方法 使用重組、合成或半合成方法或內(nèi)源性方法產(chǎn)生的肽、多肽、多核苷酸或抗體。本發(fā)明的其它方面和實(shí)施方式如下文所述。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
用本發(fā)明特定實(shí)施方式和附圖作為參考對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。

圖1A-1C 甲烷桿菌基因組比較(圖1A)；反芻甲烷短桿菌基因組統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(圖 1B)；預(yù)測(cè)參與甲烷桿菌目細(xì)菌的甲烷生成的基因(圖1C)。圖2.疫苗接種方案。圖3.使用反芻甲烷短桿菌細(xì)胞壁制劑和根據(jù)反芻甲烷短桿菌mtr和表面蛋白設(shè)計(jì) 的肽進(jìn)行疫苗接種后綿羊的抗體應(yīng)答。圖4.用于產(chǎn)生抗體的肽序列。圖5A-5B 選擇用于產(chǎn)生抗體的ORF 核苷酸序列(圖5A)；氨基酸序列(圖 5B)。圖6A-6C:由反芻甲烷短桿菌鑒定的編碼甲烷生成途徑酶的ORF:注釋(圖 6A)；核苷酸序列(圖6B)；氨基酸序列(圖6C)。圖7A-7C 由反芻甲烷短桿菌鑒定的細(xì)胞表面蛋白的ORF :注釋(圖7A)；核 苷酸序列(圖7B)；氨基酸序列(圖7C)。圖8A-8C 由反芻甲烷短桿菌鑒定的編碼外泌多糖生物合成的ORF :注釋(圖 8A)；核苷酸序列(圖8B)；氨基酸序列(圖8C)。圖9A-9C 由反芻甲烷短桿菌鑒定的含有跨膜結(jié)構(gòu)域的ORF :注釋(圖9A)； 核苷酸序列(圖9B)；氨基酸序列(圖9C)。
具體實(shí)施例方式定義術(shù)語(yǔ)“抗體”應(yīng)理解為最廣泛的可能含義，并意于包含完整的單克隆抗體和多 克隆抗體。也意于覆蓋抗體片段和衍生物，只要其顯示生物學(xué)活性?？贵w包括免疫球蛋 白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的活性部分，即包含特異性結(jié)合抗原(與其免疫反應(yīng))的 抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。這些包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈 抗體、Fe、Fab、Fab，和Fab2片段和Fab表達(dá)文庫(kù)?？贵w分子涉及IgG、IgM, IgA、IgE和IgD的任何種類(lèi)，它們之間的差異在于
分子中重鏈的特性。它們也包括亞類(lèi)，如IgGl、IgG2和其它。輕鏈可以是κ鏈或入 鏈。本文提到抗體時(shí)包括所有類(lèi)、亞類(lèi)和類(lèi)型。還包括嵌合抗體，例如對(duì)于不止一種來(lái) 源如一種或多種小鼠、人或反芻動(dòng)物序列具有特異性的單克隆抗體或其片段。還包括羊 駝抗體或納米抗體。應(yīng)理解，本文中提到“抗體”或任何類(lèi)似術(shù)語(yǔ)包括完整抗體，及其 任何片段、變化形式、衍生物或變體。如本文所述，“改變的”編碼肽、多肽或抗體的核酸序列包括那些具有不同的 核苷酸缺失、插入或取代，得到編碼相同或功能等同序列的多核苷酸的核酸。編碼的 肽、多肽或抗體也可以是“改變的”，并包含氨基酸殘基的缺失、插入或取代，產(chǎn)生沉 默改變并得到功能等同的序列。只要生物學(xué)活性(如細(xì)胞結(jié)合、膜結(jié)合)或免疫原性/免 疫學(xué)活性得以保留，可在殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親特性 相似的基礎(chǔ)上，有意進(jìn)行氨基酸取代。例如，帶負(fù)電的氨基酸可以包括天冬氨酸和谷氨 酸；帶正電的氨基酸可以包括賴(lài)氨酸和精氨酸；具有親水性值相似的不帶電極性頭部基 團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷胺酰胺，
9絲氨酸和蘇氨酸以及苯丙氨酸和酪氨酸。如本文所用“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽、蛋白質(zhì)或抗體序列及其任何 片段，并且指任何天然產(chǎn)生的、重組的、合成或半合成的分子。本發(fā)明序列包含至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250 個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少 5-10、 10-20、 20-30、 30-40、 40-50、 50-100、 100-150、 150-200 或 200-250 個(gè)氨基
酸。序列保持該氨基酸序列的生物學(xué)活性(例如對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖的影響)或免疫 原性/免疫學(xué)活性?！鞍被嵝蛄小焙皖?lèi)似術(shù)語(yǔ)不限于與全長(zhǎng)分子有關(guān)的完整的天然氨 基酸序列，還包括它們的任何片段、變化形式、衍生物和變體。本文所用“擴(kuò)增”指產(chǎn)生核酸序列的其它拷貝，通常使用本發(fā)明熟知的聚合酶 鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)操作(Dieffenbach，C.W.和 G.S.Dveksler (1995)《PCR 引物，實(shí)驗(yàn)室 手冊(cè)，冷泉港出版社，紐約普萊恩維尤》(PCR Primer，a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview，NY))。如本文所用術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”或“功能性”指保持天然產(chǎn)生序列的一種或多 種結(jié)構(gòu)、免疫原性或生物化學(xué)功能(如細(xì)胞結(jié)合、膜結(jié)合)的肽或多肽。本文所用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞抑制劑”或“抑制劑”指降低或阻礙微生物細(xì)胞，尤其是 產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞生長(zhǎng)或復(fù)制的試劑。細(xì)胞抑制劑可用于降低或阻礙如細(xì)胞分裂。抑制劑可 減少或阻斷例如DNA合成、RNA合成、蛋白質(zhì)合成或翻譯后修飾。抑制劑也可降低或 阻斷參與甲烷生成通路的酶的活性。抑制劑還可靶向細(xì)胞，以便免疫系統(tǒng)組件識(shí)別。抑 制細(xì)胞還包括細(xì)胞殺傷和細(xì)胞死亡，例如通過(guò)裂解、凋亡、壞死等實(shí)現(xiàn)。有用的抑制劑 包括但不限于如本文詳述的抗甲烷生成化合物(如溴代乙磺酸)、抗體和抗體片段、裂 解酶、肽核酸、抗微生物肽和其他抗生素。本文所用術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”指在允許的鹽和溫度條件下多核苷酸通 過(guò)堿基配對(duì)自然結(jié)合。對(duì)于序列A-G-T，互補(bǔ)序列是T-C-A，反向互補(bǔ)是A-C-T而反 向序列是T-G-A。兩條單鏈分子間的互補(bǔ)性可以是部分的，即僅有一些核酸結(jié)合，或者 為完全互補(bǔ)，即當(dāng)單鏈分子間存在完全互補(bǔ)性時(shí)。核酸鏈間的互補(bǔ)程度對(duì)于核酸鏈間雜 交的效率和強(qiáng)度有顯著性影響。這對(duì)于依賴(lài)核酸鏈結(jié)合的擴(kuò)增反應(yīng)以及PNA分子的設(shè)計(jì) 和使用尤其重要。本文所用術(shù)語(yǔ)“衍生物”指肽、多肽或抗體的編碼核酸或與之互補(bǔ)的核酸的化 學(xué)修飾形式。此類(lèi)修飾包括例如，用烷基、?；虬被〈鷼?。在優(yōu)選方面，核酸衍生 物編碼的肽、多肽或抗體保持天然分子的生物學(xué)活性或免疫原性/免疫學(xué)活性。衍生的 肽、多肽或抗體是通過(guò)糖基化、peg化或任何相似過(guò)程修飾的多肽，它保留了其來(lái)源序列 的一種或多種生物學(xué)功能(如細(xì)胞結(jié)合、膜結(jié)合)或免疫原性/免疫學(xué)活性。本文所用術(shù)語(yǔ)“同源”指一定程度的互補(bǔ)性?？梢允遣糠滞?即，相同性小 于100%)或完全同源(即，100%相同)。使用功能性術(shù)語(yǔ)“基本同源”指代至少部 分抑制相同序列與靶核酸雜交的部分互補(bǔ)序列?？稍诘蛧?yán)謹(jǐn)性條件下使用雜交實(shí)驗(yàn)(例 如，Southern或northern印跡，溶液雜交等)檢驗(yàn)對(duì)完全互補(bǔ)序列與靶序列雜交的抑制。 基本同源的序列或雜交探針在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下將競(jìng)爭(zhēng)并抑制完全同源序列與靶序列的結(jié) 合。這并不是說(shuō)低嚴(yán)謹(jǐn)性條件允許非特異性結(jié)合；低嚴(yán)謹(jǐn)性條件需要兩條序列的相互結(jié) 合是特異性(選擇性)相互作用。
如本文所用術(shù)語(yǔ)“雜交”指核酸鏈通過(guò)堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的任何過(guò)程。本文所用“插入”或“加入”指對(duì)氨基酸或核苷酸序列進(jìn)行改變，與天然產(chǎn)生 的分子相比，導(dǎo)致加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或核苷酸。本文所用“產(chǎn)甲烷菌”指產(chǎn)生甲烷氣體的微生物，包括甲烷短桿 菌(Methanobrevibacter)、甲烷嗜熱桿菌(Methanothermobacter)、甲烷微菌 (Methanomicrobium)、甲燒桿菌(Methanobacterium)禾口甲燒疊球菌(Methanosarcina)。 具體的產(chǎn)甲烷菌包括但不限于反芻甲烷短桿(Methiinobrevibacter raminantium) (即Ml菌株或菌株DSM1093)、史氏甲烷短桿菌(Methanobrevibacter smithii)、酸 性甲燒短桿菌(Methanobrevibacteracididurans)、巢氏甲燒短桿菌(Methanobrevibacter thaueri)、布氏甲燒桿菌(Methanobacterium bryantii)、甲酸甲燒桿菌(Methanobacterium formicicum)、馬爾堡甲烷嗜熱桿菌(Methanothermobacter marburgensis)、沃氏甲烷嗜熱桿 菌(Methanothermobacter wolfeii)、其j 氏甲燒球形菌(Methanosphaerastadtmanae)、運(yùn)動(dòng)甲 烷微菌(Methanomicrobium mobile)、巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barken)、梅氏甲 燒W疊球菌(Methanosarcina mazei)、布氏擬甲燒球菌(Methanococcoidesburtonii)禾口泰氏 甲烷葉菌(Methanolobustaylorii)。所有產(chǎn)甲烷菌的屬和種均在此術(shù)語(yǔ)涵蓋范圍內(nèi)。本文所用“微生物細(xì)胞”指天然產(chǎn)生或遺傳修飾的微生物細(xì)胞，包括古細(xì)菌如 產(chǎn)甲烷菌、嗜鹽微生物和嗜酸嗜熱菌，以及真細(xì)菌，如藍(lán)藻、螺旋體、變形細(xì)菌以及革 蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌。術(shù)語(yǔ)“修飾的”指如本文所述的更改的序列和序列片段、變體和衍生物。本文所用“核酸序列”或“核苷酸序列”指多核苷酸序列、寡核苷酸或其片 段，以及天然、重組、合成或半合成來(lái)源的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈， 并可代表正義或反以鏈，或者編碼或非編碼區(qū)。本發(fā)明的序列優(yōu)選包含至少12、15、 30、45、60、75、90、105、120、135、150、300、450、600、750 個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少 15-30、30-60、60-90、90-120、120-150、150-300、300-450、450-600 或 600-750 個(gè)核 苷酸或至少1000個(gè)核苷酸或至少1500個(gè)核苷酸。應(yīng)理解的是本文中每一處提及“核酸序 列”或“核苷酸序列”將包括天然、全長(zhǎng)序列，及其任何互補(bǔ)序列、片段、變化形式、 衍生物或變體。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指至少6、8、10、12、15、18、21、25、27、30 或 36 個(gè)核 苷酸或至少12-36個(gè)核苷酸或至少15-30個(gè)核苷酸的核酸序列，可用于PCR擴(kuò)增、測(cè)序或 雜交實(shí)驗(yàn)。如本文所用，“寡核苷酸”基本等同于“擴(kuò)增物”、“引物”、“寡聚物” 以及“探針”，如本領(lǐng)域通常定義的那樣。本文中所用單數(shù)或復(fù)數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸” 一般指任何核酸序列，例如， 任何聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，它可以是未修飾的RNA或DNA，或者修飾的 RNA或DNA。包括但不限于單鏈和雙鏈DNA，包括單鏈和雙鏈區(qū)的DNA，單鏈和雙 鏈RNA以及包括單鏈和雙鏈區(qū)的RNA，包含DNA和RNA的雜交分子(可為單鏈或(更 典型的)雙鏈或包含單鏈和雙鏈區(qū))。也包括含有RNA或DNA或者RNA和DNA的三 鏈區(qū)。具體說(shuō)，包括mRNA、cDNA和基因組DNA及其任何片段。該術(shù)語(yǔ)包括含有一 個(gè)或多個(gè)修飾堿基如含氚堿基或非常見(jiàn)堿基如肌苷的DNA和RNA。本發(fā)明的多核苷酸 可涵蓋編碼或非編碼序列，或正義或反義序列或iRNA如siRNA。應(yīng)理解的是本文中每一處提及“多核苷酸”或類(lèi)似術(shù)語(yǔ)將包括全長(zhǎng)序列，及其任何互補(bǔ)序列、片段、變化形 式、衍生物或變體。本文所用“肽”或“多肽”指本發(fā)明的分離的肽或多肽，其獲自任何物種， 優(yōu)選微生物，以及任何天然、合成、半合成或重組的來(lái)源。具體說(shuō)，本發(fā)明的肽或多肽 可獲自產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞，如甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)細(xì)胞，具體是反芻甲烷短桿 菌或史氏甲烷短桿菌細(xì)胞。對(duì)于重組產(chǎn)生，本發(fā)明的肽或多肽可獲自微生物或真核細(xì) 胞，例如大腸桿菌(Escherichia)、鏈球菌(Streptomyces)、芽孢桿菌(Bacillus)、沙門(mén)菌 (Salmonella)、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞如COS和CHO細(xì)胞或植物細(xì)胞。 應(yīng)理解的是本文中每一處提及“肽”或“多肽”將包括全長(zhǎng)序列，及其任何片段、變化 形式、衍生物或變體。本文所用“肽核酸”或“PNA”指反義分子或抗-基因試劑，其包含通過(guò)肽主 鏈連接的堿基。本文所用術(shù)語(yǔ)“反芻動(dòng)物”指具有瘤胃作為特殊類(lèi)型消化器官的動(dòng)物。反芻動(dòng) 物包括但不限于牛、綿羊、山羊、水牛、糜鹿、羚羊、北美馴鹿和鹿。本文所用術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)條件”或“嚴(yán)謹(jǐn)性”指核酸、鹽和溫度限定的雜交條件。 這些條件為本領(lǐng)域所熟知，可更改這些條件以鑒定或檢測(cè)相同或相關(guān)的多核苷酸序列。 參見(jiàn)例如Sambrook，J.等(1989)《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》冷泉港出版社，紐約普萊 J§、維尤(Molecular Cloning, A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY),以及Ausubel，F(xiàn).M.等(1989)新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，約翰韋利森出版社，紐 約(CurrentPro tocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, NY)。數(shù)禾中包 含低或高嚴(yán)謹(jǐn)性的相等條件取決于以下因素，如序列的長(zhǎng)度和特性(DNA、RNA、堿基 組成)、靶點(diǎn)特性(DNA、RNA,堿基組成)、環(huán)境(在溶液中或固定于固體基材上)、 鹽和其它成分(如甲酰胺、硫酸右旋糖苷和/或聚乙二醇)的濃度和反應(yīng)溫度(例如，從 低于探針解鏈溫度5°C至低于解鏈溫度約20°C _25°C的范圍內(nèi))。可改變一種或多種因素 以產(chǎn)生不同于或等同于上述條件的低或高嚴(yán)謹(jǐn)性。術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”包括人或非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括但不限于鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物， 如反芻動(dòng)物，具體是小鼠、兔、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛和馬。本文所用術(shù)語(yǔ)“基本純化”或“分離”指從細(xì)胞、重組或合成環(huán)境中移出的核 酸或氨基酸序列，并且至少至少60%，優(yōu)選75%并最優(yōu)選至少90%或至少99%不含它們 在其環(huán)境中相關(guān)聯(lián)的其它組分。已鑒定到“分離的”多核苷酸和多肽，并與它們的自然 狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的至少一種污染物分子分離。因此，應(yīng)理解，分離的多核苷酸和多肽是不同 于它們的天然形式或天然定位的形式。還應(yīng)理解，“分離的”不一定反應(yīng)純化序列的準(zhǔn) 確程度(如具體百分率)。本文所定義“轉(zhuǎn)化”指外源DNA進(jìn)入并改變接受細(xì)胞的過(guò)程?？墒褂帽绢I(lǐng)域 所熟知多種方法在天然或人工條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化可依賴(lài)將外源核酸序列插入原核或 真核宿主細(xì)胞的任何已知方法?；谛柁D(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞類(lèi)型選擇方法，可包括但不限于 病毒感染、電穿孔、熱休克、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和粒子轟擊。此類(lèi)“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì) 胞，其中插入的DNA能夠作為自主復(fù)制質(zhì)?；蜃鳛樗拗魅旧w的一部分進(jìn)行復(fù)制。它們 還包括在限定時(shí)間期間瞬時(shí)表達(dá)插入的DNA或RNA的細(xì)胞。
