專利名稱：可穿透細胞的nm23重組蛋白、編碼其的多核苷酸以及包含其的抗轉(zhuǎn)移組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可穿透細胞的Nm23重組蛋白，其中轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23被融合至大分 子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(MTD)，并涉及編碼可穿透細胞的Nm23重組蛋白的多核苷酸、用于生產(chǎn)可穿 透細胞的Nm23重組蛋白的表達載體以及包括可穿透細胞的Nm23重組蛋白作為用于抑制轉(zhuǎn) 移的有效成分的抗轉(zhuǎn)移藥物組合物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)報道了 Nm23基因編碼在正常組織的形成和分化中涉及的蛋白質(zhì)，并且其表 達在各種轉(zhuǎn)移細胞中減少。Nm23蛋白質(zhì)屬于腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子并且通常有150至180個氨 基酸組成。Nm23蛋白質(zhì)含有亮氨酸拉鏈基序并且表現(xiàn)出核苷二磷酸激酶(NDPK)活性。兩 個人Nm23類似物Nm23-Hl和Nm23_H2由152個氨基酸構(gòu)成，其分子重量分別為17143和 17294。尤其是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Nm23-Hl在腫瘤轉(zhuǎn)移和其他各種細胞機制包括細胞增殖、胚胎發(fā) 育、分化和腫瘤形成中起重要作用。Nm23影響腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的機制還沒有被明確地研究出來。NDPK經(jīng)由共價磷 酸化酶中間產(chǎn)物在三磷酸核苷和二磷酸核苷之間轉(zhuǎn)移磷?；τ谶@樣的磷酸化，每個 Nm23-Hl和Nm23_H2的組氨酸118作為靶位點。除了 NDPK介導(dǎo)的組氨酸磷酸化，在Nm23 中觀察到絲氨酸的自動磷酸化(MacDonald NJ et al.，J Biol. Chem. 268 :25780_25789， 1993)。當與對照細胞比較時，Nm23轉(zhuǎn)染小鼠的黑色素瘤細胞在Nm23絲氨酸的體內(nèi)磷酸化 水平和腫瘤轉(zhuǎn)移可能性的抑制之間存在直接關(guān)聯(lián)。小鼠Nm23的絲氨酸磷酸化在體內(nèi)通過 cAMP抑制，而在體外通過福司柯林(forskolin)抑制，這表明磷酸化受信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的控 制。最初，據(jù)報道Nm23表達與具有較弱轉(zhuǎn)移可能性的小鼠黑色素瘤細胞系緊密相關(guān)。 在Nm23的表達減少和腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系被視為支持Nm23作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子的事實 的直接證據(jù)(Steeg，P. S.，Breast Dis. 10 =47-50,1998)。Nm23的可誘導(dǎo)過表達在高度轉(zhuǎn)移 性癌細胞系中表現(xiàn)出明顯降低的轉(zhuǎn)移能力。作為公認腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因克隆的Nm23基因 表現(xiàn)出絲氨酸/蘇氨酸特異的磷酸轉(zhuǎn)移酶和組氨酸蛋白激酶活性，以及NDPK活性。而且， Nm23的表達隨著造血干細胞(HSC)分化而降低，這表明Nm23在這些細胞中是抗分化的重 要因子(Gervasi，F(xiàn). et al. ,Cell Growth Differ. 7 1689-95，1996)。已發(fā)現(xiàn)，在強迫可誘 導(dǎo)基因表達和人腫瘤的體外轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)中，在臨時轉(zhuǎn)染后，Nm23表現(xiàn)出對腫瘤轉(zhuǎn)移的強 抑制作用。(Hirayama,R. et al.，J. Natl. Cancer Inst. 83 1249-50，1991 ；Nakayama,T. et al. , J. Natl. Cancer, Inst. 84 1349-54,1992 ；Leone, A. et al. , Oncogene 8 :2325_33, 1993 ；Leone,A. et al. ,Oncogene 8:855-65,1993)。相反，Nm23 突變，導(dǎo)致 NDPK 活性喪失， 對乳癌細胞中的Nm23的抑制功能沒有影響(MacDonald，N. J. et al.，J. Biol. Chem. 271 25107-16，1996)。當Nm23基因被轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞系中時，揭示了 Nm23是轉(zhuǎn)移抑制因子的事實最權(quán)
4威的證據(jù)。在轉(zhuǎn)移的感受態(tài)細胞中，相比于對照轉(zhuǎn)染子，給予高劑量Nm23表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移活 性降低 40-98% (Leone, A. et al.，Cell 65 :25_35，1991 ；Leone, A. et al.，Oncogene 8 2325-33，1993)。最近，已有報道，Nm23與在果蠅(黑腹果蠅，Drosophilarmelanogaster)和線蟲 (漂亮新小桿線蟲，caenorhabditis elegans)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的Ras (KSR)的激酶抑制劑相互 作用(Morrison, D. K.，J. Cell Sci. 114 =1609-12, 2001) KSR 是促細胞分裂原激活的蛋 白激酶(MAPK)級聯(lián)的支架蛋白(Burack, W. R. and Shaw, Α. S.，Curr. Opin, Cell Biol. 12 211-6,2000 ；Pawson, Τ. and Scott, J. D. , Science 278:2075_80，1997)。這樣的支架蛋白 對于增強磷酸化速度是必需的并且有助于磷酸化途徑的特異性和穩(wěn)定化。一旦MAPK信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑由活性Ras激活，則KSR被迫發(fā)生去磷酸化，然后用作MAPK級聯(lián)反應(yīng)激活的支架。 在這個過程期間，Nm23磷酸化KSR絲氨酸392，其是KSR的另一種相關(guān)蛋白的結(jié)合位點。如 果絲氨酸392發(fā)生突變，則Nm23磷酸化KSR絲氨酸434。Nm23的轉(zhuǎn)移抑制活性已經(jīng)通過 如下事實明確證實，即轉(zhuǎn)移能力在用Nm23基因轉(zhuǎn)染的各種腫瘤細胞中被抑制(Yoshida， Τ. et al.，J. Gastroenterol. 35 =768-74,2000)。在通過 MAPK 級聯(lián)的刺激激活的細胞中， 在Nm23和KSR之間的相互作用經(jīng)過組氨酸-依賴性途徑以一種復(fù)雜方式誘導(dǎo)體外KSR磷 酸化(Hartsough, Μ. Τ. et al.，J. Biol. Chem. 277 :32389_99，2002)。而且，KSR 和 Nm23 的 體內(nèi)聯(lián)合抑制激活MAPK級聯(lián)的活性Ras的表型效應(yīng)。因此，給予高劑量Nm23蛋白可以在體內(nèi)使KSR磷酸化并失活，導(dǎo)致Ras介導(dǎo)的 MAPK級聯(lián)的抑制。因此，本發(fā)明的發(fā)明人認為由KSR的再磷酸化介導(dǎo)的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 的抑制可以抑制癌細胞的細胞增殖、分化和遷移，并且在各種人類癌癥中表現(xiàn)出抗轉(zhuǎn)移作 用，并通過利用Nm23蛋白質(zhì)而努力開發(fā)新型的抗轉(zhuǎn)移劑。同時，來源于合成化合物或天然化合物的小分子可以被轉(zhuǎn)運到細胞中，而大分子 如蛋白、肽和核酸卻不能。如被廣泛理解的，大于500kDa的大分子不能穿過活細胞的細 胞質(zhì)膜，即脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。為了克服這個問題，開發(fā)了一種大分子細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)(MITT) (Joet al.，Nat. Biotech. 19 :929_33，2001)，其允許將治療有效的大分子遞送到細胞中，使 得利用肽、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)來開發(fā)新的藥物成為可能。根據(jù)這種方法，如果將靶大分子融 合至疏水性大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(MTD)和其他細胞轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)劑并以重組蛋白形式合成的、表 達的和純化的，則它能夠穿過細胞的細胞質(zhì)膜脂質(zhì)雙層，被準確地運送至靶位點，然后有效 地表現(xiàn)出其治療作用。這樣的MTD有利于融合至肽、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、合成化合物等的許多 不可穿透材料轉(zhuǎn)運到細胞中。因此，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種介導(dǎo)轉(zhuǎn)移性抑制因子Nm23轉(zhuǎn)運到細胞中 的方法，其中可穿透細胞的Nm23重組蛋白質(zhì)通過將MTD融合至轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23而被改 造。已發(fā)現(xiàn)，這樣的可穿透細胞的Nm23重組蛋白有效地介導(dǎo)轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23在體內(nèi)以 及在體外轉(zhuǎn)運到細胞中，并且在各種人類癌癥中可以被用作抑制轉(zhuǎn)移發(fā)生的抗轉(zhuǎn)移劑。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 因此，本發(fā)明的目的是提供作為抗轉(zhuǎn)移劑的可穿透細胞的Nm23重組蛋白，其通過 抑制癌細胞增殖、分化和遷移而對防止各種類型的人類癌癥中的轉(zhuǎn)移是有效的。
技術(shù)方案本發(fā)明一方面涉及可穿透細胞的Nm23重組蛋白，其通過將具有可穿透細胞的的 大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(MTD)融合至轉(zhuǎn)移抑制蛋白而能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23轉(zhuǎn)運到細胞 中。本發(fā)明另一方面涉及編碼上述可穿透細胞的Nm23重組蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還涉及含有以上多核苷酸的表達載體，以及用以上表達載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化 體。本發(fā)明另一方面涉及一種包括培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體的生產(chǎn)可穿透細胞的Nm23重組蛋 白的方法。本發(fā)明另一方面涉及一種藥物組合物，包括作為抑制轉(zhuǎn)移的有效成分的上述可穿 透細胞的Nm23重組蛋白。


