專利名稱：：蛋白質的提純方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及蛋白質的提純方法。具體地說，本發(fā)明涉及簡便地從含有以動物細胞培養(yǎng)液為代表的目的蛋白質和雜質的混合液中除去雜質，從而有效地提純目的蛋白質的方法。
背景技術：
：近年，生物技術產(chǎn)業(yè)中，蛋白質的實用性大量提純是一個重要的課題。特別是醫(yī)藥領域中，抗體藥物方面的需要增長得很快，迫切需要確立一種能夠有效大量生產(chǎn)和大量提純蛋白質的技術。通常，蛋白質是使用來自動物的細胞株經(jīng)細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的。為了將用作目的的蛋白質(以下有時簡稱為“目的蛋白質”)、特殊藥品的抗體藥物實用化，需要從細胞培養(yǎng)液中除去細胞碎片等濁質成分和來自細胞的溶存的蛋白質等非濁質成分，提純到足以用于人體治療用途的組成。由細胞培養(yǎng)液提純目的蛋白質的常規(guī)操作中，首先，對細胞培養(yǎng)液進行離心分離，沉降除去濁質成分。接下來，使用精密過濾膜，通過定徑過濾(寸^73過)，將濁質成分中不能通過離心分離除盡的約Iym以下的細胞碎片除去。進而，為了無菌化，使用最大微孔徑為0.22μm以下的過濾膜，實施無菌化過濾，得到目的蛋白質的澄清溶液(收獲工序)。得到含有目的蛋白質的澄清溶液后，接著采用以親和色譜法為首的利用2個以上的層析法技術的組合的提純工藝來分離提純目的蛋白質(后處理工序)。由培養(yǎng)液中的細胞產(chǎn)生且在該培養(yǎng)液中溶存的雜質蛋白質在后處理工序被除去。由細胞培養(yǎng)液提純目的蛋白質等的上述現(xiàn)有方法中，該培養(yǎng)液中的目的蛋白質的濃度通常為lg/L以下，該培養(yǎng)液中所含有的細胞碎片和溶存的雜質蛋白質等的濃度也與目的蛋白質的濃度處于相同的程度。在該濃度范圍，利用現(xiàn)有的收獲工序和后處理工序的提純工藝對目的蛋白質的提純十分有效。但是，隨著抗體藥物的需求的急速上升，作為抗體藥品的蛋白質面臨著大量生產(chǎn)，隨著培養(yǎng)技術的快速進步，近年來細胞培養(yǎng)液中的目的蛋白質的濃度增加，要達到了IOg/L。該培養(yǎng)技術的快速進步的同時，意味著細胞培養(yǎng)液中的雜質蛋白質也同樣增加了，據(jù)預測，這將對采用現(xiàn)有的蛋白質提純工藝進行的提純增加巨大的負荷。因此，作為用于蛋白質的大量提純的技術，例如專利文獻1和2公開了一種蛋白質吸附膜，其中，在多孔質膜上引入了離于交換基，賦予了多孔質膜蛋白質吸附能力，并也已經(jīng)能夠購買。另外，作為蛋白質吸附膜的使用例，專利文獻3公開了一種方法，其中，使用2種蛋白質吸附膜(引入了陰離子交換基的纖維素多孔膜和引入了陽離子交換基的纖維素多孔膜)，從淋巴液分離白蛋白。還有，專利文獻4公開了使用引入了陰離子交換基的纖維素多孔膜分離核酸和內毒素的方法。此外，專利文獻5和6分別公開了在聚醚砜多孔膜引入陽離子交換基和陰離子交換基得到的蛋白質吸附膜。非專利文獻1公開了使用含有離子交換基的多孔膜分離核酸和單克隆抗體的方法。專利文獻1美國專利第5，547，575號說明書專利文獻2美國專利第5，739，316號說明書專利文獻3美國專利第6，001,974號說明書專利文獻4美國專利第6，235，892號說明書專利文獻5美國專利第6，783，937號說明書專利文獻6美國專利第6，780，327號說明書非專利文獻1=Bioseparation8:281_291，1999
發(fā)明內容但是，在將含有高濃度的目的蛋白質的細胞培養(yǎng)液經(jīng)離心分離、精密過濾、以及無菌化過濾得到清澄液，并將該清澄液用蛋白A親和柱(親和色譜柱)選擇性吸附目的蛋白質后，利用酸性洗脫液洗脫回收時，回收液中常常含有凝聚的雜質。另外，隨著蛋白A親和柱重復使用的次數(shù)增加，該凝聚的雜質的量也增加，同時回收的目的蛋白質的量出現(xiàn)降低的趨勢。如上所述，雜質蛋白質的量越多，親和層析工序的負荷越大，由于柱的清洗等，提純工序所需的時間長，不僅如此，用于親和層析的色譜柱的珠(beads)的壽命、特別是蛋白A親和柱的壽命也變短了。蛋白A親和柱的價格高，所以不希望該柱的壽命變短。另外，專利文獻14所公開的方法中，將用于分離的原液預先通過精密過濾膜，除去顆粒狀的不溶物后實施分離操作。這是因為，所使用的蛋白質吸附膜的最大微孔徑較大，為3μm5μm，該蛋白質吸附膜不能除去顆粒狀的不溶物。專利文獻5和6所公開的方法中，蛋白質吸附膜的最大微孔徑為0.8μπι1.0μm，也不能除去微細的顆粒狀的不溶物。另外，通常細胞培養(yǎng)液中含有鹽，如非專利文獻1公開的那樣使用離子交換膜的情況下，來自含有0.IM以上的鹽的溶液的蛋白質的吸附量明顯減少，所以從細胞培養(yǎng)液除去雜質蛋白質不能實用。如上所述，由于現(xiàn)有的蛋白質吸附膜的最大微孔徑為約0.8μπι以上，并且在鹽的存在下的吸附量低，沒有設想到同時進行目的在于從細胞培養(yǎng)液中除去細胞碎片等微細的不溶物的除濁、和溶存的雜質蛋白質的吸附，不適合該目的。另外，對于任意的蛋白質吸附膜來說，在溶液中不存在鹽的條件下，其動態(tài)吸附容量也不過是單位膜體積為30mg/mL以下，為了有效吸附除去來自細胞培養(yǎng)液的雜質蛋白質，需要大量的蛋白質吸附膜。而且，這些現(xiàn)有的蛋白質吸附膜是平膜的形態(tài)，所以不能緊湊地收裝大量的蛋白質吸附膜。所以，需要收裝在大尺寸容器中的大量的蛋白質吸附膜，沒有實用性。另外，在溶液中存在鹽的情況下，現(xiàn)有的具有陰離子交換基的蛋白質吸附膜的吸附量明顯降低，所以更不實用。鑒于這些情況，本發(fā)明要解決的課題是提供一種方法，其中，從以動物細胞培養(yǎng)液為代表的含有目的蛋白質和雜質的混合液中簡便地除去雜質，有效地提純目的蛋白質。本發(fā)明人為解決上述課題進行了深入研究，結果意外地發(fā)現(xiàn)，使用在微孔表面具有接枝鏈、且該接枝鏈上固定有陰離子交換基的多孔膜時，能有效實現(xiàn)上述目的。S卩，本發(fā)明提供下述的蛋白質的提純方法和中空纖維多孔膜。[1]一種蛋白質的提純方法，其是用于從含有目的蛋白質和雜質的混合液中除去上述雜質的蛋白質的提純方法，其中，所述提純方法包括使用在微孔表面具有接枝鏈、且在上述接枝鏈上固定有陰離子交換基的多孔膜進行過濾的工序。[2]如上述[1]所述的蛋白質的提純方法，其中，上述目的蛋白質是選自由單克隆抗體、多克隆抗體、人化抗體、人抗體和免疫球蛋白組成的組中的1種。[3]如上述[1]或[2]所述的蛋白質的提純方法，其中，上述雜質是選自由非濁質成分和分散在上述混合液中的濁質成分組成的組中的至少一種。[4]如上述[3]所述的蛋白質的提純方法，其中，上述非濁質成分是選自由溶存于上述混合液中的雜質蛋白質、HCP、DNA、病毒、內毒素、蛋白酶和細菌組成的組中的至少一種。[5]如上述[3]或[4]所述的蛋白質的提純方法，其中，分散在上述混合液中的濁質成分是選自由細胞和細胞碎片組成的組中的至少一種。[6]如上述[1][5]的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，上述混合液的鹽濃度為0.OlM0.5M。[7]如上述[1][5]的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，上述混合液的鹽濃度為0.IM0.3M。[8]如上述[1][7]的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，上述多孔膜的基材是聚乙烯或聚偏二氟乙烯，上述接枝鏈是甲基丙烯酸縮水甘油酯的聚合物，接枝率為10%250%，上述接枝鏈所具有的環(huán)氧基的70%以上被上述陰離子交換基取代。[9]如上述[8]所述的蛋白質的提純方法，其中，上述接枝率為10%150%。[10]如上述[8]所述的蛋白質的提純方法，其中，上述接枝率為10%90%。