專利名稱：：防止病毒與dlc8結(jié)合的新型抗病毒肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新型抗病毒化合物開發(fā)以及它們在預(yù)防或治療動物或人類中的病毒感染中的應(yīng)用的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：病毒是需要整合特定細(xì)胞功能以便可以成功地進(jìn)行它們在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制循環(huán)的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。已經(jīng)證明動力蛋白在不同病毒模型如狂犬病毒、人單純皰疹病毒、I型或人免疫缺陷病毒中在不同的病毒感染步驟中具有相關(guān)作用。動力蛋白是微管動力蛋白，其干預(yù)與微管和內(nèi)體途徑聯(lián)系的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，并且是在其它功能中細(xì)胞內(nèi)信號翻譯的不同途徑的調(diào)控子。病毒利用動力蛋白用于它們的內(nèi)在化和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，用于形成病毒工廠，在那里將產(chǎn)生新的病毒體，并且用于協(xié)調(diào)這些和其它過程必需的細(xì)胞信號傳導(dǎo)。特別地，非洲豬瘟病毒(ASFV)的p54蛋白與一種細(xì)胞蛋白相互作用，該種細(xì)胞蛋白作為稱為動力蛋白的微管動力復(fù)合體的一部分并且其功能主要與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)[1]。在酵母中利用雙雜交系統(tǒng)(異源系統(tǒng))，在病毒P54蛋白可能的相互作用蛋白的豬巨噬細(xì)胞cDNA文庫中尋找相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)了該相互作用。編碼p54的序列(E183L基因)包含在BA71V分離株的完整序列中，以登記號U18466存放在NCBI數(shù)據(jù)庫中。對獲得且鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序，以發(fā)現(xiàn)它們包含8千道爾頓(kDa)的輕鏈動力蛋白的完整編碼序列，所述8千道爾頓(kDa)的輕鏈動力蛋白稱為DLC8，LC8，DLCl,DNLCl或PIN(神經(jīng)元氧化氮合酶的抑制劑蛋白)。Susscrofa中編碼DLC8的序列已經(jīng)以AF436777存放在NCBI數(shù)據(jù)庫中。使用另一種形式的技術(shù)，包括親和層析，免疫沉淀和通過共聚焦顯微鏡的雙成分共定位，確證了這些結(jié)果。這些結(jié)果僅證實(shí)ASFV的p54蛋白和DLC8之間的相互作用。DLC8是在進(jìn)化上遠(yuǎn)系物種之間(從線蟲動物到人)具有高度保守核苷酸氨基酸序列的蛋白[2，3]。細(xì)胞質(zhì)動力蛋白是驅(qū)動遍及微管的不同負(fù)荷的分子發(fā)動蛋白家族。它們負(fù)責(zé)將小泡、內(nèi)體和細(xì)胞器由細(xì)胞外部轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)部、至核或核周區(qū)域。它們是大的多蛋白復(fù)合物，由一至三個具有球狀頭部和ATP酶活性的重鏈構(gòu)成，其負(fù)責(zé)產(chǎn)生引起運(yùn)動必需的能量。與這些重鏈結(jié)合的是不定數(shù)目的中間體鏈和輕鏈。后者負(fù)責(zé)與待轉(zhuǎn)運(yùn)的負(fù)荷直接相互作用。迄今為止，已經(jīng)描述了7個輕鏈家族，其中我們可以找到DLC8。DLC8在體內(nèi)傾向于成為二聚體，其允許在兩個單體之間存在不同序列的兩個相同的結(jié)合位置。關(guān)于該細(xì)胞蛋白，對于DLC8已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種類型的它們與之相互作用的該細(xì)胞蛋白的優(yōu)先結(jié)合位點(diǎn)[12，13]?；蛑?Lys/Arg)XThrThHX為任何氨基酸)結(jié)合DLC8與一系列分子如動力蛋白的中間體鏈、促凋亡(proapoptotic)分子Bim、Kidl和Swallow轉(zhuǎn)錄因子和一些不同來源的病毒蛋白。這一結(jié)合位點(diǎn)位于兩個DLC8分子的二聚體之間。第二個基序是Gly(Ile/Val)GlnValAsp，其結(jié)合DLC8與神經(jīng)元氧化氮合酶(nNOS)或與神經(jīng)元skafolding蛋白，如目前所述。為了鑒定病毒蛋白與動力蛋白結(jié)合所需要的氨基酸殘基，在酵母系統(tǒng)中表達(dá)并檢測P54蛋白的7個剪截的片段，以確定針對DLC8的結(jié)合區(qū)位于p54蛋白的羧基末端，由在Tyrl49和Thrl61之間的13個氨基酸組成(TyrThrThrThrValThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr)[1]。一些病毒在它們在宿主細(xì)胞內(nèi)的感染周期的不同階段使用輕鏈動力蛋白(DLC8)。通過稱為pep-掃描的技術(shù)，合成了模擬不同病毒來源蛋白的線性序列的肽，印跡至濾紙上，并且用DLC8探測來確定哪種線性序列適于該相互作用[10]。下述出現(xiàn)的線性序列理論上適于DLC8結(jié)合。這些通常包含Gln(Q)殘基，在該序列中通常與T殘基(Thr)相鄰-非洲豬瘟病毒p54蛋白的TyrAlaSerGlnThr基序-呼吸道合胞病毒結(jié)合糖蛋白的TyrSerThrGlnThr基序_狂犬病毒的和Mokola病毒的、人單純皰疹病毒解旋酶的、腺病毒蛋白酶的、或A.moorei昆蟲痘病毒的P蛋白的LysSerThrGlnThr基序。-人乳頭瘤病毒(papillovirus)E4蛋白的或痘苗病毒聚合酶的LysGlnThrGlnThr基序。-人皰疹病毒基因U19的LysGlnThrGlnThr基序-AMf2^^!^(humanCoxsackievirus)^tES&WArgValMetGlnLeu^寸。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些線性病毒蛋白序列理論上能夠結(jié)合DLC8，但是這不排除所有這些序列應(yīng)該適于以蛋白天然形式相互作用或當(dāng)分子在體內(nèi)整合到發(fā)動蛋白復(fù)合物中時。此夕卜，沒有表明那些病毒序列怎樣暴露在病毒顆粒中，也沒有表明它們事實(shí)上能夠結(jié)合DLC8的推定結(jié)合位點(diǎn)，和/或這些病毒蛋白是否在感染過程中在動力蛋白可及的細(xì)胞區(qū)室如細(xì)胞溶膠中(而不是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或其它隔離的細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)中)合成的。此外，迄今為止尚未證明這些線性序列的任一種能夠以任何方式阻斷假定的蛋白與DLC8的結(jié)合，并且最終，沒有保證阻斷該位點(diǎn)將導(dǎo)致對感染的抑制。事實(shí)上，如上所述，每DLC8分子存在兩個推定的結(jié)合位點(diǎn)，并且存在可以由任何給定的病毒交替利用的多個其它輕鏈和中間體鏈?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)無一證明阻斷該位點(diǎn)將中斷該相互作用和妨礙病毒感染，并且沒有保證上文提及的序列可以有效用作抗病毒化合物。此外，對于將要用作抗病毒劑候選物的任何肽，應(yīng)該用某種辦法充分達(dá)到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，并且還必須確保在活細(xì)胞中零或非常低的毒性。當(dāng)這些序列保持一級(線性)結(jié)構(gòu)時，氨基酸序列可以被鑒定為參與病毒蛋白和DLC8之間的結(jié)合的事實(shí)不排除那些線性序列將抑制病毒蛋白和DLC8的相互作用，并且因此，包括那些氨基酸序列的肽可以作用為抗病毒化合物。應(yīng)該分析兩種相互作用表面(例如，通過它們的核磁共振譜)，以設(shè)計適于阻斷所述蛋白-蛋白相互作用的肽序列。關(guān)于其的原因在于這樣的事實(shí)，即，當(dāng)在細(xì)胞中以更高復(fù)雜性結(jié)構(gòu)折疊時，例如，結(jié)合到稱為微管發(fā)動蛋白復(fù)合物的大分子復(fù)合物上，線性氨基酸序列可以隱藏參與結(jié)合DLC8或病毒蛋白的氨基酸殘基，并且因此，那些二級結(jié)構(gòu)折疊的肽將不表現(xiàn)出任何抗病毒活性。此外，在體外或在異源系統(tǒng)如酵母中參與結(jié)合的確定序列可能不暴露于病毒顆粒的情形中，和/或可能在隱蔽的細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)中合成，這使得其在哺乳動物細(xì)胞中對感染的細(xì)胞蛋白是不可及的。在所有這樣的情形中，理論上能夠阻斷相互作用的肽將不表現(xiàn)出任何抗病毒活性。另一個原因在于，當(dāng)溶解在細(xì)胞溶膠中時，線性肽具有形成聚集體的傾向，其又將隱蔽負(fù)責(zé)結(jié)合DLC8或病毒蛋白的氨基酸。