專利名稱：N-端修飾的干擾素-α的制作方法
N-端修飾的干擾素-α相關(guān)申請段落的交叉引用本發(fā)明要求在2007年10月1日提交的美國臨時申請No. 60/976，696的權(quán)益，在此將其內(nèi)容全部納入作為參考。背景干擾素(IFNs)包括干擾素- α、IFN-β和IFN-γ，都是由免疫細胞對外來物質(zhì) (如病菌)或異常的自身物質(zhì)(如癌細胞)的響應(yīng)所產(chǎn)生的天然蛋白。它們已經(jīng)被廣泛地 用于治療病毒感染和癌癥。成熟的人IFN- α -2b (hIFN- α 2b)與它在其他物種中的對應(yīng)物都具有兩個自然產(chǎn) 生的二硫鍵，這對它們的治療應(yīng)用來說至關(guān)重要。在hIFN-a2b中，這兩個二硫鍵分別在 Cys1-Cys9i^n Cys29-Cys138之間形成。前者是蛋白質(zhì)活性所必需的。另一方面，后者的喪失 會呈現(xiàn)蛋白免疫原性。hIFN- α 2b通常通過在E. coli中表達其編碼cDNA來制備。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由此制備的 蛋白包含大量的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，包括低聚體和慢單體，這二者在非還原性條件下在SDS-聚丙 烯酰胺凝膠電泳中，都比他們天然的對應(yīng)物遷移更慢。這些由非天然的分子間或分子內(nèi)二 硫鍵的形成而產(chǎn)生的異構(gòu)體沒有治療價值，因為它們沒有活性或者產(chǎn)生免疫原性。因此，人 們非常希望開發(fā)用于生產(chǎn)幾乎無異構(gòu)體污染的IFN-α蛋白的新技術(shù)。概述本發(fā)明基于一個意外發(fā)現(xiàn)，即將氨基酸殘基加到成熟hIFN-α 2b的N-端半胱氨酸 (Cys1)導(dǎo)致非天然二硫鍵的形成，由此顯著降低了其結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的水平。一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的多肽，該多肽包含第一片段，其具有 1-5(如1、2、和3)個氨基酸殘基；與第二片段，其N-端部分是具有Cys1的成熟IFN-α (如 成熟hIFN-a2b)。該第一片段經(jīng)由肽鍵與成熟IFN-α的Cys1相連。在一個實施例中，所 述第一片段是單個氨基酸，如脯氨酸。需要注意，當該第一片段是單個氨基酸時，它不能是 甲硫氨酸。這種多肽可以用于治療疾病，如病毒感染和癌癥。另一方面，本發(fā)明的特征在于一種包含編碼上述多肽的核苷酸序列的核酸。同時，本發(fā)明的范圍還包括一種通過將1-5個氨基酸殘基加到成熟IFN-α的 Cys1，降低成熟IFN-α中非天然二硫鍵的形成的方法。例如，通過將脯氨酸殘基加到Cys1, 在hIFN-α 2b中減少了非天然二硫鍵的形成。從以下附圖和對幾種實施方式的詳細說明，以及從附加的權(quán)利要求書中將明顯看 出本發(fā)明的其他特點或優(yōu)點。


圖1顯示hIFN- α 2b的氨基酸序列及其編碼核酸序列。圖2顯示經(jīng)修飾的成熟hIFN- α 2b (Pro-IFN- α 2b)的氨基酸序列及其編碼核酸序 列。圖3是顯示在不同時間點重折疊的成熟hIFN- α 2b的高效液相色譜圖(HPLC)；右峰hIFN_a 2b的慢單體，左峰天然形式的hIFN-a 2b。圖4是顯示在不同時間點重折疊的Pro-IFN_a2b的HPLC圖；峰A 未折疊的 Pro-IFN- a 2b,峰 B =Pro-IFN- a 2b 的慢單體，峰 C 天然形式的 Pro-IFN- a 2b。