本文所用“疫苗”包括用于刺激對(duì)象的免疫應(yīng)答的所有組分和組合物。在這方 面尤其有用的是亞基疫苗，包括肽疫苗，以及載體疫苗、核酸疫苗和可食用的疫苗。可 利用疫苗建立或增強(qiáng)對(duì)抗原，尤其是微生物抗原的免疫應(yīng)答。在特定方面，疫苗包含引 起宿主保護(hù)發(fā)應(yīng)，如抗體形成、T輔助細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答的抗原。疫苗還可包含抗體， 例如，用于被動(dòng)免疫。如本文所用的肽、多肽或抗體的“變體”指一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變的氨基酸序 列。改變變體多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。變體可導(dǎo)致“保守性”改變，其中取代 的氨基酸具有相似結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，如用異亮氨酸取代亮氨酸。更少見(jiàn)的，變體可導(dǎo)致 “非保守性”變化，如用色氨酸替換甘氨酸。類(lèi)似的小變異還可包括氨基酸缺失或插入
或兩者均有。使用本領(lǐng)域熟知計(jì)算機(jī)程序如LASERGENE軟件(DNASTAR)可發(fā)現(xiàn)如 何確定可對(duì)哪一氨基酸取代、插入或缺失而不破壞生物學(xué)或免疫原性/免疫學(xué)活性的指 南。本發(fā)明還包括保留至少一種生物學(xué)活性(如細(xì)胞結(jié)合、膜結(jié)合)或免疫原性/免 疫學(xué)活性的變體。優(yōu)選的變體是具有基本相同或功能等同序列的變體，例如與公開(kāi)序列 至少80%和更優(yōu)選至少90%序列相同的變體。最優(yōu)選的變體是與本文公開(kāi)序列具有至少 95%,至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的變體。如下所述通過(guò)對(duì)需比較的 兩條序列比對(duì)、確定比對(duì)部分的相同殘基數(shù)目、除以本發(fā)明(查詢)序列總殘基數(shù)并乘以 100，從而確定相同性百分?jǐn)?shù)。有用的比對(duì)程序是AlignX(載體NTI)。發(fā)明詳述甲烷在反芻動(dòng)物前腸中由產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生，它是瘤胃系統(tǒng)中碳的終末還原產(chǎn) 物。已對(duì)甲烷產(chǎn)生通路的多個(gè)步驟進(jìn)行了闡述，主要來(lái)自于對(duì)非瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研 究，但是尚不了解對(duì)于使產(chǎn)甲烷菌在瘤胃中生長(zhǎng)和持續(xù)存在的適應(yīng)性。反芻甲烷短 桿菌(Methanobrevibacter raminantium)是新西蘭反芻動(dòng)物體內(nèi)主要的產(chǎn)甲烷菌。如本 文所述，已經(jīng)對(duì)反芻甲烷短桿菌的基因組進(jìn)行測(cè)序，顯示大小約3.0Mb，GC含量為 33.68%。已經(jīng)鑒定出甲烷生成通路的所有組件，并且將這些基因序列與熱自養(yǎng)甲烷桿菌 (Methanobacteriumthermoautotrophicum)禾口其j 氏甲燒球形菌(Methanosphaera stadtmanae) 的基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明在甲烷桿菌中甲烷生成基因的組織是保守的(圖1C)。 基因組中包含很多大表面蛋白，這些蛋白的特征表明它們可介導(dǎo)與其它瘤胃微生物的結(jié) 合。在本發(fā)明的不同方面，可以使用鑒定的多核苷酸和多肽作為在瘤胃中抑制產(chǎn)甲烷菌 和/或甲烷生成的手段，并進(jìn)一步闡明反芻甲烷短桿菌在甲烷形成中的作用。尤其有用 的是公開(kāi)的鑒定為參與甲烷生成的組分(圖6A-6C)、細(xì)胞表面組分(圖7A-7C)、參與外 泌多糖生物合成的組分(圖8A-8C)、具有跨膜結(jié)構(gòu)域的組分(圖9A-9C)的核苷酸和多 肽，以及用于產(chǎn)生抗體的多核苷酸和多肽(圖5A-5B)。肽、多肽和多核苷酸本發(fā)明包括肽和多肽，包括含有至少SEQ IDNO 1_702中至少一種或其片段、 變體和衍生物的那些多肽。可表達(dá)本發(fā)明的肽和多肽并用于不同的實(shí)驗(yàn)以測(cè)定其生物學(xué) 活性。這些肽和多肽可用于大規(guī)模合成和分離實(shí)驗(yàn)方案，例如，用于商業(yè)生產(chǎn)。可使用 此類(lèi)肽和多肽產(chǎn)生抗體，以分離相應(yīng)的氨基酸序列和對(duì)氨基酸序列水平進(jìn)行定量測(cè)定。 這些肽和多肽可用于靶向和抑制微生物細(xì)胞，尤其是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的疫苗。這些肽和多肽也可用于制備抑制這類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)和復(fù)制的抗體。本發(fā)明的肽和多肽也可用作組合物， 例如藥物組合物，特別是疫苗組合物。在特定方面，緩釋瘤胃裝置可與本發(fā)明的肽、多 肽、抗體和組合物(如藥物組合物，特別是疫苗組合物)聯(lián)用。本發(fā)明的肽包含選自下組的至少一個(gè)序列(a)包含選自SEQ IDNO 1-702或 其片段、變體或衍生物的一個(gè)氨基酸序列的至少一個(gè)片段的肽；(b)包含至少一個(gè)選自 SEQ ID NO 1-702和其片段、變體的氨基酸序列的功能性結(jié)構(gòu)域的肽；以及(C)包含選 自SEQIDNO 1-702或其變體或衍生物的至少一個(gè)氨基酸序列的至少一定數(shù)目的毗連殘 基的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有SEQ ID NO: 1-9中至少一個(gè)氨基酸序列 的分離的肽。所有這些序列統(tǒng)稱(chēng)本發(fā)明的肽。本發(fā)明多肽包含選自下組的至少一個(gè)序列(a)包含至少一個(gè)選自SEQID NO 1-702或其片段、變體或衍生物的氨基酸序列的多肽；(b)包含至少一個(gè)選自SEQID NO 1-702和其片段、變體的氨基酸序列的功能性結(jié)構(gòu)域的多肽；以及(C)包含選自 SEQ ID NO 1-702或其變體或衍生物的至少一個(gè)氨基酸序列的至少一定數(shù)目的毗連殘基 的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有SEQ ID NO: 1-9中至少一個(gè)氨基酸序列 的分離的肽。所有這些序列統(tǒng)稱(chēng)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明也包括一種分離的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO: 1_702的肽或多肽。 本發(fā)明的分離的多核苷酸還可用于對(duì)或多或少的相關(guān)細(xì)胞表面組分進(jìn)行基因組作圖、物 理作圖和基因克隆。通過(guò)本領(lǐng)域熟知技術(shù)如狹縫印跡技術(shù)或微陣列技術(shù)，可使用根據(jù)本 發(fā)明多核苷酸設(shè)計(jì)的探針在細(xì)胞中具有充分同源DNA和RNA序列的任何生物體中檢測(cè)基 因的存在和表達(dá)模式。使用本發(fā)明多核苷酸設(shè)計(jì)的引物可用于測(cè)序和PCR擴(kuò)增。本發(fā) 明多核苷酸可用于制備疫苗所用的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，以靶向和抑制微生物細(xì)胞，特 別是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞。本發(fā)明還包括多核苷酸在產(chǎn)生抑制此類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)或復(fù)制的抗體中的 應(yīng)用。本發(fā)明的多核苷酸也可用作組合物，例如藥物組合物，特別是疫苗組合物。在特 定方面，緩釋瘤胃裝置可與本發(fā)明的多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞和組合物(如藥物組合 物，特別是疫苗組合物)聯(lián)用。本發(fā)明多核苷酸包含選自下組的至少一個(gè)序列(a)包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-702或其片段或變體的氨基酸序列的編碼序列的序列；(b)至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-702或其片段或變體的氨基酸序列的編碼序列的互補(bǔ)序列、反向序列以及反向互 補(bǔ)序列；(C)至少一個(gè)選自SEQIDNO: 1-702或其片段或變體的氨基酸序列的編碼序列 中所含的開(kāi)放閱讀框；(d)至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-702或其片段或變體的氨基酸 序列的編碼序列的功能性結(jié)構(gòu)域；(e)含有至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-702或其變體 的氨基酸序列的編碼序列的至少一定數(shù)目的毗連殘基的序列；和(f)包含SEQIDNO: 703-1373中任一項(xiàng)的至少一定數(shù)目的毗連核苷酸的序列。還提供寡核苷酸探針和引物及 其變體。所有這些多核苷酸、寡核苷酸探針和引物在本文中統(tǒng)稱(chēng)為本發(fā)明的多核苷酸。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，可產(chǎn)生大量 本發(fā)明肽或多肽的編碼核苷酸序列，其中某些序列與任何已知和天然產(chǎn)生的基因的核苷 酸序列同源性很小。因此，本發(fā)明考慮到各個(gè)和每個(gè)可能的核苷酸序列變異，這些變異 可通過(guò)根據(jù)可能密碼子選擇密碼子組合而產(chǎn)生。根據(jù)應(yīng)用于天然產(chǎn)生的氨基酸序列的標(biāo) 準(zhǔn)三聯(lián)遺傳密碼產(chǎn)生這些組合，所有此類(lèi)變異都被視作已具體公開(kāi)。
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編碼肽或多肽或其片段或變體的核苷酸序列優(yōu)選在適當(dāng)選擇的肽條件或嚴(yán)謹(jǐn)條 件下能夠與天然產(chǎn)生序列的核苷酸序列雜交。然而，具有優(yōu)勢(shì)的是產(chǎn)生編碼肽或多肽或 者其片段或衍生物的、具有明顯不同密碼子使用的核苷酸序列。根據(jù)宿主使用特定密碼 子的頻率，可選擇密碼子以提高特定原核或真核宿主中的肽或多肽表達(dá)速率。改變肽或 多肽及其衍生物的編碼核苷酸序列而不改變編碼的氨基酸序列的其它原因包括產(chǎn)生具有 更有利特性，如比天然產(chǎn)生序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物具有更長(zhǎng)半衰期的RNA轉(zhuǎn)錄物。本發(fā)明還包括完全通過(guò)合成化學(xué)產(chǎn)生編碼肽或多肽，或其片段或變體的DNA 序列或其片段。在合成序列產(chǎn)生后，利用本領(lǐng)域熟知試劑，可將其插入到任何可用的 表達(dá)載體和細(xì)胞系統(tǒng)中。而且，可使用合成化學(xué)在編碼肽或多肽，或其任何變體或片 段的序列中引入突變。本發(fā)明還包括在如Wahl，G.M和S.L.Berger(1987 ； Methods Enzymol.152 399-407)以及 Kimmel，A.R.(1987; Methods Enzymol. 152 507-511)所 教導(dǎo)的各種嚴(yán)謹(jǐn)條件下，能與要求權(quán)利的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列，尤其是SEQ ID NO 703-1373中顯示的那些序列。本領(lǐng)域熟知并常用的DNA測(cè)序方法可用于實(shí)踐本發(fā)明的任何實(shí)施方式。這 類(lèi)方法可使用如DNA聚合酶I的克列諾片段，SEQUENASE(美國(guó)生物化學(xué)集團(tuán) (U. S.Biochemical Corp.),俄亥俄州克里富蘭)(U.S.BiochemicalCorp，Cleveland, OH), Taq聚合酶(珀金埃爾默)(Perkin Elmer)，熱穩(wěn)定T7聚合酶(安法馬西亞生物技術(shù)公司， 新澤西州皮斯卡塔韋)(AmershamPharmacia Biotech Piscataway, NJ)，或者聚合酶和校 對(duì)核酸外切酶的組合，如生命技術(shù)公司(Life Technologies)(馬里蘭州蓋瑟斯堡)銷(xiāo)售的 ELONGASE擴(kuò)增系統(tǒng)中找到的那些。優(yōu)選地，該方法通過(guò)機(jī)器自動(dòng)化進(jìn)行，如漢密爾頓 微型實(shí)驗(yàn)室2200 (Hamilton Micro Lab 2200)(內(nèi)華達(dá)州雷諾漢密爾頓)(Hamilton，Reno, NV)，派而特?zé)嵫h(huán)儀(Peltier Thermal Cycler) (PTC200 ； MJ研究公司，麻省沃特敦) (MJ Research, Watertown, ΜΑ) ； ABI 催化儀(ABI Catalyst)以及 373 和 377DNA 測(cè)序儀 (珀金埃爾默)(Perkin Elmer)或基因組測(cè)序儀20 (羅氏診斷公司)(Roche Diagnostics)?？墒褂貌糠趾塑账嵝蛄胁⑹褂帽绢I(lǐng)域所知方法將編碼肽或多肽的核酸序列 延伸，以檢測(cè)上游序列如啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件。例如，可使用的一種方法“位點(diǎn)限制 性” PCR使用通用引物以獲取與已知基因座相鄰的未知序列(Sarkar，G. (1993) PCR Methods Applic.2 318-322)。具體說(shuō)，在接頭序列引物和已知區(qū)域特異性引物存在的條 件下對(duì)基因組DNA進(jìn)行首次擴(kuò)增。然后對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行第二輪PCR，其中使用相同的接 頭引物和在第一引物內(nèi)的另一特異性引物。用合適的RNA聚合酶對(duì)每一輪PCR產(chǎn)物進(jìn) 行轉(zhuǎn)錄，用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行測(cè)序。市售毛細(xì)管電泳系統(tǒng)可用于分析測(cè)序或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列的大小或?qū)ζ?進(jìn)行確認(rèn)。具體說(shuō)，毛細(xì)管測(cè)序可使用可流動(dòng)聚合物進(jìn)行電泳分離，激光激發(fā)的四種 不同熒光染料(每種對(duì)應(yīng)一種核苷酸)，用電荷耦合器件照相機(jī)檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)。使用合 適的軟件(如基因組分型和序列導(dǎo)航者，珀金埃爾默公司)(GENOTYPER and Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer)可將輸出/光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從上樣到計(jì)算機(jī)分析和電 子數(shù)據(jù)顯示均可在計(jì)算機(jī)控制下進(jìn)行。毛細(xì)管電泳尤其優(yōu)選用于對(duì)特定樣品中少量存在 的小片段DNA進(jìn)行測(cè)序。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，編碼肽或多肽的多核苷酸或其片段可用于重組DNA分子以在合適宿主細(xì)胞中指導(dǎo)肽或多肽或其片段或變體的表達(dá)。由于遺傳編碼的固 有簡(jiǎn)并性，可產(chǎn)生編碼基本相同或功能等同的氨基酸序列的其它DNA序列，這些序列可 用于克隆和表達(dá)肽或多肽?？墒褂帽绢I(lǐng)域通常所知方法對(duì)本發(fā)明的核苷酸序列進(jìn)行工程 改造以根據(jù)多種原因改變氨基酸編碼序列，包括但不限于為了改變克隆、加工和/或基 因產(chǎn)物表達(dá)而進(jìn)行的變化?？墒褂猛ㄟ^(guò)隨機(jī)片段化進(jìn)行的DNA改組以及對(duì)基因片段和合 成寡核苷酸的PCR組裝對(duì)核苷酸序列進(jìn)行工程改造。例如，可使用定位誘變插入新的限 制性位點(diǎn)，改變糖基化形式，改變密碼子偏好，引入突變等等。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可將天然、修飾或重組的編碼肽或多肽的核酸序 列連接至異源序列以編碼融合蛋白。例如，編碼可被市售抗體識(shí)別的嵌合序列可能是 有用的。也可工程改造融合蛋白使其在本發(fā)明的肽或多肽和異源蛋白序列間含有切割位 點(diǎn)，以便于切割并純化該肽或多肽，與異源部分分離。在另一實(shí)施方式中，可使用本領(lǐng)域熟知化學(xué)方法合成完整或部分形式的肽或多 肽編碼序列(參見(jiàn) Caruthers，M.H.等(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223，Horn, Τ.等(1980)NucLAcids Res.Symp.Ser.225-232)。或者，可使用合成氨基酸序列或其片段 的化學(xué)方法產(chǎn)生多肽本身。例如，可使用多種固相合成技術(shù)(Roberge，J.Y.等(1995) Science 269 202-204; Merrifield J. (1963) J.Am.Chem.Soc.85 2149-2154)進(jìn)行多肽合 成，使用例如ABI 431A肽合成儀(珀金埃爾默公司)進(jìn)行自動(dòng)合成。可用化學(xué)方法合成 肽或多肽的各種片段，并用化學(xué)方法組合產(chǎn)生全長(zhǎng)分子?？捎弥苽湫透咝б合嗌V分離新合成的肽或多肽(如，Creighton, T. (1983)蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原則，WH富瑞曼公司，紐約(Proteins Stracturesand Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY))。通過(guò)氨基酸分析和測(cè)序可確認(rèn)合成的肽或多肽 的組成(如，埃得曼降解步驟(Edmandegradationprocedure ； Creighton),同上)。此外，