那些聚集的肽將不表現(xiàn)出抗病毒特性。新型抗病毒肽的設(shè)計中的另一個重要方面涉及它們在未感染細(xì)胞中的毒性。商購的抗病毒物質(zhì)應(yīng)該防止和/或抑制病毒感染，但是優(yōu)選地，不影響未感染細(xì)胞的細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖。最后但不是最少的，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)圍繞該基序的氨基酸參與DLC8-病毒蛋白結(jié)合區(qū)，并且特別是它們的疏水性，它們的確在被認(rèn)為是真正的抗病毒化合物的那些肽的結(jié)合抑制能力中起著重要作用。實(shí)現(xiàn)對病毒蛋白與DLC8結(jié)合的有效抑制的抗病毒肽必須充分溶解在細(xì)胞溶膠中，并且因此，在結(jié)合基序附近的氨基酸的疏水性和脯氨酸含量是至關(guān)重要的。因?yàn)樗羞@些原因，通過干預(yù)病毒利用細(xì)胞動力蛋白而產(chǎn)生阻斷所述病毒感染的抗病毒策略是必需的，即，阻斷其允許不同病毒來源蛋白充分利用動力蛋白的功能或結(jié)合位點(diǎn)。然而，盡管在那些病毒中存在的一些重疊部分氨基酸序列重復(fù)作為DLC8的結(jié)合基序，如KSTQT或GIQVD，但是檢查相鄰的殘基以評估是否將有效發(fā)生病毒-DLC8相互作用也是重要的。針對它們消除與DLC8的相互作用的能力而評估在那些氨基酸上的特異性改變。利用病毒模型(非洲豬瘟病毒，ASFV)我們已經(jīng)證明，對系統(tǒng)DLC8-動力蛋白的干預(yù)，能夠阻斷感染，其為新型抗病毒策略提供了主要的檢測，這組成本發(fā)明的目的。我們已經(jīng)比較了參與所述相互作用的一些蛋白的相互作用結(jié)構(gòu)域及其側(cè)翼序列，并且已經(jīng)利用該信息來設(shè)計作用為蛋白對相互作用的主要拮抗劑的肽，所述蛋白對相互作用，但是同時，其被標(biāo)記，以充分到達(dá)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，且主要實(shí)現(xiàn)抗病毒化合物必須滿足的所有要求，如先前所述在確定條件下對病毒蛋白-DLC8結(jié)合的特異性抑制，在細(xì)胞溶膠中的可及性和溶解性，不形成聚集體且不干預(yù)細(xì)胞存活性和增殖能力(無細(xì)胞毒性)?？傊景l(fā)明首次公開了作為抗病毒化合物應(yīng)用的肽，其基于作為感染成功的必需步驟的病毒通過其結(jié)合動力蛋白DLC8的序列(全部或部分)而設(shè)計，并且那些肽表現(xiàn)出有效抑制易受影響的細(xì)胞中的病毒感染，且具有可證明的抗病毒作用。病毒-DCL8相互作用的抑制反映在對病毒致細(xì)胞病變作用的抑制和感染的細(xì)胞數(shù)目的急劇減少。此外，定量測量該化合物的抗病毒作用，以利用定量PCR關(guān)于每細(xì)胞病毒基因組拷貝數(shù)的減少(這反映在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的以ng/μ1為單位的病毒復(fù)制的減少)而比較它們的相關(guān)功效，并且還測量因此引起的病毒生產(chǎn)和病毒蛋白合成的顯著減少。本發(fā)明由基于多種ASFV分離株的p54序列產(chǎn)生的肽所示例，所述肽防止感染繼續(xù)進(jìn)展，成為抗病毒治療的基礎(chǔ)。附例圖1.抗病毒肽設(shè)計?；趤碜圆煌瑏碓吹牟煌《痉蛛x株中存在的病毒ASFV蛋白P54的序列分析比較，我們設(shè)計一組肽(表1)，其包括保守基序，且在實(shí)際存在于病毒蛋白中在不同病毒分離株之間具有變異的那些中選擇最有利的側(cè)翼序列。圖2.活性肽的相互作用和中斷的NMR動力學(xué)。A.用于NMR分析的15_N標(biāo)記的DLC8的獲得(obtention)和純化。15N-標(biāo)記的DLC8在不同滴定點(diǎn)的1H-15NHSQC譜；B，游離DLC8；C,游離DLC8(黑色光譜)和使用2eq未標(biāo)記的p54(灰色光譜)；D，游離DLC8(黑色光譜)和使用5eq的肽PS19(SEQIDNO2)和2eq未標(biāo)記的p54(灰色光譜)；E，游離DLC8(黑色光譜)使用5eq肽PS19和2eq未標(biāo)記的p54(灰色光譜)和使用2eq未標(biāo)記的p54(灰色光譜)。圖3.肽向細(xì)胞中內(nèi)在化的證明。螢光素標(biāo)記的肽C0VA2(SEQIDNO:7)在非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞中的分布，所述非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞用不同濃度的連接富含精氨酸的分子轉(zhuǎn)運(yùn)體(C0VA2)的肽構(gòu)建體溫育1和3小時。在100μM肽濃度，F(xiàn)ITC-標(biāo)記的肽(C0VA2)在100%的細(xì)胞中內(nèi)在化。圖4.細(xì)胞病毒感染和通過本發(fā)明的肽COVAl(SEQIDNO6)的作用對所述感染的抑制的圖解。1.“前一天晚上在5%DMEM中以9xl04/cm2的密度培養(yǎng)的非洲綠猴腎株系細(xì)胞。2.-在37°C1小時內(nèi)以0-100μM的范圍向DMEMSC中加入300μ1不同肽的溶液，用于肽的內(nèi)在化。3.-1"細(xì)胞8471￥進(jìn)行感染。4.-在37°C吸附2小時。5.-用IlmlDMEMSC洗滌2次消除殘余的病毒。6.-在DMEM+肽中感染后6-18小時的感染過程。7.-檢測被感染的細(xì)胞。圖5.通過致細(xì)胞病變效應(yīng)比較抗病毒和對照肽的抗病毒活性。通過常規(guī)顯微鏡方法(IOOx放大倍數(shù))展示ASFV在下列條件下的致細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制在第1和2列中存在上升濃度的抗病毒肽(RS27-SEQIDNO3-和PS19-SEQIDNO:2_)，在第3和4列中為對照(RS28-SEQIDNO5-和SS20-SEQIDNO:4_)，且在第5列中不存在肽。圖6.抗病毒肽治療和通過免疫熒光檢測感染的細(xì)胞數(shù)目。圖6A顯示在感染后6小時(6hpi)用增加濃度的標(biāo)記有針對ASFVp30的抗體的抑制劑(C0VA2-SEQIDNO-J-)和對照(RS28)肽溫育的感染細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。B顯示用5μM和50μMC0VA2和RS28肽溫育的感染細(xì)胞的免疫熒光測定的代表性照片。圖7.抗病毒肽治療和病毒蛋白合成。用不同濃度的COVAl(SEQIDNO:6)肽分析早期(ρ30)和晚期(ρ72)蛋白合成1和3小時。Α，表示ρ30和ρ72蛋白的代表性蛋白質(zhì)印跡凝膠，和B表示通過密度計量學(xué)對ρ30和ρ72蛋白的定量。圖8.抗病毒肽治療和通過定量PCR定量ASF病毒DNA。與對照肽RS28相比較，在用增加濃度的抑制劑肽(C0VA1,PEPl-SEQIDNO:9_和PEP3-SEQIDNO:8_)處理后對感染后16小時(16hpi)的ASFVDNA復(fù)制的影響。該圖中還顯示包含其它DLC8結(jié)合序列的肽(PEP1和PEP3)，表明COVAl序列從較低的肽濃度就是有效的。圖9.抗病毒肽在病毒生產(chǎn)中的作用。與對照肽RS28(白色長方形)相比較，對在感染后36小時(36hpi)用增加濃度的抑制劑肽COVAl(黑色長方形)后恢復(fù)的細(xì)胞內(nèi)(A)和細(xì)胞外(B)病毒滴度的作用。圖10.化合物不存在細(xì)胞毒性。在以不同濃度的抗病毒(COVAl)和對照肽(RS28)溫育36小時后沒有監(jiān)測到非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞的增殖指數(shù)。圖11.在肽內(nèi)在化后細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保留。用不同濃度的C0VA2肽處理非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞1和3小時的代表性共聚焦顯微鏡照片。照片顯示未處理的細(xì)胞中的保守微管細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)(微管蛋白)(左列)，和在用增加濃度的標(biāo)記有FITC的肽處理的細(xì)胞中的保守微管細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)(微管蛋白)(右列)。圖12.在有絲分裂過程中形態(tài)保留和紡錘體形成。用對照㈧和抑制劑肽COVAl(B)處理的非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞的代表性共聚焦顯微鏡照片。在對照(A)和(B)肽處理的細(xì)胞中，在細(xì)胞分裂的不同階段中形成有絲分裂紡錘體的微管蛋白纖維。細(xì)胞存活力和增殖能力不受肽處理的影響。圖13.螢光素標(biāo)記的C0VA2肽的細(xì)胞分布模式。肽結(jié)合DLC8的一個貨物位點(diǎn)，并且熒光肽與DLC8精確地共定位在其動力區(qū)室中，諸如細(xì)胞凸出物(cellprojections)(A)，細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸位點(diǎn)(A)和有絲分裂后子代細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(B)，在那里DLC8在細(xì)胞分裂后行使重新配置細(xì)胞器的功能。