[11]如上述[8]所述的蛋白質的提純方法，其中，上述接枝率為30%60%。[12]如上述[1][11]任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，上述陰離子交換基是二乙基氨基和/或三甲基氨基。[13]如上述[1][12]任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，上述陰離子交換基是二乙基氨基。[14]如上述[1][13]任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，上述多孔膜的最大微孔徑是0.1μm0.8μm。[15]如上述[1][14]任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，使用上述多孔膜，對上述混合液進行過濾，由此除去含有非濁質成分的1種以上的雜質。[16]如上述[1][15]任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，上述混合液是動物細胞培養(yǎng)液。[17]如上述[1][16]任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，上述多孔膜是中空纖維多孔膜。[18]一種中空纖維多孔膜，其用于上述[17]所述的蛋白質的提純方法。[19]一種組件，其具有上述[18]所述的中空纖維多孔膜。[20]一種中空纖維多孔膜，其在微孔表面具有接枝鏈，并且在上述接枝鏈上固定有陰離子交換基，其中，上述中空纖維多孔膜的基材是聚乙烯或聚偏二氟乙烯，上述接枝鏈是甲基丙烯酸縮水甘油酯的聚合物，接枝率為10%250%，上述接枝鏈所具有的環(huán)氧基的70%以上被上述陰離子交換基取代。[21]如上述[20]所述的中空纖維多孔膜，其中，上述接枝率為10%150%。[22]如上述[20]所述的中空纖維多孔膜，其中，上述接枝率為10%90%。[23]如上述[20]所述的中空纖維多孔膜，其中，上述接枝率為30%60%。[24]如上述[20][23]任一項所述的中空纖維多孔膜，其中，上述多孔膜的最大微孔徑為0.1μm0.8μm。[25]一種組件，其具有上述[20][24]任一項所述的中空纖維多孔膜。[26]如上述[1][17]任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，該方法進一步包括利用親和色譜法進行提純的工序。通過本發(fā)明的蛋白質的提純方法，使用具有接枝鏈且在該接枝鏈上固定有陰離子交換基的多孔膜進行過濾，能夠簡便地進行以往通過離心分離、精密過濾、無菌化過濾這三個工序進行的親和層析工序以前的細胞培養(yǎng)液的清澄化。另外，通過固定有陰離子交換基的多孔膜的過濾能夠除去現(xiàn)有的方法中不能被除去的溶存的雜質蛋白質。另外，還能大大降低親和層析工序的負荷。圖1表示實施例3中的利用陰離子交換中空纖維膜組件對BSA和γ-球蛋白混合液進行過濾時的不吸附成分和吸附成分的SDS-PAGE分析結果。圖2表示實施例4-6和比較例1中的通過各種陰離子交換膜的過濾對含有Y_球蛋白的細胞培養(yǎng)液進行提純的SDS-PAGE分析結果。圖3表示實施例10中的利用陰離子交換中空纖維膜組件以一個工序進行除濁、雜質蛋白質去除以及無菌化的評價裝置的示意圖。圖4表示實施例10中的利用陰離子交換中空纖維膜組件進行過濾時的不吸附成分和吸附成分的SDS-PAGE分析結果。圖5表示實施例11中的利用精密過濾中空纖維膜組件除濁后使用陰離子交換中空纖維膜組件以兩個工序進行雜質蛋白質去除和無菌化的評價裝置的示意圖。符號說明1細胞培養(yǎng)液罐2蠕動泵3壓力計(組件入側)4陰離子交換中空纖維膜組件5壓力計(組件出側)6流量調整栓7除濁用精密過濾中空纖維膜組件具體實施例方式下面對本具體實施方式(以下稱作“本實施方式”)進行詳細說明。此外，本發(fā)明并不限于下述的本實施方式，實施時可在其要點范圍內進行各種變化。本實施方式的蛋白質的提純方法是從含有作為藥品有用的目的蛋白質和雜質的以動物細胞培養(yǎng)液為代表的混合液中除去雜質來提純蛋白質的方法，其包括使用在微孔表面具有接枝鏈且在該接枝鏈上固定有陰離子交換基的多孔膜進行過濾的工序。本實施方式的蛋白質的提純方法是能夠簡便地除去混合液所含有的雜質并得到目的蛋白質的澄清溶液的蛋白質的提純方法。本實施方式的蛋白質的提純方法優(yōu)選還包括使用經(jīng)過濾工序得到的目的蛋白質的澄清溶液，利用親和色譜法進行提純的工序。對含有目的蛋白質和雜質的混合液沒有特別的限制，可以舉出動物細胞培養(yǎng)液。作為動物細胞培養(yǎng)液，只要是含有目的蛋白質的培養(yǎng)液，則沒有特別的限制，可以舉出在含有中國倉鼠的卵巢(CHO)細胞的宿主細胞中進行細胞培養(yǎng)得到的含有重組蛋白質的培養(yǎng)液。作為目的蛋白質，可以舉出用作藥品的抗體，并可以舉出單克隆抗體、多克隆抗體、人化抗體、人抗體和免疫球蛋白。作為雜質，可以舉出混合液中分散的濁質成分以及非濁質成分等。作為濁質成分和非濁質成分，可以舉出為了制造目的蛋白質而進行動物細胞培養(yǎng)所得到的培養(yǎng)液中所含有的目的蛋白質以外的雜質。作為混合液中分散的濁質成分，可以舉出細胞和細胞碎片等，作為非濁質成分，可以舉出混合液中溶存的雜質蛋白質、宿主細胞蛋白質(HostCellProtein:HCP)、核酸(DNA)、病毒、內毒素、蛋白酶和細菌等。本實施方式的蛋白質的提純方法優(yōu)選使用多孔膜對混合液進行過濾，由此除去含有非濁質成分的1種以上的雜質。非濁質成分可以通過吸附在多孔膜上而除去。優(yōu)選在將含有非濁質成分的1種以上的雜質去除時，也能除去濁質成分。作為目的蛋白質的抗體的等電位點(pi)的范圍大致在68。普通的CHO動物細胞培養(yǎng)液的PH大概在78的范圍，該培養(yǎng)液含有約1質量％(約0.17M)的鹽。根據(jù)動物細胞培養(yǎng)液的種類的不同，上述PH和鹽濃度可能有變動。在水溶液中，蛋白質的氨基以離子化的狀態(tài)-NH3+存在，羧基以離子化的狀態(tài)-C00—存在，水溶液中的蛋白質的總電荷取決于培養(yǎng)液的pH。等電位點(Pl)的PH下，蛋白質的總電荷為0。所以，在pi以上的pH環(huán)境下，蛋白質處于帶負電的狀態(tài)，在pi以下的PH環(huán)境下，蛋白質處于帶正電的狀態(tài)。動物細胞培養(yǎng)液的pH為78，所以目的蛋白質的總電荷幾乎為0或者是稍帶正電的狀態(tài)下，目的蛋白質存在于該培養(yǎng)液中，所以目的蛋白質實質上不被陰離子交換基吸附。與此相對，混合液中溶存的雜質蛋白質、宿主細胞蛋白質(HCP)、核酸(DNA)和內毒素等的Pl值幾乎均為6以下，所以即使溶解在動物細胞培養(yǎng)液中，在該培養(yǎng)液中也是以帶負電的狀態(tài)存在。上述混合液中溶存的雜質蛋白質等具有在不存在鹽的條件下被陰離子交換基吸附的性質。但是，實際上，動物細胞培養(yǎng)液通常含有約1質量％(0.17M)程度的鹽，因此，即使Pl為6以下，雜質蛋白質等也幾乎不被陰離子交換基吸附。即，即使使用通常具有陰離子交換基的吸附膜或陰離子交換層析法，也不能從動物細胞培養(yǎng)液中直接除去雜質。即使是鹽濃度為0.OlM0.5M的動物細胞培養(yǎng)液，也能通過使用本實施方式的蛋白質的提純方法進行提純。能夠以本實施方式很好地進行提純的動物細胞溶液的鹽濃度為0.IM0.3M。本實施方式中，使用在微孔表面具有接枝鏈且該接枝鏈固定有陰離子交換基的多孔膜進行動物細胞培養(yǎng)液的過濾的情況下，意外地發(fā)現(xiàn)，無論細胞培養(yǎng)液中是否含有鹽，混合液中溶存的雜質蛋白質、宿主細胞蛋白質(HCP)、核酸(DNA)和內毒素等均被該多孔膜的陰離子交換基吸附。過濾工序中使用在微孔表面具有接枝鏈且該接枝鏈固定有陰離子交換基的多孔膜時，能夠吸附混合液中溶存的來自動物細胞培養(yǎng)液的雜質蛋白質、宿主細胞蛋白質、核酸和內毒素等，這是通常不能實現(xiàn)的。