專利名稱：：使用編碼bmp-7的重組載體的關(guān)節(jié)軟骨基因療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組載體，包括此種重組載體的藥物組合物，以及確保在脊椎動(dòng)物中的軟骨修復(fù)和/或減緩骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展和/或逆轉(zhuǎn)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的方法。本發(fā)明還涉及能夠在宿主中表達(dá)屬于成骨蛋白質(zhì)-1/骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)-7(ΟΡ-1/ΒΜΡ-7)蛋白質(zhì)家族的生物學(xué)活性多肽的載體。本發(fā)明還涉及用此種載體的關(guān)節(jié)內(nèi)基因療法。
背景技術(shù)：
：骨關(guān)節(jié)炎(OA)是脊椎動(dòng)物關(guān)節(jié)的慢性退行性疾病。疼痛是OA的主要表現(xiàn)癥狀。具有OA的包括人、哺乳動(dòng)物，特別是運(yùn)動(dòng)馬(athlectichorse)、犬和貓?jiān)趦?nèi)的脊椎動(dòng)物具有一般伴隨承重和活動(dòng)而惡化并且伴隨休息而改善的疼痛，以及在不活動(dòng)時(shí)段后所涉及關(guān)節(jié)的晨僵和膠凝(gelling)。疾病的此種體征與癥狀通常以生活質(zhì)量的下降而達(dá)到頂峰。這種疾病在部分身體關(guān)節(jié)中更頻繁，特別是髖、膝、肩、肘、腕間和跗骨間(intertarsus)關(guān)節(jié)?？蓜?dòng)關(guān)節(jié)是脊椎動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)器官。由于覆蓋長(zhǎng)骨接合表面的關(guān)節(jié)軟骨的獨(dú)特生物學(xué)、化學(xué)和機(jī)械性質(zhì)，它們達(dá)到幾乎無(wú)摩擦運(yùn)動(dòng)。關(guān)節(jié)在滑膜腔或關(guān)節(jié)間隙內(nèi)發(fā)生，其內(nèi)膜表面由滑膜襯里，并且在其內(nèi)通常存在小容量的潤(rùn)滑滑液。特定關(guān)節(jié)例如膝具有另外的非關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)，稱為半月板。滑膜襯有纖維囊，在其外存在支持關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的關(guān)節(jié)外肌群和韌帶。在人類中目前的OA影響是巨大的，并且在許多方面比得上缺血性心臟病的影響。隨著嬰兒潮時(shí)期的人達(dá)到成年晚期并且肥胖流行盛行，OA將呈現(xiàn)對(duì)社會(huì)甚至更大的影響。在較年輕的群體中，參加接觸性運(yùn)動(dòng)或活動(dòng)例如過(guò)度賽跑的運(yùn)動(dòng)員也處于關(guān)于發(fā)展OA的高危險(xiǎn)中。在獸醫(yī)學(xué)中，OA在馬和犬中是非常常見的，但也在貓中識(shí)別出，盡管處于較低程度。在馬匹產(chǎn)業(yè)中，由于關(guān)節(jié)損傷和疾病的跛行是在賽馬中運(yùn)動(dòng)功能減少和損耗的最普遍原因?？傊P(guān)節(jié)損傷和關(guān)節(jié)疾病代表馬臨床醫(yī)生的絕大多數(shù)病例量。馬OA可以來(lái)自各種原因，其中創(chuàng)傷和伴發(fā)性滑膜炎是馬機(jī)能缺乏的最常見原因。通常OA起始于使運(yùn)動(dòng)馬傾向于對(duì)軟骨的不適當(dāng)生物機(jī)械力的過(guò)度使用或構(gòu)造機(jī)能不全。在犬中，OA是最常見的慢性肌肉骨骼疾病和跛行原因之一。它通常繼發(fā)于先天性或獲得性肌肉骨骼病癥。數(shù)種關(guān)節(jié)病可以影響幼犬并且導(dǎo)致繼發(fā)性O(shè)A，包括關(guān)節(jié)發(fā)育不良、剝落性骨軟骨病、肘突離裂(ununitedanconealprocess)和膝蓋骨脫臼。除發(fā)育異常外，存在與軟骨退化相關(guān)的許多獲得性肌肉骨骼病癥。在某些情況下，創(chuàng)傷可能直接誘導(dǎo)分離的軟骨損害，這可以是擴(kuò)展的和進(jìn)行性的退行性損害的開始。在韌帶損害后，軟骨損傷可能由于關(guān)節(jié)不穩(wěn)定性在數(shù)周后出現(xiàn)。