發(fā)明描述基于在來自不同來源的不同病毒分離株中存在的病毒ASFV蛋白p54的序列分析比較，我們設(shè)計一組肽(表1)，其包括在大部分病毒分離株中是保守的共有序列和最便利的側(cè)翼序列，在側(cè)翼序列中，在不同病毒分離株之間蛋白存在變異(圖1)?？紤]長度、疏水性和脯氨酸含量。脯氨酸可以在溶液和聚集體中進(jìn)行順式/反式異構(gòu)化。一旦我們已經(jīng)選擇了一組肽，我們就合成我們通過它們的氨基酸組成預(yù)測是可溶的和穩(wěn)定的那些，并且用將它們遞送至細(xì)胞的序列標(biāo)記它們，然后我們通過下述方法繼續(xù)檢測那些肽。核磁共振(NMR)技術(shù)允許深入分析不同蛋白之間的相互作用表面。在本發(fā)明中，通過NMR分析了ASFV蛋白p54和動力蛋白輕鏈(DLC8)之間的相互作用。這一分析已經(jīng)提供了可以詳細(xì)了解所述相互作用的數(shù)據(jù)，認(rèn)為兩種蛋白和兩種相互作用表面的三維結(jié)構(gòu)允許精煉最適肽序列，以覆蓋參與相互作用的殘基。獲得DLC8的NMR譜，并且評估在存在增加濃度的病毒P54的條件下，這些光譜怎樣被修正(化學(xué)遷移)，這指示兩種蛋白之間的高親和性相互作用。因?yàn)樗鼈儏⑴c相互作用，所以可以確定由在所述光譜上消失的DLCSS基組成的蛋白活性中心。這些殘基如下Trp54，Lys9，Ser88，Asn61，Asn23，Asn33，Gly59，Ser86,Arg60,Glul5，和Tyr75。然后我們能夠選擇可以結(jié)合并且覆蓋包含在相互作用表面中的肽，然后檢測哪些能夠通過阻斷這一高親和性相互作用而防止任意濃度的病毒蛋白P54的任何進(jìn)一步的結(jié)合。本發(fā)明證明所述病毒蛋白與細(xì)胞動力蛋白正確的相互作用對于感染是至關(guān)重要的，感染必須包括病毒由膜到核周區(qū)域(在與微管組織中心或MTOC相對應(yīng)的區(qū)域，在那里在健康細(xì)胞中發(fā)生DLC8的最大聚集)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，并且在感染ASFV的情形中，其是病毒工廠所在的位置，并且在那里合成待裝配的病毒蛋白且產(chǎn)生新的病毒體。近來，利用上述NMR進(jìn)行的研究以使在我們實(shí)驗(yàn)室中可以證明提前向DLC8中加入包括在p54中存在的相互作用序列TyrThrThrThrvalThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr(SEQIDNO13)的肽來防止p54與DLC8結(jié)合是可能的。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案由通過利用病毒蛋白序列，或其部分，來阻礙病毒在感染過程中對動力蛋白的使用從而阻礙感染組成，在某些情形中，通過病毒蛋白-動力蛋白鍵合的抗病毒肽拮抗劑來飽和細(xì)胞蛋白的結(jié)合位點(diǎn)而進(jìn)行。在所述肽內(nèi)，本發(fā)明已經(jīng)在使用肽序列對任何來源的細(xì)胞的處理中證明它們干預(yù)病毒蛋白與輕鏈動力蛋白的作用，例如，包含14個氨基酸的那些=TyrThrThrThrvalThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr(SEQIDNO13)，其包括在所述序列和在不同動物病毒的序列類似物或該肽的功能類似物中的保守氨基酸改變。發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基序(維持p54-DLC8，ThrAlaSerGlnThr-SEQIDN0:14_之間的相互作用的氨基酸序列)的側(cè)翼序列的疏水性改變肽結(jié)合DLC8的能力。肽序列的設(shè)計必須考慮所述肽應(yīng)該在位于DLC8三維結(jié)構(gòu)所示的疏水峽谷中的特定位點(diǎn)結(jié)合DLC8?？紤]到預(yù)期結(jié)合DLC8的理論序列的事實(shí)，S卩，在體外它們中的一些結(jié)合，另一些不能結(jié)合DLCSjB上述所解釋，本發(fā)明利用NMR繼續(xù)進(jìn)一步精煉所述肽序列，并且選擇了一組抑制劑肽。我們證明P54-DLC8相互作用是高親和性相互作用，如由它們的NMR相互作用動力學(xué)所定義的那樣。然而，我們能夠加入某些肽而阻斷該高親和性相互作用，這首次表明可以用給定的肽序列(表1)干預(yù)鍵合而阻斷P54-DLC8相互作用。所選擇的最佳肽序列能夠阻斷所述相互作用，而另一些用作對照肽，所述對照肽不改變NMR分析的P54和DLC8之間的相互作用動力學(xué)。本發(fā)明的方法近似法還包括用任意來源的包括任意前述序列或在所述序列中具有保守氨基酸改變的肽序列的任何治療。它們包括那些序列的所有保守轉(zhuǎn)化和目前目的為將這些肽轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)部的所有已知的機(jī)制，例如與易位至細(xì)胞內(nèi)部的序列連接的任意月太(氛基己酸(aminocaproicacid)或氛基己塊酸(aminohexinoicacid)添力口,等)；月旨質(zhì)體或作用為將所述肽內(nèi)在化在細(xì)胞中的任何其它媒介物，如載體，特別是病毒載體如腺病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒，質(zhì)粒，等等，優(yōu)選與標(biāo)記序列連接的那些載體。用肽治療的目的是將它們與下列各項預(yù)溫育，而飽和使用與動力蛋白連接的轉(zhuǎn)運(yùn)體的動力蛋白結(jié)合基序動力蛋白輕鏈，DLC8蛋白，或其中包含的任何氨基酸序列，或包含基序(Lys/Arg)XThrGlnThr或Gly(IleAal)GlnValAsp)的任意肽，或衍生于其具有氨基酸的保守改變的序列。保守改變定義為不改變蛋白的負(fù)荷、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)或形成的那些。類似地，本發(fā)明包括與其它肽序列、肽轉(zhuǎn)運(yùn)體等連接的或與脂質(zhì)體或其它媒介物一起提供的任一種前述肽，以使所述肽在細(xì)胞中內(nèi)在化，和通常，在對于任何來源的細(xì)胞目前已知的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中內(nèi)在化。發(fā)明詳述因此，本發(fā)明的目的是選自來自不同病毒分離株的P54序列的肽的抗病毒組合物，其能夠與病毒蛋白競爭結(jié)合DLC8。特別地，那些肽必須有效防止所述蛋白和病毒與DLC8在體外和體內(nèi)的結(jié)合，并且因此，以抑制病毒感染。在那些肽中，可以選擇與參與病毒蛋白-DLC8相互作用的序列有關(guān)的肽，不管是由病毒蛋白序列分離的還是DLC8序列本身。衍生于其的任何肽，特別是具有保守氨基酸取代，也將包括在本發(fā)明中[14:Tayl0r，W.R.]。所選的肽，除了抑制病毒_蛋白與DLC8的相互作用之外，在與針對其尋找抗病毒保護(hù)的細(xì)胞溫育時必須不表現(xiàn)出毒性。此外，參與病毒蛋白與DLC8結(jié)合的大部分分離的肽，或由病毒蛋白或由動力蛋白輕鏈(DLC8)分離的，表現(xiàn)出聚集且形成二聚體的傾向。當(dāng)那發(fā)生時，它們的結(jié)合能力是低得多的，并且可以甚至消失。二聚體形成和/或聚集可以通過考慮疏水性、總長和脯氨酸含量而改變那些肽序列中的一些氨基酸而便利地避免。本發(fā)明還研究了那些改變，并且已經(jīng)選擇了一個肽家族，其通過與DLC8高親和性競爭結(jié)合而阻礙病毒結(jié)合DLC8，不表現(xiàn)出聚集或二聚體形成，且在必須防止或治療病毒感染的細(xì)胞中具有低毒性。另外，所選擇的肽具有Arg尾，例如，8個Arg，以促進(jìn)那些肽進(jìn)入必須防止或治療病毒感染的細(xì)胞內(nèi)部。所選的肽家族(PS19，COVAl，C0VA2,PEPl和PEP3)，它們均衍生于與負(fù)責(zé)與DLC8結(jié)合的P54相關(guān)的序列部分。本發(fā)明的肽家族由SEQIDNO14表示，并且包括通過在SEQIDNO:14的至少一個氨基酸的保守取代而衍生于其的任何其它的肽。由于它們對細(xì)胞的無毒作用，由SEQIDNO1表示的肽亞族特別令人感興趣。本發(fā)明的抗病毒組合物，其包括SEQIDNO14或SEQIDNO:1表示的家族的至少一種肽，可以另外包括任何其它活性化合物和/或藥用賦形劑、載體或稀釋劑。其中可以用本發(fā)明的抗病毒組合物治療的病毒感染為ASFV，人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus)，腺病毒，昆蟲痘病毒A.moorei，痘苗病毒，呼吸道合胞病毒，人柯薩奇病毒，狂犬病毒，人單純皰疹病毒，Mokola病毒或AIDS病毒。