圖1是示意圖，示出了根據(jù)本發(fā)明的被融合至kFGF4_來源的MTD、J0-76MTD和 J0-77MTD之一并且以全長形式被構(gòu)建的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的結(jié)構(gòu)。圖2a是瓊脂糖凝膠電泳分析的照片，示出了根據(jù)本發(fā)明的編碼可穿透細胞的 Nm23重組蛋白被融合至kFGF4-來源的MTD并且以全長形式構(gòu)建的PCR擴增的DNA片段。圖2b是瓊脂糖凝膠電泳分析的照片，示出了根據(jù)本發(fā)明的編碼可穿透細胞的 Nm23重組蛋白被融合至J0-76和J0-77MTD中的每一個并且以全長形式構(gòu)建的PCR擴增的 DNA片段。圖3a是示意圖，示出了根據(jù)本發(fā)明將編碼可穿透細胞的Nm23重組蛋白的PCR產(chǎn) 物亞克隆入pGEM-T Easy載體中。圖3b和3c是瓊脂糖凝膠電泳分析的照片，分別示出了根據(jù)本發(fā)明的亞克隆入 pGEM-T Easy載體中的圖2a和2b中的編碼可穿透細胞的Nm23重組蛋白的PCR產(chǎn)物。圖4a是示意圖，示出了根據(jù)本發(fā)明將編碼可穿透細胞的Nm23重組蛋白的重組DNA 片段克隆入PET 28(+)載體中。圖4b和4c是瓊脂糖凝膠電泳分析的照片，示出了根據(jù)本發(fā)明被亞克隆入pET 28(+)載體中的編碼可穿透細胞的Nm23重組蛋白的重組DNA片段。圖5是SDS-PAGE分析的照片，示出了在各種類型的宿主細胞中根據(jù)本發(fā)明的可穿 透細胞的Nm23重組蛋白的可誘導(dǎo)表達。圖6是SDS-PAGE分析的照片，示出了由根據(jù)本發(fā)明的表達載體被轉(zhuǎn)化到其中的轉(zhuǎn) 化體表達的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的純化。圖7a和7b是曲線圖，示出了根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的可穿透 細胞的的流式細胞儀分析的結(jié)果。圖8a至8c是共聚焦激光掃描顯微照片，可視化了在小鼠成纖維細胞中根據(jù)本發(fā) 明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的細胞穿透性。圖9a和9b是蛋白質(zhì)印跡分析的照片，示出了根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重 組蛋白對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用。圖IOa和IOb是侵入分析的照片，示出了根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白對轉(zhuǎn)移的抑制作用。圖11是傷口遷移測定的照片，示出了根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白 對轉(zhuǎn)移的抑制作用。圖12a是照片，示出了在從給予根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的小鼠 提取的小鼠肺組織中對轉(zhuǎn)移的抑制作用。圖12b是免疫組織化學(xué)染色的照片，示出了在從給予根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的 Nm23重組蛋白的小鼠提取的小鼠肺組織中，轉(zhuǎn)移標記物波形蛋白(vimentin)的表達。圖13是末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標記(TUNEL)分析的照 片，示出了在從給予根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的小鼠提取的小鼠肺組織 中的細胞凋亡誘導(dǎo)作用。圖14是微陣列分析的照片，示出了在從給予根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重 組蛋白的小鼠提取的小鼠肺組織中的差異基因表達。
具體實施例方式本發(fā)明提供可穿透細胞的Nm23重組蛋白(CP_Nm23)，其能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)移抑制因子 Nm23轉(zhuǎn)運到細胞中，其中轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23被融合至大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，由此賦予細胞穿 透性；以及編碼每一種所述可穿透細胞的Nm23重組蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的特征在于一種轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23，(其是能夠被引入到細胞中的大分 子)被融合至特定大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(下文稱為“MTD”)肽以便提供細胞穿透性，因而能 夠被有效地轉(zhuǎn)運到細胞中。該MTD肽可以融合至轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23的N-端、C-端或這兩 端。本發(fā)明涉及可穿透細胞的Nm23重組蛋白，其通過將轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23融合至能 夠介導(dǎo)大分子轉(zhuǎn)運到細胞中的三種MTD結(jié)構(gòu)域之一而被改造。如本文使用的，術(shù)語“可穿透細胞的Nm23重組蛋白”是指有MTD和轉(zhuǎn)移抑制蛋白 Nm23的共價結(jié)合復(fù)合體，其中它們通過遺傳融合或化學(xué)偶聯(lián)而功能性地連接。這里，術(shù)語 “遺傳融合”是指通過編碼這些蛋白的多核苷酸分子的遺傳表達，兩個或更多個蛋白或其片 段經(jīng)由它們的個體肽主鏈的共線性、共價連接。Nm23是這樣一種轉(zhuǎn)移抑制蛋白質(zhì)，其通過控制由KSR磷酸化介導(dǎo)的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 級聯(lián)反應(yīng)而抑制癌細胞的增殖、分化和遷移，并誘導(dǎo)細胞凋亡。Nm23具有SEQ ID NO :2表 示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :1表示的核苷酸序列。Nm23在信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)(包括KSR和Ras-介導(dǎo)的MAPK)中充當重要的靶蛋白。已有報道，Nm23是一種內(nèi)源性蛋白并且表現(xiàn)出NDP (二磷酸核苷)-激酶酶活性 (Biggs et al. , Cell 63，933-940，1990)。還發(fā)現(xiàn)Nm23是一種轉(zhuǎn)錄因子和細胞分化抑制 劑(I 因子)(Postel et al.，Science 261，478—480，1993 ；Okabe-kado et al.，Biochim. Biophys. Acta. 1267，101—106，1995)。在人體中，至今已經(jīng)鑒定了8 個 nm23 亞型(nm23-Hl，nm23-H2，DR-nm23，nm23-H4， nm23-H5, nm23_H6，nm23_H7 和 nm23_H8)，所有這些在調(diào)控轉(zhuǎn)移中都涉及(Rosengard et al. ,Nature 342,177-180,1989 ；Charpin C. et al. ,Int. J. Cancer 74，416-420，1997)。在 某些實施方式中，已經(jīng)構(gòu)建了 Nm23-Hl可穿透細胞的重組蛋白，但不限于此。
對于能夠被融合至轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23的MTD，可以使用具有選自由SEQ ID NO :4、 6、8和37至227組成的組中的氨基酸序列的可穿透細胞的肽。具有選自由SEQ ID NO :4、 6、8和37至227組成的組中的氨基酸序列之一的MTD是這樣一種可穿透細胞的多肽，其能 夠介導(dǎo)生物學(xué)活性分子如多肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或全長蛋白轉(zhuǎn)運跨過細胞膜。對于本發(fā)明，合 適的MTD包括，通過在由含有分泌的蛋白切割位點的N-端結(jié)構(gòu)域、疏水性結(jié)構(gòu)域和C-端結(jié) 構(gòu)域構(gòu)成的信號肽處形成螺旋結(jié)構(gòu)，而表現(xiàn)出細胞膜靶向活性的疏水區(qū)。這些MTD能夠直 接穿過細胞膜同時沒有引起任何細胞損傷、將靶蛋白轉(zhuǎn)運到細胞中，并由此允許該靶蛋白 表現(xiàn)出其期望的功能。具有由SEQ ID NO :4、6、8和37至227代表的氨基酸序列且能夠被融合至根據(jù)本 發(fā)明的轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23的MTD概括在下表Ia至11中。[表 la] [表 lb]
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11 [表 lc]
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說明書11/57頁
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CN 101918556 A
說明書17/57頁
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CN 101918556 A
說 明 書20/57頁
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23
MTD起源氨基酸序列SEQ ID NOJO-105NP_639721推定分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Val Ala Val Pro Leu Leu Val Val Ala139JO-106NP_854954保守的可能分泌蛋白 [牛分支桿菌AF2122/97]Ala Val Ala Val Ala Pro Val Ala Ala Ala Ala140JO-107NP_627759分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Ala Ala Ala Val Val Ala Ala Val Pro Ala Ala141JO-108NP_003842E1A-刺激基因的 細胞抑制劑[智人]Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Pro142JO-109NP_003842E1A-刺激基因 的細胞抑制劑[智人]Leu Leu Ala Leu Leu Val Pro143JO-110NP_003842E1A-刺激基因 的細胞抑制劑[智人]Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Leu Val144JO-111NP_000589智人胰島素樣生長 因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)Ala Ala Ala Leu Pro Leu Leu Val Leu Leu Pro145JO-112CAB59459推定分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Ala Ala Ala Val Pro Ala Ala Leu Ala Pro146JO-113NP_628917分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Ala Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala147JO-114NP_624695分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Ala Val Leu Ala Ala Ala Val Pro148JO-115NP_624695分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Val Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala149JO-116NP_624791分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Ala Leu Ala Leu Ala Val Pro Ala Val Leu Pro150
[表Ii]
JO-151NP_630126分泌殼多糖酶 (分泌蛋白) [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Ala Ala Ala Pro Val Ala Ala Val Pro185JO-152NP_872425分泌性蛋白 L0C348174 [智人]Leu Leu Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Pro186JO-153NP_630107分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Val Leu Ala Leu Leu Val Ala Val Val Pro187
[表Ij]
MTD起源氨基酸序列SEQID NOJO-154NP—733688肽結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Ala Leu Val Val Pro Ala Ala Val Pro188JO-155NP—629904分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Ala Val Val Leu Pro Leu Leu Leu Pro189JO-156YP—177852MCE-家族蛋白 MCE3A [結(jié)核分支桿菌H37Rv]Ala Val lie Pro Val Ala Val Leu Val Pro190JO-157CAA19627推定分泌溶解物 結(jié)合蛋白[天藍色鏈霉菌A3 (2)]Ala Ala Ala Val Pro Ala Ala Val Leu Ala Pro191JO-158NP—639884推定大分泌蛋白 [天藍色鏈霉菌A3 (2)]Val Ala Val Pro Val Val Leu Ala lie Leu Pro192JO-159P24327折疊酶蛋白prsA前體lie Ala lie Ala Ala lie Pro Ala lie Leu Ala Leu193JO-160CAB84808推定膜脂蛋白 [腦膜炎球菌Z2491]Ala Leu lie Ala Pro Ala Leu Ala Ala Pro194
[表lk]