圖5是顯示硫酸銨/氯化鈉處理前后的天然hIFN- a 2b和hIFN- a 2b結(jié)構(gòu)異構(gòu)體 的HPLC圖；峰A :hIFN- a 2b的慢單體，峰B 天然形式的hIFN- a 2b。詳細說明本發(fā)明旨在減少成熟IFN- α中非天然雙硫鍵的形成，通過將1_5個氨基酸殘基加 到成熟IFN- α的Cys1來實現(xiàn)。相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種包括兩個片段的分離的多肽第一片段包括多至5個氨 基酸殘基，而第二片段在其N-端部分包括成熟IFN- a。該第一片段通過肽鍵與成熟IFN- a 的Cys1相連。成熟形式的有Cys1 WlFN-α蛋白可以通過檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫來識別，如 GenBank數(shù)據(jù)庫。這種IFN- α蛋白的實例包括人IFN- α 2b (GenBank登錄號AAP20099 ；也 可見圖 1),豬 IFN- α (GenBank 登錄號 ΒΑΕ93462)，狗 IFN- α (GenBank 登錄號 ΒΑΕ92736)，以 及牛 IFN- α (GenBank 登錄號 ΑΑΡ87280)。上述第一片段可以是單個氨基酸殘基，如脯氨酸。然而該單個氨基酸殘基不能是 甲硫氨酸，因為它可以在細胞中被除去。該第一片段也可以是有2-5個氨基酸殘基的肽，其 序列并不重要。上述分離的多肽可以利用重組技術(shù)來制備。下面是一個實例，通過本領(lǐng)域中已 知的方法分離編碼IFN-α的基因，例如參見Sambrook et al.，MolecularCloning :A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor，N. Y.，1989。然后通過將編碼上述 片段的核苷酸序列直接加到編碼IFN-α的Cys1的遺傳密碼子上，修飾上述基因。這種修 飾可以通過例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來實現(xiàn)。然后，如此修飾的基因，其編碼N-端修飾的 IFN-α，可以在Ε. coli、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞中表達。該分離的多肽也可以通過合成方法或合成與重組方法聯(lián)合來制備。在一種實施例 中，上述第一片段通過合成方法加到成熟IFN-α的N端，將其在宿主細胞中表達和純化。人們可以用藥學(xué)上可接受的載體配制該分離的多肽，以生產(chǎn)藥物組合物。藥學(xué)上 可接受的載體是指可以與該組合物中的活性成分兼容(并且優(yōu)選地，可以穩(wěn)定該活性成 分)，并對治療的主體無害的載體。適宜的載體包括微晶纖維素、甘露醇、葡萄糖、脫脂奶粉、 聚乙烯吡咯烷酮和淀粉，或它們的結(jié)合。然后可以將該組合物制成各種形式，如片劑、膠囊、 粉末或液體。包含該分離的多肽的組合物可以通過適宜的途徑施予患者，如靜脈注射或皮下注 射，每天一次或多次，或每隔幾天一次。無菌注射組合物可以是無毒的腸外可接受的稀釋劑 或溶劑中(如1，3_ 丁二醇中)的溶液或懸浮液?？墒褂玫膶儆诳山邮艿妮d體和溶劑的有 甘露醇、水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，不揮發(fā)性油被常規(guī)地用作溶劑或懸浮媒 介(例如合成的甘油單酯或甘油二酯)。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于注射劑的 制備，天然的藥學(xué)上可接受的油也是如此，如橄欖油或蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙烯化形 式。這些油溶液或懸浮液也可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，羧甲基纖維素，或類似的分散 齊U。為了配制的目的，還可以使用其他常用的表面活性劑，例如通常用于制備藥物學(xué)上可接 受的固體、液體或其他劑型的吐溫、或司盤、或其他類似的乳化劑或生物利用度增強劑。