其具體的理由尚不清楚，據(jù)推測理由如下。普通的陰離子交換膜和陰離子交換層析法中，陰離子交換基通常被固定在多孔質膜微孔或樹脂以及該微孔的表面。蛋白質被表面的陰離子交換基吸附。陰離子交換基僅被固定于多孔膜的微孔或樹脂以及該微孔的表面，以平面方式存在。因此，蛋白質在多孔膜的微孔或樹脂以及該微孔的表面以點接觸的方式吸附，所以能夠參與吸附的陰離子交換基的數(shù)量少。因此，溶液中存在鹽時，蛋白質的吸附性明顯降低。這是對陰離子交換膜的常規(guī)概念，基于該原理，對吸附的蛋白質進行洗脫時，通常采用的方法是使用鹽溶液。即，據(jù)認為，溶液中存在鹽的情況下，陰離子交換膜不吸附蛋白質，這種想法對于具有接枝鏈的陰離子交換膜也是同樣的。本實施方式使用的多孔膜中，陰離子交換基被固定在位于微孔表面的接枝鏈上。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用本實施方式中的多孔膜(陰離子交換基被固定在接枝鏈上的陰離子交換膜)，即使是含有鹽的溶液，蛋白質的吸附性也不會明顯降低。對于陰離子交換基僅處于微孔或樹脂的表面的通常的多孔膜，蛋白質的吸附是平面上的吸附，與此相對，由于陰離子交換基被固定在接枝鏈上，所以陰離子交換基以三維立體分布。據(jù)認為，由于陰離子交換基被固定在接枝鏈上，所以是以接枝鏈抱裹蛋白質的方式進行吸附的，因此，參與吸附的陰離子交換基的數(shù)量多。由于能夠參與吸附的陰離子交換基的數(shù)量多，所以即使溶液中存在鹽，蛋白質的吸附性也降低得很少，能夠實用性地實現(xiàn)利用吸附從細胞培養(yǎng)液中除去溶存的雜質。本實施方式使用的具有陰離子交換基的多孔膜是指，在作為基材的多孔質體及其微孔的表面上固定有接枝鏈，并且該接枝鏈上以化學或物理方式固定有陰離子交換基的多孔質體的多孔膜。對多孔膜的基材沒有特別限制，為了保持機械性能，優(yōu)選由聚烯烴系聚合物構成。作為聚烯烴系聚合物，可以舉出例如乙烯、丙烯、丁烯和偏二氟乙烯等烯烴的均聚物、該烯烴的2種以上的共聚物、或1種或者2種以上的烯烴與全鹵烯烴的共聚物等。作為全鹵烯烴，可以舉出四氟乙烯和/或氯三氟乙烯等。這些基材中，從機械強度特別優(yōu)異并且能得到高吸附容量的材料的方面出發(fā)，優(yōu)選聚乙烯或聚偏二氟乙烯，更優(yōu)選聚乙烯。對在多孔膜的表面和微孔引入接枝鏈并進一步在該接枝鏈固定陰離子交換基的方法沒有限定，例如可以舉出日本特開平2-132132號公報公開的方法。本實施方式中，接枝率是指引入到陰離子交換基被固定前的基材上的接枝鏈的重量相對于基材的重量之比(百分率)。接枝率優(yōu)選為10%250%，更優(yōu)選為10%150%，進一步優(yōu)選為10%90%，更進一步優(yōu)選為30%60%。接枝率為10%以上時，蛋白質的吸附容量明顯增高，具有實用性。接枝率為250%以下時，能夠得到足夠實用的強度。通常，對吸附的蛋白質進行洗脫時，使鹽溶液通過多孔膜，但具有膜體積因此發(fā)生膨脹的特性，并且接枝率越高，膨脹率越高。流通鹽溶液所帶來的膜體積的膨脹率雖然與多孔膜和接枝鏈的結構有關，但接枝率為60%時，膨脹率約為2%以下；接枝率為90%時，膨脹率約3%以下；接枝率為150%時，膨脹率約5%以下。接枝率為250%以下時，可以將膨脹率控制在10%以下，所以從實用性方面出發(fā)，優(yōu)選接枝率為250%以下的多孔膜。本實施方式中，被引入到基材的接枝鏈是指具有引入反應后即使用二甲基甲酰胺(DMF)等有機溶劑清洗也不會被除去的化學結構的鏈。作為接枝鏈，例如可以舉出甲基丙烯酸縮水甘油酯、乙酸乙烯酯和羥基丙基乙酸酯的聚合物，從容易引入陰離子交換基的方面出發(fā)，優(yōu)選甲基丙烯酸縮水甘油酯或乙酸乙烯酯的聚合物，更優(yōu)選甲基丙烯酸縮水甘油酯的聚合物。作為陰離子交換基，只要是吸附混合液中溶存的雜質蛋白質、DNA、HCP、病毒和內毒素等的陰離子交換基，則沒有特別的限制，可以舉出二乙基氨基(DEA、Et2N-)、季銨基(Q、R3N+-)、季銨乙基(QAE、R3N+-(CH2)2-)、二乙基氨基乙基(DEAE、Et2N-(CH2)2-)、二乙基氨基丙基(DEAP、Et2N-(CH2)3-)等。對R沒有特別限定，結合在同一N上的R可以相同或不同，優(yōu)選R表示烷基、苯基、芳烷基等烴基。作為季銨基，例如可以舉出三甲基氨基(接枝鏈引入有三甲基銨基、Me3N+-)等。由于容易對多孔膜上引入的接枝鏈進行化學固定，并且能夠得到高吸附容量，所以優(yōu)選DEA和Q，更優(yōu)選DEA。陰離子交換基可以通過將構成接枝鏈的甲基丙烯酸縮水甘油酯聚合物所具有的環(huán)氧基開環(huán)，加成上二乙基胺等胺和二乙基銨或三甲基銨等銨鹽來固定在接枝鏈上。以摩爾比例計，優(yōu)選接枝鏈的環(huán)氧基之中70%以上、優(yōu)選75%以上、更優(yōu)選為80%以上被陰離子交換基取代。陰離子交換基的取代的量在上述范圍內時，能夠形成動態(tài)吸附容量優(yōu)異的多孔膜。為了截住濁質成分和細菌并且得到高透過流速，多孔膜的最大微孔徑優(yōu)選為0.1μm0.8μm，更優(yōu)選為0.1μm~0.6μm,進一步優(yōu)選為0.2μm0.5μm。本實施方式中，多孔膜的最大微孔徑是指如實施例所示那樣通過泡點法測定的值。為了有效減輕對基于親和色譜法的提純工序的親和色譜柱的負荷，具有陰離子交換基的多孔膜從不含鹽的溶液吸附蛋白質的動態(tài)吸附容量優(yōu)選為30mg/mL以上，更優(yōu)選為50mg/mL以上，進一步優(yōu)選為70mg/mL以上。緩沖液含有0.lmol/L的鹽的情況下的動態(tài)吸附容量優(yōu)選為10mg/mL以上，更優(yōu)選為20mg/mL以上，進一步優(yōu)選為30mg/mL以上。吸附在離子交換膜上的雜質的量與離子交換膜的體積成比例。因此，離子交換膜的動態(tài)吸附容量越大，越能減小用于蛋白質提純的組件的尺寸。本實施方式中，動態(tài)吸附容量是指多孔膜每單位體積上多孔膜吸附的蛋白質達到轉效時的蛋白質質量(單元[mg/mL])?？梢允褂门Ｑ灏椎鞍?BSA)作為吸附量評價的模型蛋白質，將BSA溶解在20mMTris-HCl(pH8.0)的緩沖液中，通過下述的實施例記載的方法評價動態(tài)吸附容量。只要是多孔質體，則對多孔膜的形態(tài)沒有特別限定，可以舉出平膜、無紡布、中空纖維膜、整體式(monolith)、毛細管、圓板或圓筒狀等。從制造的容易性、按比例放大性、組件成型時的膜的密封性等出發(fā)，優(yōu)選為中空纖維膜。本實施方式中，在親和色譜法的后處理工序之前的收獲工序中，使用具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜，對含有目的蛋白質的動物細胞培養(yǎng)液進行過濾，由此能夠得到目的蛋白質的澄清溶液。通過使用具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜，除了作為濁質成分存在的細胞和細胞碎片等之外，還能夠除去作為非濁質成分存在的在培養(yǎng)液中以溶解的狀態(tài)存在的雜質蛋白質、HCP、DNA、病毒等，并且還能除去細菌，得到雜質被除去了并無菌化的澄清的目的蛋白質溶液?；趶募毎囵B(yǎng)液得到澄清的目的蛋白質的溶液的目的，具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜優(yōu)選設置在組件內。中空纖維多孔膜組件是內置了由在多孔質中空纖維的表面和微孔的表面以化學或物理的方式固定有陰離子交換基的多孔質中空纖維構成的中空纖維多孔膜的組件。使用該中空纖維多孔膜組件，使動物細胞培養(yǎng)液透過，由此能夠從該培養(yǎng)液中除去作為濁質成分存在的細胞和細胞碎片等以及作為非濁質成分存在的溶存的雜質蛋白質、HCP、DNA和細菌等。由于作為濁質成分存在于該培養(yǎng)液中的細胞和細胞碎片等的尺寸大，不能通過多孔質中空纖維的微孔，因此能夠通過定徑過濾除去這些濁質成分。