肽或多肽或其任何部分的氨基酸序列可在直接合成中更改和/或通過(guò)化學(xué)方法與來(lái)自其 它蛋白質(zhì)或其部分的序列組合以產(chǎn)生變體分子。為了表達(dá)生物學(xué)活性肽或多肽，可將編碼該序列或功能等同物的核苷酸序列插 入合適的表達(dá)載體，即包含插入序列轉(zhuǎn)錄和翻譯必需元件的載體?？捎帽绢I(lǐng)域熟練技 術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含肽或多肽編碼序列以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載 體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。Sambrook，J.等 (1989)《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》冷泉港出版社，紐約普萊恩維尤(Molecular Cloning， A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview，NY)， 以 及 Ausubel， F.M.等(1989)新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，約翰韋利森出版社，紐約(Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley&Sons，New York, NY)對(duì)此類(lèi)技術(shù)進(jìn)行了 描述。可使用多種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)包含并表達(dá)本發(fā)明肽或多肽的編碼序列。它 們包括但不限于微生物體如重組噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；酵 母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)轉(zhuǎn)化的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；病毒表達(dá) 載體(如，花椰菜花葉病毒CaMV;煙草花葉病毒TMV)或細(xì)菌表達(dá)載體(如，Ti或 pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。對(duì)于細(xì)菌，有用的質(zhì)粒包括英駿公 司(Invitrogen)的 pET、pRSET、pTrcHis2 和 pBAD 質(zhì)粒；諾瓦基公司(Novagen) WpET 和pCDF質(zhì)粒以及西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)的Director 質(zhì)粒。對(duì)于產(chǎn)甲烷菌，有用的質(zhì)粒包括但不限于pME2001、pMV15和pMPl。所用表達(dá)載體或宿主細(xì)胞并 不限制本發(fā)明?！翱刂圃焙汀罢{(diào)節(jié)序列”是載體的非翻譯區(qū)-增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、5'和3' 非翻譯區(qū)一它們與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。此類(lèi)元件的強(qiáng)度和特 異性可能不同。根據(jù)所使用載體系統(tǒng)和宿主，可使用任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元 件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，當(dāng)克隆進(jìn)細(xì)菌系統(tǒng)時(shí)，可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子， 如BLUESCRIPT噬菌粒(司查塔基公司，加州拉霍亞)(Stratagene，LaJolla, CA)或 pSPORT 1質(zhì)粒(生命技術(shù)公司)(Life Technologies)的雜交IacZ啟動(dòng)子等?？稍诶ハx(chóng) 細(xì)胞中使用桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子?？蓪?lái)源于植物細(xì)胞基因組(如，熱休克、 RUBISCO和存儲(chǔ)蛋白質(zhì)基因)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子或來(lái)自于植物病毒的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子 (如病毒啟動(dòng)子或前導(dǎo)序列)克隆到載體中。在細(xì)菌系統(tǒng)中，可根據(jù)肽或多肽的指定應(yīng)用對(duì)許多表達(dá)載體進(jìn)行選擇。例如， 當(dāng)需要大量肽或多肽時(shí)，可使用指導(dǎo)高水平表達(dá)易于純化的融合蛋白的載體。此類(lèi)載體 包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體如BLUESCRIPT (司查塔基公司)，其 中可將多肽編碼序列連接入載體，與半乳糖苷酶的氨基末端Met和后續(xù)7個(gè)殘基在 相同讀框內(nèi)，從而產(chǎn)生雜合蛋白；pIN載體(Van Heeke，G.和S.M.Schuster(1989) J.Biol. Chem.264 5503-5509)等。也可采用pGEX載體(普洛麥格公司，威斯康星州麥迪遜)(Promega，Madison,
WI)表達(dá)肽或多肽與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，這類(lèi)融合蛋白可 溶，并容易通過(guò)以下方法由裂解細(xì)胞純化吸附于谷胱甘肽瓊脂糖珠上，然后在游離谷 胱甘肽的存在下洗脫。可設(shè)計(jì)此類(lèi)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以使其包含肝素、凝血酶或Xa因 子蛋白酶切割位點(diǎn)，從而使感興趣的克隆的肽或多肽可按需從GST部分釋放出來(lái)。在 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用包含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的多種載 體，如α因子、醇氧化酶和PGH。參見(jiàn)Ausubel等(同上)和Grant等(1987) Methods Enzymol.l53 516-544 的綜述。也可使用特異性起始信號(hào)達(dá)到更有效的翻譯本發(fā)明肽或多肽編碼序列的目的。 此類(lèi)信號(hào)包括ATG啟動(dòng)密碼子和相鄰序列。當(dāng)肽或多肽編碼序列、其起始密碼子和上游 序列插入到合適表達(dá)載體的情況下，無(wú)需另外的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號(hào)。然而，當(dāng)僅插入 編碼序列或其片段時(shí)，需提供外源的翻譯控制信號(hào)包括ATG起始密碼子。而且，起始密 碼子應(yīng)當(dāng)位于正確的閱讀框中，以保證完整插入物的翻譯。外源翻譯控制元件和起始密 碼子可有多種天然或合成來(lái)源。通過(guò)包括適合所用特定細(xì)胞體系的增強(qiáng)子可增強(qiáng)表達(dá)效 率，如文獻(xiàn)中所述(Schaff，D.等，(1994) Results Probl.Cell Differ.20 125-162)。此外，可根據(jù)宿主細(xì)胞株調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)或以所期望的方式加工表達(dá)的肽或 多肽的能力對(duì)其進(jìn)行選擇。此類(lèi)序列的修飾包括但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、 磷酸化、脂化和?；?。也可使用切割肽或多肽“前體”形式的翻譯后加工以利于 正確的插入、折疊和/或功能?？蓮拿绹?guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(馬里蘭州貝塞斯達(dá)) (American Type Culture Collection(ATCC ； Bethesda，MD)獲取具有特定細(xì)胞機(jī)器或翻 譯后活性的特征性機(jī)制的不同宿主細(xì)胞，選擇以保證正確的序列修飾和加工。具體宿 主細(xì)胞包括但不限于產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞，如產(chǎn)甲烷短桿菌細(xì)胞，具體說(shuō)，反芻甲烷短桿菌或史氏甲烷短桿菌細(xì)胞。感興趣的宿主細(xì)胞還包括例如，紅酵母(Rhodotorala)、短 梗霉菌(Aureobasidium)、釀酒酵母(Saccharomyces)、擲孢酵母(Sporobolomyces)、假 單胞菌(Pseudomonas)、歐文氏菌(Erwinia)和黃桿菌(Flavobacterium)；或其它此類(lèi)有 機(jī)體如埃希菌(Escherichia)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、芽胞桿菌(Bacillus)、鏈霉菌 (Streptomyces)等。特定的宿主細(xì)胞包括尤其適于本發(fā)明使用的大腸桿菌(Escherichia coli)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、變青鏈霉菌(Streptomyceslividans)等。數(shù)種技術(shù)可將核酸引入體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞中。它們包括化學(xué)方法(Feigner 等，Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 84: 7413 7417(1987) ； Bothwell 等，真核基因克隆和分 析方法(Methods for Cloning and Analysis offiukaryotic Genes)，編，約翰和巴特勒出版公 司，麻省波士頓(JonesandBartlett Publishers Inc., Boston, Mass.) (1990) ； Ausubel 等， 分子生物學(xué)簡(jiǎn)明實(shí)驗(yàn)方案(Short Protocols in Molecular Biology)，約翰韋利森公司，紐 約(JohnWiley and Sons，New York, NY) (1992)；以及 Farhood，Annal.NY Acad.Sci.， 716 23 34(1994)),使用原生質(zhì)體(Bothwell，同上)或電脈沖(Vatteroni 等，Mutn. Res., 291 163169(1993) ； Sabelnikov, Prog.Biophys.Mol.Biol., 62: 119152(1994)； Bothwell等，同上；以及Ausubel等，同上)，使用減毒病毒(Davis等，J.Virol.1996， 70(6)，3781 3787; Brinster 等 J.Gen.Virol.2002, 83 (Pt 2), 369 381; Moss, Dev.Biol. Stan., 82 55 63 (1994)；以及 Bothwell 等，同上)，以及物理方法(Fynan 等，Int J Immunopharmacol. 1995年 2 月；17(2) 79-83; Johnston等，Meth.Cell Biol.，43 (PtA) 353 365 (1994) ； Bothwell 等，同上；以及 Ausubel 等，同上)?？赏ㄟ^(guò)以下方法將核酸成功遞送至動(dòng)物組織使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Watanabe 等，Mol.Reprod.Dev.，38 268 274 (1994))，直接將裸露的 DNA 或 RNA 注射入動(dòng) 物肌肉組織(Robinson 等，Vacc.，11 957 960(1993) ； Hoffman 等，Vacc.12 1529 1533(1994) ； Xiang 等，Virol.，199 132 140(1994) ； Webster 等，Vacc.，12: 1495 1498(1994) ； Davis 等，Vacc.，12: 1503 1509(1994) ； Davis 等，Hum.Molec.Gen.，2 1847 1851(1993) ； Dalemans 等，AnnNY Acad.Sci. 1995，772，255 256.Conry 等，Cancer Res.1995，55(7)，1397-1400)和胚胎(Naito等，Mol.Reprod.Dev.，39: 153 161(1994)； 和 Burdon 等，Mol.Reprod.Dev., 33: 436 442(1992)),肌肉內(nèi)注射自我復(fù)制的 RNA 疫苗 (Davis 等，JVirol 1996，70(6)，3781 3787 ； Balasuriya 等，Vaccine 2002，20(1112)， 1609 1617)或者用“基因槍”技術(shù)皮內(nèi)注射DNA(Johnston等，同上)。用蛋白質(zhì)特異性多克隆或單克隆抗體檢測(cè)和測(cè)定本發(fā)明肽或多肽表達(dá)的各種實(shí) 驗(yàn)方案為本領(lǐng)域所知。例子包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、放射性免疫(RIA)和熒光 激活的細(xì)胞分選(FACS)。可使用與肽或多肽上兩個(gè)非干擾表位具有反應(yīng)性的單克隆抗體 進(jìn)行雙位點(diǎn)單克隆免疫實(shí)驗(yàn)，也可使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。這些和其它實(shí)驗(yàn)參見(jiàn)Hampton， R.等(1990 ；血清學(xué)方法，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Serological Methods，a laboratory Manual), APS 出版社，明尼蘇達(dá)州圣保羅)以及 Maddox，D.E.等(1983 ； J.Exp.Med.158 1211-1216)等。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員了解多種標(biāo)記和偶聯(lián)技術(shù)，可用于多種核酸和氨基酸實(shí) 驗(yàn)。產(chǎn)生標(biāo)記的雜交或PCR探針用于檢測(cè)多核苷酸相關(guān)序列的方法包括寡核苷酸標(biāo)記、缺口平移、末端標(biāo)記或使用標(biāo)記核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；蛘?，可將肽或多肽或其 任何片段或變體的編碼序列克隆入載體用于產(chǎn)生mRNA探針。此類(lèi)載體為本領(lǐng)域所知 并可購(gòu)得，可在加入合適RNA聚合酶如T7、T3或SP6以及標(biāo)記的核苷酸后用于體外 合成RNA探針?？衫冒卜R西亞生物技術(shù)公司、普洛麥格公司和美國(guó)生物化學(xué)公司 (AmershamPharmacia Biotech, Promega and US Biochechemical)生產(chǎn)的多禾中市售試齊Ll盒進(jìn) 行這些步驟。易于檢測(cè)的合適報(bào)告分子或標(biāo)記包括放射性核素、酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā) 光物質(zhì)或發(fā)色劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等?？稍谶m于表達(dá)和從培養(yǎng)物中回收肽或多肽的條件下，培養(yǎng)表達(dá)載體或用表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)物可包含體外或體內(nèi)表達(dá)組件。體外表達(dá)組件包括兔網(wǎng)織紅細(xì) 胞裂解物、大腸桿菌裂解物和麥芽提取物的體外表達(dá)組件，例如，英駿公司(Iiwitrogen) 的 Expressway 或RiPs 系統(tǒng)，英特龍生物技術(shù)公司(iNtRON Biotechnology)的 Genelator 系統(tǒng)，諾瓦基公司(Novagen)的EcoPro 或STP3 系統(tǒng)，普洛麥格公司(Promega)的 TNT 快速偶聯(lián)系統(tǒng)和凱杰公司(QIAGEN)的EasyXpress系統(tǒng)。產(chǎn)自培養(yǎng)物的肽或多肽 可以是分泌的或細(xì)胞內(nèi)包含的多肽，這取決于序列和/或所用載體。