JO-187NP—059120貓眼綜合癥關(guān)鍵區(qū) 蛋白1亞型a前體[智人]Leu Leu Leu Ala Val Ala Pro221JO-188NP—006519組織因子 途徑抑制劑2 [智人]Leu lie Leu Leu Leu Pro Leu Ala Ala Leu222[表11]
在一些實施方式中，本發(fā)明可以米用具有SEQ ID NO :3的核苷酸序列和SEQ ID NO 4的氨基酸序列的卡波西式成纖維細胞生長因子4(kFGF4)_來源的MTD(下文稱為 "MTD1")、具有SEQID NO 5的核苷酸序列和SEQ ID NO 6的氨基酸序列的J0-76MTD(其是 來源于環(huán)形泰勒蟲(Theileria annulata)的假設(shè)蛋白)(下文稱為“MTD2”)、以及具有SEQ ID NO 7的核苷酸序列和SEQID NO 8的氨基酸序列的J0-77MTD(其屬于人TMEM9結(jié)構(gòu)域
家族的成員B)(下文稱為“MTD3”)，作為能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23轉(zhuǎn)運到細胞中的MTD。根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中三種MTD(kFGF4 來源的MTD =MTD1, J0-76 =MTD2, J0-77 =MTD3)中的一個融合至轉(zhuǎn)移抑制蛋白Nm23的一個末 端或兩個末端，并且SV40大T抗原-來源的核定位序列(NLS) (SEQ ID NO 9的核苷酸序 列，SEQ ID NO 10的氨基酸序列)和對于易于純化的組氨酸標簽(His-Tag)親和性結(jié)構(gòu)域 融合至所得構(gòu)建體的一個末端。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過利用kFGF4來源的MTD、J0-76MTD、 J0-77MTD中的一個來構(gòu)建可穿透細胞的Nm23重組蛋白的8個全長形式。如本文使用的，術(shù)語“全長形式”是指這樣的構(gòu)建體，其包括轉(zhuǎn)移抑制蛋白Nm23的 整個氨基酸序列，其不包括在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基的任 何缺失、添加、插入或取代。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)當是顯而易見的，在本發(fā)明中 能夠使用包括通過在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基的缺失、添加、 插入或取代的各種類型的改變(其是在不會導(dǎo)致Nm23抗轉(zhuǎn)移作用退化的范圍內(nèi)作出的) 的Nm23衍生物。參照圖1，可穿透細胞的Nm23重組蛋白的全長形式如下1) His-MTDrNm23 (HM1N)，其中 kFGF4-來源的 MTD 融合至全長 Nm23 的 N-端，2) Hi S-Nn^S-MTD1 (HNM1)，其中 kFGF4_ 來源的 MTD 融合至全長 Nm23 的 C-端，3) Hi s-MTD1-Nm23-MTD1 (HM1NM1)，其中 kFGF4-來源的 MTD 融合至全長 Nm23 的兩個 末端，4) Hi s-MTD2-Nm23 (HM2N)，其中 J0-76MTD 融合至全長 Nm23 的 N-端，5) Hi s-Nm23-MTD2 (HNM2)，其中 J0-76MTD 融合至全長 Nm23 的 C-端，6) Hi s-MTD3-Nm23 (HM3N)，其中 J0-77MTD 融合至全長 Nm23 的 N-端，7)His-Nm23-MTD3(HNM3)，其中 J0-77MTD 融合至全長 Nm23 的 C-端，8) Hi S-MTD3-Nm23-MTD3 (HM3NM3)，其中 JO-77MTD 融合至全長 Nm23 的兩個末端，其中來源于SV40大T抗原的His-標簽和NLS共價偶聯(lián)于以上構(gòu)建體的N-末端。對于如上所述通過利用kFGF4_來源的MTD構(gòu)建的可穿透細胞的Nm23重組蛋 白的全長形式，His-MTD1-Nn^S(HM1N)具有SEQID NO :22表示的氨基酸序列，而編碼其的 多核苷酸具有SEQ IDNO :21表示的核苷酸序列；HiS-Nn^S-MTD1 (HNM1)具有SEQ IDNO 24表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :23表示的核苷酸序列；而 His-MTD1-Nn^S-MTD1(HM1W1)具有SEQ ID NO :26表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸 具有SEQID NO 25表示的核苷酸序列。對于如上所述通過利用J0-76MTD構(gòu)建的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的全長形 式，His-MTD2-Nm23 (HM2N)具有SEQ ID NO :28表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有 SEQ ID NO :27表示的核苷酸序列；而His-Nm23-MTD2(HNM2)具有SEQ ID N0:30表示的氨基 酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :29表示的核苷酸序列。對于如上所述通過利用J0-77MTD構(gòu)建的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的全 長形式，His-MTD3-匪23 (HM3N)具有SEQ ID NO :32表示的氨基酸序列，而編碼其的多 核苷酸具有SEQ ID NO :31表示的核苷酸序列；His-Nm23-MTD3 (HNM3)具有SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :33表示的核苷酸序列；而Hi s-MTD3-Nm23-MTD3 (HM3W3)具有SEQ IDNO 36表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具 有SEQ ID NO 35表示的核苷酸序列。作為用于可穿透細胞的Nm23重組蛋白的對照，構(gòu)建了 His-Nm23 (HN)，其中全長 Nm23僅融合至來源于SV40大T抗原的NLS和組氨酸標簽(His-Tag)而沒有任何MTD。該 對照蛋白具有SEQ ID NO :20表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO 19 表示的核苷酸序列。而且，本發(fā)明提供了一種含有編碼上述每一種可穿透細胞的Nm23重組蛋白的多 核苷酸的表達載體，以及一種能夠高水平生產(chǎn)每一種可穿透細胞的Nm23重組蛋白的轉(zhuǎn)化 體，其可通過利用所述表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞而獲得。如本文使用的，術(shù)語“表達載體”是能夠在合適的宿主細胞中表達靶蛋白或靶RNA 的載體。本發(fā)明的核苷酸序列可以在這樣的載體中，其中該核苷酸序列可操作地連接于能 夠提供用于通過合適宿主細胞表達所述核苷酸序列的調(diào)控序列。在表達載體的范圍內(nèi)，術(shù)語“可操作地連接”用來表示感興趣的核苷酸序列以允許 表達該核苷酸序列的方式連接至該調(diào)控序列。術(shù)語“調(diào)控序列”用于包括啟動子、增強子、 以及其他表達控制元件。這樣的與表達載體的可操作連接可以通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)基因 重組技術(shù)實現(xiàn)，而位點定向DNA切割和連接通過利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)酶來進行。適用于本發(fā)明的表達載體可以包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、病毒載體 等，但并不限于此。用于本發(fā)明的表達載體可以包含用于膜靶向或分泌的信號序列或引導(dǎo) 序列，以及調(diào)控序列如啟動子、操縱基因、起動密碼子、終止密碼子、多聚腺苷酸化信號、增 強子等。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動子。而且，表達載體可以包括一種或多種可選 標記基因，用于選擇含有該表達載體的宿主細胞，并且可以進一步包括能夠使該載體在上 述的宿主細胞中進行復(fù)制的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的表達載體可以通過pET28a(+PHNM1進行舉例說明，其中編碼 重組蛋白HNM1(其中kFGF4來源的MTD融合至全長Nm23的C-端)的多核苷酸插入到 pET-28a(+)載體的多個克隆位點(MCS)中的NdeI限制酶的切割位點中。在另一個實施方式中，本發(fā)明的多核苷酸被克隆入帶有His-標簽序列的 pET-28a(+)載體(N0Vagen，USA)，以便將六個組氨酸殘基融合至可穿透細胞的Nm23重組蛋 白的N-端，從而允許簡單的純化。因此，在上述表達載體中表達的可穿透細胞的Nm23重組蛋白具有這樣的結(jié)構(gòu)， 其中kFGF4-來源的MTD、J0-76MTD和J0-77MTD中的一個融合至全長或截短的Nm23，并且 His-標簽和NLS連接至其N-端。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化體，其能夠高水平生產(chǎn)每一種可穿透細胞的Nm23重組 蛋白，且可以通過利用所述表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞而獲得。適用于本發(fā)明的宿主細胞可以 是真核細胞如大腸桿菌。在本發(fā)明的一個實施方式中，用作宿主細胞的大腸桿菌用表達載 體例如含有編碼可穿透細胞的重組蛋白HNM1 (其中kFGF4-來源的MTD融合至根據(jù)本發(fā)明的 全長Nm23的C-端)的pET28a(+)-HNM1加以轉(zhuǎn)化，以便高水平生產(chǎn)可穿透細胞的Nm23重 組蛋白。用于轉(zhuǎn)化細菌細胞的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并且包括但不限于生化手段如轉(zhuǎn)化、 轉(zhuǎn)染、軛合(conjugation)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀，和應(yīng)用多聚陽離子如二乙基氨基乙 基(DEAE)葡聚糖，以及化學(xué)手段如電穿孔、直接微注射、微粒轟擊、磷酸鈣(CaPO4)沉淀、氯化鈣(CaCl2)沉淀、PEG-介導(dǎo)的融合和脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法。在一些實施方式中，通過分別用含有可穿透細胞的Nm23重組蛋白HM3N(其中 J0-77MTD融合至全長Nm23的N-端)的表達載體、和含有可穿透細胞的Nm23重組蛋白 HNM3 (其中J0-77MTD融合至其C-端)的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α獲得的轉(zhuǎn)化體，在韓 國大田廣域市 305-333 儒城區(qū)魚隱洞 52 號(52，Oun-Dong, Yusong-Ku, Taejon 305-333， Republic of Korea)的韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)典型培養(yǎng)物保藏中心 (KCTC)分別以登錄號KCTC-11380BP和KCTC-11381BP進行保藏。本文中提到的所有保藏是 依據(jù)布達佩斯條約于2008年8月28日進行的，并且保藏人對關(guān)于保藏的生物材料對公眾 的可獲得性施加的所有限制將在授予專利權(quán)后不可取消地去除。本發(fā)明提供了一種高水平生產(chǎn)可穿透細胞的Nm23重組蛋白的方法，其包括培養(yǎng) 上述轉(zhuǎn)化體的步驟。本發(fā)明的方法可以如下實施通過在被引入轉(zhuǎn)化體的表達載體中表達本發(fā)明的可 穿透細胞的Nm23重組蛋白的合適條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體。通過培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化體來表達重組蛋白的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并且例如可以如下實施通過在生長轉(zhuǎn) 化體的合適培養(yǎng)基中接種轉(zhuǎn)化體，進行傳代培養(yǎng)，將其轉(zhuǎn)移到主培養(yǎng)基中，在合適條件下培 養(yǎng)，例如補充有基因表達誘導(dǎo)物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并由此誘導(dǎo)重組蛋白 的表達。在培養(yǎng)完成之后，可以從培養(yǎng)溶液中回收“基本上純的”重組蛋白。術(shù)語“基本上純 的”是指本發(fā)明的重組蛋白和編碼其的多核苷酸在實踐和適于它們的計劃用途的程度上， 基本上沒有在自然或體內(nèi)系統(tǒng)中與它們一起發(fā)現(xiàn)的其他物質(zhì)。如上獲得的本發(fā)明的重組蛋白可以分離自宿主細胞的內(nèi)部或外部(例如培養(yǎng) 基)，并純化為基本上純的同源性多肽。用于多肽分離和純化的方法不限于任何特定方 法。實際上，任何標準方法都可以使用。