另外，溶解在該培養(yǎng)液中而存在的雜質蛋白質等可以通過被固定在多孔質中空纖維的表面和微孔的表面的陰離子交換基吸附而除去。本實施方式中，為了除去動物細胞培養(yǎng)液中的濁質成分和非濁質成分等雜質，優(yōu)選使用使加壓的培養(yǎng)液流通多孔質中空纖維的內側，并透過到多孔質中空纖維的外側的基于錯流的過濾方法。使培養(yǎng)液以錯流通過多孔質中空纖維的內側，由此能夠抑制在使濾液透過到多孔質中空纖維外側時濁質物質向內側表面的堆積，抑制透過流速的大幅降低。錯流過濾中，在多孔質中空纖維內流動時的液體的線速度優(yōu)選為0.05m/s5.Om/s,更優(yōu)選為0.lm/s2.Om/s。本實施方式中，線速度是液體透過多孔質中空纖維內截面的速度，用(每1秒在多孔質中空纖維內流動的液體的體積)/(多孔質中空纖維的內截面積)表示。過濾液從多孔質中空纖維內側向外側的透過壓力優(yōu)選為0.OlMPa0.5Mpa，更優(yōu)選為0.05MPa0.2MPa。本實施方式中，為了在短時間由動物細胞培養(yǎng)液得到澄清的目的蛋白質的溶液，作為優(yōu)選的方式，還可以舉出僅進行動物細胞培養(yǎng)液的除濁處理后，就使用具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜進行過濾工序的方法。利用具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜進行過濾前，通過預先對動物細胞培養(yǎng)液僅進行除濁處理，能夠在過濾工序中得到高的透過流速，能夠利用中空纖維多孔膜通過加壓過濾(押込3過)進行過濾工序。利用具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜的過濾僅除去殘存的細胞碎片、溶解的雜質蛋白質、HCP、DNA、細菌等非濁質成分，所以優(yōu)選預先進行除濁處理。動物細胞培養(yǎng)液的除濁處理可以舉出基于離心分離、利用硅藻土過濾膜等深度過濾器的加壓過濾、利用精密過濾膜的錯流過濾的方法等，但并不限于這些。由于可以將經(jīng)除濁處理的處理液直接送于使用具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜的過濾，所以優(yōu)選利用精密過濾膜的錯流過濾，更優(yōu)選利用精密過濾中空纖維膜組件的錯流過濾。用于除濁處理的精密過濾中空纖維膜組件的多孔質中空纖維的最大微孔徑優(yōu)選為0.1μm0.8μm，更優(yōu)選為0.2μm0.6μm。最大微孔徑小，則不能得到足夠的透過流速，最大微孔徑大，則在后段的本實施方式中的由具有陰離子交換基的多孔質中空纖維構成的中空纖維膜組件的加壓過濾時容易發(fā)生阻塞，透過壓力增大。使用精密過濾中空纖維膜組件，利用錯流過濾進行除濁處理時，動物細胞培養(yǎng)液在多孔質中空纖維內表面流動的線速度優(yōu)選為0.05m/s5.Om/s,更優(yōu)選為0.lm/s2.Om/s。過濾液從多孔質中空纖維內側向外側的透過壓力優(yōu)選為0.OlMPa0.5Mpa，更優(yōu)選為0.05MPa0.2MPa。本實施方式的蛋白質的提純方法優(yōu)選進一步含有利用親和色譜法進行提純的工序。利用親和色譜法進行的提純可以通過現(xiàn)有公知的方法進行，并可以使用蛋白A親和柱進行。該工藝中，首先，使通過使用具有陰離子交換基的多孔膜進行過濾得到的含有目的蛋白質的澄清溶液通過蛋白A親和柱，選擇性地吸附目的蛋白質。澄清溶液中所含有的溶存雜質蛋白質不被蛋白A親和柱吸附而流出，從而被除去。接下來，利用與所述清澄溶液PH相同的緩沖液對柱進行清洗，除去柱內殘存的雜質，其后，使用酸性洗脫液，將被吸附的目的蛋白質洗脫回收，由此可以進一步除去大部分雜質蛋白質，得到經(jīng)提純的目的蛋白質的溶液。使用的含有目的蛋白質的溶液中即使溶存有雜質蛋白質，通過使用蛋白A親和柱，也能夠提純目的蛋白質。利用親和色譜法進行提純的工序中，溶存的雜質蛋白質多，則來自柱的回收液中存在發(fā)生了凝聚的雜質，或者因增加了對柱的負荷而導致柱的壽命降低。優(yōu)選在應用該柱前，預先使用具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜盡可能多地除去溶存的雜質蛋白質，所以，適宜使用本實施方式所用的多孔膜進行過濾。作為本實施方式所用的親和色譜柱，可以舉出具有蛋白Α、肝素、ConA、活性紅(ProcionRedHE-3B)、活性藍(CibacronBlue3GA)、賴氨酸、精氨酸和苯甲脒等作為配位體的柱，抗體是目的蛋白質的情況下，大多使用蛋白A親和色譜柱。使通過使用具有陰離子交換基的多孔膜進行過濾得到的含有目的蛋白質的澄清溶液過親和色譜柱并進行吸附的方法可以通過利用泵或靜水壓將澄清的溶液供給到平衡好的柱的方法等來進行。對吸附有目的蛋白質的親和色譜柱進行清洗時，使用與含有目的蛋白質的澄清溶液的PH相同的緩沖液即可，沒有特別的限制，例如可以舉出磷酸鈉緩沖液等緩沖液。利用緩沖液進行的清洗可以通過用柱體積的210倍量程度的緩沖液過柱來進行。由吸附有目的蛋白質的親和色譜柱回收目的蛋白質時，使用酸性溶液的緩沖液作為洗脫溶液即可，沒有特別的限制，例如可以舉出PH34的檸檬酸-氫氧化鈉緩沖液等酸性溶液。利用酸性溶液進行的目的蛋白質的回收可以通過將柱體積的210倍量的洗脫緩沖液過柱來進行。使用具有陰離子交換基的多孔膜，進行含有目的蛋白質的動物細胞培養(yǎng)液的過濾，得到澄清的目的蛋白質的溶液，接下來，利用親和色譜法，進行澄清的目的蛋白質的溶液的提純，回收目的蛋白質，由此能夠抑制以往在親和色譜法中利用酸性溶液進行蛋白質回收時發(fā)生的凝聚雜質的生成。使用本實施方式所用的多孔膜對含有目的蛋白質的混合液進行過濾，由此能夠減輕對親和柱的負荷，同時能夠回收高度提純的目的蛋白質。實施例下面，通過實施例和比較例對本實施方式進行更具體的說明，但本實施方式并不僅限于這些實施例。此外，本實施方式采用的評價方法和測定方法如下。(1)泡點法為了測定多孔質中空纖維的最大微孔徑，使用泡點法。將長度8cm的多孔質中空纖維的一個末端堵住，將另一個末端經(jīng)壓力計與氮氣供給管線連接。在連接狀態(tài)下供給氮氣，將管線內部置換成氮氣環(huán)境后，將多孔質中空纖維浸泡在乙醇中。此時，以乙醇不在管線內部倒流而稍微用氮氣施加了壓力的狀態(tài)浸泡。在浸泡多孔質中空纖維的狀態(tài)下，慢慢增加氮氣的壓力，記錄開始從多孔質中空纖維穩(wěn)定排出氮氣氣泡時的壓力(P)。將最大微孔徑記作d、將乙醇和空氣的界面的表面張力記作Y，通過下式(I)計算出多孔質中空纖維的最大微孔徑。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>此處，C為常數(shù)。由于浸泡液是乙醇，所以Cy=0.632(kg/cm)，將ρ(kg/cm2)代入上式，求出最大微孔徑d(μm)。(2)細菌挑戰(zhàn)試驗為了確認實施例1、2和6制作的小型組件的滅菌性能，實施細菌挑戰(zhàn)試驗。首先，以錯流的要領使IOOppm次亞氯酸鈉水溶液(200mL)在組件內通過，同時使其透過組件進行殺菌，接下來，同樣地流通500mL超純水，同時使其透過組件，進行清洗。使用Pseudomonasdimunuta作為0.22μm孔徑的指標菌，同樣以錯流的要領使含有濃度為IO6個/mL的指標菌的水溶液(200mL)通過組件的同時使其透過組件。測定透過液中所含有的Pseudomonasdimunuta的量，其結果為10個/IOOmL以下，該組件的0.22μm指標菌的LRV(對數(shù)減少值)為7以下，證明可以大致完全無菌化。(3)含有目的蛋白質的動物細胞培養(yǎng)液的模型液的制備準備鹽濃度約0.9質量％(0.15M)、蛋白質濃度約lg/L、細胞密度3.OXIO7AiL的CHO細胞無血清細胞培養(yǎng)液(不含抗體蛋白質)，向其中添加作為目的蛋白質的Y-球蛋白(SIGMA制造)，并使其達到lg/L濃度，制作含有目的蛋白質的未被除濁的動物細胞培養(yǎng)液的模型液。