在某些特定方面， 可設(shè)計(jì)編碼肽或多肽的表達(dá)載體使其包含指導(dǎo)肽或多肽通過(guò)原核或真核細(xì)胞膜分泌的信 號(hào)序列。其它構(gòu)建物可包含利于肽或多肽純化的氨基酸結(jié)構(gòu)域。此類(lèi)結(jié)構(gòu)域包括但不 限于可在固化金屬上進(jìn)行純化的金屬螯合結(jié)構(gòu)域如組氨酸-色氨酸(如6X-HIS)模 塊，可在固定免疫球蛋白上進(jìn)行純化的蛋白質(zhì)A結(jié)構(gòu)域，以及在FLAG 擴(kuò)展/親和純 化系統(tǒng)(因繆耐斯集團(tuán)，華盛頓州西雅圖)(Immunex Corp.，Seattle, WA)中所用結(jié)構(gòu) 域。可用的表位標(biāo)簽包括3XFLAG 、HA、VSV-G> V5、HSV、GST、GFP> MBP> GAL4和β-半乳糖苷酶。有用的質(zhì)粒包括含有生物素標(biāo)簽的質(zhì)粒(如，普洛麥格公司的 PinPoint 質(zhì)粒)，含有鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白的質(zhì)粒(如司查塔基公司的pCAL質(zhì)粒)，含有 鏈霉親和素結(jié)合肽的質(zhì)粒(如司查塔基公司的InterPlay 質(zhì)粒)，含有C-myC或FLAG 標(biāo)簽的質(zhì)粒(如西格瑪奧德里奇公司的免疫沉淀質(zhì)粒)或含有組氨酸標(biāo)簽的質(zhì)粒(如凱杰 公司的QIAExpress質(zhì)粒)。為了利于純化，表達(dá)載體可包含可切割的接頭序列，如Xa因子或腸激酶(英 駿公司，加州圣地亞哥)的特異性接頭序列。例如，載體在純化結(jié)構(gòu)域和肽或多肽間可 包含一個(gè)或多個(gè)接頭。一種此類(lèi)表達(dá)載體能夠用于表達(dá)包含本發(fā)明肽或多肽的融合蛋 白，并提供編碼硫氧還蛋白或腸激酶切割位點(diǎn)前6組氨酸殘基的核酸。組氨酸殘基利于 在IMAC (固定金屬離子親和色譜柱，如Porath，J等(1992)Prot.Exp.Purif.3 263-281所 述)上純化，而腸激酶切割位點(diǎn)則提供一種從融合蛋白中純化肽或多肽的方法。Kroll， D.J.等(1993 ； DNACell Biol. 12 441-453)提供了關(guān)于包含融合蛋白的載體的討論?？贵w和疫苗可使用本領(lǐng)域通常所知的方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。具體說(shuō)，可根據(jù)已知方法使 用純化的肽、多肽或多核苷酸產(chǎn)生抗體。此類(lèi)抗體可包括但不限于多克隆、單克隆、 嵌合和單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段。尤其優(yōu)選將中和抗體(即抑制 功能的那些抗體)與疫苗一起使用。為了產(chǎn)生抗體，可將具有免疫原性的肽、多肽、多核苷酸或其任何片段注射入不同的宿主，包括山羊、兔、大鼠、人等，以進(jìn)行免疫。根據(jù)宿主種類(lèi)，可使用不同的 佐劑以提高免疫應(yīng)答。此類(lèi)佐劑包括但不限于福氏佐劑、礦物凝膠如氫氧化鋁和表面 活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、普流羅尼克多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔血藍(lán)素和二 硝基酚。用于人的佐劑中，尤其優(yōu)選BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。用于誘導(dǎo)抗體的肽、多肽或片段優(yōu)選具有包含至少5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選10個(gè)氨 基酸的氨基酸序列。優(yōu)選的是，它們與天然蛋白質(zhì)氨基酸序列的一部分相同，以及它們 可包含小的天然產(chǎn)生分子的完整氨基酸序列?？蓪被岫瘫叟c另一蛋白質(zhì)如鑰孔血藍(lán) 素以及抗嵌合分子的抗體的短臂融合。使用通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)制備單克隆抗體。這些技術(shù) 包括但不限于雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以及EBV雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.等 (1975) Nature 256 495-497; Kozbor, D.等(1985)J.Immunol.Methods 81 31-42; Cote, R.J.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80 2026-2030 ； Cole, S.P.等(1984) Mol.Cell Biol.62 109-120)。此外，也可使用為產(chǎn)生“嵌合抗體”開(kāi)發(fā)的技術(shù)，如將小鼠抗體基因和人抗 體基因組合以獲得具有合適抗原特異性和生物學(xué)活性的分子(Morrison，S.L.等(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.81 6851-6855 ； Neuberger, M.S.等(1984) Nature 312 604-608; Takeda, S.等(1985)Nature 314 452-454)。或者，可通過(guò)本領(lǐng)域所知方法改進(jìn)用于產(chǎn) 生單鏈抗體的技術(shù)，以產(chǎn)生特異性單鏈抗體。具有相關(guān)特異性但獨(dú)特型組成不同的抗體 可通過(guò)隨機(jī)組合免疫球蛋白文庫(kù)的鏈改組產(chǎn)生(Burton D.R. (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88 11120-3)。本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員理解術(shù)語(yǔ)“雙抗體”和“三抗體”。存在包含重鏈 可變結(jié)構(gòu)域(VH)通過(guò)短肽接頭與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)連接的分子，該短肽接頭太短以 至相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間無(wú)法配對(duì)。這促使與一條或多條其它鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)， 并促進(jìn)形成具有兩個(gè)或多個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的二聚體或三聚體分子。所得的抗體分 子可以是單特異性或多特異性的(如，雙抗體的情況下具有雙重特異性)。使用本發(fā)明 涉及領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，如Todorovska等(在癌癥靶向中雙抗體、三抗體和四抗體的設(shè)計(jì) 禾口應(yīng)用(Design and application of diabodies， triabodies and tetrabodies for cancertargeting). J.Immunol.Methods.2001年2月1日；248(1-2) 47-66)所述，從兩種或多種抗體產(chǎn)生此 類(lèi)抗體分子。也可通過(guò)在淋巴細(xì)胞群中誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生或通過(guò)如文獻(xiàn)所述方法篩選免疫球蛋白 文庫(kù)或高特異性結(jié)合試劑板塊產(chǎn)生抗體(Orlandi，R.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86 3833-3837 ； Winter, G.等(1991) Nature 349 293-299)。也可產(chǎn)生包含特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。例如，此類(lèi)片段包括但不限于可 通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab' )2片段，以及通過(guò)還原F(ab' )2片段的二硫橋 產(chǎn)生的Fab片段。或者，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)以快速簡(jiǎn)便的鑒定具有所需特異性的單克 隆 Fab 片段(Huse, W.D.等(1989) Science254 1275-1281)。可使用不同免疫實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選鑒定具有結(jié)合特異性的抗體。本領(lǐng)域熟知使用具有 確定特異性的多克隆或單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合或免疫放射實(shí)驗(yàn)的多種實(shí)驗(yàn)方法。此類(lèi)免疫實(shí)驗(yàn)通常包括測(cè)定肽、多肽或多核苷酸和其特異性抗體間形成的復(fù)合物。優(yōu)選使用 與兩個(gè)非干擾表位具有反應(yīng)性的單克隆抗體的雙位點(diǎn)單克隆免疫實(shí)驗(yàn)，但也可使用競(jìng)爭(zhēng) 性結(jié)合實(shí)驗(yàn)(Maddox，同上)。本文所述抗體具有靶向和/或抑制細(xì)胞的能力，還可作為載體分子用于將其它 抑制劑分子遞送入微生物細(xì)胞。將化合物偶聯(lián)至氨基酸的化學(xué)方法已經(jīng)得以很好的發(fā) 展，可將多種不同的分子類(lèi)型與抗體連接。最常見(jiàn)的偶聯(lián)方法依賴(lài)于游離氨基(α-氨基 或Lys)、巰基(Cys)或羧酸基團(tuán)(Asp、Glu或α _羧基)的存在?？墒褂门悸?lián)方法通過(guò) 羧基-或氨基-末端殘基將抗體連接至細(xì)胞抑制劑。在一些情況下，序列包含多個(gè)可與 所選化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的殘基?？墒褂迷摲椒ㄉa(chǎn)包含多于一種細(xì)胞抑制劑的多聚物。 或者，可縮短或選擇抗體，使反應(yīng)性殘基位于序列的氨基或羧基末端。例如，在多肽合成中可使用N-α-Fmoc-N ε-1-(4，4_二甲基_2，6二氧代環(huán)亞 己-1-基-3-甲基丁基)-L-賴(lài)氨酸，將報(bào)告分子如熒光素特異性摻入到賴(lài)氨酸殘基(Ono 等，1997)。合成后用胼處理去除4，4-二甲基-2，6-二氧代環(huán)亞己-1-基，偶聯(lián)5-和 6_羧基熒光素琥珀酰亞胺酯。因此，通過(guò)在多肽序列中包含賴(lài)氨酸殘基，然后與合適的 衍生化細(xì)胞抑制劑反應(yīng)，能夠完成抑制劑分子與抗體的偶聯(lián)。還可使用EDC (鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)或碳二亞胺偶 聯(lián)方法。碳二亞胺可激活天門(mén)冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈羧基基團(tuán)，以及羧基末端基團(tuán)，使 其成為伯胺偶聯(lián)的反應(yīng)性位點(diǎn)。將活化的抗體與細(xì)胞抑制劑混合以產(chǎn)生最終的偶聯(lián)物。 如果細(xì)胞抑制劑首先被活化，那么EDC法將通過(guò)N末端α胺并且可能通過(guò)Lys側(cè)鏈中的 胺(如果存在的話)偶聯(lián)細(xì)胞抑制劑。間-馬來(lái)酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)是異雙功能試劑，可 通過(guò)半胱氨酸將抗體連接于細(xì)胞抑制劑。半胱氨酸殘基的硫醇基團(tuán)參與偶聯(lián)。如果所選 序列不包含Cys，通常將Cys殘基放置于N_或C-末端以便在高度控制條件下連接抗體與 細(xì)胞抑制劑。出于合成的目的，將半胱氨酸置于抗體的N末端是有幫助的。MBS尤其 適合用于本發(fā)明。戊二醛可用作通過(guò)其氨基將兩個(gè)化合物連接的雙功能偶聯(lián)試劑。戊二醛在抗體 和細(xì)胞抑制劑之間提供了高度靈活的間隔物，以利于呈現(xiàn)。戊二醛是反應(yīng)性非常高的化 合物，與Cys、Tyr和His進(jìn)行有限程度的反應(yīng)。當(dāng)多肽在其氨基末端僅包含一個(gè)游離氨 基時(shí)，戊二醛偶聯(lián)方法尤其有用。當(dāng)抗體包含不止一個(gè)游離氨基時(shí)，可形成大型多聚復(fù) 合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體可融合于(如通過(guò)框內(nèi)克隆)或連接于(如通過(guò)化 學(xué)偶聯(lián))細(xì)胞抑制劑，如抗微生物試劑。其中包括抗微生物肽，例如殺菌/通透性增 加蛋白、陽(yáng)離子抗微生物蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白和犬科抗菌肽(cathelicidinsM如來(lái)自 中性粒細(xì)胞，參見(jiàn)例如 Hancock 和 Chappie，1999，Antimicrob.Agents Chemother.43 1317-1323 ； Ganz 禾Π Lehrer, 1997，Curr.Opin.Hematol.4 53-58 ； Hancock 等，1995， Adv.Microb.Physiol.37 135-175)?？刮⑸镫倪€包括防御素(如，來(lái)自上皮細(xì)胞或中 性粒細(xì)胞)和血小板殺微生物蛋白(參見(jiàn)例如，Hancock和Chappie，1999，Antimicrob. Agents Chemother.43 1317-1323)。其它抗微生物肽包括但不限于短桿菌肽S、桿菌 肽、多粘菌素B、鱟素、白細(xì)胞抗菌肽(bactenecin)(如，牛白細(xì)胞抗菌肽)，牛蛙皮膚抗
21菌肽(ranalexin)、天蠶素A (cecropin A)、尹杜抗菌肽(indolicidin)(如牛尹杜抗菌肽)和
乳酸鏈球菌素(如細(xì)菌乳酸鏈球菌素)?？刮⑸镌噭┻€包括離子載體(ionophores)，它利于離子(如鈉)的穿越脂質(zhì) 屏障如細(xì)胞膜進(jìn)行傳播。尤其適合本發(fā)明的兩個(gè)離子載體化合物是RUMENSIN (禮來(lái) 公司)(Eli Lilly)和拉沙里菌素(Lasalocid)(羅氏公司)(Hoffman LaRoche)。其它離子 載體包括但不限于鹽霉素、阿伏霉素、阿瑞辛(aridcin)和阿克拉寧(actaplanin)。其 他抗微生物劑包括青霉素、莫能菌素 和阿奇霉素、甲硝唑、鏈霉素、卡那霉素和青 霉素，以及內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氯霉素、新生霉素、利福平和氟 喹諾酮(參見(jiàn)例如 Horn 等，2003，Applied Environ.Microbiol.69 74-83 ； Eckburg 等， 2003, Infection Immunity 71 591—596; Gijzen 等，1991, Applied Environ.Microbiol.57 1630-1634 ； Bonelo 等，1984，F(xiàn)EMS Microbiol丄ett.21 341-345 ； Huser 等，1982， Arch.Microbiol.132 1-9 ； Hilpert 等，1981，Zentbl.Bakteriol.Mikrobiol.Hyg.l Abt Orig.C 2 21-31)。尤其有用的抑制劑是阻斷或干擾甲烷生成的化合物，包括溴代乙磺酸，如， 2-溴代乙磺酸(BES)或其鹽，例如鈉鹽。鉬酸鈉(Mo)是硫酸還原抑制劑，可與溴代 乙磺酸一起使用。其它抗甲烷生成化合物包括但不限于硝酸、甲酸、甲基氟、三氯甲 烷、水合氯醛、亞硫酸鈉、乙烯和不飽和烴、乙炔，脂肪酸如亞油酸，順式油酸，飽和 脂肪酸，如山崳酸(behenic)和硬脂酸，以及陸馬嗪(lumazine)(例如，2，4-二羥基蝶 啶)。其它化合物包括3-溴丙磺酸鹽(BPS)、丙炔酸和2- 丁炔酸乙酯?？刮⑸飫┻€包括裂解酶，包括噬菌體溶菌酶、內(nèi)溶素、溶菌酶、溶素、噬菌 體溶素、溶腸壁素、胞壁質(zhì)酶和病毒溶素。有用的酶具有水解細(xì)菌細(xì)胞壁中特定鍵的能 力。特定的裂解酶包括但不限于葡萄糖苷酶，它水解肽聚糖中氨基糖(如N-乙?；?壁酸和N-乙?；咸前?間的糖苷鍵；酰胺酶，它切割多糖鏈和交聯(lián)肽之間的N-乙酰 胞壁酰-L-丙氨酸的酰胺連接；以及內(nèi)肽酶，它水解肽間連接(如，半胱氨酸內(nèi)肽酶)， 和內(nèi)異肽酶，它攻擊來(lái)自甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)的產(chǎn)甲烷菌的假胞壁質(zhì)。此外，PNA也包括作為抗微生物試劑。PNA是肽-核酸雜交物，其中磷酸主 鏈被獲自N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單位的非手性中性主鏈取代(參見(jiàn)例如優(yōu)卡生物科 學(xué)系列(Eurekah Bioscience Collection)。人端粒酶的PNA和寡核苷酸抑制劑(PNA and Oligonucleotide Inhibitors of HumanTelomerase) .G.Gavory 禾口 S.Balasubramanian，蘭登生物 科學(xué)公司(LandesBioscience)，2003)。通過(guò)亞甲羰基連接將A、G、T、C堿基連接于 主鏈的氨基氮上(P.E.Nielsen 等，Science 1991.254 1497-1500 ； M.Egholm 等，Nature 1993.365 566-568)。PNA以高特異性與互補(bǔ)序列結(jié)合，并且相對(duì)類(lèi)似的DNA或RNA， PNA具有更高親合力(M.Egholm等，同上)。與對(duì)應(yīng)的DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈 體相比，PNA/DNA或PNA/RNA雜交物具有更高的熱穩(wěn)定性(M.Egholm等，同上)。 由于非天然酰胺主鏈不被核酶或蛋白酶識(shí)別，因而PNA還具有高的化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性 (V.Demidov 等，Biochem Pharmacol 1994.48 1310-1313)。