例如，可以適當?shù)剡x擇和組合色譜法、過濾、超濾、 鹽析、溶劑沉淀、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳、透析 和重結(jié)晶，以分離和純化多肽。對于色譜法，例如親和性色譜、離子交換色譜、疏水性色譜、 凝膠過濾色譜、反相色譜、吸附性色譜等可以使用(Maniatis et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, N. Y,1982 ； Sambrook et al. ,Molecular Cloning :A LaboratoryManual,2d Ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 ；Deutscher, Μ. , Guide to Protein Purification Methods Enzymology vol.182. Academic Press. Inc. , San Diego, CA,1990)。同時，在根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中表達的重組蛋白，根據(jù)蛋白純化工藝方法的蛋白 質(zhì)特性可以分成可溶部分和不可溶部分。如果多數(shù)所表達的重組蛋白以可溶部分存在，則 重組蛋白可以根據(jù)如上所述的方法進行分離和純化。然而，當多數(shù)所表達的重組蛋白以不 可溶部分存在，即作為包涵體，則重組蛋白首先通過利用多肽變性劑例如脲、鹽酸胍，或去 污劑進行溶解，然后通過實施一系列離心、透析、電泳和柱色譜進行純化。由于多肽變性劑 引起結(jié)構(gòu)改變而存在喪失重組蛋白活性的危險，所以從不可溶部分純化重組蛋白的工藝要 求脫鹽和再折疊步驟。即，脫鹽和再折疊步驟通過用不包括多肽變性劑的溶液進行透析和 稀釋，或通過用過濾器進行離心而實施。而且，如果用于從可溶部分純化重組蛋白的溶液的 鹽濃度相對較高，則可以實施這樣的脫鹽和再折疊步驟。在一些實施方式中 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白大多數(shù)作為包涵體以不可溶部分存在。為了從不可溶部分純化重組蛋白，該不可溶部分可以溶解在含 有非離子表面活性劑如Triton X-100的溶胞緩沖液中，進行超聲處理，然后離心以分離沉 淀物。分離的沉淀物可以溶解在補加有強變性劑如脲的緩沖液中，并離心以分離上清液。以 上分離的上清液借助于組氨酸-標記的蛋白純化試劑盒進行純化，并進行超聲處理，例如 通過利用用于鹽去除和蛋白質(zhì)再折疊的超過濾器，從而獲得本發(fā)明的純化的重組蛋白。而且，本發(fā)明提供一種抗轉(zhuǎn)移藥物組合物，包括作為通過抑制癌細胞增殖、分化和 遷移并誘導(dǎo)細胞凋亡而防止轉(zhuǎn)移的有效成分的可穿透細胞的Nm23重組蛋白。轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23，其對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)(包括KSR和Ras-介導(dǎo)的MAPK)是重要 的靶蛋白，能夠控制通過KSR磷酸化介導(dǎo)的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，并由此抑制癌細胞的增殖、 分化和遷移并誘導(dǎo)凋亡。因此，本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白可以有效地被用作能 夠預(yù)防和/或治療癌轉(zhuǎn)移的抗轉(zhuǎn)移劑。本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白，通過有效地將轉(zhuǎn)移抑制蛋白Nm23引入細 胞中，而可以激活在誘導(dǎo)響應(yīng)于DNA損傷或致癌信號的細胞周期停滯和凋亡的ATM和p53 激活中涉及的細胞信號機制。因此，本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白可以有效地用作 治療各種類型的人癌癥的抗轉(zhuǎn)移劑。包含本發(fā)明的重組蛋白作為有效成分的藥物組合物可以進一步包括適于口服 給藥或非腸道給藥的藥用載體。如本文使用的，“藥用載體”如本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的， 包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌 劑，抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘結(jié)劑、賦形 劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、風(fēng)味劑、染料、這類的材料以及它們的組合(Remington' s PharmaceuticalSciences，19th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995)。用于 口服給藥的載體可以包括乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。在口服給藥的情 況下，本發(fā)明的重組蛋白可以以可咀嚼片劑、口含片劑、含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、晶 片或其組合的形式，通過與載體混合而進行配制。而且，用于非腸道給藥的載體可以包括 水、合適的油、鹽水、含水葡萄糖、乙二醇等，并且可以進一步包括穩(wěn)定劑和防腐劑。適用于 本發(fā)明的穩(wěn)定劑可以包括抗氧化劑如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉和抗壞血酸。合適的防腐劑可 以包括氯化芐烷銨、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯和氯丁醇。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成各種非腸道或口服給藥形式。非腸道制劑的代表 性實例包括設(shè)計為通過注射給藥的那些。對于注射，本發(fā)明的重組蛋白可以配制成含水溶 液，特別是在生理學(xué)相容性緩沖液或生理鹽水緩沖液中。這些注射制劑可以使用一種或多 種分散劑、潤濕劑和懸浮劑，通過常規(guī)方法進行配制。對于口服給藥，蛋白質(zhì)可以通過組合 這些蛋白與本領(lǐng)域熟知的藥用載體而易于配制。這樣的載體使得本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以配制 成片劑、丸劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等，用于待治療病人口服攝取。這樣的口 服固體制劑可以包括合適的賦形劑，如稀釋劑(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、 纖維素和/或甘氨酸)和潤滑劑(例如膠體硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、和/或 聚乙二醇)。片劑可以包括粘結(jié)劑，如硅酸鋁、淀粉、明膠、樹膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基 甲基-纖維素、羧甲基纖維素鈉、和/或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，以及崩解劑如交聯(lián)聚乙烯 基吡咯烷酮、瓊脂、或海藻酸或它們的鹽，如海藻酸鈉。如果需要，可以加入吸附劑、著色劑、 風(fēng)味劑和/或甜味劑。這些制劑可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法通過混合、顆粒化或涂覆
39而制得。如果必要，本發(fā)明的藥物組合物可以進一步包括藥物添加劑，如防腐劑、抗氧化 劑、乳化劑、緩沖劑和/或用于調(diào)節(jié)滲透性的鹽以及其他治療有效物質(zhì)，并且可以根據(jù)本領(lǐng) 域已知的常規(guī)方法進行配制。另外，本發(fā)明的藥物組合物可以經(jīng)由口服途徑或非腸道途徑如靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi) 或腹膜內(nèi)進行給藥。口服給藥可以包括舌下給藥。非腸道給藥可以包括點滴輸入和注射如 皮下注射、肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射和瘤內(nèi)注射。本發(fā)明的重組蛋白的總有效量可以以單劑量給予病人或可以通過分開的治療方 案給予，其中多個劑量在更長的時間內(nèi)給予。盡管在本發(fā)明藥物組合物中的重組蛋白或編 碼其的核酸的量可以根據(jù)疾病嚴重度變化，但是該蛋白或核酸通?？梢砸? 20mg的有效 劑量每天給予多次。然而，本發(fā)明藥物組合物中的重組蛋白的合適劑量可以取決于許多因 素，如病人的年齡、體重、健康狀況、性別、疾病嚴重度、飲食和排泄，以及給藥途徑和要給予 的治療數(shù)量。鑒于以上因素，本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員可以確定在各種人癌癥中作為用于防 止轉(zhuǎn)移的抗轉(zhuǎn)移劑的重組蛋白的有效劑量。含有重組蛋白的本發(fā)明的藥物組合物對其配 制、給藥途徑和/或給藥模式?jīng)]有特別限制，只要表現(xiàn)出本發(fā)明的效果即可。[實施例]提供以下實施例用來更詳細地舉例說明本發(fā)明的實施方式，但不以任何方式限制 其范圍。實施例1-可穿透細胞的Nm23重組蛋白(CP_Nm23)的構(gòu)建8個全長形式的可穿透細胞的Nm23 (CP-Nm23)重組蛋白通過利用kFGF4_來源的 MTD (MTD1), J0-76MTD (MTD2)和J0-77MTD (MTD3)作為大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域進行構(gòu)建。參照圖1，CP_Nm23重組蛋白的全長形式如下DHis-MTD1-Nn^S(HM1N),其中 kFGF4_ 來源的 MTD 融合至全長 Nm23 的 N-端，2) Hi S-Nn^S-MTD1 (HNM1)，其中 kFGF4_ 來源的 MTD 融合至全長 Nm23 的 C-端，3) Hi s-MTD1-Nm23-MTD1 (HM1NM1)，其中 kFGF4-來源的 MTD 融合至全長 Nm23 的兩個 末端，4) Hi s-MTD2-Nm23 (HM2N)，其中 J0-76MTD 融合至全長 Nm23 的 N-端，5) Hi s-Nm23-MTD2 (HNM2)，其中 J0-76MTD 融合至全長 Nm23 的 C-端，6) Hi s-MTD3-Nm23 (HM3N)，其中 J0-77MTD 融合至全長 Nm23 的 N-端，7) Hi s-Nm23-MTD3 (HNM3)，其中 J0-77MTD 融合至全長 Nm23 的 C-端，8) Hi S-MTD3-Nm23-MTD3 (HM3NM3)，其中 JO-77MTD 融合至全長 Nm23 的兩個末端，其中來源于SV40大T抗原的His-標簽和NLS共價偶聯(lián)于以上構(gòu)建體的N-末端。為了制備全長CP_Nm23重組構(gòu)建體，通過利用在下表1中描述的寡核苷酸作為對 于每一個重組構(gòu)建體特異的引物對并將人Nm23cDNA(SEQ ID NO 1)作為模板，來實施聚合 酶鏈反應(yīng)(PCR)。用于擴增HM1N的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO :13和12表示的核 苷酸序列；用于擴增HNM1的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO :11和14表示的核苷酸序 列；用于擴增HM1W1的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO 13和14表示的核苷酸序列； 用于擴增HM2N的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO 15和12表示的核苷酸序列；用于擴 增HNM2的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO :11和16表示的核苷酸序列；用于擴增HM3N
40的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO :17和12表示的核苷酸序列；用于擴增HNM3的正向 和反向引物分別具有SEQ ID NO 11和18表示的核苷酸序列；用于擴增HM3NM3的正向和反 向引物分別具有SEQID NO 17和18表示的核苷酸序列。作為對于每個重組蛋白特異的正向和反向引物組的寡核苷酸概括在下表2中。[表 2]