在不進一步詳細說明的情況下，可以相信以上描述已經(jīng)足夠使本發(fā)明被授權(quán)。因 此，以下實施例僅視為說明性的，而不以任何方式限制本說明書的其余實施方式。在此將本 文引用的所有出版物全部納入作為參考。實施例1 重組 hIFN- α 2b 和 N-端修飾的 hlFN- α 2b (Pro-hlFN- α 2b)的制備利用人基因組DNA作為模板通過PCR擴增編碼hIFN- α 2b的第一核酸。見圖1。 基于編碼hIFN-α 2b基因(GenBank登錄號NM_000605)的編碼區(qū)域的側(cè)翼序列設(shè)計PCR 引物。將由此得到的PCR產(chǎn)物克隆進pGEM-T載體(Promega)，然后亞克隆進蛋白表達載體 pET~24a(Novagen)。通過利用根據(jù)圖2所示的核酸序列設(shè)計的引物，經(jīng)PCR擴增修飾上述第一核酸，獲 得了編碼Pro-hIFN-α 2b的第二核酸。簡言之，將兩個另外的密碼子ATG和CCG (分別編碼 Met和Pro)添加至編碼成熟hIFN- α 2b的Cys1的密碼子TGT的5’。將該核酸也克隆進表 達載體pET-24a。然后，將攜帶hIFN- α 2b 和 Pro-hlFN- α 2b 基因的 pET_24a 載體轉(zhuǎn)化 Ε. coli BLR-CodonPlus (DE3) -RIL株(Novagene)。選擇高水平表達這兩種蛋白的Ε. coli克 隆。按照設(shè)計，Pro-hlFN-α 2b基因中表達的初生蛋白在N-端有Met (Met-Pro-Cys—)。 該Met殘基經(jīng)內(nèi)部酶消化在Ε. coli中除去，產(chǎn)生具有N-端Pro的成熟蛋白，其與 hIFN- α 2b (Pro-Cys—)中的 Cys1 相連。將表達hIFN-α 2b或Pro-hlFN-α 2b的Ε. coli克隆體在IOOOml燒瓶中培養(yǎng)，該 燒瓶含有250ml SYN Broth培養(yǎng)基(大豆蛋白胨，酵母提取物，和氯化鈉)，帶有卡那霉素 (50ug/ml)和改用氯霉素(50ug/ml)，在37°C，200rpm培養(yǎng)16小時。然后將220ml過夜培 養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到 5L 發(fā)酵罐(Bioflo3000 ；New Brunswick Scientific Co.，Edison, NJ)中，該 發(fā)酵罐包含3L確定成分培養(yǎng)基(10g/L葡萄糖，0. 7g/L MgSO4 · 7H20,4g/L (NH4) 2HP04, 3g/ LKH2PO4,6g/L K2HPO4,1. 7g/L檸檬酸鹽，lOg/L酵母提取物，lOml/L微量元素以及2g/L異亮 氨酸)，帶有卡那霉素(25ug/ml)，改用氯霉素(25ug/ml)，0.4%甘油以及0.5% (ν/ν)微量 元素(10g/L FeSO4 ·7Η20，2· 25g/L ZnSO4 ·7Η20，lg/L CuSO4 ·5Η20，0· 5g/L MnSO4 ·Η20，0· 3g/ LH3BO3, 2g/L CaCl2 · 2H20，0. lg/L (NH4) 6Mo7024，0. 84g/L EDTA，和 50ml/L HCl)。培養(yǎng)基中氧 氣的濃度控制在35%，并且必要時通過添加37%氨水使pH保持在7. 1。制備含800g/L葡 萄糖和20g/L MgSO4 ·7Η20的進料溶液。當溶解的氧升至大于設(shè)定點的值，添加適量的進料 溶液以增加培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度。在0. 7mM的最終濃度下，通過IPTG誘導(dǎo)hIFN-α 2b或 者Pro-hlFN- α 2b基因的表達，然后添加營養(yǎng)料(酵母提取物和微量元素)，在IPTG誘導(dǎo)5 小時后，收集表達這些蛋白的E. coli細胞。