本發(fā)明的另一個目的在于抗病毒化合物的選擇和其功效評估的方法，特征在于其包括a)用能夠結(jié)合DLC8的化合物預(yù)先溫育或預(yù)先混合用表達(dá)所述肽序列的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述化合物用適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)遞送序列標(biāo)記或與已知的遞送方法如脂質(zhì)體等組合；b)將病毒與在步驟a)預(yù)先溫育或混合的細(xì)胞培養(yǎng)物接觸；c)在一定時間后檢測并定量細(xì)胞內(nèi)病毒感染的水平；d)將所述病毒感染水平與在沒有與能夠結(jié)合DLC8的化合物預(yù)先溫育或預(yù)先混合的感染該病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物中達(dá)到的病毒感染水平進(jìn)行比較。本發(fā)明的另一個方面在于抗病毒化合物的選擇和其功效評估的方法，特征在于其包括a)將病毒與包括能夠結(jié)合DLC8的序列、其部分序列或通過保守置換序列中或其部分序列中的至少一個氨基酸產(chǎn)生的能夠結(jié)合DLC8的類似序列的化合物預(yù)先溫育或預(yù)先混合；b)將細(xì)胞培養(yǎng)物與步驟a)中預(yù)先溫育或預(yù)先混合的病毒接觸；c)在一定時間后檢測并定量細(xì)胞內(nèi)病毒感染的水平d)將所述病毒感染水平與在沒有用步驟a)的化合物預(yù)先溫育或預(yù)先混合的感染該病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物中達(dá)到的病毒感染水平進(jìn)行比較。此外，本發(fā)明的另一個目的涉及對細(xì)胞內(nèi)與動力蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)的病毒途徑的研究。本發(fā)明還涵蓋特征在于將能夠結(jié)合DLC8的一組肽標(biāo)記的研究方法，其可以例如，通過直接熒光顯微鏡檢測?？梢赃x擇下列各項作為在細(xì)胞研究中可用的任何標(biāo)志標(biāo)記螢光素、羅丹明或其它熒光和非熒光標(biāo)記如生物素，血細(xì)胞凝集素，c-myc，等等...優(yōu)選用作標(biāo)記，其用于利用二抗的檢測，等等。最后，本發(fā)明還涉及通過測量輕鏈動力蛋白(DLC8)光譜變化而評估對配體與DLC8結(jié)合的抑制的方法。下述實(shí)施例是實(shí)施本申請中包含的相關(guān)發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且在不限制范圍的目的前提下提供，僅是為了允許本領(lǐng)域技術(shù)人員在無需過多的努力的條件下再現(xiàn)那些相關(guān)的方法。實(shí)施例通過防止p54和8kDa的細(xì)胞動力蛋白輕鏈(DLC8)之間的相互作用的肽而抑制非洲豬瘟病毒(ASFV)感染。1.1.材料1.1.1所用的細(xì)胞系和培養(yǎng)基在該實(shí)施例中，使用非洲綠猴腎細(xì)胞系作為模型。在該建立的細(xì)胞系中進(jìn)行肽的感染和內(nèi)在化檢測，所述細(xì)胞下在培養(yǎng)物中非整倍體和不確定生長。其來源于成年非洲綠猴腎臟(Cercopithecus)，且其獲自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures)(ECACC)，保藏號為84113001。它們的形態(tài)學(xué)是成纖維細(xì)胞類型的，并且其總是以少于20個步驟使用，在使用它們之前將它們冷凍且整分保存在液氮中。該細(xì)胞系使用Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Lonza)進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了5%在56°C滅活30分鐘的胎牛血清(BFS，Lonza)，4mM谷氨酰胺(Invitrogen)，200IU/ml青霉素和IOOmM鏈霉素(Invitrogen)。細(xì)胞的培養(yǎng)條件為37°C和5%CO2的氛圍。常規(guī)地，這些細(xì)胞一周兩次以16進(jìn)行傳代培養(yǎng)，生長在Easy-T-Flasks培養(yǎng)瓶中，用Nunclon(Nunc)包被75cm2。取決于特定的檢測需要，以一些形式補(bǔ)充DMEM培養(yǎng)基。因此，當(dāng)其以不含抗生素、谷氨酰胺或SBF進(jìn)行使用時，我們稱為DMEMSC。當(dāng)加入SBF百分?jǐn)?shù)時，我們稱為2%DMEM，以該百分?jǐn)?shù)維持其它添加劑處于前段提及的濃度。對于瓊脂糖平板，使用Dulbecco2X(Gibco)培養(yǎng)基。1.1.2.所用的病毒分離株在感染抑制檢測中所用的非洲豬瘟病毒分離株為BA71V，其適合在非洲綠猴腎細(xì)胞系中生長[4]。病毒儲液以100μ1的整分試樣在-80°C保存在補(bǔ)充了15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。在使用它們時，將所需要的整分試樣在37°C在水浴中迅速解凍，并且置于冰上。1.1.3.所用的替代材料·Iml容量低溫管(Nalgene)以在液氮中保存整分的病毒分離株和保存非洲綠猴腎細(xì)胞系?！ぷ畲笕萘繛?000，200和20μ1的微量移液管(Gilson)。·1000,200和20μ1容量的具有濾器和不含RNA酶的微量移液管頭(Arc)，以避免可能的污染。·不含RNA酶的1.5ml容量管(Eppendorf)?！?，6，12和24孔的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc)?！ぶ睆絠anrn的蓋玻片(GeverLabs)?！こＲ?guī)三角載玻片(GeverLabs)?！び糜诘鞍椎南趸w維素膜，9x7cm(GE衛(wèi)生保健(GEHealthcare)).·Whatman紙，9x7cm。1.1.4.所用的抗體和色原·抗-p30單克隆抗體其在Dr.JoseAngelMartinezEscribano實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生，特異性識別和檢測ASFV的早期蛋白p30。·抗-DLC8多克隆抗體，在用與10個組氨酸殘基結(jié)合的DLC8蛋白免疫的兔中獲得，與10個組氨酸殘基結(jié)合的DLC8蛋白在大腸桿菌(E.coli)異源系統(tǒng)中表達(dá)，并且后來純化。其在我們實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生。抗-α微管蛋白單克隆抗體(西格瑪(Sigma))?？?p72單克隆抗體(抗-p73)由Ingenasa市售，特異性識別和檢測ASFV的結(jié)構(gòu)晚期蛋白，主要是P72或p73。與Alexa594熒光團(tuán)(分子探針(MolecularProbes))綴合的小鼠抗IgG抗體。與Alexa488熒光團(tuán)(分子探針(MolecularProbes))綴合的小鼠抗IgG抗體?！づcHRP過氧化物酶(GE衛(wèi)生保健(GEHealthcare))綴合的小鼠抗IgG抗體?！づcHRP過氧化物酶(GE衛(wèi)生保健(GEHealthcare))綴合的兔抗IgG抗體。1.1.5.其它試劑·TritonX_100(西格瑪(Sigma))·吐溫20.(西格瑪(Sigma))·磷酸鹽緩沖液(PBS)*BSA，牛血清白蛋白(西格瑪(Sigma))·ECL化學(xué)發(fā)光試劑(GE衛(wèi)生保健(GEHealthcare))·不含RNA酶的水(Ambion)·RNAseZAP溶液(Ambion)，以消除工作表面和材料的RNA酶活性·ProLong，封固試劑(mountingreagent)，以保存熒光)·Hoechst3332(西格瑪(Sigma))，作為核酸的插入生色劑·β-巰基乙醇，SDS,Tris堿(西格瑪(Sigma))‘NP-40(Fluka)·NaCl(Duchefa^.itMM(Duchefabiochemicals))·超純低熔點(diǎn)瓊脂糖(Invitrogen)1.1.6.所用的肽設(shè)計不同的肽，其包含前述ASFVP54蛋白中的DLC8結(jié)合基序，設(shè)計不相關(guān)序列的另一系列肽用作陰性對照(RS27和SS20肽)。所有這些記述在表1中。在一些肽中，包括一些修飾，諸如下述·在N端添加8個精氨酸殘基(R),目的是增加肽在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)在化[6](RS27；RS28；COVAl；C0VA2；PEP3；PEP1).·在N端與螢光素綴合，以便通過熒光顯微鏡直接顯現(xiàn)其(C0VA2；PEP3；PEP1).·置換特定殘基，以促進(jìn)肽的溶解且避免其聚集(C0VA1，C0VA2,PEPl和PEP3)將ThrAlaSerGlnThr基序內(nèi)的殘基置換為保持p54與DLC8的相互作用能力的另一些殘基(PEP3K1]。在本實(shí)施例中所用的所有設(shè)計的肽由Sigma-Genosys合成。其純化通過HPLC進(jìn)行，在所有情形中獲得大于90%的純度。一旦合成和純化，在實(shí)驗(yàn)室中得到作為凍干物的所述肽。表1.實(shí)施例1中所用的肽的列表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(1)包含p54中存在的針對DLC8的結(jié)合序列。(2)與螢光素綴合。(3)包含關(guān)于p54中存在的針對DLC8的結(jié)合序列的改變，以避免所述肽的聚集和二聚體化。(4)包含8x精氨酸序列，以促進(jìn)在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)在化。(5)陰性對照(6)在p54中存在的DLC8結(jié)合基序中的置換，其不改變兩種蛋白之間的結(jié)合。