該模型液中，Y-球蛋白是目的蛋白質，包含濁質成分的來自細胞培養(yǎng)液的全部蛋白質是雜質蛋白質。(4)蛋白質的SDS-PAGE分析為了對透過實施例1、2和6制作的小型組件的培養(yǎng)液中的蛋白質進行分析，使用SDS-PAGE。將10μL分析用透過液與同量的試樣處理液(第一化學試劑株式會社制造，Tris-SDS試樣處理液或Tris-SDSβME試樣處理液)混合，在100°C進行5分鐘熱處理。將得到的試樣用微量移液管在電泳用凝膠微板(第一化學試劑株式會社制造，multigelIImini)上每1個孔滴加10yL，插入裝滿電泳用緩沖液(第一化學試劑株式會社制造，SDS-三甘氨酸泳動緩沖液經(jīng)稀釋10倍后使用)的電泳槽(和光純藥株式會社制造，EasySeparator)。以30mA的恒定電流電泳1小時，分離透過液中的蛋白質。電泳后的凝膠微板用染色試劑(Fimakoshi株式會社制造的InstantBlue或第一化學試劑株式會社制造的2D-銀染色試劑-II)染色，確認蛋白質的條帶。(5)HCP的定量作為雜質的HCP的定量如下進行將待評價的液體點在CygnusTechnologies制的CHOHostCellProteinELISAKit的96孔板上，使用GE醫(yī)療制的酶標儀(UltrospecVisiblePlateReader1196)進行定量。(6)DNA的定量作為雜質的DNA的定量如下進行使用invitrogen制的Quant-idsDNAHSAssayKit對待評價的液體進行處理后，使用Qubit熒光計進行定量。(7)利用蛋白A親和柱進行的目的蛋白質的吸附回收以透過實施例1、2和6制作的小型組件而得到的澄清培養(yǎng)液作為試樣液，對利用蛋白A親和柱由其中進行目的蛋白質的吸附回收進行評價。將蛋白A親和柱(GE醫(yī)療制的HiTrapProteinAHPImL)與市售的色譜法系統(tǒng)(GE醫(yī)療制的AKTAexplorerlOO)連接過柱。柱平衡化和應用試樣后的清洗時使用的緩沖液使用20mM磷酸鈉(pH7.0)，吸附的目的蛋白質的洗脫緩沖液使用0.IM檸檬酸-NaOH(pH3.0)。吸附評價中，以下述5個工序為一個循環(huán)，進行實施，對目的蛋白質的吸附量進行評價1)為了平衡化，將IOmL緩沖液過柱；2)將含有目的蛋白質的清澄液過柱，吸附目的蛋白質；3)將IOmL緩沖液過柱，對柱內的雜質蛋白質進行清洗；4)將IOmL洗脫緩沖液過柱，將吸附的目的蛋白質洗脫回收；5)將IOmL緩沖液過柱，對柱再次清洗。此時，全部工序中，以1.OmL/min的流速進行過柱。目的蛋白質的吸附回收的重復性評價中，連續(xù)進行該循環(huán)。另外，吸附量如下求出將回收液稀釋10倍，測定280nm的紫外線吸光度，根據(jù)由預先已知濃度的紫外線吸光度測定得到標準曲線求出吸附量。(8)除濁用精密過濾中空纖維膜組件將11根外徑2.0mm、內徑1.4mm、最大微孔徑0.4μm的聚磺酸精密過濾中空纖維捆在一起，用環(huán)氧系灌封劑將兩末端固定在聚碳酸酯制組件外殼中，但不要堵住該中空纖維中空部，制作用于除濁的小型組件。得到的小型組件的內徑為0.9cm、長度約8cm、組件內的該中空纖維內面的有效膜面積為39cm2。(9)動態(tài)吸附容量的測定使用在20mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中以lg/L的濃度溶解有的BSA的BSA溶液，使BSA溶液透過評價組件，直到發(fā)生轉效。此處，根據(jù)BSA溶液的濃度Q、直至評價組件發(fā)生轉效時透過的BSA溶液的體積Vb以及評價組件內的實施例的離子交換膜的體積VM，基于下式(II)計算動態(tài)吸附容量A。A=QXVb/Vm···(II)離子交換膜的體積是除去了中空部分的體積。另外，轉效是指透過液中的BSA濃度超過所供給的BSA溶液的濃度的10%(0.lg/L)。另外，溶液從評價組件內的中空狀的離子交換膜的內側向外側通過。通過該方法測定的實施例1、2和6制作的陰離子交換膜的動態(tài)吸附容量分別為70mg/mL、35mg/mL和75mg/mL。[實施例1](i)向中空纖維多孔膜引入接枝鏈將外徑3.0mm、內徑2.0mm、以上述(1)所述的泡點法測定的最大微孔徑為0.3μm的聚乙烯多孔質中空纖維放入密閉容器，用氮氣交換容器內的空氣。其后，從容器的外側用干冰進行冷卻，同時照射Y線200kGy，生成自由基。將得到的具有自由基的聚乙烯多孔質中空纖維放入玻璃反應管，減壓到200Pa以下，由此除去反應管內的氧。在此將調整到40°C的由3體積份甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、97體積甲醇構成的反應液注入20質量份中空纖維，在密閉狀態(tài)靜置12分鐘，實施接枝聚合反應，將接枝鏈引入多孔質中空纖維?；旌先芤侯A先鼓入氮氣，將混合溶液內的氧交換成氮氣。接枝聚合反應后，舍棄反應管內的反應液。接下來，向反應管內添加二甲亞砜，對中空纖維進行清洗，由此除去殘存的甲基丙烯酸縮水甘油酯、其低聚物和未固定在中空纖維多孔膜上的接枝鏈。舍棄清洗液后，進一步添加二甲亞砜，進行2次清洗。使用甲醇同樣地進行3次清洗。將清洗后的中空纖維干燥，測定重量，結果為中空纖維多孔膜的重量為引入接枝鏈前的138%，以接枝鏈的重量相對于基材重量之比定義的接枝率為38%。通過下式(III)計算，引入的GMA(分子量142)的摩爾數(shù)相對于基材聚乙烯的骨架單元CH2基(分子量14)的摩爾數(shù)的值相當于3.75%。引入的GMA的摩爾數(shù)％=(接枝率/142)/(100/14)XlOO··‘(III)通過固體NMR法測定接枝反應后的中空纖維多孔膜中的聚乙烯骨架單元CH2基的摩爾數(shù)與構成接枝鏈的GMA上特有的酯基(C00基)的摩爾數(shù)之比。測定時，使用0.5g將接枝反應后的中空纖維冷凍粉碎得到的粉末試樣，使用BrukerBiospin社制造的DSX400,以13C為核素，通過HighPowerDecoupling法(高功率去偶法，HPDEC法)的定量模式，在等待時間100s、積分1000次的條件，室溫下進行測定。由于得到的NMR光譜的對應酯基的峰面積和對應CH2基的峰面積之比對應于GMA與CH2基的摩爾數(shù)之比，所以，根據(jù)測定結果，計算出引入的GMA的摩爾數(shù)相對于CH2基的摩爾數(shù)之比，其結果為3.8%。這相當于接枝率38.5%，表明利用固體NMR法測定接枝反應后的試樣能夠得到接枝率。(ii)陰離子交換基(叔氨基)向接枝鏈的固定將干燥的引入了接枝鏈的中空纖維在甲醇中浸泡10分鐘以上，使其溶脹后，在純水中浸泡，進行水置換。將由50體積份二乙基胺、50體積份純水的混合溶液構成的反應液調整到30°C，在玻璃反應管中添加接枝反應后的20質量份中空纖維。插入引入了接枝鏈的多孔質中空纖維，靜置210分鐘，將接枝鏈的環(huán)氧基取代成二乙基氨基，由此得到具有二乙基氨基作為陰離子交換基的中空纖維多孔膜。得到的中空纖維多孔膜的外徑為3.3mm、內徑為2.1mm，中空纖維多孔膜中接枝鏈所具有的環(huán)氧基的80%被二乙基氨基取代了。根據(jù)環(huán)氧基的摩爾數(shù)N2之中被取代成二乙基氨基的摩爾數(shù)N1，通過下式(IV)計算取代率T。T=IOOXN1ZN2=100X{(W2-W1)/MJWw1(dg/(dg+100))/M2}··.(IV)M1是二乙基銨的分子量(73.14)、W1是接枝聚合反應后的多孔質中空纖維膜的重量、W2是二乙基氨基取代反應后的多孔質中空纖維膜的重量、dg是接枝率、M2是GMA的分子量(142)。通過固體NMR法，與上述方法同樣地進行操作，測定GMA所特有的酯基的摩爾數(shù)相對于引入了二乙基氨基的中空纖維多孔膜中的聚乙烯骨架單元CH2基的摩爾數(shù)之比，得到了3.75%的結果。其對應于接枝率38%，由該結構可以確認，二乙基氨基的引入沒有導致接枝率的變化。