由于不完全骨折復(fù)位，關(guān)節(jié)內(nèi)骨折通常并發(fā)于繼發(fā)性軟骨降解。關(guān)節(jié)脫位或脫位復(fù)位通常并發(fā)于韌帶和囊傷害和/或軟骨損害。越來(lái)越多地認(rèn)為肥胖是對(duì)于犬OA的重要危險(xiǎn)因素，如它在人類醫(yī)學(xué)中一樣。OA的特征在于生物化學(xué)和酶促變化、軟骨斷裂和損失、骨贅形成和骨質(zhì)硬化。盡管并未完全了解OA的原因，但影響關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的生物化學(xué)應(yīng)激、關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中的生物化學(xué)變化、以及遺傳因素在OA發(fā)病機(jī)制中都是重要的。最通常地，炎癥性過(guò)程在滑膜、軟骨、關(guān)節(jié)囊或軟骨下骨中開始，并且迅速起始來(lái)自最初創(chuàng)傷組織的炎癥介質(zhì)的級(jí)聯(lián)。這通常引起炎癥性過(guò)程進(jìn)入次級(jí)組織內(nèi)的“多米諾效應(yīng)”，所述次生組織轉(zhuǎn)而釋放炎癥介質(zhì)。與物種無(wú)關(guān)，與OA相關(guān)的分子和細(xì)胞炎癥事件涉及花生四烯酸代謝產(chǎn)物在細(xì)胞膜中的釋放。這轉(zhuǎn)而借助于前列腺素起始疼痛。透明質(zhì)酸在關(guān)節(jié)液中的降解起因于炎癥途徑的化學(xué)引誘物和副產(chǎn)物、溶酶體酶、和由受損滑膜細(xì)胞加工的非溶酶體酶、以及來(lái)自嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的氧衍生自由基。關(guān)節(jié)軟骨的降解視為OA的絕對(duì)必要條件。肉眼可見的發(fā)現(xiàn)包括關(guān)節(jié)軟骨中的纖顫、侵蝕和磨損線。組織學(xué)特征包括淺表纖顫，這可以進(jìn)展以形成下至軟骨下骨的垂直裂縫。通常關(guān)節(jié)軟骨的蛋白聚糖含量隨同膠原的破壞一起減少。這導(dǎo)致軟骨中水?dāng)z取的增加，導(dǎo)致生物力學(xué)“更柔軟的”軟骨表面。這些發(fā)現(xiàn)還可以伴隨軟骨細(xì)胞壞死和關(guān)節(jié)軟骨的最終全層喪失。病理變化也可以在關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)中發(fā)生。軟骨下骨骨硬化通常伴隨軟骨退化，并且透明和鈣化關(guān)節(jié)軟骨之間的分界線變得被血管所穿透。這些變化的慢性進(jìn)展導(dǎo)致在關(guān)節(jié)邊緣處關(guān)節(jié)周唇形變的形成，由于軟骨和軟骨下骨沿著關(guān)節(jié)邊界的進(jìn)行性過(guò)度生長(zhǎng)。關(guān)節(jié)囊的滑液襯里和纖維層在OA中改變?；ぷ兊贸溲⑼噬驮龊?。在組織學(xué)上，滑膜細(xì)胞顯得肥大，并且淋巴質(zhì)漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可能存在于滑液組織的內(nèi)膜下間質(zhì)中。眾多醫(yī)學(xué)治療已廣泛用于治療OA。迄今為止，大多數(shù)治療已針對(duì)降低并且隨后維持在傷害關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥程度的降低。相對(duì)較少的注意力集中于如下治療劑，其實(shí)際上保護(hù)關(guān)節(jié)組織，并且由InternationalLeagueAgainstRheumatism(ILAR)指導(dǎo)方針而分類為“疾病緩解”O(jiān)A藥物(DMOAD)。理論上，用這類藥物的治療應(yīng)阻止、延緩或逆轉(zhuǎn)OA的形態(tài)學(xué)軟骨損害。非類固醇抗炎藥(NSAID)和皮質(zhì)類固醇已是抗炎療法的主要方式。盡管非類固醇抗炎藥通常提供癥狀緩解，但該藥物對(duì)關(guān)節(jié)軟骨提供很少的保護(hù)和再生，也不改變潛在的疾病過(guò)程。許多NSAID也與不希望有的副作用的顯著發(fā)生相關(guān)，使得其長(zhǎng)期使用成為問(wèn)題。皮質(zhì)類固醇也常用于治療OA，并且是減少疼痛和炎癥的有力介導(dǎo)物。然而，報(bào)告了對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的不利作用，包括受損的軟骨細(xì)胞活性，減少的葡糖氨基聚糖和蛋白聚糖含量和減少的軟骨彈性。