1.2.方法1.2.1序列比較分析將存在于不同領(lǐng)域和ASF病毒的實(shí)驗(yàn)室分離株中的p54序列(存放在Genebank(NCBI))標(biāo)示在BLAST數(shù)據(jù)庫中，并且用局部比對搜索工具(LocalAlignmentSearchTool)進(jìn)行比較。從來自不同分離株的不同序列選取保守基序和最合適的側(cè)翼序列。對于該肽設(shè)計，考慮長度、疏水性和脯氨酸含量。脯氨酸可以在溶液和聚集體中進(jìn)行順式/反式異構(gòu)化。肽的親水性質(zhì)也可能是難以純化且難以促使沉淀的。一旦我們已經(jīng)設(shè)計了該組肽，我們選擇合成通過其氨基酸組成預(yù)測是可溶的且穩(wěn)定的那些，并且用將它們遞送至細(xì)胞的序列(如下文詳述，8個精氨酸尾)標(biāo)記它們。1.2.2.核磁共振在用N15標(biāo)記并純化ASFV蛋白p54和DLC8后獲得核磁共振光譜。本研究所用的方法稱為化學(xué)位移改變。首先，純化兩種蛋白，并且將光譜與Lo等人于1998年關(guān)于DLC8報道的那些光譜進(jìn)行比較(圖2)。1.2.3肽的處理按照其分子量(見表1)，將肽重懸在具有相對應(yīng)的純度mQ且無菌的H2O體積中，以獲得濃度為5mM的儲液。要特別注意避免溶液渾濁，并且槍頭總是與濾器一起使用，以避免可能的交叉污染。制成20μ1整分試樣，并且保存在-80°C直至使用時。使用其時，在冰上緩慢解凍。由儲液在DMEMSC培養(yǎng)基中以0_100μM的濃度范圍制備肽的工作溶液，制備總是在無菌條件下進(jìn)行，且在將其加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中之前立即制備以避免其降解。1.2.4在細(xì)胞培養(yǎng)物中由肽阻斷P54-DLC8相互作用在實(shí)驗(yàn)的前夜在24-孔板中培養(yǎng)9xIO4Vero非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞。次日上午，將細(xì)胞在DMEMSC中洗滌，并且用300μ1含有不同濃度的不同肽的溶液替換已有的培養(yǎng)基。在37°C和5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞與該肽一小時，而后用ASFV感染所述細(xì)胞。為了感染細(xì)胞，取出已有的細(xì)胞培養(yǎng)物，并且將其替換為含有對應(yīng)量的2%350μ1/孔，以獲得1個噬斑形成單位(pfu)/細(xì)胞的感染系數(shù)。允許感染在37°C和5%CO2進(jìn)行至需要的時間。在吸附期(在37°C2小時)后，通過用DMEMSC洗滌兩次而去除殘留的病毒，最后將細(xì)胞置于300μ1含有相應(yīng)濃度的肽的新鮮DMEMSC中。在每次實(shí)驗(yàn)中，允許感染在37°C進(jìn)行需要的時間，這取決于要分析的感染的參數(shù)。該過程示意性表示在圖4中。1.2.5通過間接免疫熒光(IIF)檢測ASFV感染的細(xì)胞在感染后6小時進(jìn)行檢測先前暴露于不同肽的細(xì)胞中ASFV感染的細(xì)胞。所用的通過免疫熒光檢測ASFV感染的那些細(xì)胞的IIF技術(shù)是常規(guī)技術(shù)。概言之，用ImlPBS洗滌細(xì)胞，然后用3.8%PBS-低聚甲醛溶液在環(huán)境溫度下固定10分鐘。然后，通過用ImlPBS洗滌細(xì)胞3次而去除殘余的低聚甲醛。使用0.2%PBS-TritonX-100在環(huán)境溫度下進(jìn)行細(xì)胞膜的滲透15分鐘。再用PBS洗滌3次后，將細(xì)胞在37°C在封閉溶液(3%PBS-BSA)中溫育45分鐘。當(dāng)檢測病毒抗原時，選擇ASFVp30的早期蛋白[5]，并且使用1200稀釋在PBS中的抗-p30抗體在37°C進(jìn)行其檢測1小時。將細(xì)胞用PBS洗滌3次，并且將其用1300稀釋在PBS中的小鼠抗-IgG抗體的溶液在環(huán)境溫度下溫育30分鐘。將細(xì)胞在PBS中洗滌，并且最后結(jié)合用Hoechst3332標(biāo)記的核仁。最后，使用Prolong作為封固介質(zhì)將包含所述細(xì)胞的蓋玻片封固在載玻片上。在常規(guī)熒光顯微鏡(Leica)下觀察該制備物，以計數(shù)針對病毒抗原P30陽性的細(xì)胞數(shù)目。1.2.6^ASFV感染i寸禾旱中誦過屈白質(zhì)印跡分析病毒蛋白的合成待分析的病毒蛋白受試者是在感染開始階段表達(dá)的早期ASFVp30蛋白[5]和在感染晚期階段表達(dá)的P72蛋白(有時還稱為p73)[7，8]。對所述細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，所述細(xì)胞用Iml冷PBS洗滌，然后收集在50μ1冷凍RIPA蛋白提取緩沖液(150mMNaCl,5mMβ-巰基乙醇，1%ΝΡ40,1%SDS和50mMTris-HClpH=8)中。將其在軌道攪拌條件下在4°C溫育20分鐘，以溶解該蛋白，然后將其在臺式離心機(jī)中在4V以12，OOOrpm離心10分鐘。棄掉沉淀，收集上清，將上清保存在-70°C直至通過蛋白質(zhì)印跡對其進(jìn)行分析時。將樣品在冰上解凍，并且通過Bradford法定量不同樣品中的蛋白質(zhì)量。通過在15%丙烯酰胺二丙烯酰胺凝膠中在100V恒定電壓下電泳90分鐘而分離20μg在100°C5分鐘完全變性的蛋白。在存在轉(zhuǎn)移緩沖液(Tris-甘氨酸，20%甲醇)的條件下，在100V恒壓下90分鐘，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。在存在50ml5%脫脂PBS-奶粉的條件下，在環(huán)境溫度和軌道旋轉(zhuǎn)下，封閉該膜至少1小時。然后，將該膜與150稀釋在PBS中的IOml抗-DLC8多克隆抗體在環(huán)境溫度和攪拌下雜交1小時。此后，將該膜在環(huán)境溫度下用20ml0.05%PBS-Tween洗滌3次，每次15分鐘。在環(huán)境溫度和攪拌下，用綴合至過氧化物酶上且14000稀釋在PBS中的二級兔抗-IgG抗體溫育持續(xù)1小時。已完成之后，將該膜用0.005%PBS-吐溫洗滌3次，每次15分鐘。最后，按照供應(yīng)商的使用說明以常規(guī)方式進(jìn)行利用ECL的化學(xué)發(fā)光檢測。使用來自暴露于或未暴露于不同肽且后來感染或未感染ASFV16小時的非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞的總可溶蛋白提取物作為分析的起始樣品。在獨(dú)立的膜中，使用1100稀釋在PBS中的抗-p30單克隆抗體和12000稀釋在PBS中的抗-p72單克隆抗體作為一級抗體。將膜用兩種抗體在室溫和軌道攪拌下溫育1小時。在兩種情形中，使用綴合至過氧化物酶上的小鼠抗-IgG抗體作為二級抗體。最后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的密度計量，以定量和相對描述在所檢測的每條條帶中存在的蛋白的量。1.2.7檢測和定量ASFV基因組通過使用特定的寡核苷酸(SEQIDNO10和SEQIDNO11)和TaqMan探針(SEQIDNO12)的定量實(shí)時PCR實(shí)現(xiàn)對ASFV基因組的檢測和定量。在感染后16小時(16hpi)用DNeasy血液和組織試劑盒(DNeasybloodandtissuekit)(Qiagen)提取并純化用BA71V0.5pfu/細(xì)胞感染的或假感染的細(xì)胞的DNA。通過測量260nm處的吸光度(A26tl)估算DNA濃度和純度。在冰上制備擴(kuò)增混合物，如下3口1模板0嫩(1口8).1μ1寡核苷酸0E3F50pmol.1μ1寡核苷酸0E3R50pmol.10μ1QuantimixEasy工胃(QuantimixEasyProbesBiotools)2X.1μ1TaqMan探針SE25pmol.4μ1H2O.擴(kuò)增反應(yīng)在RotorGene6000(CorvetteResearch)中進(jìn)行，如下表所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>在測定中包括陽性擴(kuò)增對照(由ASFV病毒體純化的DNA)和陰性擴(kuò)增對照(來自假感染的細(xì)胞的DNA)，并且每份樣品分析一式兩份。1.2.7.在ASFV感染過程中肽處理對病毒后代產(chǎn)生的影響在實(shí)驗(yàn)前夜在24-孔板中接種9xIO4非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞。在感染前1小時，將細(xì)胞在300μ1包含不同濃度的C0VA1或RS28肽的DMEM中溫育。然后，將細(xì)胞用0.5pfu/細(xì)胞的ASFVBA71V毒株進(jìn)行感染或假感染。在感染后36小時(36hpi)，從孔中收集100μ1培養(yǎng)基，并且保存在-80°C直至分析細(xì)胞外病毒后代。還將感染的細(xì)胞收集在100μ1新鮮DMEM中。將細(xì)胞冷凍并且解凍三次，以能夠增溶胞內(nèi)病毒后代，然后保存在-80°C備用。通過噬斑測定法分析來自胞內(nèi)或胞外樣品的病毒滴度。簡言之，將接種在6-孔板中的非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞單層用500μ1含有病毒后代的10倍連續(xù)稀釋的樣品溫育。