(iii)陰離子交換膜組件的制作將3根具有二乙基氨基作為陰離子交換基的多孔質中空纖維捆在一起，用環(huán)氧系灌封劑將兩末端固定在聚磺酸制組件外殼中，但不要堵住多孔質中空纖維的中空部，制作陰離子交換膜的中空纖維組件。得到的組件的內徑為0.9cm、長度約3.3cm、組件的內容積約2mL、組件內的多孔質中空纖維所占的有效體積為0.85mL、除去中空部分后的僅中空纖維多孔膜的體積為0.54mL。[實施例2](iv)陰離子交換基(季銨基)向接枝鏈的固定與實施例1同樣地進行操作，將干燥的引入了接枝鏈的中空纖維在甲醇中浸泡10分鐘以上，使其溶脹后，在純水中浸泡，進行水置換。準備由50體積份純水和50體積份二甲亞砜構成的混合溶液，向該溶液中添加三甲基氯化銨，使?jié)舛葹?.5M，進行混合，得到均勻的反應液。在玻璃反應管中，將該反應液加進接枝反應后的20質量份中空纖維中，調整到60°C。其后，向其中插入引入了接枝鏈的多孔質中空纖維，靜置200分鐘，將接枝鏈的環(huán)氧基取代成三甲基氨基，得到具有三甲基氨基作為陰離子交換基的中空纖維多孔膜。得到的中空纖維多孔膜的外徑為3.2mm、內徑為2.Imm,中空纖維多孔膜中接枝鏈所具有的環(huán)氧基的80%被三甲基氨基取代了。計算取代率時，上述式(IV)中，將三甲基氯化銨的分子量95.57代入M1，與二乙基氨基同樣地進行計算。(ν)陰離子交換膜組件的制作與實施例1同樣地制成具有三甲基氨基作為陰離子交換基的多孔質中空纖維膜組件，得到了多孔質中空纖維的有效體積為0.75mL、除去中空部分后的僅中空纖維多孔膜的體積為0.46mL的組件。[實施例3]向20mMTris-HCl(pH8.0)中添加NaCl，使?jié)舛葹?.17M，制成含有金屬鹽的緩沖液。在該緩沖液中分別以lg/L的濃度溶解BSA(pI5.6)和γ-球蛋白(ρΙ6_7)，制成蛋白質混合溶液。使該蛋白質混合溶液以2mL/min的流速通過實施例1制作的具有二乙基氨基的陰離子交換膜組件，每5mL—個級分采集透過液。為了分析通過組件的級分中的蛋白質，使用SDS-PAGE。將10μL用于分析的透過液與同量的試樣處理液(第一化學試劑株式會社制造，Tris-SDS試樣處理液)混合，在100°C熱處理5分鐘。將得到的試樣用微量移液管在電泳用凝膠微板(第一化學試劑株式會社制造，multigelIImini)上每1個孔滴加10μL，插入裝滿電泳用緩沖液(第一化學試劑株式會社制造，SDS-三甘氨酸泳動緩沖液經(jīng)稀釋10倍后使用)的電泳槽(和光純藥株式會社制造，EasySeparator)。以30mA的恒定電流電泳1小時，分離透過液中的蛋白質。電泳后的凝膠微板用染色試劑(Fimakoshi株式會社制造的InstantBlue)進行染色。得到的結果見圖1。泳道1是BSA、泳道2是僅Y-球蛋白，泳道3是BSA和γ-球蛋白的混合液、泳道5到泳道12是透過液的級分、泳道13是吸附物的洗脫液。累積到20mL前的透過液(泳道5到泳道8)幾乎僅存在Y-球蛋白，BSA全被吸附了。另外，吸附后，用緩沖液中溶解有IMNaCl的鹽溶液進行洗脫。洗脫液中(泳道13)僅存在BSA，組件選擇性地僅吸附BSA，不吸附Y-球蛋白。由圖1所示的結果可知，本實施方式的方法對于從含有鹽的溶液中分離目的蛋白質是有效的。[實施例4]使用精密過濾中空纖維膜組件，對含有0.5g/LY-球蛋白作為目的蛋白質的CHO無血清細胞培養(yǎng)液進行死端過濾，得到經(jīng)除濁的上清。在實施例1制作的具有二乙基氨基的陰離子交換膜組件中以2mL/min的流速流通54mL該上清液(相當于中空纖維膜體積的100倍)，采集全部的透過液。為了對透過組件的級分中的蛋白質進行評價，使用SDS-PAGE0將10μL用于分析的透過液與同量的試樣處理液(第一化學試劑株式會社制造，Tris-SDSβME試樣處理液)混合，在100°C進行還原熱處理5分鐘。將得到的試樣用微量移液管在電泳用凝膠微板(第一化學試劑株式會社制造，multigelIImini)上每1個孔滴加10μL，插入裝滿電泳用緩沖液(第一化學試劑株式會社制造，SDS-三甘氨酸泳動緩沖液經(jīng)稀釋10倍后使用)的電泳槽(和光純藥株式會社制造，EasyS印arator)。以30mA的恒定電流電泳1小時，分離透過液中的蛋白質。電泳后的凝膠微板用染色試劑(第一化學試劑株式會社制造，2D-銀染色試劑-II)染色。得到的結果見圖2。泳道2是僅Y-球蛋白、泳道3是僅CHO無血清細胞培養(yǎng)上清、泳道4和泳道9是含有γ-球蛋白的CHO無血清細胞培養(yǎng)上清、泳道10是該評價中的透過液。結果顯示，通過使其透過陰離子交換膜組件，除去了含有鹽的細胞培養(yǎng)液中大量的雜質，得到了經(jīng)提純的目的蛋白質。另外，作為代表性的雜質，HCP和DNA在陰離子交換膜組件透過前的細胞培養(yǎng)上清中的濃度分別是346μg/mL和7200ng/mL，透過液中的濃度分別是39μg/mL和52ng/mL，有大幅的減少，這些表明了溶存的雜質蛋白質的去除性優(yōu)異。[實施例5]使用實施例2制作的具有三甲基氨基的陰離子交換膜組件，與實施例4同樣地進行操作，將46mL(相當于膜體積的100倍)的含有0.5g/LY-球蛋白作為目的蛋白質的相同的CHO無血清細胞培養(yǎng)的上清液通過組件，除去雜質。與實施例4同樣地利用SDS-PAGE進行評價。結果與實施例4同樣示于圖2。泳道12是該評價中的透過液。結果顯示，通過使其透過陰離子交換膜組件，除去了含有鹽的細胞培養(yǎng)液中大量的雜質，得到了經(jīng)提純的目的蛋白質。另外，作為代表性的雜質，HCP和DNA在陰離子交換膜組件透過前的細胞培養(yǎng)上清中的濃度分別是346μg/mL和7200ng/mL，透過液中的濃度分別是73.8μg/mL和32.8ng/mL，有大幅的減少，這些表明了溶存的雜質蛋白質的去除性優(yōu)異。[實施例6]如實施例1，其中，反應液的組成為甲基丙烯酸縮水甘油酯10體積份、甲醇90體積份，除此以外，與實施例1同樣地進行接枝鏈的引入以及二乙基氨基接枝鏈的固定，得到了具有二乙基氨基作為陰離子交換基的接枝率為140%的中空纖維多孔膜。另外，使用(IV)式計算的結果為，接枝鏈所具有的環(huán)氧基的93%被取代成了二乙基氨基。得到的中空纖維多孔膜的外徑為4.0mm、內徑為2.5mm,使用該中空纖維多孔膜，與實施例1同樣地進行操作，制作出多孔質中空纖維的有效體積為1.53mL、除去了中空部分的僅中空纖維多孔膜的體積為0.92mL的中空纖維組件。圖2的泳道11表示的是使用該中空纖維組件與實施例4同樣進行試驗得到的結果。結果顯示，通過使其透過該組件，除去了含有鹽的細胞培養(yǎng)液中大量的雜質，得到了經(jīng)提純的目的蛋白質。另外，作為代表性的雜質，HCP和DNA在陰離子交換膜組件透過前的細胞培養(yǎng)上清中的濃度分別是346μg/mL和7200ng/mL，透過液中的濃度分別是42.6μg/mL和32.8ng/mL，有大幅的減少，這些表明了溶存的雜質蛋白質的去除性優(yōu)異。[比較例1]作為市售的具有陰離子交換基的膜，使用賽多利斯(Sartorius)制SartobindQMA75(膜體積2.06mL)、Pall制MustangQAcrodisc(膜體積0.18mL)禾ΠCuno制BioCap25Filter90ZA(膜體積5mL以上)這3種，與實施例4同樣地進行操作，將含有0.5g/LY-球蛋白作為目的蛋白質的CHO無血清細胞培養(yǎng)的上清液以相當于膜體積的100倍的體積份分別通過各膜，除去雜質。與實施例4同樣地利用SDS-PAGE進行評價。結果與實施例4同樣示于圖2。泳道6是SartobindQMA75、泳道7是MustangQAcrodisc、泳道8是BioCap25Filter90ZA的透過液。由此可知，即使使用市售的具有陰離子交換基的膜，也不能有效地從含有鹽的細胞培養(yǎng)液中除去雜質。