通常 PNA 的長(zhǎng)度至少為 5 個(gè)堿基，并包含末端賴(lài)氨酸?？蓪NA PEG化以進(jìn)一步延長(zhǎng)其壽命(Nielsen，P.E.等 (1993) Anticancer Drug Des.8 53-63)。在一個(gè)具體方面，可將本發(fā)明抗體融合或連接于其它抗體或其片段。加入的抗體或抗體片段可靶向微生物細(xì)胞，或者特別是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞，或一種或多種細(xì)胞組件。 例如，可靶向細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，如胞外受體。在某些方面，可利用對(duì)象中特異性表達(dá)的 序列，如人或反芻動(dòng)物序列工程改造所述抗體或抗體片段。還包括嵌合抗體，例如對(duì) 于不止一種來(lái)源如一種或多種小鼠、人或反芻動(dòng)物序列具有特異性的單克隆抗體或其片 段。還包括羊駝抗體或納米抗體。本發(fā)明的抗體在靶向微生物細(xì)胞，具體說(shuō)是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞中尤其有用。在某些 方面，可利用該抗體與細(xì)胞壁或膜連接或結(jié)合，和/或抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)或復(fù)制。同樣， 可利用該抗體瞬時(shí)或長(zhǎng)期與細(xì)胞連接，或介導(dǎo)細(xì)胞的死亡或吞噬，和/或裂解。為了實(shí) 現(xiàn)靶向，可將微生物細(xì)胞與抗體接觸，如本文詳述，抗體可分離自宿主有機(jī)體，或產(chǎn)自 表達(dá)載體和/或宿主細(xì)胞，或來(lái)自于合成或半合成化學(xué)方法?；蛘咭部赏ㄟ^(guò)給予宿主有 機(jī)體本文所公開(kāi)的肽、多肽或多核苷酸使宿主有機(jī)體本身產(chǎn)生應(yīng)答，從而產(chǎn)生抗體。應(yīng) 當(dāng)理解的是，本發(fā)明抗體，以及對(duì)應(yīng)的多核苷酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、肽和多肽可用 于靶向多種微生物，例如，反芻甲烷短桿菌和史氏甲烷短桿菌，前者是反芻動(dòng)物中的主 要產(chǎn)甲烷菌，后者是人體的主要產(chǎn)甲烷菌。在特定方面，將抗體、或?qū)?yīng)多核苷酸、表 達(dá)載體、宿主細(xì)胞、肽或多肽以本文詳述的組合物形式，通過(guò)(例如)緩釋瘤胃裝置遞送 至對(duì)象。在多種方面，可將本發(fā)明的試劑(例如一種或多種肽、多肽、多核苷酸和抗體) 包含到組合物，例如，藥物組合物，尤其是疫苗組合物中。該組合物包含，例如a)分 離的肽或其變化形式、片段、變體或衍生物；b)分離的肽或其變化形式、片段、變體或 衍生物；c)分離的多核苷酸或其變化形式、片段、變體或衍生物；d)包含該多核苷酸的 表達(dá)載體；e)包含該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；或(f)抗體或其變化形式、片段、變體或衍 生物。根據(jù)公開(kāi)的方法，本發(fā)明的組合物可專(zhuān)門(mén)包裝為試劑盒的一部分，用于靶向和/ 或抑制微生物細(xì)胞，尤其是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞。該試劑盒包括至少一種本文所列組合物；以 及用于靶向產(chǎn)甲烷菌或其它微生物細(xì)胞，或抑制其細(xì)胞生長(zhǎng)或復(fù)制的使用說(shuō)明。對(duì)于疫苗，可使用多種方法增強(qiáng)抗原的免疫原性，例如，通過(guò)使用抗原顆粒、 抗原聚合物和聚合；乳化劑；抗原微膠囊；殺死的細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物；化學(xué)佐劑和細(xì)胞 因子；以及使抗原靶向抗原遞呈細(xì)胞的試劑(綜述參見(jiàn)Paul，基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology)，1999,林普科特瑞文出版社，紐約(Lippincott-Raven Publishers，New York, NY), 1392-1405)?？墒褂妹鞯\沉淀使抗原顆粒化。使用氫氧化鋁或磷酸鋁，使所研究的抗原摻入 到不溶性凝膠樣沉淀中，或者通過(guò)靜電作用與預(yù)先形成的凝膠結(jié)合?？蓪?duì)抗原進(jìn)行輕度 熱聚集。還可使用顯示自我組裝的抗原。脂質(zhì)體、病毒體和免疫染色復(fù)合物(ISCOM) 也可用于形成顆粒。為了促進(jìn)聚合，非離子型嵌段共聚物可用作結(jié)合抗原的佐劑添加物，例如聚合 物或聚氧丙烯以及聚氧乙烯。在森太公司(Syntex) (SAF-1，Syntex佐劑制劑1 (Syntex Adjuvant Formulation-1))以及瑞比化學(xué)公司(RibiChemical Co.)生產(chǎn)的復(fù)合佐劑制劑組分 中均可找到這些物質(zhì)。甘露糖聚合物(如甘露聚糖)或β 1-3葡萄糖聚合物(如葡聚糖) 可以相似方法運(yùn)用(OkawaY，Howard CR, Steward MW.用甘露聚糖偶聯(lián)肽免疫小鼠后在 小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗肽的抗體(Production of anti-peptide antibody in mice followingimmunizationof mice with peptides conjugated to mannan) .J ImmunolMethods 1992 ； 142 127—131; Ohta M，Kido N，Hasegawa T，等甘露聚糖側(cè)鏈對(duì)于脂多糖佐劑功能的貢獻(xiàn)(Contribution of the mannan side chains to theadjuvant action of lipopolysaccharides) .Immunology 1987 ； 60 503-507)。可使用多種試劑進(jìn)行乳化，包括油包水乳劑，如福氏佐劑(如福氏不完全佐 劑)或其它包含表面活性劑穩(wěn)定的小水滴的混合物，例如在礦物油或其它油如角鯊?fù)?的連續(xù)相中的二縮甘露醇一油酸。另一方案使用水包油乳劑，例如MF5963(希龍公司 (Chiron)),或包含鯊烯油滴、乳化劑吐溫80和司盤(pán)85的混合物、以及化學(xué)免疫調(diào)節(jié)劑 如胞壁酰二肽衍生物，如胞壁酰三肽_磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)的其它混合物(Valensi J-PM, Carlson JR, Van NestGA.用含MF59油劑和其它高級(jí)佐劑的三價(jià)流感疫苗免疫 Balb/c 小鼠后的全身細(xì)胞因子特征(Systemic cytokine profiles in Balb/c mice immunized withtrivalent influenza vaccine containing MF59 oil emulsion and other advancedadjuvants) .J Immunol 1994 ； 153 4029-4039)。也可以混合物形式使用少量的聚山梨酯80和失水山 梨醇三油酸酯。作為另一個(gè)例子，可使用SAF_165(森太公司(Syntex))或其它含有普羅 流尼克L121、角鯊烯和吐溫80的水包油混合物。微膠囊，具體是可生物降解的微膠囊，可用于制備控釋疫苗(ChangTMS. 包含酶激素、疫苗和其它生物材料的可生物降解、半透性微膠囊(Biodegradable， semi-permeable microcapsules containing enzymes hormones, vaccines and other biologicals). J Bioeng 1976 ； 1: 25-32 ； Langer R.大分子緩釋聚合物在一步法免疫中的用途 (Polymers for the sustained release ofmacromolecules their use in a single step method of immunization) MethodsEnzymol 1981 ； 73 57-75)。氰基丙烯酸酯是另一種形 式的可生物降解聚合物。例如，聚(2-氰基丙烯酸丁酯)可用作口服免疫的佐劑 (O，Hagan DT, Palin KJ, Davis SS.聚(2-氰基丙烯酸丁酯)顆粒作為口服免疫的佐劑 (Poly (butyl-2-cyanoacrylate) particles as adjuvants for oral immunization) .Vaccine 1989 ； 7 213-216)。微膠囊可用于疫苗的粘膜給藥。尤其適合的是極小的顆粒(納米顆粒)。可 通過(guò)腸衣聚合物對(duì)抗胃內(nèi)消化，需要的話可用增加腸吸收的物質(zhì)包衣。除了殺死的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，還可使用多種細(xì)菌作為佐劑。當(dāng)殺 死的細(xì)菌制備物本身具有高度抗原性時(shí)，佐劑特性則擴(kuò)展至共同給予的抗原。有用的有 機(jī)體包括百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum) 以及巴西日?qǐng)A線蟲(chóng)(Nippostrongylusbrasiliensis)。還可使用細(xì)菌的肽和脂質(zhì)組分。示范性 組分包括乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺，或胞壁酰二肽(MDP) (EllouzF，Adam A, CiorbaraR, Lederer Ε.細(xì)菌肽聚糖佐劑活性的必需結(jié)構(gòu)(Minimal structuralrequirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycans) .BiochemBiophys Res Commun 1974 ； 59 1317-1325)，MDP(莫拉丁酯)(Chedid L，Parant MA, Audibert FM 等，新合成的無(wú) 致熱性胞壁酰二肽的生物學(xué)活性(Biological activity of a new synthetic muramyl dipeptide devoid ofpyrogenicity) Infect Immun 1982 ； 35 417-424)，蘇氨酰 MDP (Allison AC， Byars NE.—種選擇性引起保護(hù)性抗體同種型的形成和細(xì)胞介導(dǎo)免疫的佐劑制劑(An adjuvant formulation that selectively elicits the formation ofantibodies of protective isotypes and cell-mediated immunity) .J ImmunolMethods 1986 ； 95 157-168)以及 MTP-PE。月旨質(zhì)佐劑可包含革蘭陰性細(xì)菌，如大腸桿菌(Escherichia)、沙門(mén)菌(Salmonella)和假單胞菌 (Pseudomonas)的LPS內(nèi)毒素。在某些方案中，可對(duì)脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾以降低毒 性但保留佐劑特性，例如單磷酰脂質(zhì)A(MPL)(強(qiáng)生集團(tuán)(Johnson AG)，Tomai M，Solem L, Beck L, Ribi E.無(wú)毒單磷酉先月旨質(zhì)的表征(Characterization ofnon—toxic monophosphoryl lipid) .Rev Infect Dis 1987 ； 9 S512)?？墒褂枚喾N化學(xué)品作為佐劑，包括多核苷酸，如聚_I:C和聚-A:U，維生素D3、 硫酸葡聚糖、菊糖、二甲基二-十八烷基溴化銨(DDA)、阿夫立定(avridine)、類(lèi)似甘露 聚糖的糖聚合物以及海藻糖二霉菌酸酯(Morein B，Lovgren-Bengtsson K, CoxJ.現(xiàn)代佐 齊U 功能方面(Modern adjuvants functional aspects), Kaufmann SHE 編，疫苗開(kāi)發(fā)概念 (Concepts in vaccinedevelopment) .Berlin Walter de Grayter, 1996 243-263)。也包括聚 膦嗪(最早作為環(huán)式促進(jìn)劑引入)和利什曼原蟲(chóng)(Leishmania)蛋白LeIF。細(xì)胞因子也可 用作佐劑，例如 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、GM—CSF 禾口 IFN—Y。為了靶向抗原遞呈細(xì)胞，可使用C3d結(jié)構(gòu)域、Fc結(jié)構(gòu)域以及CTB結(jié)構(gòu)域 (Dempsey PW, Allison MED，Akkaraju S, Goodnow CC, Fearon DT.補(bǔ)體 C3d 作為 分子佐齊Ll 連接先天禾口后天免疫(C3d of complement as amolecular adjuvant bridging innate and acquired immunity.Science 1996 ； 271 348-350) ； Sun J-B, Holmgren J, Czerkinsky C.霍亂毒素B亞基引起外周免疫耐受的有效跨粘膜載體-遞送系統(tǒng) (Cholera toxin B subunit anefficient transmucosal carrier-delivery system for induction of peripheralimmunological tolerance.Proc Natl Acad Sci USA 1994 ； 91 10795-10799)； SunJ-B, Rask C, Olsson T，Holmgren J, Czerkinsky C.通過(guò)服用與霍亂毒素 B 亞基偶 聯(lián)的髓磷脂堿性蛋白治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(Treatment ofexperimental autoimmune encephalomyelitis by feeding myelin basic proteinconjugated to cholera toxin B subunit) .Proc NatlAcad Sci USA1996 ； 93: 7196-7201)。還可使用粘膜遞送專(zhuān)用佐劑，如CT、LT和破傷風(fēng)毒素的C片段(ElsonCJ， Ealding W.霍亂毒素粘膜刺激后小鼠體內(nèi)廣泛的全身和粘膜免疫(Generalized systemic and mucosal immunity in mice after mucosal stimulationwith cholera toxin) .J Immunol 1984 ； 132 2736-2743 ； Holmgren J, Lycke N, Czerkinsky C.霍亂毒素和霍亂 B 亞基作為 口 腔粘膜佐齊Ll禾口抗原載體系統(tǒng)(Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigenvector systems) .Vaccine 1993 ； 11 1179-1184 ； Clements JD, Hartzog NM, Lyon FL.大腸桿菌不耐熱腸毒素的佐劑活性以及對(duì)于小鼠中誘導(dǎo)對(duì)非相關(guān)蛋白抗原口服 而才受性的影 口向(Adjuvant activity of Escherichia coli heat—labileenterotoxin and effect on the induction of oral tolerance in mice to unrelatedprotein antigens) .Vaccine 1988 ； 6 269—277 ； Gomez-Duarte OG，Galen J, Chatfield SN，Rappuoli R, Eidels L, Levine MM.在傷寒沙 門(mén)菌CVD 908疫苗菌株中表達(dá)與白喉毒素羧基末端融合的破傷風(fēng)毒素C片段(Expression offragment C of tetanus toxin fused to a carboxyl-terminal fragment of diphtheriatoxin in Salmonella typhi CVD 908 vaccine strain) .Vaccinel995 ； 13 1596-1602)。治療和診斷本發(fā)明的肽、多肽、多核苷酸以及抗體被認(rèn)為具有健康益處。在特定方面方 面，靶向產(chǎn)甲烷菌的疫苗可用于恢復(fù)以甲烷形式從個(gè)體流失的能量。因此，本發(fā)明涉及
25上述任何方法所用的與藥學(xué)上可接受載體聯(lián)用的藥物組合物(特別是疫苗組合物)。此 類(lèi)藥物組合物可包含肽、多肽或抗體和細(xì)胞抑制劑的組合。或者，藥物組合物可包含本 文詳述的多核苷酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞?？蓡为?dú)給予該組合物或與至少一種其它藥 劑，如穩(wěn)定化合物聯(lián)合給予，可利用任何無(wú)菌的生物相容性藥學(xué)載體，包括但不限于 鹽水、緩沖鹽水、右旋糖和水給與該組合物。該組合物可單獨(dú)給予對(duì)象或與其它藥劑、 藥物(如抗微生物藥物)或激素聯(lián)合給予。除了活性成分，這些藥物組合物還可包含合適的藥學(xué)上可接受的載體，包括利 于將活性化合物加工成藥學(xué)可用制劑的賦形劑和輔助劑。在最新版的雷明頓藥物科學(xué) (Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences)(賓夕法尼亞外丨伊斯頓的麥克出版公司(Maack