在90分鐘吸附時間后，將細(xì)胞在新鮮DMEM5%中洗滌兩次，并且向細(xì)胞中加入3ml/孔的覆蓋物(低熔點(diǎn)瓊脂糖2%和DMEM2X,νν)。當(dāng)覆蓋物變成固體時，將平板在37°C和5%CO2下溫育12天。然后，將細(xì)胞用在5%甲醛中的結(jié)晶紫染色，以能夠顯現(xiàn)病毒噬斑。計算病毒滴度，如下pfu/ml=2xn°噬斑χ10稀釋倍數(shù)1.2-9細(xì)胞毒性分析。細(xì)胞存活力和增殖測定為了評估細(xì)胞存活力，將接種在24孔板中的非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞在含有濃度在0-100μM范圍內(nèi)的抑制劑肽C0VA1或陰性對照RS28的DMEM中溫育。在用肽溫育24小時后，收集細(xì)胞，并且通過Tripanblue(西格瑪(Sigma))染色排除測定法確定細(xì)胞混懸液中存在的存活細(xì)胞數(shù)目。簡言之，將20μ1含有0.08%TripanBlue的PBS加入當(dāng)?shù)润w積的細(xì)胞混懸液中并且混合。2分鐘后，使用血細(xì)胞計數(shù)器和常規(guī)光學(xué)顯微鏡計數(shù)藍(lán)色細(xì)胞(死細(xì)胞)。為了評估細(xì)胞增殖，將接種在96孔板中的3xl04非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞在50μ1含有濃度在0-100μM范圍內(nèi)的抑制劑肽C0VA1或陰性對照RS28的DMEM中溫育。溫育36小時后，使用CellTiter96Aqueous(Promega)測定法，按照供應(yīng)商的使用說明，確定細(xì)胞增殖。1.3.結(jié)果1.3.1抗病毒肽設(shè)計將存在于不同地域和實(shí)驗(yàn)室的ASF病毒分離株中的p54序列標(biāo)示在數(shù)據(jù)庫中，并進(jìn)行比較?；谠趤碜圆煌瑏碓吹牟煌《痉蛛x株中存在的病毒ASFV蛋白p54的這一序列分析比較，我們設(shè)計了一組肽(表1)，其包括在大部分病毒分離株中保守的共有序列和最便利的側(cè)翼序列，在側(cè)翼序列中在不同病毒分離株之間蛋白存在變異(圖1)。對于肽設(shè)計，考慮長度、疏水性和脯氨酸含量。脯氨酸可以在溶液和聚集體中進(jìn)行順式/反式異構(gòu)化。肽的疏水性質(zhì)也可能是難以純化且難以促使沉淀的。一旦我們已經(jīng)設(shè)計了該組肽，我們選擇合成通過其氨基酸組成預(yù)測是可溶的且穩(wěn)定的那些，并且用將它們遞送至細(xì)胞的序列(如下文詳述，8個精氨酸尾)標(biāo)記它們，然后我們通過下述方法繼續(xù)檢測這些肽。1.3.2.通過其核磁共振光譜分析相互作用表面在用N15標(biāo)記并純化兩種蛋白后獲得核磁共振光譜。本研究所用的方法稱為化學(xué)位移改變。該方法分析當(dāng)目標(biāo)蛋白與配體相互作用時在目標(biāo)蛋白中觀察到的化學(xué)改變。首先，純化兩種蛋白，并且將光譜與Lo等人于1998年(13)關(guān)于DLC8報道的那些光譜進(jìn)行比較(圖2A)。在存在增加濃度的ASFV蛋白p54的條件下，DLC8光譜改變，并且結(jié)合基序包含的信號漸進(jìn)消失。在0.Ieq的p54濃度下，最先消失的信號對應(yīng)于殘基W54，K9，S88，N61，N23。當(dāng)達(dá)到0.3eq的濃度時，消失的信號對應(yīng)于殘基N33，G59，N23,S86，R60,E15，yY75(圖1A)。在DLC8和P54之間觀察到的相互作用過程的緩慢交換表明這些蛋白之間的結(jié)合以高親和力發(fā)生。然而，當(dāng)加入某些肽時，我們能夠干涉該高親和力的相互作用，并且在任意濃度的P54的條件下，沒有觀察到在來自蛋白活性中心的上述提及的任意殘基中的DLC8光譜改變(圖2B)，這首次表明該相互作用可能被給定的肽序列(表1)有效阻斷了。1.3.3.肽在非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞中的內(nèi)在化參考書目描述了在肽末端添加精氨酸殘基顯著增加它們對細(xì)胞內(nèi)部的穿透性。對于所述目的，我們結(jié)合由8個精氨酸組成的胞內(nèi)遞送轉(zhuǎn)運(yùn)體。為了檢驗(yàn)所設(shè)計的肽高效在細(xì)胞內(nèi)部內(nèi)在化，在N端結(jié)合螢光素標(biāo)記。那些沒有精氨酸胞內(nèi)遞送轉(zhuǎn)運(yùn)體的肽不能進(jìn)入細(xì)胞，而結(jié)合了所述轉(zhuǎn)運(yùn)體尾的那些以微管連續(xù)模式有效地內(nèi)在化，并且在用該肽溫育1和3小時后，幾乎100%存在于培養(yǎng)物中的細(xì)胞被清楚地染色(圖3)。C0VA2肽滿足這一組特征，其包括先前在P54中記述的DLC8結(jié)合基序，并且其用于直接觀察在非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞中的內(nèi)在化。從圖3可以觀察到，該肽有效內(nèi)在化，對于其甚至在其加入后6小時通過直接熒光顯微鏡檢測是可能的。C0VA2肽的最適濃度為50和100μΜ，在兩種濃度之間無顯著區(qū)別?？梢詸z測25μM的C0VA2，盡管比以更高的濃度具有更大的難度，然而，較低的濃度，即，低于5μΜ，幾乎不能通過熒光顯微鏡檢測。1.3.4.通過阻斷p54-DLC8結(jié)合的肽抑制ASFV感染如在本實(shí)施例的方法部分詳述的，感染以lpfu/細(xì)胞在預(yù)先暴露于不同肽的非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞的單層ASFV上進(jìn)行。在存在肽的條件下時感染進(jìn)行，并且分析下述感染參數(shù)，以檢驗(yàn)待檢測的肽的抑制作用。1.3.4.1.肽對病毒感染的致細(xì)胞病變作用特征的影響ASFV感染在感染的細(xì)胞上產(chǎn)生損害，其是非常特征性的，并且通過常規(guī)的顯微鏡方法作為致細(xì)胞病變作用易于檢測到的。其在感染早期開始，并且最終導(dǎo)致進(jìn)展性的胞內(nèi)液泡化(vacuolization)、細(xì)胞輪廓變圓和感染細(xì)胞所附著的表面的分離[9]。我們在存在不同肽的條件下，在其中進(jìn)展感染的非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)物中評估了感染后18小時的普遍致細(xì)胞病變作用的存在或不存在。使用該方法，可以驗(yàn)證在用這樣的肽溫育的那些細(xì)胞培養(yǎng)物中對致細(xì)胞病變作用的抑制，所述肽在其序列中包含DLC8結(jié)合基序和促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的精氨酸序列。相反，那些暴露于對照肽或無精氨酸序列的肽的細(xì)胞發(fā)展與在正常發(fā)展感染的細(xì)胞中觀察到的相似的致細(xì)胞病變作用。如圖5所示，所觀察到的致細(xì)胞病變作用程度與所用的肽濃度成正比。因此，抑制致細(xì)胞病變作用的PS19肽濃度完全在25-100μM的濃度范圍之內(nèi)，但是低于25μM的濃度在抑制所述致細(xì)胞病變作用時不是有效的。下表總結(jié)對于所檢測的不同肽及其相應(yīng)的濃度抑制致細(xì)胞病變作用的能力。表2.在50在100DLC8結(jié)8χ精氨肽別名μΜ的μΜ的合基序酸I·C.Ε·I·C.Ε·PS19INTSTP1有%%%RS27INTSTP2有WWWSS20INTCTl%%%%RS28INTCT2%WCOVAlDNBLKlWWWWC0VA2DNBLK2WWWWPEPlDNBLK3WWWW<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>此外，具有那些修飾的、含有DLC8結(jié)合基序的肽保持肽的相互作用能力，并且證明在感染中抑制致細(xì)胞病變作用時是有效的。1.3.4.2.肽對感染細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)的影響通過計數(shù)ASFV感染的細(xì)胞(對抗原ρ30是陽性的)數(shù)目而分析肽的抑制作用。為了進(jìn)行此，在存在不同的抑制劑肽和對照肽的條件下，在病毒感染之前，溫育細(xì)胞，如在本實(shí)施例的方法部分詳述的那樣。如圖6所示，與在用對照肽RS28溫育的細(xì)胞中獲得的數(shù)據(jù)相比較，在感染之前用C0VA2肽溫育導(dǎo)致感染的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)的急劇減少。此外，該減少取決于所用的C0VA2肽的濃度。1.3.4.3.肽對病毒蛋白合成的影響使用特異性抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析早期和晚期ASFV蛋白的合成。因此，可以觀察到，在存在COVAl肽的條件下發(fā)生ASFV感染時，早期(ρ30)和晚期(ρ72)病毒蛋白的合成二者均劑量依賴性減少。此外，所述減少取決于添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中的COVAl的劑量(圖7).1.3.4.4.通過病毒基因組復(fù)制計數(shù)測量的肽的作用非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞用不同的肽濃度預(yù)先溫育，如前述，并且用BA71VASFV分離株感染。