將收集的E. coli 細胞在 TEN 緩沖液中(50mM Tris-HCl, ρΗ7· O ；ImMEDTA,以及 IOOmM NaCl)Wl 10 (濕重g/ml)的比例重新懸浮，用勻質(zhì)器打碎，然后以10，OOOrpm離 心20min。將含有內(nèi)含體(IB)的顆粒沉淀用TEN緩沖液洗滌兩次，再按如上所述離心，懸浮 在比例為Iml溶液2. 5g濕重沉淀/ml的4M鹽酸胍(GnHCl)水溶液中，再以20，OOOrpm離 心20min。將含有重組hIFN-α 2b的IB溶解在50ml含5mM DTT的6M GuHCl中，然后在室 溫下攪拌1.5hr，接著在25°C以20，000印111離心201^11。收集上清液。在這個過程中，重組 hIFN- a 2b或Pro-hlFN蛋白被變性。實施例2 :hIFN~ a 2b 和 Pro-IFN- a 2b 的重折疊
將上述IB與1. 5L新鮮制備的重折疊緩沖液(IOOmM Tris-HCl (ρΗ7. 0)，0.5M L-精 氨酸，2mM EDTA)混合。將由此產(chǎn)生的反應(yīng)混合物在室溫下不經(jīng)攪拌培養(yǎng)24_36hr，以使該 重組hIFN-a2b和Pro-hIFN-a2b蛋白重折疊。然后將重折疊的蛋白用pH 7. 0的20mM Tris-HCl緩沖液透析，并進一步通過以下描述的Q-瓊脂糖凝膠柱色譜純化。將Q-瓊脂糖凝膠柱(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)預(yù)平衡，并用 20mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)洗滌。然后將重折疊的重組蛋白裝填到平衡的Q-瓊脂糖凝膠柱 上，并用含有80mM NaCl的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)洗脫。將含有Pro-hlFN- α 2b的 部分根據(jù)它們在280nm的吸收進行收集。利用Bradford方法通過蛋白檢測試劑盒(Pierce， Rocford, IL)確定這些蛋白的濃度。利用C18反相HPLC(RP-HPLC)確定重折疊的重組蛋白的構(gòu)象，其中自然產(chǎn)生的蛋 白和慢單體蛋白是分開的(用圖3和4所示的不同峰表示)。RP-HPLC分析是在配備有自動 梯度控制器、兩個緩沖泵、UV檢測器和積分記錄器的Angilent HPLC系統(tǒng)上進行。C18HPLC 柱(46mmx250mm，5ym 粒徑；300人孔徑)是在 80%緩沖液 A :0. 2% (v/v)TFA 在 30 70 乙腈水(HPLC級)中平衡。該蛋白是根據(jù)以下梯度用緩沖液B(0. 2% TFA在80 20乙 腈水)以lml/min的流速從C18HPLC柱中洗脫時間(min) 洗脫液(A) 洗脫液(B)072281722856733206337305743404060424060507228從C18HPLC分析獲得的結(jié)果表明，大量的重折疊的重組hIFN- α 2b蛋白是慢單體 (圖3中的右峰)。不同的是，在重折疊的重組Pro-hIFN-α 2b蛋白中只有極少的慢單體污 染，見圖4中峰B。實施例3 天然hIFN- α 2b和hIFN- α 2b異構(gòu)體(isoform)的分離將hIFN- α 2b通過上述Q-瓊脂糖凝膠柱色譜進行純化。將包含于純化蛋白中的 hIFN-α 2b異構(gòu)體，包括寡聚體和慢單體，根據(jù)美國專利No. 4，534，906中描述的方法除去。 簡言之，將該蛋白與ASP緩沖液(3M硫酸銨和IMNaOAc)混合至最終濃度(0.9M硫酸銨和 20mM NaOAc)，pH4. 5。將該混合物在室溫下(如34-40°C )孵育20分鐘，以形成包括慢單體 和寡聚體的蛋白沉淀。通過離心除去該沉淀，并收集含天然形式的hIFN-α 2b上清液。在 C18反相HPLC中分析硫酸銨/氯化鈉處理前后的蛋白樣本，由此獲得的結(jié)果如圖5所示。 通過Q-瓊脂糖凝膠柱色譜純化制備的hIFN- α 2b蛋白包括大量異構(gòu)體。見圖5頂部的右 峰。這些異構(gòu)體在硫酸銨/氯化鈉處理后被除去。其他實施方式本說明書中披露的所有特征可以任意組合結(jié)合。本發(fā)說明書中披露的每一特征可 用滿足相同、等同或相似目的的供選擇的特征來代替。因此，除非另有說明，披露的每一特征僅是通用系列中的等同或類似特征的一個實例。