Publishing Co., Easton，PA))可找到制劑和給藥技術(shù)的更多細(xì)節(jié)。本發(fā)明使用的藥物組 合物可通過(guò)任何途徑給予，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘 內(nèi)、心室內(nèi)、透皮、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下或直腸方式?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體，以口服給藥合適劑量，配制用于口 服給藥的藥物組合物。此類(lèi)載體使藥物組合物可以配制為片劑、丸劑、糖衣劑、膠囊 劑、液體、凝膠劑、糖漿、漿液、混懸劑等，便于對(duì)象攝取。可通過(guò)以下方法獲得口服 用途的藥物制劑將活性化合物與固定賦形劑混合，任選將所得混合物研磨，在加入合 適的輔助劑后將該混合物加工成顆粒，獲得片劑或糖衣劑芯體。合適的賦形劑是糖或 蛋白質(zhì)填充物，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；來(lái)自玉米、小麥、稻米、 土豆或其它植物的淀粉；纖維素，如甲基纖維素、羥丙基甲基-纖維素或羧甲基纖維素 鈉；膠質(zhì)物，包括阿拉伯膠和黃芪膠；以及蛋白質(zhì)如明膠和膠原。需要的話，可加入崩 解劑或增溶劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽，如藻酸鈉?？煽诜褂玫钠渌幬镏苿┌髂z制成的壓接(push-fit)膠囊，以及明膠和包 衣劑(coating)(如甘油或山梨糖醇)制成的密封軟膠囊。壓接膠囊可包含與填充劑或粘合 劑，如乳糖或淀粉；潤(rùn)滑劑，如滑石粉或硬脂酸鎂以及任選穩(wěn)定劑混合的活性組分。在 軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮于含有或不含穩(wěn)定劑的合適液體，如脂肪油、液體 或液體聚乙二醇中。糖衣劑芯體可與合適的包衣劑，如濃縮糖溶液聯(lián)合使用，其中還可 包含阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆 溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？蓪⑷玖匣蝾伭霞尤肫瑒┗蛱且聞┌轮校糜?標(biāo)示產(chǎn)品或表征活性化合物的量，即劑量?？捎盟匀芤海瑑?yōu)選生理相容性緩沖液，如漢克斯溶液、林格溶液或生理緩沖 鹽水配制適合胃腸道外給藥的藥物制劑。水性注射懸液可包含增加懸液粘度的物質(zhì)，如 羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖苷。此外，活性化合物的懸液可制備為合適的油性 注射懸液。合適的親脂性溶劑或運(yùn)載體包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙 酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。也可使用非脂質(zhì)聚陽(yáng)離子氨基酸聚合物進(jìn)行遞送。懸液可任 選包含合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度以制備高濃縮溶液的試劑。對(duì)于局部或鼻腔給 藥，在制劑中使用適合要滲透的特定屏障的滲透劑。本領(lǐng)域通常了解此類(lèi)滲透劑。本發(fā)明的藥物組合物可以本領(lǐng)域所知方式制造，如，通過(guò)常規(guī)的混合、溶解、 造粒、制造糖衣劑、水飛、乳化、包膠、包封或凍干工藝的方法?？梢喳}的形式提供 藥物組合物，所述鹽可用多種酸形成，包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等。在水性或其它質(zhì)子溶劑中鹽比對(duì)應(yīng)的游離堿形式更易于溶解。 在其它情況下，優(yōu)選制劑可以是包含下列任何或所有成分的凍干粉末l-50mM組氨 酸、0.1%-2%蔗糖和2-7%甘露醇，pH范圍為4.5-5.5，在使用前與緩沖液組合。藥物 組合物制備后，可將其放置于合適的容器中，并貼上用于治療所示病癥的標(biāo)簽。對(duì)于本 發(fā)明組合物的給藥，此標(biāo)簽可包含給藥量、頻率和方法。適用于本發(fā)明的藥物組合物包括包含有效量活性組分以達(dá)到預(yù)期目的的組合 物。對(duì)于任何化合物，最初可在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，如微生物細(xì)胞或具體說(shuō)，在產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞 中，或在動(dòng)物模型中，通常是小鼠、兔、狗或豬或反芻動(dòng)物如綿羊、牛、鹿或山羊中估 計(jì)治療有效劑量。還可使用動(dòng)物模型確定合適的濃度范圍和給藥途徑。此類(lèi)信息還可用 于確定有用的給藥劑量或途徑。通常給藥劑量可以是0.1-100,000微克，甚至總劑量約為 Ig,這取決于給藥途徑。文獻(xiàn)中提供了有關(guān)具體劑量和遞送方法的指南，本領(lǐng)域?qū)嵤┤?員可獲得這些指南。與遞送多肽相比，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將使用不同制劑遞送多核苷 酸。相似地，肽、多肽、多核苷酸或抗體的遞送對(duì)于特定細(xì)胞、病癥、位置等而言是不 同的。實(shí)施者根據(jù)需要治療對(duì)象相關(guān)的因素確定準(zhǔn)確劑量。對(duì)劑量和給藥進(jìn)行調(diào)整以 提供足夠水平的活性試劑或維持所需效果。需要考慮的因素包括疾病狀況的嚴(yán)重性、對(duì) 象的總體健康狀況、年齡、體重和性別、飲食、給藥的時(shí)間和頻率、聯(lián)合用藥、對(duì)治療 的反應(yīng)敏感性以及耐受/響應(yīng)。根據(jù)特定制劑的半衰期和清除率，長(zhǎng)效藥物組合物可每 3-4天，每周或每?jī)芍芙o予一次?？蓪⒃摻M合物與本文所述一種或多種其它抗微生物試 劑，包括抗甲烷生成化合物(例如溴乙基磺酸)、抗體或抗體片段、裂解酶、肽核酸、 抗微生物肽或其它抗生素共同給予。共同給藥可同時(shí)或依次進(jìn)行，或者可用重復(fù)給藥替 代。本發(fā)明組合物(如藥物組合物)尤其有用的是緩釋配方或原理。例如，瘤胃 內(nèi)裝置包括但不限于新西蘭埃格瑞飼料公司(Agri-Feeds Ltd.，NewZealand)時(shí)間膠 囊皿丸范圍，最初由新西蘭愛(ài)吉研究公司開(kāi)發(fā)(AgResearchLtd.，New Zealand),如WO 95/19763和NZ 278977所公開(kāi)的，以及新西蘭奧克蘭的紐法姆公司的分支機(jī)構(gòu)紐法姆健 康和科學(xué)公司的 CAPTEC (Nufarm Health&Sciences，a division of Nufarm Ltd., Auckland, NewZealand),如 AU 35908178，PCT/AU81/100082 和 Laby 等，1984，Can.J.Anim. Sci.64(增刊)337-8所公開(kāi)的，將所有這些參考文獻(xiàn)納入本文作參考。作為特定的例子， 該裝置可包括彈簧和柱塞，迫使組合物穿過(guò)同末端的孔。作為另一實(shí)施方式，本發(fā)明涉及作為水補(bǔ)充物的組合物如進(jìn)水組合物，和食物 補(bǔ)充劑如反芻動(dòng)物飼料組分，用于上述任何方法。在特定方面，食物補(bǔ)充劑包含至少一 種可食用的植物材料以及本發(fā)明的肽或多肽。或者，食物補(bǔ)充劑包含至少一種可食用的 植物材料以及本文公開(kāi)的肽或多肽，或編碼本文公開(kāi)的肽或多肽的多核苷酸，例如，表 達(dá)載體或含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的形式。具體說(shuō)，組合物還包含與所得序列融合或連 接的細(xì)胞抑制劑。優(yōu)選的植物材料包括干草、草、谷物或粗磨粉中的任一種，例如，豆 科干草、禾本科干草、玉米青貯、禾本青貯、豆科青貯、玉米粒、燕麥、大麥、釀酒谷 物、啤酒谷物、大豆粗磨粉和棉籽粗磨粉。具體說(shuō)，禾本青貯可用作反芻動(dòng)物的食物組 合物?？蓪?duì)植物材料進(jìn)行遺傳改造，使其包含本發(fā)明的一種或多種組分，如一種或多種多肽或肽、多核苷酸或載體。在另一實(shí)施方式中，特異性結(jié)合本發(fā)明肽、多肽或多核苷酸的抗體可在監(jiān)測(cè)微 生物水平的實(shí)驗(yàn)種用于測(cè)定該微生物，尤其是產(chǎn)甲烷菌的存在。同上所述可以相同的方 法制備用于診斷目的的抗體。診斷實(shí)驗(yàn)包括使用抗體和標(biāo)簽檢測(cè)人體體液或細(xì)胞或組織 提取物中肽或多肽的方法。可使用修飾或未修飾的抗體，通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)方式將報(bào)告 分子與其結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記?？墒褂帽绢I(lǐng)域所知的多種不同的報(bào)告分子，上文對(duì)其中幾個(gè)進(jìn) 行了描述。本領(lǐng)域已知用于測(cè)量肽、多肽或多核苷酸水平的多種實(shí)驗(yàn)方案(如ELISA、 RIA、FACS)，為診斷微生物，尤其是產(chǎn)甲烷菌的存在或水平提供了基礎(chǔ)。通過(guò)在適合 形成復(fù)合物的條件下將來(lái)自正常對(duì)象如正常人或反芻動(dòng)物的體液或細(xì)胞提取物與抗體組 合，從而確定正?；驑?biāo)準(zhǔn)水平。利用各種方法可對(duì)標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合物的形成量進(jìn)行定量，但優(yōu) 選分光光度法。將對(duì)象、對(duì)照和治療樣品(如來(lái)自疫苗接種對(duì)象的樣品)中表達(dá)的肽、 多肽或多核苷酸的量與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)值和對(duì)象值之間的偏差確定了用于測(cè)定微 生物存在或水平的參數(shù)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，通過(guò)使用特定雜交和/或擴(kuò)增技術(shù)，可將多核苷 酸用于診斷目的。可使用的多核苷酸包括寡核苷酸、互補(bǔ)RNA和DNA分子和PNA。 多核苷酸可用于檢測(cè)或定量測(cè)定樣品中的基因表達(dá)，其中表達(dá)與微生物的存在或水平相 關(guān)?？墒褂迷\斷實(shí)驗(yàn)區(qū)分微生物水平的不存在、存在和改變，并在治療干預(yù)中監(jiān)測(cè)水 平。在一個(gè)方面，可利用與PCR探針的雜交鑒定核酸序列，尤其是基因組序列，其 編碼本發(fā)明的肽或多肽。無(wú)論探針產(chǎn)生于高度特異性的區(qū)域，如5’調(diào)節(jié)區(qū)的10個(gè)獨(dú) 特核苷酸，或者較低特異性的區(qū)域，如3'編碼區(qū)，探針的特異性以及雜交或擴(kuò)增的嚴(yán)謹(jǐn) 性(最大、高、中等或低)將決定該探針是否僅僅識(shí)別天然產(chǎn)生的序列、等位基因或相 關(guān)序列。探針也可用于檢測(cè)相關(guān)序列，并應(yīng)該優(yōu)選包含來(lái)自任何編碼序列的至少50% 核苷酸。本發(fā)明的雜交探針可以是DNA或RNA，并來(lái)源于核苷酸序列SEQ ID NO : 703-1373或其互補(bǔ)或修飾序列，或來(lái)自于包含天然產(chǎn)生序列的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件的基 因組序列。用于產(chǎn)生特異性DNA雜交探針的方法包括將核酸序列克隆入載體以產(chǎn)生mRNA 探針。本領(lǐng)域了解此類(lèi)載體，它們可購(gòu)得，并且通過(guò)加入合適的RNA聚合酶和合適的標(biāo) 記核苷酸可將它們用于體外合成RNA探針?？赏ㄟ^(guò)多種報(bào)告基團(tuán)對(duì)雜交探針進(jìn)行標(biāo)記， 這些報(bào)告基團(tuán)例如放射性核素如32P或35S,或酶標(biāo)記，如通過(guò)親和素/生物素偶聯(lián)系統(tǒng)偶 聯(lián)至探針的堿性磷酸酶等。多核苷酸可用于Southern或northern分析，點(diǎn)印跡或其它基 于膜的技術(shù)；用于PCR技術(shù)；或者用于試紙條、狹縫、ELISA實(shí)驗(yàn)或微陣列，用來(lái)自對(duì) 象活檢的液體或組織檢測(cè)微生物的存在和水平。本領(lǐng)域熟知此類(lèi)定性或定量的方法。在一個(gè)特定方面，核酸序列可用于各種標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)，并在適合雜交和 /或擴(kuò)增的條件下加入來(lái)自對(duì)象的液體或組織。孵育合適的時(shí)間后，洗滌樣品，對(duì)信號(hào) 進(jìn)行定量并與標(biāo)準(zhǔn)值比較。如果受試樣品的信號(hào)量與可比較的對(duì)照樣品的信號(hào)量相比發(fā) 生了顯著的改變，那么樣品中出現(xiàn)核苷酸序列水平的改變表明微生物的出現(xiàn)或水平。還 可使用此類(lèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)特定疫苗接種方案在動(dòng)物研究、臨床實(shí)驗(yàn)或者監(jiān)測(cè)對(duì)象治療中的效果。為了提供微生物出現(xiàn)或水平的診斷基礎(chǔ)，需確定表達(dá)的正?；驑?biāo)準(zhǔn)特征。通過(guò) 在適合雜交和/或擴(kuò)增的條件下，將來(lái)自正常對(duì)象的體液或細(xì)胞提取物與多核苷酸或其 片段混合，來(lái)完成這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)比較獲自正常對(duì)象的值與獲自使用已知量基本純化多 核苷酸的實(shí)驗(yàn)中的值，可對(duì)標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行定量?？蓪?lái)自正常樣品的標(biāo)準(zhǔn)值與來(lái)自針對(duì) 微生物生長(zhǎng)進(jìn)行治療的對(duì)象的值進(jìn)行比較。利用標(biāo)準(zhǔn)值和對(duì)象值之間的偏差測(cè)定微生物 的存在或水平。一旦鑒定了微生物并開(kāi)始了疫苗接種方案，則在常規(guī)基礎(chǔ)上進(jìn)行重復(fù)的雜交和/ 或擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)相對(duì)于正常對(duì)象中觀察到的表達(dá)水平，對(duì)象中的表達(dá)水平是否開(kāi)始降 低。來(lái)自連續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可用于顯示疫苗接種在數(shù)天至數(shù)月的效果。由核酸序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸的特定診斷用途可包括使用PCR。此類(lèi)寡聚體可以 是化學(xué)合成、酶學(xué)方法產(chǎn)生或體外產(chǎn)生的。寡聚體優(yōu)選由兩個(gè)核苷酸序列組成，一個(gè)為 正義方向(5' ->3')，另一個(gè)為反義方向(3' ->5')，在為鑒定具體基因或條件 的優(yōu)化條件下使用。在用于檢測(cè)和/或定量測(cè)定緊密相關(guān)的DNA或RNA序列的較低嚴(yán) 謹(jǐn)性條件下，使用相同的兩種寡聚物，巢式寡聚物集合或寡聚物簡(jiǎn)并庫(kù)?？捎糜诙繙y(cè)定表達(dá)的方法包括放射性標(biāo)記或生物素化核苷酸，對(duì)照核酸共 擴(kuò)增以及可通過(guò)插值獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果插值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Melby，P.C.等(1993)J.Immunol. Methods, 159 235-244 ； Duplaa, C.等(1993) Anal.Biochem.229-236)?？赏ㄟ^(guò)以 ELISA形式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)加快多個(gè)樣品的定量速度，其中感興趣的寡聚物以各種稀釋度出 現(xiàn)，通過(guò)分光光度法或比色法進(jìn)行快度定量。在另外的實(shí)施方式中，源自本發(fā)明所述任何多核苷酸的寡核苷酸或更長(zhǎng)的片段 可用作微陣列中的靶點(diǎn)?？墒褂梦㈥嚵型瑫r(shí)監(jiān)測(cè)大量基因的表達(dá)水平(產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物圖 像)，并鑒定遺傳變體、突變和多態(tài)性?？墒褂迷撔畔⒋_定基因功能，了解疾病的遺傳學(xué) 基礎(chǔ)，診斷疾病，開(kāi)發(fā)并監(jiān)測(cè)治療劑活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本領(lǐng)域所知方法制 備和使用微陣列，如 PCT 申請(qǐng) WO 95/11995 (Chee 等)，Lockhart, D.J.等(1996 ； Nat. Biotech. 14 1675-1680)以及 Schena，Μ.等(1996; Proc.Natl.Acad.Sci.93 10614-10619) 所述。在一個(gè)方面，可使用化學(xué)偶聯(lián)步驟和噴墨打印應(yīng)用設(shè)備，如PCT申請(qǐng)WO 95/251116(Baldeschweiler等)所述在微陣列表面合成寡核苷酸。在另一方面，可使 用類(lèi)似于斑點(diǎn)或狹縫印跡的“網(wǎng)狀”陣列(HYBRIDOT設(shè)備，生命科技公司(Life Technologies)),利用真空系統(tǒng)、熱、UV、機(jī)械或化學(xué)連接步驟將cDNA片段或寡核 苷酸安置和連接至基材表面。在另一方面，可手工或利用可獲得的設(shè)備、材料或機(jī)器 (包括多道移液器或機(jī)器人儀器；布林克曼公司，韋斯特伯里，紐約州(Brinkmann， Westbury, N.Y.))生產(chǎn)陣列，該陣列可包括例如 24、48、96、384、1024、1536 或 6144 或更多個(gè)點(diǎn)或孔(如多孔板)，或從2-1,000,000的任何倍數(shù)，以便充分利用市售儀器。為了用微陣列進(jìn)行樣品分析，從生物制品中抽提多核苷酸?？蓮娜魏误w液(血 液、尿液、唾液、痰、胃液等)，培養(yǎng)細(xì)胞，活檢物或其它組織制備物中獲取生物樣品。 為了生產(chǎn)探針，使用抽提自樣品的多核苷酸產(chǎn)生與陣列上核酸互補(bǔ)的核酸序列。如果微 陣列由cDNA組成，則反義RNA是合適的探針。因此，在一個(gè)方面，使用mRNA產(chǎn)生cDNA,進(jìn)而在熒光核苷酸存在下用cDNA產(chǎn)生片段或反義RNA探針。將這些熒光標(biāo)記的探針與微陣列孵育，以使探針序列與微陣列的cDNA寡核苷酸雜交。在另一方面，用 作探針的核酸序列可包含使用雜交技術(shù)領(lǐng)域熟知的限制酶、PCR技術(shù)和寡聚物標(biāo)記試劑 盒(安法馬西亞生物技術(shù)公司(AmershamPharmaciaBiotech))產(chǎn)生的多核苷酸、片段和互 補(bǔ)或反義序列。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可利用本發(fā)明的肽或多肽、或其功能性或免疫原 性片段或寡肽通過(guò)任何藥物篩選技術(shù)篩選化合物文庫(kù)。此類(lèi)篩選所用片段可在溶液中游 離，附加于固體支持物、攜帶于細(xì)胞表面或定位于細(xì)胞內(nèi)部?？蓹z測(cè)肽或多肽和受試物 間的結(jié)合復(fù)合物的形成。公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO 84/03564描述了一種藥物篩選技術(shù)，它可用于高通量篩選 對(duì)感興趣肽或多肽具有合適親和力的化合物。在該方法中，在固體基質(zhì)如塑料針或一些 其它表面上合成大量不同的小受試化合物。受試化合物與肽或多肽或其片段反應(yīng)，然后 洗滌。然后利用本領(lǐng)域熟知方法檢測(cè)結(jié)合的肽或多肽。還可將純化的肽或多肽直接包被 在板上，用于上述藥物篩選技術(shù)。或者，可使用非中和抗體捕獲肽并將其固定到固體支 持物上。在另一項(xiàng)技術(shù)中，可使用競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選實(shí)驗(yàn)，其中能夠結(jié)合肽或多肽的中和 抗體與受試化合物特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述肽或多肽。以此方式，可使用該抗體檢測(cè)與該抗 體具有相同的一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的受試化合物的存在。