在獸醫(yī)實(shí)踐中，上述療法有時(shí)相組合用于對(duì)關(guān)節(jié)損傷的累加如果非協(xié)同的應(yīng)答。通常NSAID或類固醇與透明質(zhì)酸治療相組合，以改善關(guān)節(jié)液的粘彈性和關(guān)節(jié)內(nèi)軟組織的邊界潤(rùn)滑?；颊咭步?jīng)常給予腸胃外以及經(jīng)口多硫酸化葡糖氨基聚糖(PSGAG)，以支持或促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝活性且抑制細(xì)胞因子或前列腺素對(duì)軟骨的有害作用。盡管沒(méi)有良好控制的臨床研究評(píng)估這種“獵槍(shotgun)”方法，但每種藥物具有有利作用，并且迄今為止未報(bào)告來(lái)自使用這些療法的許多不同模式的不良反應(yīng)。OA中的治療干預(yù)通過(guò)無(wú)法使治療劑直接靶向進(jìn)入關(guān)節(jié)內(nèi)而部分地被進(jìn)一步阻礙。一般的經(jīng)口、靜脈內(nèi)和肌內(nèi)途徑相對(duì)無(wú)效，因?yàn)樾》肿油ㄟ^(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入關(guān)節(jié)間隙，并且大分子(例如蛋白質(zhì))被排除關(guān)節(jié)間隙外。盡管關(guān)節(jié)內(nèi)施用繞過(guò)這些限制，但直接施用到關(guān)節(jié)間隙內(nèi)的大多數(shù)試劑的半衰期仍很短，并且需要頻繁的關(guān)節(jié)內(nèi)注射，以維持對(duì)于慢性疾病的延長(zhǎng)治療的生物學(xué)活性。總之，迄今為止，沒(méi)有治療劑有效且無(wú)副作用地消除OA的進(jìn)展。因此存在對(duì)用于人類和獸醫(yī)應(yīng)用的真正創(chuàng)新DMOAD策略的迫切醫(yī)學(xué)需要。近來(lái)，已證實(shí)先前已知促進(jìn)骨形成和治愈的成骨蛋白質(zhì)I(OP-I)，別名骨形態(tài)生成蛋白7CBMP-7)，在關(guān)節(jié)軟骨再生和修復(fù)中起顯著作用，潛在地充當(dāng)DM0AD。各種研究已顯示，當(dāng)暴露于BMP-7時(shí)，間充質(zhì)細(xì)胞具有潛能以分化成在表型上表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞。這些細(xì)胞在體外和體內(nèi)產(chǎn)生具有對(duì)關(guān)節(jié)軟骨特異的II型膠原和蛋白聚糖的基質(zhì)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)已在各種動(dòng)物模型包括犬大型全層骨軟骨缺陷模型中得到證實(shí)。已觀察到所獲得的修復(fù)組織具有透明樣外觀，并且在長(zhǎng)期動(dòng)物研究中得到維持。然而，BMP-7用于OA療法的使用并非沒(méi)有局限性和潛在的并發(fā)癥。當(dāng)僅注射到關(guān)節(jié)內(nèi)時(shí)，由于通過(guò)滑液血管化從關(guān)節(jié)間隙中快速消除，在溶液中重組純化的BMP-7蛋白質(zhì)不提供預(yù)期治療益處。蛋白質(zhì)在關(guān)節(jié)內(nèi)的短半衰期要求重組BMP-7蛋白質(zhì)包括在合適的生物學(xué)載體材料內(nèi)，以確保緩慢釋放和持續(xù)的局部濃度。生物學(xué)載體進(jìn)一步確保用于細(xì)胞和血管移植的移植穩(wěn)定性和物理網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致軟骨形成。包括在生物學(xué)載體中的高濃度重組蛋白質(zhì)(例如在綿羊創(chuàng)傷后實(shí)驗(yàn)OA模型中通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射每一周施用2次的340μgOP-I輸注(HurtigMB等人，ProceedingsCombinedOrthopaedicResearchSociety,070，2004年10月)，在牛衍生的I型膠原裝置中的350μgBMP-7修復(fù)在犬科手術(shù)誘導(dǎo)的全層骨軟骨缺陷的關(guān)節(jié)軟骨缺陷(CookS.D.等人，J.BoneJointSurgery,2003，85(3)116-123))。就實(shí)踐而言，使大量純化蛋白質(zhì)與合適生物學(xué)材料復(fù)合的成本和復(fù)雜性使得該操作在獸醫(yī)學(xué)中并非經(jīng)濟(jì)上可行的。