引物SEQ ID NO序列HN-5， (30nt)11CCG CAT ATG GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTCHN-3， (33nt)12CCG CATATG TCATTC ATAGAT CCAGTT CTGAGCHM1N-S' (72nt)13CCG CAT ATG GCA GCC GTT CTT CTC CCT GTT CTT CTT GCC GCA CCC GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTCATTGCGΗΝΜ「3，(72nt)14CCG CAT ATG TCA GGG TGC GGC AAG AAG AAC AGG GAG AAG AAC GGC TGC TTC ATA GAT CCA GTT CTG AGC ACAΗΜ2Ν-5' (60nt)15CCG CAT ATG GCG CTG GTG CTG CCG CTG GCG CCG GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTC ATT GCGΗΝΜ2-3' (60nt)16CCG CAT ATG TCA CGG CGC CAG CGG CAG CAC CAG CGC TTCATAGAT CCAGTT CTGAGCACAΗΜ3Ν-5， (63nt)17CCG CAT ATG GCG GTG GCG CTG CTG ATT CTG GCG GTG GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTC ATT GCGHNM3-S' (63nt)18CCG CAT ATG TCA CAC CGC CAG AAT CAG CAG CGC CAC CGC TTC ATA GAT CCA GTT CTG AGC ACA在 50 μ 1 含有 IOOng 作為模板的人 Nm23cDNA、0. 2mM dNTP 混合物(dGTP，dATP, dTTP和dCTP，每一個為2mM)、0. 6μΜ的每個引物、5μ 1的IOx Taq緩沖液、1 μ 1的Taq聚 合酶(Takara，Japan)的反應(yīng)混合物中實施PCR。在94°C 2分鐘的初始變性后，以94°C 45 秒、53°C45秒和72°C45秒實施PCR 25個循環(huán)，接著在72°C 5分鐘進行最后伸展。在完成 PCR之后，擴增的PCR產(chǎn)物用限制酶NdeI消化并加載到1. 0%瓊脂糖凝膠上進行分離。如圖2a和2b所示，確認了融合至kFGF4-來源的MTD、J0-76MTD和J0-77MTD中的一個的每一 個重組構(gòu)建體的預(yù)期片段被成功地擴增。預(yù)期大小的DNA帶從凝膠切除，洗脫，并通過利用QIAquick凝膠提取試劑盒 (Qiagen, USA)純化。洗脫的DNA用乙醇沉淀并在蒸餾水中再懸浮用于連接。如圖3a所 示，含有編碼區(qū)的PCR擴增的DNA片段根據(jù)TA克隆方法，利用T4連接酶，亞克隆入pGEM_T Easy載體(Promega，Magison WI，USA)中，接著用該pGEM-T Easy載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)細胞。這些細胞鋪放到補充50 μ g/ml氨芐西林的LB平板培養(yǎng)基上，并在37°C下培 養(yǎng)過夜。在重組片段插入的pGEM-T Easy載體中，通過用限制酶NdeI在37°C處理1小時而 被分離之后，進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳。如圖3b所示，檢測到大約0. 5kb全長形式的DNA片段和大約3kb的載體片段，確 認了 CP-Nm23重組構(gòu)建體的插入DNA適于被亞克隆入pGEM_T Easy載體中。帶有組氨酸標簽的pET_28(+)a載體(Novagen, Madison, WI)和T7啟動子用限 制酶NdeI (Enzynomics, Korea)消化。含有CP_Nm23重組片段和pET_28 (+) a載體片段的 pGEM-T Easy載體片段通過利用QIAquick凝膠提取試劑盒進行純化。每一個pGEM-TEasy 載體片段被克隆入在16°C利用T4連接酶預(yù)處理12小時的pET-28a(+)中，接著用所得 pET28a(+)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(圖4a)。在克隆體用限制酶NdeI (Enzynomics，Korea)處理并經(jīng)過0. 8 %瓊脂糖凝膠 電泳之后，證實檢測到大約0. 5kb全長形式的DNA片段和大約5kb的載體片段，確認了 pET28a(+)載體中CP-Nm23重組構(gòu)建體的插入DNA的克隆，如圖4b所示。將用于表達可穿透細胞的Nm23重組蛋白的成功克隆的表達載體分別指定為 pET28a(+) -HM1N, pET28a (+)-HW” pET28a (+)-HM1W1、pET28a (+)-HM2N、pET28a (+)-HNM2、 pET28a (+) -HM3N, pET28a (+) -HNM3 和 pET28a (+) -HM3NM3。在它們之中，通過分別用表達載 體pET28a (+) -HM3N和pET28a (+) -HNM3轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體DH5 α / HM3Nm23和DH5 α/HNm23M3，依據(jù)布達佩斯條約于2008年8月28日，在韓國大田廣域市 305-333 儒城區(qū)魚隱洞 52 號(52，Oun-Dong, Yusong-Ku, Taejon 305-333，Republic of Korea)的韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)分別以登 錄號 KCTC-11380BP 和 KCTC-11381BP 進行保藏。序列測定分析的結(jié)果如下對于如上所述通過利用kFGF4_來源的MTD構(gòu)建的可穿透細胞的Nm23重組蛋 白的全長形式，His-MTD1-Nn^S(HM1N)具有SEQID NO :22表示的氨基酸序列，而編碼其的 多核苷酸具有SEQ IDNO :21表示的核苷酸序列；HiS-Nn^S-MTD1 (HNM1)具有SEQ IDNO 24表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :23表示的核苷酸序列；而 His-MTD1-Nn^S-MTD1(HM1W1)具有SEQ ID NO :26表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸 具有SEQID NO 25表示的核苷酸序列。對于如上所述通過利用J0-76MTD構(gòu)建的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的全長形 式，His-MTD2-NM23 (HM2N)具有SEQ ID NO :28表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有 SEQ ID NO :27表示的核苷酸序列；而His-Nm23-MTD2(HNM2)具有SEQ ID N0:30表示的氨基 酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :29表示的核苷酸序列。對于如上所述通過利用J0-77MTD構(gòu)建的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的全長形式，His-MTD3-匪23 (HM3N)具有SEQ ID NO :32表示的氨基酸序列，而編碼其的多 核苷酸具有SEQ ID NO :31表示的核苷酸序列；His-Nm23-MTD3 (HNM3)具有SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :33表示的核苷酸序列；而 Hi s-MTD3-Nm23-MTD3 (HM3W3)具有SEQ IDNO 36表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具 有SEQ ID NO 35表示的核苷酸序列。作為用于可穿透細胞的Nm23重組蛋白的對照，構(gòu)建了 His-Nm23 (HN)，其中全長 Nm23僅融合至來源于SV40大T抗原的NLS和組氨酸標簽(His-Tag)而沒有任何MTD。該 對照蛋白具有SEQ ID NO :20表示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO 19 表示的核苷酸序列。實施例2-重組蛋白的表達<2_1>最佳菌株的選擇為了選擇對于以上實施例1中制得的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的表達的最佳 菌株，以下實驗在大腸桿菌BL21 (DE3)、BL21-金(DE3)、BL21-密碼子(BL21_Codonplus) (DE3)和BL21-金(DE3)pLysS菌株(Stratagene, USA)中實施，它們都含有LacI啟動子。首先，根據(jù)熱休克方法，將表達載體pET28a(+)_■#、pET28a(+)-HNM1、 pET28a(+)-HM1W1和pHN(對照)中的每一個分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)、BL21-金 (DE3)、BL21-密碼子(DE3)和BL21-金(DE3) pLysS菌株。而且，根據(jù)熱休克方法，將表達載 體 pET28a (+) -HM2N, pET28a (+) -HNM2、pET28a (+) -HM3N、pET28a (+) -HNM3 和 pET28a (+) -HM3W3 中的每一個分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。在轉(zhuǎn)化之后，細胞在含有50 μ g/ml氨芐西 林的LB瓊脂平板中進行培養(yǎng)。在該平板上形成的菌落，在Iml培養(yǎng)基中在37°C下生長過夜， 培養(yǎng)基在劇烈搖晃下，在IOOml的LB培養(yǎng)基中在37°C下培養(yǎng)，直至光密度600 (0D_)達到 0. 5。然后以終濃度0. 7mM向其加入IPTG (異丙基- β -D-硫代半乳糖苷)，以誘導(dǎo)CP_Nm23 重組蛋白的表達。蛋白誘導(dǎo)在30°C下持續(xù)2小時。大腸桿菌培養(yǎng)溶液通過在4°C、7000xg 下離心20分鐘收集，在溶胞緩沖液(IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris-HCl，8M脲，pH 8.0)中再懸 浮，并利用裝配有探針的近距離聲波定位器在冰上進行超聲處理。細胞溶胞產(chǎn)物以14000xg 離心15分鐘，以便分離不可溶部分與可溶部分。由此獲得的在具有IPTG的大腸桿菌菌株 中表達的CP-Nm23重組蛋白的可溶和不可溶部分加載到SDS-PAGE凝膠上。如圖5所示，盡管一些細胞可溶性Nm23重組蛋白在BL21-金(DE3)中以較低水平 表達，但是大多數(shù)可穿透細胞的Nm23重組蛋白在該菌株中表現(xiàn)出最高表達水平。根據(jù)這些 結(jié)果，選擇BL21-金(DE3)作為用于根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的表達的最 佳菌株。<2_2>重組蛋白的表達將表達載# pET28a(+)-HMlN, pET28a (+)-HNM1, pET28a (+)-HM1NM1, pET28a (+) -HM2N, pET28a (+)-HNM2、pET28a (+) -HM3N, pET28a (+) -HNM3 和 pET28a (+)-HM3W3 中的每一個轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)(在以上實施例2的部分<2_1>中選擇作為最佳菌 株)中，接著根據(jù)實施例2的部分<2-1>中描述的相同方法，通過加入0.7mM IPTG而誘導(dǎo) 它們的表達。之后，將從其獲得的CP-Nm23重組蛋白的可溶和不可溶部分加載到SDS-PAGE 凝膠上。如圖6所示，確認了在宿主細胞中表達的可穿透細胞的Nm23重組蛋白(19
4320kDa)大多數(shù)作為包涵體包括在不可溶部分中，并且它們的表達在IPTG存在下顯著增大。實施例3-重組蛋白的純化和再折疊<3_1>重組蛋白的純化可穿透細胞的Nm23重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中的可誘導(dǎo)表達導(dǎo)致形成不可溶聚 集體，其被稱為包涵體。為了徹底地溶解這些包涵體，以上所有表達的蛋白通過將它們?nèi)芙?在用作強變性劑的8M脲中加以變性。首先，用表達載體pETZSaGPH^N、pET28a(+)-HNM1、pET28a(+)-HM1Wp pET28a (+) -HM2N, pET28a (+)-HNM2、pET28a (+) -HM3N, pET28a (+) -HNM3 和 pET28a (+)-HM3W3 中的每一個轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株在IL如實施例2中描述的LB培養(yǎng)基中進行培 養(yǎng)。每一個培養(yǎng)溶液通過離心進行收集，在沒有形成氣泡的情況下，溫和地再懸浮在20ml 溶胞緩沖液(HN禾PHNM1 :50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOmM咪唑，ρΗ 8. 0 ；其他CP_Nm23 :100mM NaH2PO4, IOmM Tris-HCl，8M脲，ρΗ 8.0)中，并利用裝配有微小尖端的近距離聲波定位器在 冰上進行超聲處理。細胞間歇地聲處理30秒，接著冷卻10秒，同時將功率設(shè)置為25%的最 大功率?？偮曁幚頃r間為5分鐘。細胞溶胞產(chǎn)物在4°C、4000xg下離心20分鐘，以便分離 上清液和細胞碎片沉淀物。上清液加載到M-NTA瓊脂糖樹脂上，其中次氮基三乙酸瓊脂糖 加載有鎳(Ni)。Ni-NTA瓊脂糖樹脂用溶胞緩沖液平衡。通過在4°C溫和搖晃(使用旋轉(zhuǎn) 搖床)8小時或更長，以允許上清液吸附到樹脂上。吸附有包涵體(含有重組蛋白)的樹脂 在4°C、IOOOxg下離心5分鐘，以去除樹脂溶液并用清洗緩沖液(HN和HNM1 :50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOmM 咪唑，ρΗ 6· 3 ；其他 CP_Nm23 =IOOmM NaH2PO4,1 OmMTris-HC1,8M 脲，ρΗ 6. 3)清洗5次以去除非特異性吸附物質(zhì)。