實(shí)施例本文所述實(shí)施例用以解釋本發(fā)明的實(shí)施方式。其它實(shí)施方式、方法和分析類(lèi)型 在分子診斷領(lǐng)域的一般技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)，無(wú)需在此贅述。其它本領(lǐng)域范圍內(nèi)的實(shí)施 方式也應(yīng)作為本發(fā)明的一部分。實(shí)施例1 基因組大小估測(cè)反芻甲燒短桿菌(Methanobrevibacterruminantium)菌株 M1T(DSM1093)生 長(zhǎng)于BY+培養(yǎng)基中(基本培養(yǎng)基，Joblin等，1990)，該培養(yǎng)基由[g/l]NaCl(1)、 KH2PO4 (0.5)、(NH4)2SO4 (0.25)、CaCL2.2H20 (0.13)、MgSO4JH2O (0.2)、K2HPO4(I)、 澄清反芻液(300ml)、dH20 (360ml)、NaHCO3 (5)、刃天青(0.2ml)、L-鹽酸半胱 氨酸(0.5)、酵母提取物(2)以及巴赫微量元素溶液(IOml)(加入微量元素；Balch 等，1979)組成，由(g/Ι)三乙酸腈(1.5)、MgSO4JH2O (3)、MnSO4-H2O (0.5), NaCl (1)、FeSO4JH2O (0.1)、CoC12.6H20 (0.1) > CaCl2.2H20 (0.1)、ZnSO4JH2O (0.1)、 CuS04.5H20(0.01)、AlK (SO4) 2.12H20 (0.01)、H3BO3(O-Ol)、Na2Mo04.2H20 (0.01)、 NiS04.6H20 (0.03)、Na2SeO3 (0.02)和 Na2W04.2H20 (0.02)組成。在液氮中冷凍細(xì)胞團(tuán)并 用預(yù)冷的無(wú)菌研缽和杵研磨，抽提基因組DNA。將細(xì)胞勻漿液包埋于瓊脂糖塞中，后續(xù) 操作在栓中進(jìn)行以減少對(duì)基因組DNA的物理剪切。用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行消化，用脈 沖場(chǎng)電泳(PFGE)分離DNA片段。實(shí)施例2 DNA克隆和測(cè)序安進(jìn)科生物科學(xué)公司(美國(guó)麻省)(Agencourt Biosciences Corporation (Massachusetts, USA))使用隨機(jī)鳥(niǎo)槍克隆方案(Fleischmann 等，1995)，馬克基因公司(美國(guó)馬里蘭州洛克維爾)(Macrogen Corporation(Rockville，MD, USA))使用
焦磷酸測(cè)序?qū)Ψ雌c甲烷短桿菌的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序。簡(jiǎn)單的說(shuō)，通過(guò)隨機(jī)物理破壞基因組DNA和電泳分離片段在大腸桿菌中構(gòu)建反芻甲烷短桿菌的DNA文庫(kù)。從凝膠中回 收40Kb范圍內(nèi)的大片段，并用于產(chǎn)生大的插入f粘粒文庫(kù)?；厥?-4kb范圍的DNA片 段并用于產(chǎn)生小的插入質(zhì)粒文庫(kù)。培養(yǎng)大和小的插入文庫(kù)所得的克隆，回收其f粘?；?質(zhì)粒DNA并用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)足夠數(shù)量的克隆進(jìn)行測(cè)序以達(dá)到對(duì)反芻甲烷 短桿菌基因組理論上8倍的覆蓋。通過(guò)對(duì)隨機(jī)剪切的基因組DNA片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序獲 得額外的序列覆蓋度(馬克基因集團(tuán)(MacrogenCorporation))，最終理論基因組覆蓋度達(dá) 到約10倍。實(shí)施例3 序列組裝和注釋比對(duì)DNA序列以找到交疊序列，并利用帕拉賽基因組組裝者(ParacelGenome Assembler)(帕拉賽公司，加利福尼亞州，美國(guó))(Paracel Inc，CA, USA)和Staden軟件 包(Staden等，1998)，與來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)和反向PCR的序列組合組裝成毗連序列(毗連群)。 使用開(kāi)放閱讀框(ORF)尋找器GLIMMER(基因定位插值馬爾可夫模型ER) (GeneLocator Interpolated Markov Model ER^Delcher 等，1999)分析毗連群，利用缺口 BLAST (基礎(chǔ)本 地比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul 等，1997)在國(guó)家生物技術(shù) 信息中心(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)的非冗余核苷酸和蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)每一 ORF進(jìn)行分析。通過(guò)以隨機(jī)方式人工連接來(lái)自8倍草圖噬菌體序列的毗連群產(chǎn)生“假分子”， 并提交給基因組研究所(The Institute for Genomic Research) (TIGR，美國(guó)華盛頓特區(qū)) (TIGR，DC, USA)進(jìn)行自動(dòng)注釋。用GLIMMER對(duì)來(lái)自10倍焦磷酸測(cè)序組裝的毗連群 再次進(jìn)行分析，并且用GAMOLA (復(fù)雜現(xiàn)場(chǎng)Blast DNA序列全局注釋(Global Annotation of Multiplexed On-site BlastedDNA sequences) ； Altermann 禾口 Klaenhammer, 2003)對(duì) ORF 進(jìn)行自動(dòng)注釋。隨后對(duì)自動(dòng)注釋進(jìn)行人工校驗(yàn)。利用直系同源蛋白聚類(lèi)(COG)數(shù)據(jù)庫(kù)， 根據(jù)功能對(duì)ORF分類(lèi)(閾值le-02) (Tatusov等，2001)。 分別利用全局和局部比對(duì)(http://pfam-wustl.edu)以及標(biāo)準(zhǔn)和片段模式 TIGRFAM HMM 模型(http://www.tigr.org/TIGRFAMs)(閾值 le_02)，使用 PFAM HMM 禾口 TIGRFAM文庫(kù)通過(guò)HMMER (http://hmmer.wustl.edu)對(duì)蛋白基序進(jìn)行確定。用 TRNASCAN-SE 鑒定 tRNA (Lowe 和 Eddy，1997)，用 KODON 軟件包(應(yīng)用數(shù)學(xué)公 司，美國(guó)得克薩斯州奧斯汀)(Applied Maths，Austin, TX, USΑ)禾Π REPUTER(Kurtz 禾口 Schleiermacher，1999)鑒定核苷酸重復(fù)。用GENEWIZ構(gòu)建基因組圖譜(Jensen等， 1999) ο 利用內(nèi)部開(kāi)發(fā)的軟件(PathwayVoyager ； Altermann 和 Klaenhammer，2005),從 預(yù)測(cè)的反芻甲烷短桿菌ORF組和KEGG (京都基因與基因組百科全書(shū))(KyotoEncyclopedia ofGenes and Genomes, Kanehisa 等，2004)在線數(shù)據(jù)庫(kù)重建通路。實(shí)施例4:測(cè)序結(jié)果和分析通過(guò)限制性酶消化基因組DNA和通過(guò)PFGE測(cè)定片段大小進(jìn)行反芻甲烷短桿 菌基因組大小的估測(cè)，表明單條染色體大小約2.5-2.9Mb。大和小插入克隆的初始測(cè) 序(6倍草圖覆蓋)以及將序列組裝為毗連群表明基因組中40Kb的區(qū)域出現(xiàn)頻率非常高 (over-represented) ( > 20倍)，特別是在小插入物文庫(kù)中?？赡艿脑蚴窃谟糜贒NA抽提的培養(yǎng)物的生長(zhǎng)過(guò)程中，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒(盡管沒(méi)有鑒定到染色體外DNA)或溶原性細(xì) 菌噬菌體復(fù)制。因?yàn)檫@種巨大序列偏向，所以僅對(duì)大插入克隆進(jìn)行再次測(cè)序(2倍理論基 因組覆蓋)，從Sanger測(cè)序中產(chǎn)生最終的8倍覆蓋。將8倍草圖階段(phase)序列組裝 為通過(guò)105個(gè)支架連接的756個(gè)毗連群。進(jìn)一步進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，以實(shí)現(xiàn)額外約10倍 的 覆蓋，將這些序列摻入組裝物使毗連群的數(shù)目降至27。使用反向和長(zhǎng)范圍PCR技術(shù)的后 續(xù)缺口連接過(guò)程使毗連群數(shù)目降至14。該14-毗連群序列的合并長(zhǎng)度表明，該基因組略大(2,920,443bp)于PFGE估計(jì)的 大小(圖1A)，顯著大于其最接近的親緣菌史氏甲烷短桿菌(M.smithii) (1.9Mb)。32.7% 的％0+(接近反芻甲烷短桿菌菌株的報(bào)道范圍27.5%-31.6%(8&1011等，1979)。序列分 析預(yù)測(cè)到2672個(gè)ORF，圖IB報(bào)道蛋白質(zhì)家族命中(TIGRFam和PFam)和直向同源組類(lèi) 群(COG)的總數(shù)。這里列出了預(yù)測(cè)參與由H2+C02和甲酸生成甲烷的所有基因(圖IC 和圖6A-6C)。然而，反芻甲烷短桿菌的草圖序列缺少甲基輔酶還原酶II (mcr II或mrt) 系統(tǒng)。在其它產(chǎn)甲烷菌中，mcrll類(lèi)群編碼甲基CoM還原酶I酶的同工酶，它在H2分壓 較高的生長(zhǎng)條件下上調(diào)(Reeve等，1997)。H2在瘤胃中快速使用，不會(huì)累積至高水平， 因此反芻甲烷短桿菌似乎能適應(yīng)只通過(guò)mcr I系統(tǒng)利用低水平的H2。將反芻甲烷短桿菌的基因組草圖與密切相關(guān)的史氏甲烷短桿菌和熱自養(yǎng)甲烷嗜 熱桿菌(Mt.thermoautotrophicus)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)不同區(qū)域。一些基因差異編碼富天 冬酰胺/蘇氨酸大蛋白家族的非常大的表面蛋白，它們可含有在瘤胃環(huán)境中可能介導(dǎo)與 表面或其它微生物相互作用的CPOMP和DUFll重復(fù)序列(分別是衣原體多態(tài)性外膜蛋 白和未知功能結(jié)構(gòu)域)(參見(jiàn)圖7A-7C)。在斯氏甲烷球形菌(Ms.stadtmanae)和史氏甲烷 短桿菌基因組編碼的大表面蛋白中均找到相似的重復(fù)序列(Samuel等，2007)。先前報(bào)道反芻甲烷短桿菌產(chǎn)生莢膜(Smith和Hungate，1958)，并且序列分析表 明它編碼超過(guò)50個(gè)參與外泌多糖合成和運(yùn)輸?shù)幕?糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)、其它轉(zhuǎn)移酶、 差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，證明它利用多糖修飾其表面(參見(jiàn)圖8A-8C)。反芻甲烷短桿 菌具有至少30種糖基轉(zhuǎn)移酶(6種GTl、21種GT2、2種GT4以及1種GT66 ；參見(jiàn)圖 8A-8C)，史氏甲烷短桿菌則有28種(1種GTl、22種GT2、4種GT4以及1種GT66)， 斯氏甲烷球形菌有41種(2種GT1、26種GT2、12種GT4以及1種GT66) (Samuel等， 2007 ； Fricke等，2006; Coutinho和Henrissat，1999)。這些有機(jī)體使用相對(duì)大量的基因 編碼表面多糖，表明這是它們?cè)谖改c道環(huán)境中存活的重要因素。核苷酸重復(fù)分析表明在反芻甲烷短桿菌基因組中存在至少兩個(gè)間隔物散在直接 重復(fù)(Spacer Interspersed Direct Repeat) (SPIDR)區(qū)。SPIDR 是由異源序列間隔的相同
單元形成的核苷酸重復(fù)(通常少于40nt)，在原核細(xì)胞中首次鑒定到該序列(Jansen等， 2002)。反芻甲烷短桿菌的SPIDR I具有獨(dú)特的遺傳排列，由側(cè)接含有相關(guān)cas基因簇的 17kb區(qū)域的兩個(gè)相同重復(fù)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。在多種產(chǎn)甲烷菌的基因組中找到了相似的重復(fù)結(jié) 構(gòu)。詹氏甲烷球菌(Methimocaldococcusjannaschii)包含18個(gè)拷貝的多拷貝重復(fù)核苷酸元 件(Bult等，1996)，它們由長(zhǎng)(391-425bp)重復(fù)片段、后接多達(dá)25個(gè)短(27_28bp)重復(fù) 片段組成，短重復(fù)片段本身被31-51bp的獨(dú)特序列間隔開(kāi)。斯氏甲烷球形菌的基因組包 含某一 30bp元件重復(fù)59次的4.8Kb區(qū)域(Fricke等，2006)。熱自養(yǎng)甲烷嗜熱桿菌包含 兩個(gè)擴(kuò)展重復(fù)(大小為3.6和8.6kb)，它們含有372-bp的重復(fù)序列，后接被長(zhǎng)34_38bp的獨(dú)特序列間隔開(kāi)的47和124個(gè)拷貝的相同30bp重復(fù)序列(Smith等，1997)。這些SPIDR 的生物學(xué)功能未知，但目前的假設(shè)推測(cè)此系統(tǒng)是真核小干擾RNA系統(tǒng)的功能類(lèi)似物，代 表了根據(jù)反義RNA原理對(duì)抗外源復(fù)制子的防御系統(tǒng)(Jansen等，2002; Haft等，2005; Godde 和 Bickerton，2006 ； Makarova 等，2006)。反芻甲烷短桿菌基因組還編碼許多經(jīng)預(yù)測(cè)編碼具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的 ORF,因此預(yù)計(jì)這些蛋白質(zhì)具有暴露于細(xì)胞表面的區(qū)域(圖9A、9B和9C)。實(shí)施例5 抗體產(chǎn)生與測(cè)試 制備反芻甲烷短桿菌的細(xì)胞壁在液氮下冷凍細(xì)胞團(tuán)并用預(yù)冷的無(wú)菌研缽和杵 研磨，制備反芻甲烷短桿菌的細(xì)胞壁。經(jīng)細(xì)磨的細(xì)胞重懸于胰蛋白酶磷酸緩沖液(40mg 胰蛋白酶/200ml 0.1M磷酸鹽緩沖液，pH 7.9)中并在37°C孵育2小時(shí)。然后將該制備 物在4°C下48,OOOg離心30分鐘，用無(wú)菌蒸餾水洗滌所得團(tuán)塊兩次，并冷凍干燥?？贵w制備從反芻甲烷短桿菌的基因組序列中鑒定出九條預(yù)測(cè)位于細(xì)胞外部的 肽序列，選作潛在抗原。合成這些肽，每種5mg (英駿公司(Invitrogen))，并用質(zhì)譜鑒定 其純度。肽及其編碼序列如圖4所示。全長(zhǎng)核酸和氨基酸序列如圖5所示。每種肽取 2mg(未偶聯(lián))用于ELISA，取3mg與鑰孔血藍(lán)素(KLH)偶聯(lián)用于免疫動(dòng)物。疫苗接種程序如圖2所述，并按照如下步驟進(jìn)行。每次免疫使用一只綿羊(1-3 歲)，并在第0天預(yù)放血得到2-5ml免疫前血清。然后在第0天通過(guò)10-15個(gè)部位皮內(nèi) (ID)注射CFA(完全福氏佐劑)配制的200 μ g未偶聯(lián)肽進(jìn)行初次免疫。在第14天通過(guò) 10-15個(gè)部位皮內(nèi)(ID)注射IFA (不完全福氏佐劑)配制的200 μ g LH-肽，在第28天 通過(guò)10-15個(gè)部位注射CFA配制的200 μ g KLH-肽。在第56、70、84、98和112天， 再在10-15個(gè)部位皮內(nèi)(ID)注射IFA配制的200 μ g KLH-肽5次。在第42、56、84禾口 112天進(jìn)行4次驗(yàn)血(2-5ml)。在標(biāo)準(zhǔn)程序結(jié)束時(shí)進(jìn)行生產(chǎn)性放血，以獲取約1,000ml抗 血清。