從以上描述中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，并且在不背 離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種變化和修改，以適應(yīng)不同的用途和 條件。因此，其他的實施方式也屬于以下權(quán)利要求書的范圍。
權(quán)利要求
一種分離的多肽，包括由Xn表示的第一片段，X為氨基酸殘基，n為1、2、3、4或5，其中如果n＝1，X不為Met；和包含成熟干擾素α的第二片段，其N-端是Cys，該成熟干擾素α形成所述第二片段的N-端部分，其中Cys經(jīng)由肽鍵與所述第一片段相連。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中η為1、2或3。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中η為1，并且X為脯氨酸。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述干擾素α是人干擾素α-2b。
5.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中所述干擾素α是人干擾素α_2b。
6.一種分離的核酸，包括編碼多肽的核苷酸序列，該多肽包括由Xn表示的第一片段，X為氨基酸殘基，η為1、2、3、4或5，其中，如果η為1，X不為 Met ；禾口包含成熟干擾素α的第二片段，其N-端是Cys，該成熟干擾素α形成所述第二片段的 N-端部分，其中Cys經(jīng)由肽鍵與所述第一片段相連。
7.如權(quán)利要求6所述的核酸，其中η為1、2或3。
8.如權(quán)利要求6所述的核酸，其中η為1，并且X為脯氨酸。
9.如權(quán)利要求6所述的核酸，其中所述第一片段為Met-Pro。
10.如權(quán)利要求6所述的核酸，其中所述干擾素α是人干擾素α_2b。
11.如權(quán)利要求8所述的核酸，其中所述干擾素α是人干擾素α_2b。
12.如權(quán)利要求9所述的核酸，其中所述干擾素α是人干擾素α_2b。
13.一種包含權(quán)利要求6所述核酸的載體。
14.一種包含權(quán)利要求13所述載體的轉(zhuǎn)化細胞。
15.一種治療病毒感染的方法，包括將含有有效量的權(quán)利要求1所述多肽的組合物施 予需要的主體。
16.一種治療病毒感染的方法，包括將含有有效量的權(quán)利要求5所述多肽的組合物施 予需要的主體。
17.一種減少干擾素α中非天然產(chǎn)生的二硫鍵的形成的方法，包括將一至五個氨基酸 殘基加到成熟干擾素α的N端Cys。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中將一至三個氨基酸殘基加到成熟干擾素α的N端Cys。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中將Pro加到成熟干擾素α的N端Cys。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述干擾素α是人干擾素α_2b。
全文摘要
通過將一個或多個氨基酸殘基加到成熟干擾素α的N端半胱胺酸，減少成熟IFN-α中非天然雙硫鍵的形成的方法。本發(fā)明還披露了由此修飾的IFN-α。
文檔編號C07H21/04GK101883784SQ200880109799
公開日2010年11月10日 申請日期2008年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月1日
發(fā)明者布賴恩·T·H·吳, 徐明品, 沈彩奎, 鄧慶璐 申請人:藥華醫(yī)藥股份有限公司