在清洗之后，吸附至樹脂的蛋白用洗脫緩沖液(HN 和 HNM1 :50mMNaH2P04,300mM NaCl, IOmM 咪唑，ρΗ 4. 5 ；其他 CP_Nm23 =IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris-HCl，8M脲，ρΗ 4.5)在ρΗ 4. 5的酸性條件下，在攪拌下洗脫2小時或更長。洗脫的蛋 白質(zhì)用12% SDS-PAGE凝膠電泳進行分析，用考馬斯亮藍R通過溫和搖晃進行染色，并用脫 染色溶液加以脫染色。根據(jù)圖6所示的結(jié)果，分別融合至kFGF4-來源的MTD、J0-76MTD和J0-77MTD的所 有可穿透細胞的Nm23重組蛋白，作為對應(yīng)于大約19 20kDa的單個帶進行檢測，這確認了 本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白已從不可溶部分純化出來。<3-2>重組蛋白的再折疊由于如在以上實施例3的部分<3_1>描述的，從不可溶部分純化的本發(fā)明的可穿 透細胞的Nm23重組蛋白通過強變性劑如8M脲加以變性，所以變性的蛋白必須通過如下再 折疊工藝變成活性形式。首先，純化的重組蛋白通過在再折疊緩沖液(0. 55M鹽酸胍，0. 88M L-精氨酸，50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, ImM EDTA, IOOmM NDSB，ImM 谷胱甘肽氧化的，以及 ImM 谷胱甘肽還 原的)中，在4°C下對它們進行透析24小時，由此去除變性劑。所有再折疊的重組蛋白通 過利用透析袋(蛇皮皺褶物，PIERCE)在4°C針對細胞培養(yǎng)基DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Medium)透析10小時，同時攪拌。培養(yǎng)基每3小時用新鮮DMEM進行取代。通過再折 疊工藝轉(zhuǎn)化成活性形式的本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白在以下實驗中使用。實施例4_Nm23重組蛋白的穿透細胞性的定量分析為了定量確定根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的細胞穿透性，通過動物模型中的FACS(熒光活化細胞分選)來分析引入細胞中的蛋白，如下。在以上實施例3的部分<3_2>中再折疊成它們的活性形式的可穿透細胞的Nm23 重組蛋白用FITC(熒光素-5-異硫氰酸酯，分子探針)進行標記。該重組蛋白(2 20mg) 與1 μ 1的濃度為333mg/ml的FITC混合，并于室溫下溫和攪拌在暗室中反應(yīng)1小時。反應(yīng) 溶液在4°C對DMEM透析2天，直到未反應(yīng)的FITC完全除去，由此獲得FITC軛合的重組蛋 白。由此獲得的FITC軛合重組蛋白進行布拉德福德蛋白測定儀測量蛋白濃度。結(jié)果，測得 每一種FITC軛合的重組蛋白具有大約0. 7 μ g/ μ 1的濃度。同時，將來源于小鼠巨噬細胞的RAW 264. 7細胞保持在補充有10%胎牛血清和 青霉素/鏈霉素(500mg/ml)的DMEM中并在37°C下在5% CO2氣體的潮濕環(huán)境中進行孵育。在孵育之后，細胞用ΙΟμΜ的上面制備的各種FITC軛合的重組蛋白(HM1N, HNM1, HM1Wi, HM3N, HNM3和HM3NM3)處理，接著進一步在37°C下將它們培養(yǎng)1小時。隨后， 細胞用胰蛋白酶/EDTA(T/E，Invitrogen)處理以去除細胞表面結(jié)合蛋白，用冷PBS(磷 酸緩沖鹽水)清洗三次，然后通過利用FACS(熒光活化的細胞分選)Calibursystem(B eckton-Dichinson)的CellQuest Pro軟件程序進行流式細胞儀分析。每個樣品的細胞濃 度為IxlO4個細胞/μ 1，并且該分析進行兩次或更多次。根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23 重組蛋白的細胞穿透性通過將其與沒有融合至MTD的對照蛋白進行比較而確定。圖7a和7b示出了流式細胞儀分析的結(jié)果，其中灰色填充曲線僅代表細胞，黑色曲 線僅代表FITC，藍色曲線代表沒有融合至MTD(HN)的對照蛋白的細胞穿透性，紅色曲線代 表可穿透細胞的重組蛋白HM1I HM3N> HNM3和HM3NM3的細胞穿透性，綠色曲線代表可穿透細 胞的重組蛋白HNM1的細胞穿透性，而橙色曲線代表可穿透細胞的重組蛋白HM1W1的細胞穿 透性。參照圖7a和7b中所示的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所有的可穿透細胞的Nm23重組蛋白表現(xiàn)出比對 照蛋白顯著更高的細胞穿透性。 實施例5-Nm23重組蛋白的顯微細胞穿透性分析為了將遞送到細胞中的人Nm23蛋白的細胞內(nèi)定位可視化，將NIH 3T3細胞(韓國 細胞系庫，韓國首爾)用FITC軛合的重組蛋白(HM1N, HNM1, HM1W1，HM2N, HNM2, HM3N, HNM3和 HM3NM3)處理并通過共聚焦激光掃描顯微鏡進行可視化。首先，將NIH 3T3細胞在8孔室載玻片(LabTek，Nalgen Nunc)中培養(yǎng)24小時。 NIH3T3細胞保持在補充有10%胎牛血清和5%青霉素/鏈霉素(500mg/ml)的DMEM中并在 37°C下在5% CO2氣體的潮濕環(huán)境中進行孵育。在細胞用PBS清洗三次后，細胞分別用無血 清DMEM、含有FITC的無血清DMEM和含10 μ M各種FITC-軛合的重組蛋白的DMEM在37°C 下在5% CO2氣體中進行處理。1小時之后，細胞在室溫下用4%低聚甲醛固定20分鐘。為了直接檢測被內(nèi)化的FITC軛合的重組蛋白，細胞用PBS清洗三次并用核熒光 染色溶液(PI，Sigma-Aldrich)進行復(fù)染。細胞用濃度為1 μ g/ml的PI染色5分鐘，接 著用PBS清洗三次。為了保持重組蛋白的FITC熒光，在觀察前將載玻片在10 μ 1的含有 DABCO(Fluca)的聚乙烯醇包埋劑中固定15分鐘。熒光的細胞內(nèi)分布利用諾馬斯基過濾器 在通過共聚焦激光掃描顯微鏡分析的單個細胞中部進行確定。共聚焦激光掃描顯微鏡用于 觀察細胞形態(tài)、FITC熒光和PI熒光。FITC在488nm激發(fā)并在530nm處借助于帶通濾波器 (bandpass filter)進行檢測。
如圖8a至8c所示，觀察到相比于僅細胞、僅FITC和缺少MTD的對照蛋白，用FITC 和PI染色的可穿透細胞的Nm23重組蛋白在細胞核中良好地大范圍地分布。根據(jù)本發(fā)明融 合至kFGF4-來源的MTD、J0-76MTD和J0-77MTD中的一個的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的 細胞內(nèi)定位與通過上述流式細胞儀確定的細胞穿透性一致。根據(jù)這些結(jié)果，確認本發(fā)明的 可穿透細胞的Nm23重組蛋白表現(xiàn)出高的細胞穿透性。實施例6-可穿透細胞的Nm23重組蛋白對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用為了確認根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的體內(nèi)功能，通過蛋白質(zhì)印 跡研究了重組蛋白對三種類型的癌細胞系的生物化學(xué)功能。MDA-MB-435和MDA-MB-231細胞，在本實驗中使用的高度轉(zhuǎn)移性人乳癌細胞系，購 自韓國細胞系庫(韓國首爾)。將這些細胞系在37°C下在5% CO2氣體的孵育器中保持在補 充有10 % FBS和1 %青霉素/鏈霉素(500mg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基(L-谷氨酸300mg/l， 25mM HEPES和25mM NaHCO3)中。CCL-185細胞(一種人肺癌細胞系)獲自ATCC并在37°C 下在5% CO2氣體的孵育器中保持在補充有10% FBS和青霉素/鏈霉素(500mg/ml)的 HamF-12K培養(yǎng)基(2mM L-谷氨酸，1500mg/l碳酸氫鈉)中。在將2ml補充FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基加入到6孔板的每個孔之后，MDA-MB-435、 MDA-MB-231和CCL-185細胞孵育至5xl06個細胞/ml的濃度。孔板在37°C下孵育1天以便 允許細胞生長同時粘附至孔板。在取出培養(yǎng)基之后，粘附至孔板的細胞用冷PBS清洗。接 著，細胞用500 μ 1濃度為10 μ M的各種可穿透細胞的Nm23重組蛋白和缺少MTD的Nm23對 照蛋白(HN)進行處理，并在37°C下在5% CO2氣體的孵育器中反應(yīng)1小時。MDA-MB-435細 胞用HM1N, HNM1, HM1W1, HM2N, HNM2, HM3N、HNM3和HM3匪3重組蛋白中的每一種進行處理，而 MDA-MB-231和CCL-185細胞用HM3N、HNM3和HM3NM3重組蛋白中的每一種進行處理。在反應(yīng) 完成之后，細胞用PBS清洗兩次，然后在上述相同條件下在有血清下分別培養(yǎng)2、4、6和8小 時。在培養(yǎng)完成之后，將細胞懸浮在200 μ 1的溶胞緩沖液(20mMHEPES，pH 7.2,1% Triton-X, 10%甘油和蛋白酶抑制劑)中并在冰上進行超聲處理30分鐘，以由此獲得細胞 溶胞產(chǎn)物。細胞溶胞產(chǎn)物在4°C以12000rpm離心20分鐘以分離上清液。由此獲得的上清 液進行布拉德福德蛋白測定儀定量地測量蛋白濃度。將重組蛋白以25 μ M的濃度再懸浮在 SDS-PAGE加載緩沖液中以制備細胞溶解產(chǎn)物樣品。由此制得的細胞溶胞產(chǎn)物樣品在90°C 加熱5分鐘，然后儲存在-80°C至使用。對于蛋白質(zhì)印跡分析，將p21(21kDa，Cell SignalingTechnology)、 phospho-p53 (Serl5, 53kDa, Cell Singaling)、phospho-MEK (Ser217/221，45kDa，Cell Signaling)和 phospho-Erk(Thr202/Tyr204，42/44kDa，Cell Signaling)用作第一抗體， 并將羊抗 _ 小鼠 IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology)和羊抗-兔 IgG-HRP (SantaCruz Biotechnology)用作第二抗體。細胞溶胞產(chǎn)物樣品在100V施加至12% SDS-PAGE達2小時 并在100V轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PDVF)膜上達90分鐘。為了防止印跡蛋白和不相關(guān)抗體 之間的非特異性相互作用，PVDF膜在室溫下用5%在TBS/T(10mM Tris-Cl, pH 8. 0,150mM NaCl,0. 05% Tween 20)中的無脂干奶粉封閉1小時。在去除封閉緩沖液之后，PVDF膜用 TBS/T清洗，接著在4°C用每一種第一抗體(用新制備的封閉緩沖液以1 10000比率稀釋 的)孵育1小時。在去除第一抗體溶液之后，該膜TBS/T清洗5次，每次5分鐘，并在室溫
46下用第二抗體(用新制備的封閉緩沖液以1 5000比率稀釋)孵育1小時。在用TBS/T 清洗5次之后，該膜利用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng)(GE Healthcare Amersham UK)染 色以可視化抗原/抗體相互作用。如圖9a和9b所示，在用可穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的細胞中，相比于用對 照蛋白處理的細胞，KSR絲氨酸392(其是MAPK級聯(lián)的支架蛋白)的磷酸化被增強，而誘導(dǎo) 腫瘤細胞周期活化的MEK的磷酸化(P-MEK)被減少。尤其是，其中J0-77MTD分別融合至 N-端和C-端的HM3N和HNM3重組蛋白在所有三種類型的人癌細胞系中強烈地抑制ERK和 MEK的磷酸化。實施例7-可穿透細胞的Nm23重組蛋白的體外抗轉(zhuǎn)移作用<7_1>侵入實驗為了考察腫瘤轉(zhuǎn)移在用根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的癌細胞 中是否通過阻礙癌細胞遷移而被抑制，侵入實驗實施如下。首先，將人乳癌細胞系MDA-MB-435細胞在沒有生長因子下在補充有10% FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天，將細胞用胰蛋白酶處理并收集，接著懸浮在相同的 RPMI 1640培養(yǎng)基中。細胞用缺少MTD的Nm23對照蛋白(HN)、以及根據(jù)本發(fā)明的可穿透細 胞的匪23重組蛋白(HM2N，HNM2, HM3N, HNM3和HM3NM3)中的每一種在37°C以10 μ M的濃度處 理1小時。同時，將孔徑為3μπι的trans-well聚碳酸酯膜過濾器(BD Falcon)的上部分 用Matrigel (每孔40 μ 1 ；BD Bioscience)涂覆。向小室的下部分，加入補充有10% FBS的 DMEM培養(yǎng)基作為粘附基質(zhì)。將用上述蛋白質(zhì)處理的細胞懸浮在補充有0. FBS的DMEM培 養(yǎng)基中以制備細胞懸液。由此制得的細胞懸液在trans-well膜過濾器上孵育(每孔IxlO5 個細胞)，并在37°C下在5% CO2孵育器中培養(yǎng)20至24小時。過濾器用PBS清洗，并通過 利用棉簽去除在上部分的表面上殘留的非侵入性細胞。通過基質(zhì)膠(Matrigel)并移動到 過濾器下部分的侵入性細胞用4%低聚甲醛固定5至10分鐘，并用0. 5% (w/v)hemacolor 染色10至20分鐘。