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，使用高結(jié)合96孔中結(jié)合于固相的肽-GGG(山 羊￥球蛋白)(0.14§/10(^1/孔)測(cè)定抗體滴度。首先將血清稀釋50倍，然后進(jìn)行2 倍連續(xù)稀釋。通過(guò)使405nm處OD值等于0.2的稀釋因數(shù)估計(jì)值計(jì)算ELISA滴度，其獲 自連續(xù)稀釋曲線的非線性回歸分析。使用HRP偶聯(lián)的第二抗體和ABTS底物進(jìn)行檢測(cè)。綿羊?qū)σ呙缃臃N的抗體反應(yīng)如圖3所示。所有綿羊血清在第6周時(shí)的滴度至少 為免疫前的32倍(1 1600)。最具抗原性的制備物是mtrD肽，它所產(chǎn)生的滴度是免疫 前水平的1024倍。免疫原性最弱的制備物是mtrE肽、ORF508和ORF819表面蛋白肽。 反芻甲烷短桿菌細(xì)胞壁制備物誘導(dǎo)理想的抗體應(yīng)答(是免疫前水平的256-倍)，盡管進(jìn)行 數(shù)次加強(qiáng)注射，但這種應(yīng)答維持不超過(guò)15周?？贵w與反芻甲烷短桿菌細(xì)胞的結(jié)合使用ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定與反芻甲烷短桿菌細(xì) 胞結(jié)合的抗體，步驟如下用反芻甲烷短桿菌全細(xì)胞(含40μ1細(xì)胞的碳酸鈉緩沖液2ml) 和反芻甲烷短桿菌胞漿蛋白質(zhì)組分包被MaxiSorpELISA板(Nunc)。用含1 % w/v酪蛋白 的PBS吐溫20對(duì)血清樣品進(jìn)行1/20稀釋(25 μ 1加入475 μ 1稀釋劑)，并在室溫孵育1 小時(shí)。用PBS吐溫20洗滌板6次。包括陰性對(duì)照血清，該對(duì)照血清獲自未吃過(guò)初乳的 綿羊。用于檢測(cè)的偶聯(lián)物是驢抗綿羊/山羊IgG HRP (斯羅泰克(Serotec)公司產(chǎn)品，批次號(hào)061005星號(hào)88P)，在每孔中加入50 μ 1的1/5000稀釋物(2 μ 1加入IOml稀釋劑)。然后加入3，3’，5，5’四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(50 μ /孔)，室溫下避光孵育反應(yīng) 15分鐘。然后加入終止液(0.05Μ H2SO4, 50 μ 1/孔)并在450nm讀板。反芻甲烷短桿菌生長(zhǎng)抑制測(cè)試在無(wú)氧罩中融化免疫血清樣品，10個(gè)樣品中各 取0.1ml加入1.5ml微量離心管中。在無(wú)氧罩中室溫下開(kāi)蓋孵育混合物(Iml)過(guò)夜以去 除任何溶解氧。免疫前血清用作陰性對(duì)照。在無(wú)氧罩中，將組合的血清樣品(0.3ml)加 入含5ml正在生長(zhǎng)的反芻甲烷短桿菌培養(yǎng)物的亨格特管中，一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將氣體 (80% H2和20% CO2)泵入亨格特管中，并將培養(yǎng)物置于39°C搖床孵育(IOOrpm)。用分 光光度計(jì)測(cè)定600nm的OD，并通過(guò)氣相色譜測(cè)定氫的使用和甲烷的產(chǎn)生，從而監(jiān)測(cè)產(chǎn)甲 烷菌的生長(zhǎng)。ELISA實(shí)驗(yàn)表明產(chǎn)自每一抗原的抗體與固定于微孔板上的反芻甲烷短桿菌細(xì)胞 結(jié)合。抗體在體外能夠與反芻甲烷短桿菌細(xì)胞結(jié)合，但加入反芻甲烷短桿菌培養(yǎng)物的單 個(gè)抗體制備物不能抑制產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)或者降低甲烷產(chǎn)量。然而，包含來(lái)自10種不同抗原 抗血清的匯集樣品的制備物似乎在加入反芻甲烷短桿菌培養(yǎng)物時(shí)增加了細(xì)胞的聚集。實(shí)施例6:概述選擇反芻甲烷短桿菌進(jìn)行基因組測(cè)序是因?yàn)樗诟鞣N飼養(yǎng)條件下的反芻動(dòng)物瘤 胃中廣泛存在(基于培養(yǎng)和分子檢測(cè)數(shù)據(jù))，容易獲得培養(yǎng)物，易于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng) 以及可獲得關(guān)于這種有機(jī)體的大量的前期研究數(shù)據(jù)和背景文獻(xiàn)。已經(jīng)為反芻甲烷短桿菌 內(nèi)大量基因指定功能，從而對(duì)瘤胃內(nèi)此種有機(jī)體的生活方式進(jìn)行詳細(xì)描述。反芻甲烷短 桿菌對(duì)簡(jiǎn)單底物(H2+CO2，甲酸)的依賴(lài)性以及它通過(guò)表面蛋白和外泌多糖與瘤胃環(huán)境的 相互作用是重要的抑制靶點(diǎn)。相似地，SPIDR有可能用于特異性靶向反芻甲烷短桿菌， 以及有助于確定基因功能的遺傳學(xué)操縱。這些序列數(shù)據(jù)闡明了此種生物體的代謝機(jī)制和 它與其它微生物相互作用的方式，并且指出產(chǎn)甲烷菌中的保守性系統(tǒng)和組件，可對(duì)這些 系統(tǒng)和組件進(jìn)行滅活以消除或減少瘤胃中形成的甲烷。參考文獻(xiàn)Altermann E，Klaenhammer TR (2005)通路探險(xiǎn)人用京都基因和基因組 (KEGG)百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路作圖(PathwayVoyager pathwaymapping using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database) .BMC Genomics 6 60-66。Altermann, E.和 T.R.Klaenhammer.2003.GAM()LA 序列注釋以及對(duì)原核 基因組草圖和完成序列進(jìn)行分析的新的本地解決方案(GAMOLA: anew local solution for sequence annotation and analyzing draft and finishedprokaryotic genomes)， Omics 7 161-169。Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997)，缺口 BLAST和PSI-BLAST 新一代的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序(Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of protein databasesearch programs) .Nucleic Acids Research 25，3389-3402。Balch WE, Fox GE，Magrum LJ，Woese CR, Wolfe RS (1979)產(chǎn)甲烷菌一 個(gè)獨(dú)特生物學(xué)群體的重新評(píng)估(Methanogens reevaluation of a uniquebiological group). Microbiological Reviews 43，260—296。
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22-28。將上述說(shuō)明書(shū)提及的所有公開(kāi)物和專(zhuān)利全文納入本文作參考。如果參考上述說(shuō) 明書(shū)中提及具有已知等同形式的內(nèi)容，那么將這些等同形式也納入本文，就好像在本文 中單獨(dú)列出那樣。雖然已結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了描述，但應(yīng)了解，如權(quán) 利要求所述，本發(fā)明不應(yīng)過(guò)分地受限于這些具體實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解的是在不背離本發(fā) 明的構(gòu)思和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的修改。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其包含選自SEQIDNO : 1-9的氨基酸序列。
2.—種分離的多肽，其包含選自SEQIDNO: 10-17的氨基酸序列。
3.—種分離的多肽，其包含選自SEQID NO : 18-44的氨基酸序列。
4.一種分離的多肽，其包含選自SEQIDNO 45-260的氨基酸序列。
5.—種分離的多肽，其包含選自SEQID NO : 261-331的氨基酸序列。
6.一種分離的多肽，其包含選自SEQIDNO 332-702的氨基酸序列。
7.—種分離的多肽，其與選自SEQID NO: 1-9的氨基酸序列具有90%相同性。
8.—種分離的多肽，其與選自SEQID NO: 10-17的氨基酸序列具有90%相同性。
9.一種分離的多肽，其與選自SEQIDN0 : 18-44的氨基酸序列具有90%相同性。
10.—種分離的多肽，其與選自SEQIDN0: 45-260的氨基酸序列具有90%相同性。
11.一種分離的多肽，其與選自SEQ ID NO: 261-331的氨基酸序列具有90%相同性。
12.—種分離的多肽，其與選自SEQID NO: 332-702的氨基酸序列具有90%相同性。
13.—種分離的多肽或肽，其包含選自SEQIDN0 : 10-17的氨基酸序列的胞外區(qū)。
14.一種分離的多肽或肽，其包含選自SEQ ID NO 45-260的氨基酸序列的胞外區(qū)。
15.—種分離的多肽或肽，其包含選自SEQ ID NO: 332-702的氨基酸序列的胞外區(qū)。
16.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQIDN0 : 1-9的氨基酸序列。
17.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQIDN0 : 10-17的氨基酸序列。
18.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO : 18-44的氨基酸序列。
19.一種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO : 45-260的氨基酸序列。
20.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO : 261-331的氨基酸序列。
21.一種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQIDN0 332-702的氨基酸序列。
22.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQIDN0 : 10-17的氨基酸序列的胞外區(qū)。
23.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO: 45-260的氨基酸序列的胞外區(qū)。
24.一種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO 332-702的氨基酸序列的胞外區(qū)。
25.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQIDN0 703-710的核苷酸序列。
26.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQIDN0 711-736的核苷酸序列。
27.—種分離的多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO : 737-931的核苷酸序列。
28.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQIDN0 932-1002的核苷酸序列。
29.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQIDN0 1003-1373的核苷酸序列。
30.一種分離的多核苷酸，其與權(quán)利要求16-29中任一項(xiàng)所述的多核苷酸互補(bǔ)。
31.一種編碼權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述多肽的載體。
32.—種編碼權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述多肽或肽的載體。
33.一種包含權(quán)利要求16-30中任一項(xiàng)所述多核苷酸的載體。
34.一種包含權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述載體的宿主細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求34所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
36.如權(quán)利要求35所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是大腸桿菌。
37.如權(quán)利要求34所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是產(chǎn)甲烷菌。
38.如權(quán)利要求37所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌。
39.一種偶聯(lián)物分子，其包含權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述多肽。
40.一種偶聯(lián)物分子，其包含權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的多肽或肽。
41.一種融合分子，其包含權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述多肽。
42.一種融合分子，其包含權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的多肽或肽。
43.一種與權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述多肽結(jié)合的抗體或抗體片段。
44.一種與權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述多肽或肽結(jié)合的抗體或抗體片段。
45.如權(quán)利要求43或44所述的抗體或抗體片段，其特征在于，所述抗體或抗體片段 是多克隆的。
46.如權(quán)利要求43或44所述的抗體或抗體片段，其特征在于，所述抗體或抗體片段 是單克隆的。
47.一種偶聯(lián)物分子，其包含權(quán)利要求43-46中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段。
48.如權(quán)利要求47所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，所述分子還包含抗甲烷生成化合 物、信號(hào)序列、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽或抗生素。
49.一種融合分子，其包含權(quán)利要求43-46中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段。
50.如權(quán)利要求49所述的融合分子，其特征在于，所述分子還包含抗甲烷生成化合 物、信號(hào)序列、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽或抗生素。
51.一種包含權(quán)利要求43-46中任一項(xiàng)所述抗體的藥物組合物。
52.—種包含權(quán)利要求39、40、47和48中任一項(xiàng)所述偶聯(lián)物分子的藥物組合物。
53.一種包含權(quán)利要求41、42、49和50中任一項(xiàng)所述融合分子的藥物組合物。
54.—種靶向產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞以便鑒定、分離或抑制的方法，所述方法包括a)任選地 產(chǎn)生或分離權(quán)利要求43-46中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段；和b)將所述細(xì)胞與所述抗 體或抗體片段相接觸。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌菌株 M1T(DSM1093)。
57.—種靶向產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞以便鑒定、分離或抑制的方法，所述方法包括a)任選地 產(chǎn)生或分離權(quán)利要求47或48所述的偶聯(lián)物分子；和b)將所述細(xì)胞與所述偶聯(lián)物分子相 接觸。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌菌株 M1T(DSM1093)。
60.—種靶向產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞以便鑒定、分離或抑制的方法，所述方法包括a)任選 地產(chǎn)生或分離權(quán)利要求49或50所述的融合分子；和b)將所述細(xì)胞與所述融合分子相接 觸。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌菌株M1T(DSM1093)。
全文摘要
本發(fā)明涵蓋用于產(chǎn)生抗體的來(lái)自微生物細(xì)胞的組分，包括肽、包含這些肽的多肽，編碼這些肽或多肽的多核苷酸，以及針對(duì)這些肽、多肽或多核苷酸的抗體。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生這些肽、多肽、多核苷酸和抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涵蓋使用一種或多種公開(kāi)的肽、多肽、多核苷酸、抗體、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞檢測(cè)、靶向和抑制微生物細(xì)胞，尤其是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的方法和組合物，尤其是疫苗組合物。
文檔編號(hào)C07K14/345GK102015755SQ200880109450
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月25日
發(fā)明者D·李, E·H·阿特曼, G·T·愛(ài)特伍德, S·C·利伊, W·J·凱利, Z·孔 申請(qǐng)人:田園溫室氣體研究有限公司