在感染后16小時(16hpi)收集細(xì)胞，并且通過定量實(shí)時PCR使用特異性TaqMan探針和寡核苷酸[11]分析ASFV基因組的復(fù)制。從圖8可看出，用抑制劑肽COVAl處理劑量依賴性強(qiáng)烈地減少ASFV基因組的復(fù)制。類似地，用其它阻斷肽(PEP1和PEP3)預(yù)先溫育，所述肽在DLC8結(jié)合基序中包含不影響P54-DLC8相互作用的改變，也導(dǎo)致ASFV基因組復(fù)制的減少，盡管用COVAl序列處理以較低的肽濃度(25μΜ)是有效的。病毒DNA復(fù)制在肽處理后的這種減少是這些肽對感染的抑制的結(jié)果。然后，通過該靈敏的定量方法，可以在所述肽內(nèi)確定可以妨礙P54-DLC8鍵合和干涉感染，存在可以在體內(nèi)更有效阻斷感染的給定序列(圖8).1.3.4.5.肽處理對ASFV感染過程中的病毒后代產(chǎn)生的影響將生長在24-孔板中的9χ104非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞用不同濃度的肽COVAl和RS28在37°C處理1小時，如在材料和方法部分所述。然后，將細(xì)胞以0.5pfu/細(xì)胞用BA71V感染或假感染。在感染后36小時(36hpi)，通過噬斑測定法分析來自感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的胞外和胞內(nèi)病毒后代。如在圖9中所示，當(dāng)在存在50μM或更大濃度的COVAl的條件下進(jìn)行感染時，在所計算的胞外(圖9Β)和胞內(nèi)(圖9Α)病毒滴度中觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著的減少。然而，用不同濃度的陰性對照肽RS28溫育不影響病毒滴度，并且所獲得的病毒后代數(shù)值與不存在肽的條件下來自感染細(xì)胞的那些相似。1.3.5.細(xì)胞毒性分析。肽處理對細(xì)胞存活力和增殖的影響。為了評估任何細(xì)胞毒性或副作用是否與用所述肽對非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞的處理相關(guān)，進(jìn)行細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活力測定。在這些實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)與用陰性對照肽RS28處理的細(xì)胞比較時，在用不同濃度的COVAl肽處理后的細(xì)胞增殖數(shù)值沒有減少(圖10)。用COVAl獲得的增殖數(shù)值與在不存在肽的條件下在對照細(xì)胞中獲得的那些相似。此外，在用不同的肽(抑制劑或?qū)φ针?溫育后，細(xì)胞存活力百分?jǐn)?shù)沒有改變，如Tripan-blue排除測定所判斷的那樣。在所有情形中，細(xì)胞存活力百分?jǐn)?shù)約為90%。這些結(jié)果證明，用本發(fā)明所述的肽溫育不影響非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞的增殖或存活力。1.3.5.1.細(xì)胞結(jié)構(gòu)和DLC8功能整合我們檢測與微管發(fā)動動力蛋白相關(guān)的主要細(xì)胞結(jié)構(gòu)是否被肽治療改變。與肽內(nèi)在化一起，我們分析了細(xì)胞骨架成分的完整性，并且我們觀察到，在存在肽C0VA2的條件下，微管沒有被改變(圖11)。此外，微管上的輕鏈動力蛋白分布模式保持在與微管組織中心(MTOC)相對應(yīng)的致密區(qū)域(圖11)。已知動力蛋白功能在有絲分裂中是重要的，在有絲分裂紡錘體的形成和染色體的遷移中起作用，并且我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂沒有改變(圖12)。1.3.5.2.螢光素標(biāo)記的C0VA2肽的細(xì)胞分布模式螢光素標(biāo)記的肽C0VA2表現(xiàn)出與用針對完整DLC8分子的多克隆抗體染色的DLC8相似的分布。DLC8可在細(xì)胞質(zhì)中與所選的調(diào)控細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)的貨物、RNA和向微管負(fù)端(向核仁)的蛋白相互作用，并且其功能對于有絲分裂后細(xì)胞器如高爾基體的重新放置是基本的。有趣的是，C0VA2肽與DLC8分子的動力區(qū)室精確共同定位。熒光肽主要分布在細(xì)胞質(zhì)區(qū)域、細(xì)胞突出物、絲狀偽足(filopodia)和在其余細(xì)胞中的細(xì)胞接觸中。在進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞中，它保持在外周細(xì)胞質(zhì)區(qū)域中直到發(fā)生晚期有絲分裂。然后，在進(jìn)行核分裂的細(xì)胞和子代細(xì)胞中，C0VA2染色增加，并且在有絲分裂后進(jìn)行細(xì)胞器再分布的那些細(xì)胞中在所有的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域是非常致密的(圖13)。使用染色完整DLC8分子的抗體，在有絲分裂后，在活性重置細(xì)胞器的細(xì)胞中，共同定位的百分?jǐn)?shù)較高。然后，發(fā)現(xiàn)其是細(xì)胞中與DLC8介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)相聯(lián)系的動力區(qū)室的選擇性標(biāo)記。這些結(jié)果清楚地表明，可以使用基于在不同病毒分離株的病毒p54中存在的DLC8結(jié)合基序而專門設(shè)計的防止兩種蛋白之間的相互作用的肽來抑制(ASFV的)病毒感染。這種抑制反映在對致細(xì)胞病變作用的抑制、感染細(xì)胞數(shù)目的急劇減少、每細(xì)胞病毒基因組拷貝數(shù)的急劇減少(其反映在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的以ng/μ1為單位的病毒復(fù)制的減少)、和因此引起的病毒生產(chǎn)和病毒蛋白合成的顯著減少?？傊景l(fā)明首次使用基于病毒通過其結(jié)合動力蛋白DLC8的序列設(shè)計的肽，所述病毒結(jié)合動力蛋白DLC8是感染成功的必需步驟，并且所述肽表現(xiàn)出在易感細(xì)胞中有效抑制病毒感染且具有可證明的抗病毒作用。參考書目1.Alonso,C.,等人’Africanswinefevervirusp54proteininteractswiththemicrotubularmotorcomplexthroughdirectbindingtolight-chaindynein(非洲豬瘟病毒p54蛋白通過直接結(jié)合輕鏈動力蛋白與微管動力復(fù)合體相互作用)·JVirol(病毒學(xué)雜志)，2001.75(20):ρ·9819-27.2.Harrison,Α.禾口S.Μ·King,Themolecularanatomyofdynein(云力力蛋白的分子剖析)·EssaysBiochem(生物化學(xué)測定)，2000.35:ρ·75-87.3.King,S.Μ.,Organizationandregulationofthedyneinmicrotubulemotor(動力蛋白微管動力的組織和調(diào)控).CellBiolInt(國際細(xì)胞生物學(xué)),2003.27(3):p.213-5.4.Enjuanes,L.，等人，TitrationofAfricanswinefever(ASF)virus(瘟(ASF)病毒的滴定)·JGenVirol(基因病毒學(xué)雜志)，1976.32(3):ρ·471-7.5.Afonso,C.L.,^ΑCharacterizationofp30,ahighlyantigenicmembraneandsecretedproteinofAfricanswinefevervirus(p30白勺表征，p30為與豬癌病毒的高抗原性膜和分泌蛋白).Virology(病毒學(xué))，1992.189(1):ρ·368-73.6.Melikov,K.禾口L.V.Chernomordik,Arginine_richcellpenetratingpeptides:fromendosomaluptaketonucleardelivery(富含精氨酸的穿透肽由內(nèi)體攝入至細(xì)胞核遞送).CellMolLifeSci(細(xì)胞分子生命科學(xué))，2005.62(23)p.2739-49.7.Tabares,E.,^ΑProteinsspecifiedbyAfricanswinefevervirus.II.Analysisofproteinsininfectedcellsandantigenicproperties(豬;iS病毒特異性蛋白。II.對感染細(xì)胞中的病毒和抗原性特性的分析。)ArchVirol(病毒學(xué)報)，1980.66(2):ρ·119-32.8.Cobbold,C.禾口Τ·WiIeman，ThemajorstructuralproteinofAfricanswinefevervirus,p73,ispackagedintolargestructures,indicativeofviralcapsidormatrixprecursors，ontheendoplasmicreticulum.