陰離子交換膜組件透過前的細胞培養(yǎng)上清中的HCP和DNA的濃度分別為346μg/mL和7200ng/mL，透過后的液體中，對于SartobindQMA75，HCP和DNA的濃度分別為269μg/mL和492ng/mL,對于MustangQAcrodisc,HCP和DNA的濃度分別為248μg/mL和3916ng/mL,對于BioCap25Filter90ZA,HCP和DNA的濃度分別為310μg/mL和7600ng/mL，可知這些方法與本實施方式的方法相比，雜質的去除性低。[實施例7]DEA陰離子交換膜透過液的蛋白A提純使用實施例4得到的具有二乙基氨基的中空纖維膜組件的透過液作為除去了溶存的雜質的細胞培養(yǎng)液，通過用蛋白A親和柱進行吸附回收來進行Y-球蛋白的提純。按照上述(7)的方法，將30mL實施例4的透過液過蛋白A親和柱，吸附Y-球蛋白，利用洗脫緩沖液進行提純回收。將回收液稀釋10倍，測定紫外線吸收強度，評價回收率，結果在回收液中含有14.2mg的Y-球蛋白，回收率為95%。另外，回收液中所含有的HCP和DNA的濃度分別是0.162μg/mL和11.8ng/mL，表現(xiàn)出了利用本實施方式的方法的高回收率和雜質去除性。[實施例8]TMA陰離子交換膜透過液的蛋白A提純使用實施例5得到的具有三甲基氨基的中空纖維膜組件的透過液作為除去了溶存的雜質的細胞培養(yǎng)液，與實施例7同樣地進行操作，通過用蛋白A親和柱進行吸附回收來進行Y-球蛋白的提純。按照上述(7)的方法，將30mL實施例5的透過液過蛋白A親和柱，吸附Y-球蛋白，利用洗脫緩沖液進行提純回收。將回收液稀釋10倍，測定紫外線吸收強度，評價回收率，結果在回收液中含有13.8!^的Y-球蛋白，回收率為92%。另外，回收液中所含有的HCP和DNA的濃度分別是0.289μg/mL和19.Ing/mL,表現(xiàn)出了利用本實施方式的方法的高回收率和雜質去除性。[實施例9]DEA陰離子交換膜透過液的蛋白A提純(2)使用實施例6得到的具有二乙基氨基的中空纖維膜組件的透過液作為除去了溶存的雜質的細胞培養(yǎng)液，通過用蛋白A親和柱進行吸附回收來進行Y-球蛋白的提純。按照上述(7)的方法，將30mL實施例6的透過液過蛋白A親和柱，吸附Y-球蛋白，利用洗脫緩沖液進行提純回收。將回收液稀釋10倍，測定紫外線吸收強度，評價回收率，結果在回收液中含有13.9mg的Y-球蛋白，回收率為93%。另外，回收液中所含有的HCP和DNA的濃度分別是0.186μg/mL和13.8ng/mL，表現(xiàn)出了利用本實施方式的方法的高回收率和雜質去除性。[比較例2]使用實施例4中僅利用精密過濾膜實施了除濁得到的含有0.5mg/mL的γ-球蛋白的細胞培養(yǎng)液作為未除去溶存的雜質的細胞培養(yǎng)液，與實施例7同樣地進行提純評價。將蛋白A親和柱的回收液稀釋10倍，測定紫外線吸收強度，評價回收率，結果在回收液中含有14.5mg的Y-球蛋白，回收率為97%。另外，回收液中所含有的HCP和DNA的濃度分別是2.93μg/mL和63.2ng/mL,雖然目的蛋白質的回收率高，但是與本實施方式的利用具有陰離子交換基的中空纖維膜組件實施了雜質去除的情況相比，回收液中含有大量的雜質。[比較例3]使用比較例1得到的市售的陰離子交換膜的透過液，與實施例7同樣地通過用蛋白A親和柱進行吸附回收來進行Y-球蛋白的提純。將蛋白A親和柱的回收液稀釋10倍，測定紫外線吸收強度，對各陰離子交換膜的透過液的回收率進行評價，對于SartobindQMA75,回收率是97%，對于MustangQAcrodisc,回收率是93%，對于BioCap25Filter90ZA,回收率是95%，均是高回收率。另外，回收液中的HCP和DNA的濃度方面，對于SartobindQMA75,HCP和DNA的濃度分別是3.83μg/mL禾Π32.6ng/mL；對于MustangQAcrodisc,HCP和DNA的濃度分別是2.54μg/mL和46ng/mL；對于BioCap25Filter90ZA,HCP和DNA的濃度分別是3.27μg/mL和88.2ng/mL,與本實施方式的方法相比，雜質的去除性低，僅得到了與比較例2的不利用陰離子交換膜進行透過處理的情況大致相同的提純度。實施例4-9和比較例1-3所示的HCP和DNA的濃度見表1。由表1的結果可知，實施例4-9中，得到了高的雜質去除性。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>[實施例10]組裝圖3所示的錯流過濾評價裝置，將上述(3)制備的含有目的蛋白質的細胞培養(yǎng)液300mL加入細胞培養(yǎng)液罐1，使用蠕動泵2，以0.5m/s的線速度將培養(yǎng)液通向實施例1制作的內置有具有二乙基氨基作為陰離子交換基的中空纖維多孔膜的中空纖維膜組件(以下稱作陰離子交換中空纖維膜組件)4，進行錯流過濾。此處，采用透過液從多孔質中空纖維內側向外側移動的內壓式過濾。透過壓力用流量調節(jié)栓6調整以使壓力計(組件入側)3和壓力計(組件出側)5的平均值為0.IMpa,進行錯流過濾，每次采集30mL透過組件的液體，共取210mL，最后再取40mL，總透過液量達到250mL。其間的平均透過流速為21L/m2/hr(21LMH)。另外，采集的全部的透過液目視觀察為澄清狀。按照上述(4)記載的方法進行的透過液和洗脫液的SDS-PAGE結果見圖4。對于采集的全部透過液來說，透過液中含有與原液相同濃度的目的蛋白質，并且，雜質蛋白質明顯被陰離子交換中空纖維膜組件吸附了。用20mMTris-HCl(pH8.0)的緩沖液對錯流過濾評價后的陰離子交換中空纖維膜組件進行逆洗清洗，將在多孔質中空纖維內側堆積的濁質成分去除后，將吸附的成分用含有IM的NaCl的緩沖溶液洗脫，用SDS-PAGE對其分析。結果表明，陰離子交換中空纖維膜組件吸附了大量的雜質蛋白質，但目的蛋白質未被該組件吸附。將通過透過得到的澄清培養(yǎng)液全部放入同一容器，制成均勻的溶液，將其過未使用的蛋白A親和柱，根據(jù)上述(7)記載的方法，對目的蛋白質在蛋白A親和柱上的吸附量進行評價。此處，透過柱的培養(yǎng)液為10mL。評價中，不更換柱，反復實施上述(7)記載的吸附評價循環(huán)10次，測定吸附量的變化，結果第1次的吸附量為9.8mg，第10次的吸附量為9.8mg，重復10次未見吸附量的減少。另外，目視觀察洗脫液，全部的評價中，洗脫液澄清透明，未見任何凝聚物。評價結束后，將蛋白A親和柱分解，用光學顯微鏡觀察內部的珠，珠上未觀察到任何雜質的附著。由此證明，使用陰離子交換中空纖維膜組件，能夠由細胞培養(yǎng)液同時進行除濁和溶存的雜質蛋白質的去除，最終能大幅降低對蛋白A親和柱的負荷。[比較例4]使用內徑3.0mm、外徑2.0mm、最大微孔徑0.2μm的不帶陰離子交換基的聚乙烯多孔質中空纖維，以與實施例1所述的陰離子交換中空纖維膜組件相同的方法制作小型組件。使用該小型組件，以與實施例3相同的方法采集含有目的蛋白質的細胞培養(yǎng)液的透過液。目視觀察，得到的透過液為澄清狀，但按照上述(4)所記載的方法，通過SDS-PAGE進行分析時發(fā)現(xiàn)，與實施例10的透過液相比，其溶存的雜質蛋白質極多。另外，與實施例10同樣，用緩沖液對將該評價后的該小型組件進行逆洗清洗后，用IMNaCl緩沖溶液進行洗脫，結果表明，在小型組件上沒有吸附雜質蛋白質和目的蛋白質。與實施例10同樣地使通過透過得到的澄清培養(yǎng)液通過未使用的蛋白A親和柱，對目的蛋白質的吸附量進行評價。評價時，不更換柱，反復實施10次評價，測定吸附量的變化，結果第1次的吸附量為9.8mg，隨著重復次數(shù)的增加，吸附量降低，第10的吸附量為9.4mg。另外，目視觀察洗脫液，發(fā)現(xiàn)有極少的由凝聚物引起的混濁。評價結束后，將蛋白A親和柱分解，用光學顯微鏡觀察內部的珠，觀察到在珠之間附著有凝聚的雜質。由此證明，除去溶存的雜質蛋白質對降低對蛋白A親和柱的負荷是重要的，并且證明了具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜的效果。[實施例11]組裝圖5所示的錯流過濾評價裝置，將上述(3)制備的含有目的蛋白質的細胞培養(yǎng)液300mL加入細胞培養(yǎng)液罐1，使用蠕動泵2，以0.5m/s的線速度將培養(yǎng)液通向上述(8)所述的除濁用精密過濾中空纖維膜組件7，進行錯流過濾。