此外，從安全觀點(diǎn)來(lái)看，大量強(qiáng)力骨誘導(dǎo)性蛋白質(zhì)的使用增加異位骨形成的可能性，特別是當(dāng)植入位點(diǎn)并非良好包含時(shí)?；蜣D(zhuǎn)移是避開純化重組蛋白質(zhì)所面臨的局限性的有吸引力的策略。因?yàn)榛蚩梢栽陉P(guān)節(jié)內(nèi)局部遞送并表達(dá)，所以最高濃度的治療蛋白質(zhì)可以在關(guān)節(jié)內(nèi)原位產(chǎn)生，從而使不利副作用的可能性減少至最低限度，因?yàn)榉前衅鞴賹⒔邮茌^少的暴露?；な怯糜诨虮磉_(dá)的有吸引力的靶組織，因?yàn)樗拇蟊砻婕捌渑c關(guān)節(jié)間隙的直接接觸。盡管關(guān)節(jié)軟骨是在關(guān)節(jié)內(nèi)的另一個(gè)可用靶組織，但缺乏滲透通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)的載體被視為重要的技術(shù)局限性?？梢钥紤]將基因轉(zhuǎn)移給關(guān)節(jié)的2種方法離體和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。離體基因轉(zhuǎn)移指收獲細(xì)胞、其體外遺傳修飾及其后續(xù)移植回關(guān)節(jié)內(nèi)。事實(shí)上，在馬軟骨缺陷模型中用表達(dá)BMP-7的Ad5離體轉(zhuǎn)導(dǎo)的軟骨細(xì)胞移植后已證實(shí)加速的軟骨修復(fù)。因?yàn)檫@種技術(shù)允許在身體外的遺傳操作，所以它與增加的安全特性相關(guān)。然而，該方法面臨多種實(shí)踐問(wèn)題，因?yàn)樗鼘?duì)于收獲、處理且再植入細(xì)胞是費(fèi)時(shí)且耗資源的。此外，重組蛋白質(zhì)表達(dá)在軟骨細(xì)胞移植物中的壽命仍是限制因素，并且需要極高初始劑量或反復(fù)治療。此種策略的臨床可應(yīng)用性是復(fù)雜且麻煩的，顯著限制在獸醫(yī)學(xué)中的商業(yè)化潛力。相比之下，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移指直接靶向關(guān)節(jié)其自身內(nèi)的滑膜細(xì)胞或軟骨細(xì)胞，這可使用合適載體在臨床水平上達(dá)到。然而，這種后述策略也受顯著局限性限制，其確切性質(zhì)依賴于考慮的具體載體系統(tǒng)。腺病毒作為基因療法載體具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括易于產(chǎn)生高滴度的重組病毒，對(duì)通過(guò)此種病毒的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感的廣泛范圍的細(xì)胞類型，包括不分裂細(xì)胞。所謂的第一代重組人腺病毒血清型5(Ad5)是基于病毒基因組的El和潛在地E3區(qū)的缺失。這些修飾提供用于轉(zhuǎn)基因插入的基因座，還導(dǎo)致在靶物種中病毒復(fù)制所依賴的晚期基因激活的阻止。此種優(yōu)點(diǎn)已導(dǎo)致Ad5載體在臨床前和臨床研究中的廣泛應(yīng)用。然而，在1999年暴露于極大Ad5劑量的人類患者的死亡已使腺病毒載體的安全記錄出現(xiàn)污點(diǎn)。迄今，全身施用的Ad5載體的安全被許多人視為存在問(wèn)題。然而，這種載體用于關(guān)節(jié)中的臨床使用的實(shí)用性面臨顯著局限性或不確定。抗Ad5免疫應(yīng)答的觸發(fā)劑可能干擾轉(zhuǎn)基因遞送和長(zhǎng)期表達(dá)，還可能引起病理狀態(tài)，通常為炎癥。事實(shí)上在小鼠、大鼠、兔或馬中關(guān)節(jié)內(nèi)遞送的重組Ad5已注意到有免疫和炎癥干擾。盡管可能涉及批次間變異和純度，但關(guān)節(jié)內(nèi)注射的病毒顆粒的量看起來(lái)是驅(qū)動(dòng)關(guān)于關(guān)節(jié)內(nèi)基因療法的Ad5相關(guān)炎癥的關(guān)鍵方面。因?yàn)锳d5載體觸發(fā)轉(zhuǎn)基因在關(guān)節(jié)內(nèi)表達(dá)的功效可以與所注射的劑量成比例，所以選擇關(guān)于關(guān)節(jié)基因療法的功效和安全之間的合適平衡仍是技術(shù)挑戰(zhàn)。與重組蛋白質(zhì)在關(guān)節(jié)內(nèi)的長(zhǎng)期表達(dá)相容的Ad5劑量的限定根據(jù)現(xiàn)有參考文獻(xiàn)并不明確。