遷移到該膜過濾器的基座表面的細胞數(shù)量(紫色)通過用光學(xué)顯微鏡 觀察進行計數(shù)。根據(jù)圖IOa和IOb所示的結(jié)果，與對照蛋白(HN)相比，在用大多數(shù)可穿透細胞的 Nm23重組蛋白HM2N、HM3N和HNM3處理的細胞的情況下，細胞的侵入顯著減少。根據(jù)這些結(jié) 果，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白能夠有效地抑制體內(nèi)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移 能力。<7_2>傷口遷移測定為了考察根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白是否能夠抑制具有高遷移 活性的乳癌細胞系MDA-MB-435細胞的遷移，傷口遷移實驗實施如下。MDA-MB-435細胞在 60-mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)直至它們形成覆蓋底部的匯合的單層。在孵育之后，細胞用缺少MTD的 Nm23對照蛋白(HN)和根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白(HM2N，HNM2,HM3N,HNM3和 HM3NM3)中的每一種在37°C以10 μ M的濃度處理1小時。在細胞用PBS清洗之后，它們被 無菌黃色尖端形成傷口，由此形成將匯合區(qū)域與空白區(qū)域分開的參考線。細胞中加入補充 有10% FBS的RPMI培養(yǎng)基(3mL)，接著在37°C下在5% CO2孵育器中培養(yǎng)24小時。細胞 用PBS清洗，用甲醇固定1分鐘，用Geimsa(Chameleon Chemical)染色5分鐘，然后，用蒸 餾水清洗。利用40x放大的倒置光學(xué)顯微鏡(inverted lightmicroscope)，通過計數(shù)從傷口邊緣遷移到空白區(qū)域中的細胞數(shù)對遷移進行定量。參考圖11所示的結(jié)果，與對照蛋白相比，腫瘤細胞的遷移在用可穿透細胞的Nm23 重組蛋白，尤其是HM2N、HM3N和HNM3處理的細胞中被顯著抑制，這與來自上述侵入測定的結(jié)
果一致。實施例8-可穿透細胞的Nm23重組蛋白的體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移作用為了考察已在體外確認的可穿透細胞的Nm23重組蛋白對腫瘤轉(zhuǎn)移的體內(nèi)抑制作 用，免疫組織化學(xué)分析實施如下。首先，將MDA-MB-435細胞(一種高轉(zhuǎn)移性人乳癌細胞系)以IxlO6個細胞/ml的 濃度懸浮在0. Iml PBS中并注射到5周齡MHC (主要組織相容性復(fù)合物)-缺陷型Balb/c nu/nu小鼠的外尾靜脈。20只小鼠分成4組，每組5只小鼠。將融合J0-77MTD的可穿透細 胞的Nm23重組蛋白(HM3N, 300 μ g)、載體(PBS，300 μ g)和缺少MTD的Nm23對照蛋白(HN， 300 μ g)、以及其中J0-77MTD融合至EGFP的N-端的EGFP重組蛋白(HM3E)中的每一種給 予小鼠。這里，融合MTD的EGFP重組蛋白用作對照以考察融合至Nm23的J0-77MTD對Nm23 表達是否有作用。在將MDA-MB-435細胞注射到小鼠之后5周，每天將這些蛋白經(jīng)靜脈內(nèi)注 射給予每組的小鼠達21天。在從每組選取三只小鼠并殺死之后，從其提取肺組織樣品。每 組中剩下的其他兩只小鼠在給藥結(jié)束后進一步觀察14天，然后，從其提取肺組織樣品。將 肺組織樣品用Bouin固定溶液固定過夜，用于檢測轉(zhuǎn)移性群落，用蒸餾水清洗，然后埋入石 蠟中以制備石蠟塊。由此制得的石蠟塊用超薄切片機切割成具有4 μ m的厚度，其中切片固 定在載玻片上并用二甲苯處理5分鐘，處理三次以去除石蠟。載玻片用波形蛋白作為轉(zhuǎn)移 標記物進行免疫組織化學(xué)染色。對于免疫組織化學(xué)染色，將抗-波形蛋白抗體(Abeam)用作第一抗體，而羊抗-小 鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)用作第二抗體。為了防止印跡蛋白和不相關(guān)抗 體之間的非特異性相互作用，載玻片在攪拌下在室溫下用在TBS/T(IOmM Tris-Cl,pH 8.0， 150mM NaCl,0. 05% Tween 20)中的無脂奶粉封閉1小時。在去除封閉緩沖液之后，載玻片 用TBS/T清洗三次，接著在4°C用作為第一抗體的抗-波形蛋白抗體(用PBSWl 200比 率稀釋的)孵育1小時。在去除第一抗體溶液之后，載玻片用TBS/T清洗5次，每次5分鐘， 并在室溫下用作為第二抗體的羊抗_小鼠IgG-HRP(用PBS以1 200比率稀釋的)孵育 1小時。在用TBS/T(0. 025% Triton-X 100)清洗兩次之后，載玻片用DAB基質(zhì)染色以檢測 波形蛋白。圖12a示出了在給予根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白達21天之后，光 學(xué)觀察從小鼠提取的肺組織的結(jié)果，并且也從可穿透細胞的Nm23重組蛋白在給予結(jié)束后 14天的小鼠提取。如圖12a所示，盡管用這些蛋白處理21天，在用賦形劑、對照蛋白(HN) 和MTD融合的EGFP重組蛋白(HM3E)處理的小鼠的肺組織中，腫瘤生長顯著增加。而且，腫 瘤大小在隨后的2周非處理期之后沒有減小，并且新形成的腫瘤在其他周圍組織中發(fā)現(xiàn)， 表明發(fā)生轉(zhuǎn)移。然而，在用根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白(HM3N)處理的小鼠 的肺組織中，不僅在3周的蛋白質(zhì)處理期間沒有形成腫瘤，而且在隨后的2周非處理期間也 沒有腫瘤形成，表明腫瘤形成和轉(zhuǎn)移被該可穿透細胞的Nm23重組蛋白質(zhì)有效地抑制。圖12b示出了免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果，示出了在從小鼠提取的肺組織中，在給 予根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白達21天(第21天)之后，以及從可穿透細胞的Nm23重組蛋白給予終止14天后(第35天)的小鼠提取的肺組織中，轉(zhuǎn)移性標記物 波形蛋白的表達。如圖12b所示，在用賦形劑、對照蛋白(HN)和MTD融合的EGFP重組蛋白 (HM3E)處理的小鼠的肺組織中，在第21天和第35天均檢測到波形蛋白，而在用根據(jù)本發(fā)明 的可穿透細胞的Nm23重組蛋白(HM3N)處理的小鼠肺組織中在第21天和第35天均沒有檢 測到波形蛋白。根據(jù)這些結(jié)果，確認了根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白在體內(nèi)能 夠有效地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。實施例9-在給予可穿透細胞的Nm23重組蛋白之后的體內(nèi)細胞凋亡誘導(dǎo)作用為了考察在給予可穿透細胞的Nm23重組蛋白之后在腫瘤組織中誘導(dǎo)細胞凋亡的 作用，通過利用如實施例8中描述的相同小鼠模型，實施TUNEL(末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶 介導(dǎo)的dUTP切口末端標記)測定。TUNEL測定通過利用原位細胞死亡檢測試劑盒(TMR red, Roche)實施。具體地，將可穿透細胞的Nm23重組蛋白(HM3N)、賦形劑和作為對照的HN、以及融 合MTD的EGFP重組蛋白(HM3E)中的每一種，根據(jù)如實施例8中所述的相同方法，經(jīng)靜脈內(nèi) 注射每天給予分成4組的小鼠。在從每組選取三只小鼠并殺死之后，從其提取肺組織樣品。 每組中剩下的其他兩只小鼠在給藥結(jié)束后進一步觀察14天，然后，從其提取肺組織樣品。 將肺組織樣品埋入石蠟中以制備石蠟塊。由此制得的石蠟塊用超薄切片機切割成4 μ m的 厚度，并固定到載玻片上。載玻片用二甲苯處理5分鐘，處理三次以去除石蠟。然后按順序 用100%乙醇兩次5分鐘、和90%、80%及70%乙醇每個3分鐘處理，以便使肺組織脫水，培 養(yǎng)基在PBS中孵育5分鐘。載玻片用溶解在0.檸檬酸鈉溶液中的0. i%Trition X-100 處理8分鐘，并用PBS清洗兩次2分鐘，在向載玻片加入一滴TUNEL反應(yīng)緩沖液(50 μ 1， Roche,USA)之后，載玻片在37°C的潮濕孵育器中孵育1小時，用PBS清洗三次，然后利用熒 光顯微鏡進行觀察。參考圖13所示的結(jié)果，在用賦形劑、對照蛋白(HN)和MTD融合的EGFP重組蛋白 處理的小鼠肺組織中沒有顯著的組織學(xué)變化，而在用可穿透細胞的Nm23重組蛋白(HM3N) 處理的小鼠肺組織中，觀察到染成紅色的表示細胞凋亡特性的區(qū)域，確認根據(jù)本發(fā)明的可 穿透細胞的Nm23重組蛋白的誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。而且，還觀察到在用根據(jù)本發(fā)明的可穿 透細胞的Nm23重組蛋白處理的小鼠肺組織中，在給藥結(jié)束后14天的仍在癌細胞中誘導(dǎo)細 胞凋亡。實施例10-在給予可穿透細胞的Nm23重組蛋白之后蛋白表達譜的比較為了檢測根據(jù)本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的腫瘤組織中的蛋白表 達譜的變化，微陣列測定實施如下。具體地，根據(jù)如以上實施例9中描述的相同方法，將可穿透細胞的Nm23重組蛋白 (HM3N)、賦形劑和HN(對照)中的每一種，經(jīng)靜脈內(nèi)注射給予分成三組的小鼠達21天，然后 在給藥結(jié)束之后保留14天。在給藥結(jié)束后的14天，從每組中提取肺組織樣品并用液氮冷 凍。根據(jù)制造商說明，通過利用TRIZOL試劑(Invitrogen)從肺組織分離總RNA，并用無RNA 酶的DNA酶(Life Technologies, Inc.)處理，由此完全地去除殘留基因組DNA。根據(jù)制造商說明，通過利用Low RNA Input Linear Amplification試劑盒 (Agilent Technology)，由此分離的RNA進行靶cRNA探針的合成和雜交。簡而言之，將 IygS RNA與T7啟動子特異性引物混合并在65°C下反應(yīng)10分鐘。通過混合第一鏈緩沖液(firststrand buffer) (5x)、0. IM DTTUOmM dNTP 混合物、RNase-Out (RNA 酶抑制劑)和 MMLV-RT (反轉(zhuǎn)錄酶)制備cDNA主混合物(master mix)，并加入到反應(yīng)混合物中。所得混 合物在40°C反應(yīng)2小時，接著在60°C反應(yīng)15分鐘，從而終止反轉(zhuǎn)錄和dsDNA合成。根據(jù)制 造商說明，通過混合轉(zhuǎn)錄緩沖液(4x)、0. IM DTT, NTP混合物、50% PEG、RNase_0ut、無機焦 磷酸酶、T7-RNA聚合酶和酞菁(3/5-CTP)制備轉(zhuǎn)錄主混合物。由此制得的轉(zhuǎn)錄基本混合物 加入到dsDNA反應(yīng)混合物中并在40°C反應(yīng)2小時以便實施dsDNA轉(zhuǎn)錄。根據(jù)制造商說明， 由此擴增和標記的cRNA用cRNA收集模型(Cleanup Module) (Agilent Technology)純化。 標記的靶cRNA通過利用ND-1000分光光度計(NanoDropTechnologies，Inc.)進行定量。 在檢測了標記有效性之后，cRNA與封閉劑(IOx)和片段化緩沖液(fragmentation buffer) (25x)混合，并在60°C反應(yīng)30分鐘以便實施cRND的片段化。分段的cRNA再懸浮在雜交緩 沖液(2x)中并直接滴到全人基因組寡聚微陣列(Whole Human Genome Oligo Microarray) (44K)上。該微陣列在65°C在雜交爐(Agilent Technology)中雜交17小時，接著根據(jù)制 造商說明進行清洗(Agilent Technology) 0通過利用DNA微陣列掃描儀(Agilent Technology)讀出雜交譜并通過利用特征 提取軟件(Feature Extraction Software) (AgilentTechnology)進行定量。折疊改變的 基因的數(shù)據(jù)標準化和選擇通過利用Gene Spring GX 7. 3軟件(Agilent Technology)實 施。通過用標準化信號通道強度除以標準化對照通道強度來計算標準化比值的平均值。根 據(jù) Gene Ontology Consortium(http //www. geneontology. org/index, shtml)，通過利用 Gene SpringGX 7. 3軟件(Agilent Technology)執(zhí)行對于基因的功能注釋。微陣列分析的結(jié)果概括在圖14和表3至表9中，其中表3示出了細胞凋亡相關(guān)基 因的表達譜，表4示出了細胞粘附相關(guān)基因的表達譜，表5示出了細胞周期調(diào)控相關(guān)基因的 表達譜，表6a和6b示出了細胞生長相關(guān)基因的表達譜，表7示出了細胞增殖相關(guān)基因的表 達譜，表8a和8b示出了免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達譜，而表9示出了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達譜。
[表 3]
[表 4] [表 5] [表6b]