(非洲豬痕病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白P73在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上包裝成指示病毒衣殼或基質(zhì)前體的大結(jié)構(gòu))JVirol(病毒學(xué)雜志)，1998.72(6):p.5215-23.9.Nunes,J.F.，J.D.Vigario,禾口A.Μ·Terrinha，UltrastructuralstudyofAfricanswinefevervirusreplicationinculturesofswinebonemarrowcells(非洲豬瘟病毒在豬骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物中的復(fù)制的超結(jié)構(gòu)研究).ArchVirol(病毒學(xué)學(xué)報)，1975.49(1):ρ·59-66.10.Martinez-Moreno,Μ.等人’RecognitionofnovelviralsequencesthatassociatewiththelightchaindyneinLC8identifiedthroughaρ印scantechnique(通過ρ印scan技術(shù)鑒定的與輕鏈動力蛋白LC8締合的新病毒序列的知識)·FEBSLetters(FEBS通信)2003.544:262_267.11.King,D.P.,等K,DevelopmentofaTaqManPCRassaywithinternalamplificationcontrolforthedetectionofAfricanswinefevervirus(用于非洲豬瘟病毒檢測的具有內(nèi)部擴(kuò)增對照的TaqManPCR測定法的開發(fā)).VirolMethods(病毒學(xué)方法).2003.107:53_61.12.Rodriguez-Crespo,I.,等人，IdentificationofnovelcellularproteinsthatbindtotheLC8dyneinlightchainusingapepscantechnique.(使用pepscari技術(shù)鑒定與LC8動力蛋白輕鏈結(jié)合的新型細(xì)胞蛋白)，F(xiàn)EBSLett.(FEBS通信)503135-141(2001).13.Lo,K.W.,等人，The8_kDadyneinlightchainbindstoisttargetsviaaconserved(K/R)XTQTmotif(8_kDa動力蛋白輕鏈通過保守(K/R)XTQT基序結(jié)合其靶標(biāo))·J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)27614059-14066(2001).14.Taylor,W.R.,Theclassificationofaminoacidconservation(氨基酸保守性的分類).JournalofTheoreticalBiology(理論生物學(xué)雜志)，119:205_218(1986).權(quán)利要求抗病毒組合物，其包括屬于由SEQIDNO14或由其衍生的在至少一個氨基酸處具有保守變化且能夠結(jié)合DLC8蛋白的任意序列表示的家族的肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗病毒組合物，其包括屬于由SEQIDNO:1或由其衍生的在至少一個氨基酸處具有保守變化且能夠結(jié)合DLC8蛋白的任意序列表示的家族的肽。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗病毒組合物，其特征在于所述肽還包含增加所述肽內(nèi)在化到細(xì)胞中的工具。4.根據(jù)權(quán)利要求3的抗病毒組合物，其中將所述肽內(nèi)在化到細(xì)胞中的所述工具由8個精氨酸的尾部組成。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的抗病毒組合物，其中所述肽選自SEQIDN0:3,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7，SEQIDNO8或SEQIDNO:9。6.根據(jù)權(quán)利要求1的抗病毒組合物，其中所述肽是SEQIDN0:2。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的抗病毒組合物，其還包括另一種活性化合物和/或任意藥用載體、賦形劑、媒介物或稀釋劑。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的抗病毒組合物，其有效用于治療歸因于選自下列各項的病毒感染ASFV，人乳頭瘤病毒，腺病毒，昆蟲痘病毒A.moorei，痘苗病毒，呼吸道合胞病毒，人柯薩奇病毒，狂犬病毒，人單純皰疹病毒，Mokola病毒或AIDS病毒。9.屬于由SEQIDN0:14或SEQIDNO1或由其衍生的在至少一個氨基酸處具有保守變化且能夠結(jié)合DLC8蛋白的任意序列表示的家族的肽，其綴合至可檢測的熒光標(biāo)記上或任何常用的標(biāo)記上，所述標(biāo)記允許優(yōu)選利用二級抗體、熒光標(biāo)記和生色團(tuán)檢測其。10.根據(jù)權(quán)利要求9的肽，其選自:SEQIDNO7,SEQIDNO:8禾口SEQIDNO:9。11.抗病毒化合物的選擇及其功效評估的方法，其特征在于所述方法包括a)將細(xì)胞培養(yǎng)物用能夠結(jié)合DLC8的化合物、其部分序列或通過保守置換序列的至少一個氨基酸產(chǎn)生的能夠結(jié)合DLC8的類似序列或其部分序列預(yù)先溫育或預(yù)先混合；b)將病毒與在步驟a)預(yù)先溫育或混合的細(xì)胞培養(yǎng)物接觸；c)在一定時間后檢測并定量細(xì)胞內(nèi)病毒感染的水平；d)通過不同方法將所述病毒感染水平與在沒有與能夠結(jié)合DLC8的化合物預(yù)先溫育或預(yù)先混合的感染該病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物中達(dá)到的病毒感染水平進(jìn)行比較。12.評估肽、特別是病毒來源的肽向細(xì)胞中內(nèi)在化和細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)姆椒ǎ渫ㄟ^目前所有的任意方法，諸如用可追蹤的標(biāo)記直接標(biāo)記屬于由SEQIDN0:14或SEQIDNO1表示的家族的一種肽，并且通過特異性測量由與所述肽結(jié)合的標(biāo)記發(fā)射的信號、或間接地通過在二級抗體上的二級步驟標(biāo)記檢測。13.研究細(xì)胞中的動力蛋白的細(xì)胞生物學(xué)和功能的方法，其通過用可追蹤的標(biāo)記來標(biāo)記屬于由SEQIDN0:14或SEQIDNO1表示的家族的一種肽或?qū)λ鲭奶禺愋缘亩壙贵w，并且通過測量由與所述肽或與所述抗體結(jié)合的標(biāo)記發(fā)射的信號來檢測它而進(jìn)行。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13任一項的方法，其中所述肽或所述抗體用熒光分子如螢光素、羅丹明或本領(lǐng)域已知的允許通過直接的熒光顯微鏡檢測的任何其它熒光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。15.根據(jù)權(quán)利要求12或13任一項的方法，其中所述肽或所述抗體用任意非熒光標(biāo)記如生物素、血細(xì)胞凝集素、c-myc或GST標(biāo)記。16.根據(jù)權(quán)利要求12-15中任一項的方法，其中所述肽選自SEQIDN0:7，SEQIDNO8禾口SEQIDNO:9。17.選擇抗病毒化合物和評估其抗病毒功效的方法，其特征在于包括a)獲得單獨(dú)的DLC8蛋白的RMN光譜作為對照光譜；b)用病毒蛋白預(yù)先溫育DLC8足夠的時間，以允許病毒蛋白和DLC8之間的相互作用，隨后獲得結(jié)合所述病毒蛋白的DLC8的RMN光譜；c)首先用抗病毒化合物預(yù)先溫育DLC8足夠的時間，以允許抗病毒-DLC8相互作用，隨后加入病毒蛋白，溫育足夠時間，以允許DLC8-病毒蛋白相互作用，然后，獲得DLC8光譜；d)將步驟c)中獲得的光譜與步驟a)或b)中獲得的那些進(jìn)行比較，在步驟c)中獲得的光譜與步驟a)的對照光譜越相似，檢測到越大功效的干擾結(jié)合活性。全文摘要新的抗病毒肽干擾病毒與DLC8的結(jié)合，大量病毒來源的致病試劑在它們感染周期的某些點(diǎn)利用基于動力蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。本發(fā)明由新型抗病毒治療組成，所述新型抗病毒治療由通過主要經(jīng)由防止病毒蛋白和細(xì)胞DLC8蛋白之間的相互作用的干擾機(jī)制來抑制由利用動力蛋白系統(tǒng)的那些病毒引起的病毒感染組成。本發(fā)明首次公開了通過這樣的肽對該相互作用功能的阻斷，所述肽的序列包括病毒蛋白與DLC8結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的完整或部分序列或由其組成。文檔編號C07K14/01GK101835795SQ200880112912公開日2010年9月15日申請日期2008年10月20日優(yōu)先權(quán)日2007年10月24日發(fā)明者何塞·安赫爾·馬丁內(nèi)斯埃斯克里瓦諾,布魯諾·艾爾奈斯德拉普拉薩,科瓦東加·阿隆索馬蒂申請人:西班牙食品與飲料技術(shù)國家研究所;交替基因表達(dá)有限公司