透過壓力用流量調節(jié)栓6調整以使壓力計(組件入側)3和壓力計(組件出側)5的平均值為0.IMpa0將透過用于除濁的精密過濾中空纖維膜組件7的液體直接送往與實施例10相同的陰離子交換中空纖維膜組件4，每次采集30mL通過加壓過濾得到的透過液?？偼高^液量達到250mL所要的時間為160分鐘，其平均透過流速為120L/m7hr(120LMH)。另外，采集的全部的透過液目視觀察為澄清狀。按照上述(4)所記載的方法，通過SDS-PAGE對采集的透過液進行分析表明，對于采集的全部透過液來說，透過液中含有與原液相同濃度的目的蛋白質，并且，雜質蛋白質明顯被陰離子交換中空纖維膜組件吸附了。[實施例I2]使用上述(8)所述的精密過濾中空纖維膜組件，對上述(3)制備的含有目的蛋白質的動物細胞培養(yǎng)液進行過濾，得到300mL經(jīng)除濁的澄清液。圖3的評價裝置中，將流量調整栓6完全關閉后，將該得到的清澄液加入圖3的細胞培養(yǎng)液罐1，使用蠕動泵2，以IOmL/min的送液速度將培養(yǎng)液向與實施例10相同的陰離子交換中空纖維膜組件4進行送液，每次采集30mL通過加壓過濾得到的透過液?？偼高^液量達到250mL所要的時間為25分鐘，其平均透過流速為816L/m2/hr(816LMH)。另外，采集的全部的透過液目視觀察為澄清狀。由此可以證明，即使是含有溶存的雜質蛋白質的培養(yǎng)液，通過在使用陰離子交換中空纖維膜組件進行過濾前，進行精密過濾，也能以極快的處理速度除去雜質蛋白質。按照上述(4)所記載的方法，通過SDS-PAGE對采集的透過液進行分析表明，對于采集的全部透過液來說，透過液中含有與原液相同濃度的目的蛋白質，并且，雜質蛋白質明顯被陰離子交換中空纖維膜組件吸附了。如上所述，與使用不帶陰離子交換基的聚乙烯中空纖維膜組件的比較例1、3和4以及不使用陰離子交換中空纖維膜組件的比較例2相比，使用實施例1、2和6制作的內置有具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜的陰離子交換中空纖維膜組件進行過濾的實施例3-12中，能夠明顯除去溶存的雜質蛋白質，并且，利用親和色譜法進行提純時，能夠得到純度更高的目的蛋白質的溶液。特別是實施例10，反復使通過過濾得到的溶液通過蛋白A親和柱，該柱的提純能力也沒有降低，并且還能防止雜質在該柱內附著，同時能夠充分降低對該柱的負荷。另外，通過在使用陰離子交換中空纖維膜組件進行過濾前，使用精密過濾中空纖維膜組件進行過濾，能夠在使用陰離子交換中空纖維膜組件進行過濾的工序中，以極快的處理速度進行該過濾工序。另外，通過加壓過濾來進行使用陰離子交換中空纖維膜組件的過濾時也能明顯除去溶存的雜質蛋白質。本申請基于2007年10月26日提交的日本專利申請(日本特愿2007-279406號)，并以參考的形式將其內容引入本說明書。工業(yè)實用性通過使用本實施方式的蛋白質的提純方法，可以通過使用具有陰離子交換基的中空纖維多孔膜進行過濾這一個工序就能完成通常需要經(jīng)離心分離、精密過濾、無菌化過濾這三個工序進行的親和層析工序以前的細胞培養(yǎng)液的清澄化。其結果，能夠簡化工序，減小必要的設備，從而降低成本。另外，還能夠大幅地降低親和層析工序的負荷，能夠在以更高純度提純目的蛋白質的同時實現(xiàn)提純的低成本化。權利要求一種蛋白質的提純方法，其是用于從含有目的蛋白質和雜質的混合液中除去所述雜質的蛋白質的提純方法，其中，所述提純方法包括使用在微孔表面具有接枝鏈、且在所述接枝鏈上固定有陰離子交換基的多孔膜進行過濾的工序。2.如權利要求1所述的蛋白質的提純方法，其中，所述目的蛋白質是選自由單克隆抗體、多克隆抗體、人化抗體、人抗體和免疫球蛋白組成的組中的1種。3.如權利要求1或2所述的蛋白質的提純方法，其中，所述雜質是選自由非濁質成分和分散在所述混合液中的濁質成分組成的組中的至少一種。4.如權利要求3所述的蛋白質的提純方法，其中，所述非濁質成分是選自由溶存于所述混合液中的雜質蛋白質、HCP、DNA、病毒、內毒素、蛋白酶和細菌組成的組中的至少一種。5.如權利要求3或4所述的蛋白質的提純方法，其中，分散在所述混合液中的濁質成分是選自由細胞和細胞碎片組成的組中的至少一種。6.如權利要求15的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，所述混合液的鹽濃度為0.01M0.5M。7.如權利要求15的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，所述混合液的鹽濃度為0.1M0.3M。8.如權利要求17的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，所述多孔膜的基材是聚乙烯或聚偏二氟乙烯，所述接枝鏈是甲基丙烯酸縮水甘油酯的聚合物，接枝率為10%250%，所述接枝鏈所具有的環(huán)氧基的70%以上被所述陰離子交換基取代。9.如權利要求8所述的蛋白質的提純方法，其中，所述接枝率為10%150%。10.如權利要求8所述的蛋白質的提純方法，其中，所述接枝率為10%90%。11.如權利要求8所述的蛋白質的提純方法，其中，所述接枝率為30%60%。12.如權利要求111的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，所述陰離子交換基是二乙基氨基和/或三甲基氨基。13.如權利要求112的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，所述陰離子交換基是二乙基氨基。14.如權利要求113的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，所述多孔膜的最大微孔徑是0.1Pm0.8iim。15.如權利要求114的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，使用所述多孔膜，對所述混合液進行過濾，由此除去含有非濁質成分的1種以上的雜質。16.如權利要求115的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，所述混合液是動物細胞培養(yǎng)液。17.如權利要求116的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，所述多孔膜是中空纖維多孔膜。18.—種中空纖維多孔膜，其用于權利要求17所述的蛋白質的提純方法。19.一種組件，其具有權利要求18所述的中空纖維多孔膜。20.—種中空纖維多孔膜，其在微孔表面具有接枝鏈，并且在所述接枝鏈上固定有陰離子交換基，其中，所述中空纖維多孔膜的基材是聚乙烯或聚偏二氟乙烯，所述接枝鏈是甲基丙烯酸縮水甘油酯的聚合物，接枝率為10%250%，所述接枝鏈所具有的環(huán)氧基的70%以上被所述陰離子交換基取代。21.如權利要求20所述的中空纖維多孔膜，其中，所述接枝率為10%150%。22.如權利要求20所述的中空纖維多孔膜，其中，所述接枝率為10%90%。23.如權利要求20所述的中空纖維多孔膜，其中，所述接枝率為30%60%。24.如權利要求2023的任一項所述的中空纖維多孔膜，其中，所述多孔膜的最大微孔徑為0.1iim0.8iim。25.一種組件，其具有權利要求2024的任一項所述的中空纖維多孔膜。26.如權利要求117的任一項所述的蛋白質的提純方法，其中，該方法進一步包括利用親和色譜法進行提純的工序。全文摘要本發(fā)明提供一種蛋白質的提純方法，其是從含有目的蛋白質和雜質的混合液中除去所述雜質的蛋白質的提純方法，所述提純方法包括使用在微孔表面具有接枝鏈、且在所述接枝鏈上固定有陰離子交換基的多孔膜進行過濾的工序。文檔編號C07K1/14GK101835791SQ200880113118公開日2010年9月15日申請日期2008年9月26日優(yōu)先權日2007年10月26日發(fā)明者白瀧浩伸,篠原直志申請人:旭化成化學株式會社