腫瘤壞死因子受體超家族， 成員17NMOl16080. 654. 426. 810. 083/0. 00 9V-maf肌腱膜纖維肉瘤致癌 基因家族，蛋白B(鳥類)NMO106580. 832. 032. 450. 203/0. 02 3白介素7受體NM—0083720. 822. 362. 860. 195/0. 01 7Fgfrl致癌基因伴侶NM—2012300. 491. 152. 330. 031/0. 32 8 [表8b] [表 9] 如上表3所描述的，對于細胞凋亡相關(guān)基因，與用對照蛋白處理的小鼠組相比， 在用可穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的小鼠組中，半胱天冬酶14(CaSpaSe 14)、細胞死 亡誘導(dǎo)DFFA-樣效應(yīng)子c (Cidec)、細胞死亡誘導(dǎo)DNA片段化因子和α亞單位-樣效應(yīng)子 A(Cidea)的表達分別被上調(diào)大約3. 5，4. 0，2. 5和2. 5倍。如上表4所描述的，對于細胞粘附_相關(guān)基因，與用對照蛋白治療的小鼠組相比， 在用可穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的小鼠組中，鈣粘蛋白-樣26的表達被下調(diào)大約3.0倍。如上表5所描述的，對于細胞周期調(diào)控相關(guān)基因，與用對照蛋白處理的小鼠 組相比，在用可穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的小鼠組中，鳥類成紅細胞增多癥病毒 E-26(v-ets)致癌基因的表達被下調(diào)大約4. 0倍。如上表6a和6b所描述的，對于細胞生長相關(guān)基因，與用對照蛋白處理在小鼠組 相比，在用可穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的小鼠組中，在腫瘤壞死因子受體超家族的成 員17的表達被上調(diào)大約6. 8倍的同時，上顎、肺和鼻表皮癌瘤相關(guān)基因的表達被下調(diào)大約 26. 0 倍。如上表7所描述的，對于細胞增殖相關(guān)基因，與用對照基因處理的小鼠組相比，在 用可穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的小鼠組中，轉(zhuǎn)錄本6的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子的表達被 上調(diào)大約5倍。如上表8a和8b所描述的，對于免疫應(yīng)答相關(guān)基因，與對照蛋白處理的小鼠組相 比，在用可穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的小鼠組中，免疫球蛋白重鏈(J558家族)、免疫 球蛋白重鏈復(fù)合體和免疫球蛋白結(jié)合鏈的表達被分別上調(diào)大約18、15和30倍如上表9所描述的，對于轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，與用對照蛋白處理的小鼠組相比，在用可
58穿透細胞的Nm23重組蛋白處理的小鼠組中，fascin同源物1(肌動蛋白成束蛋白)、前列腺 素內(nèi)過氧化物合成酶2和血管細胞粘附分子1的表達分別被上調(diào)大約2. 5,2. 5和2. 0倍。盡管以舉例說明的目的詳細描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當理解，這樣的詳述僅用于舉 例說明的目的，在不背離通過所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域 技術(shù)人員能夠?qū)Ρ九秲?nèi)容作出改變。工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白通過有效地將轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23引入到細 胞中，而能夠誘導(dǎo)KSR的磷酸化和失活，并且抑制Ras-介導(dǎo)的MAPK級聯(lián)反應(yīng)。因此，本發(fā) 明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白通過抑制癌細胞的增殖、分化和遷移，而能夠有效地被用 作能夠防止癌轉(zhuǎn)移的抗轉(zhuǎn)移劑。用于專利程序目的國際承認的關(guān)于微生物保藏布達佩斯條約國際形式原始保藏的接收根據(jù)條約第7. 1條公布的寄至Ij JO, Daewoong residing at 1—1209，Samic Apt. 869Dogok_dong, Gangnam-gu, Seoul 135-270Republic of Korea 用于專利程序目的國際承認的關(guān)于微生物保藏布達佩斯條約國際形式原始保藏的接收根據(jù)條約第7. 1條公布的
I.；微生物鑒定保藏人給出的識別參考國際保藏機構(gòu)給出的登錄號大腸桿菌KCTC 1138IBPDH5@/HNm23 M3II.科學(xué)描述和/或提供的分類學(xué)命名在以上第I條中鑒定的微生物附帶[X]科學(xué)描述□提供的分類學(xué)命名(適用的地方用χ標記)III.收到和接受本國際保藏機構(gòu)接受在以上第I條中鑒定的微生物，其是在2008年8月28曰收到的。IV、要求保存的收到本國際保藏機構(gòu)收到在以上第I條中鑒定的4敖生物并且收到要求依據(jù)布達佩斯條約進行保藏的保存原始保藏的請求。V、國際保藏機構(gòu)名稱韓國典型培養(yǎng)物保藏中心具有代表授權(quán)官員的國際保藏機構(gòu)的權(quán)地址韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)研力的個人簽名究所(KRIBB)111 Gwahangno, Yuseong-gu,Daejeon 305-806OH, Hee-Mock,主任Republic of Korea日期2008年9月3日
60
權(quán)利要求
一種可穿透細胞的Nm23重組蛋白，包含大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(MTD)和人轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23，所述MTD融合至具有SEQID NO2表示的氨基酸序列的所述人轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23的N 端、C 端或者這兩端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可穿透細胞的Nm23重組蛋白，其中，所述MTD具有選自由SEQ ID NO :4、6、8以及37至227組成的組中的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可穿透細胞的Nm23重組蛋白，其中，所述MTD選自由具有 SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列的kFGF4(卡波西式成纖維細胞生長因子4)來源的MTD、具 有SEQ ID NO :6表示的氨基酸序列的J0-76MTD和具有SEQID NO :8表示的氨基酸序列的 J0-77MTD組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可穿透細胞的Nm23重組蛋白，進一步包含核定位序列(NLS)和組氨酸標簽親和性結(jié)構(gòu)域，所述核定位序列和組氨酸標簽親和性 結(jié)構(gòu)域共價連接至所述重組蛋白的一個末端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的可穿透細胞的Nm23重組蛋白，其中，所述重組 蛋白選自由以下組成的組一種重組蛋白，其中具有SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列的kFGF4-來源的MTD融合至 具有SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的全長Nm23的N-端；一種重組蛋白，其中具有SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列的kFGF4-來源的MTD融合至 具有SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的全長Nm23的C-端；一種重組蛋白，其中具有SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列的kFGF4-來源的MTD融合至 具有SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的全長Nm23的兩端；一種重組蛋白，其中具有SEQ ID NO 6表示的氨基酸序列的J0-76MTD融合至具有SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的全長Nm23的N-端；一種重組蛋白，其中具有SEQ ID NO 6表示的氨基酸序列的J0-76MTD融合至具有SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的全長Nm23的C-端；一種重組蛋白，其中具有SEQ ID NO 8表示的氨基酸序列的J0-77MTD融合至具有SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的全長Nm23的N-端；一種重組蛋白，其中具有SEQ ID NO 8表示的氨基酸序列的J0-77MTD融合至具有SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的全長Nm23的C-端；以及一種重組蛋白，其中具有SEQ ID NO 8表示的氨基酸序列的J0-77MTD融合至具有SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的全長Nm23的兩端。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的可穿透細胞的Nm23重組蛋白，其中，所述重組 蛋白具有選自由SEQ ID NO :20、22、24、26、28、30、32、34和36組成的組中的氨基酸序列。
7.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的可穿透細胞的Nm23重組蛋白的多核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸具有選自由SEQID NO: 19、 21、23、25、27、29、31、33和35組成的組中的核苷酸序列。
9.一種包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的多核苷酸的表達載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達載體，其中，所述表達載體選自由pET28a(+)-■#、 pETZSaGPHW” pET28a (+)-HM1W1、pET28a (+)-HM2N、pET28a (+)-HNM2、pET28a (+)-HM3N、 pET28a (+) -HNM3 和 pET28a (+) -HM3W3 組成的組。
11.一種包含根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達載體的轉(zhuǎn)化體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述轉(zhuǎn)化體是大腸桿菌DH5α / HM3Nm23(KCTC-11380BP)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述轉(zhuǎn)化體是大腸桿菌DH5α / HNm23Ms (KCTC-11381BP)。
14.一種生產(chǎn)可穿透細胞的Nm23重組蛋白的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn) 化體。
15.一種藥物組合物，包含作為有效成分的根據(jù)權(quán)利要求1所述的可穿透細胞的Nm23 重組蛋白以及藥用載體，其通過抑制癌細胞的增殖、分化或遷移以起到防止轉(zhuǎn)移的作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了可穿透細胞的Nm23重組蛋白，其中大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(MTD)被融合至轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23。還公開了編碼可穿透細胞的Nm23重組蛋白的多核苷酸、包含可穿透細胞的Nm23重組蛋白的表達載體、以及用于抑制轉(zhuǎn)移的藥物組合物，該藥物組合物包含作為有效成分的可穿透細胞的Nm23重組蛋白。本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白可以通過有效地將轉(zhuǎn)移抑制因子Nm23引入到細胞中而誘導(dǎo)KSR磷酸化和失活并且抑制Ras-介導(dǎo)的MAPK級聯(lián)反應(yīng)。因此，本發(fā)明的可穿透細胞的Nm23重組蛋白可以有效地用作抗轉(zhuǎn)移劑，其能夠通過抑制癌細胞的增殖、分化和遷移而防止癌轉(zhuǎn)移。
文檔編號C07H21/02GK101918556SQ200880114597
公開日2010年12月15日 申請日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月4日
發(fā)明者樸基淑, 杜蘭鳳, 趙大雄 申請人:株式會社普羅賽爾制藥