事實(shí)上，當(dāng)將表達(dá)IGFl的Ad5注射到馬的球關(guān)節(jié)內(nèi)時(shí)，僅對(duì)于接受極高劑量(50xl01(l病毒顆粒(VP))的那些馬可檢測(cè)出IGFl在滑液中的顯著表達(dá)(GoodrichLR等人，GeneTherapy，2006，13:1253-1262)。對(duì)于較低劑量未注意到顯著表達(dá)。這種高Ad5劑量與滑液中白血細(xì)胞(WBC)的增加相關(guān)，證實(shí)顯著的局部炎癥。在這些條件下，IGFl的表達(dá)在注射后第4天時(shí)達(dá)到峰值，并且其后下降。在使用Ad5作為遞送載體的其他研究中已觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)經(jīng)過(guò)2-4周時(shí)間段的暫時(shí)下降。盡管暫時(shí)升高在前4周和可能更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可以正向影響軟骨治愈，但對(duì)表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)月而不是數(shù)周的載體的需要在參考文獻(xiàn)中被許多作者視為優(yōu)選的。事實(shí)上，尋求延長(zhǎng)基因表達(dá)的大多數(shù)研究者目前將其努力再次確定為備選現(xiàn)有載體系統(tǒng)，例如腺伴隨病毒(AAV)或慢病毒。重組BMP-7蛋白質(zhì)用于軟骨修復(fù)的體內(nèi)使用的先前報(bào)告指出需要極高量的重組蛋白質(zhì)(例如在綿羊創(chuàng)傷后實(shí)驗(yàn)OA模型中通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射每一周施用2次的340μgOP-I輸注(HurtigMB等人，ProceedingsCombinedOrthopaedicResearchSociety,070,2004年10月)，在牛衍生的I型膠原裝置中的350μgBMP-7修復(fù)在犬科手術(shù)誘導(dǎo)的全層骨軟骨缺陷的關(guān)節(jié)軟骨缺陷(CookS.D.等人，J.BoneJointSurgery，2003，85(3)116-123))。這些量顯著高于在使用上述Ad5IGFl的研究中報(bào)告的峰量(73ng/ml)(GoodrichLR等人，GeneTherapy，2006,13:I253-I262)。因此，使用Ad5載體用于關(guān)節(jié)基因療法的先前經(jīng)驗(yàn)不支持Ad5BMP_7載體在體內(nèi)達(dá)到治療濃度的使用。進(jìn)一步相關(guān)的是，在免疫活性大鼠中高劑量Ad5BMP7用于體內(nèi)骨形成的先前使用是不成功的，而確切相同的重組病毒在免疫功能低下大鼠中能夠觸發(fā)顯著的骨形成(LiJZ等人，GeneTherapy，2003，10:1735-1743)。這個(gè)例子進(jìn)一步舉例說(shuō)明Ad5BMP7在體內(nèi)的功效預(yù)測(cè)的復(fù)雜性。待解決的技術(shù)問(wèn)題是確保關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，并且從而減緩且潛在逆轉(zhuǎn)在哺乳動(dòng)物中的骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展。關(guān)節(jié)軟骨覆蓋關(guān)節(jié)中骨部分的接合表面。軟骨允許關(guān)節(jié)中的移動(dòng)而無(wú)直接的骨與骨接觸，從而防止相對(duì)骨表面的磨損和傷害。關(guān)節(jié)軟骨不具有骨化趨勢(shì)。軟骨表面肉眼看起來(lái)是平滑和珍珠似的，并且在高倍放大率下是精細(xì)顆粒狀的。此種軟骨稱為透明軟骨，與纖維軟骨和彈性軟骨相對(duì)比。關(guān)節(jié)軟骨看起來(lái)部分從鄰近滑膜的脈管中，部分從它覆蓋的骨的脈管中獲得其營(yíng)養(yǎng)物。關(guān)節(jié)軟骨與II型和IX型膠原以及各種充分表征的蛋白聚糖的存在相關(guān)，并且與X型膠原的不存在相關(guān)，所述X型膠原與軟骨內(nèi)骨的形成相關(guān)。關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨微觀結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述，參見例如，Aydelotte和Kuettner，Conn.Tiss.Res.18205(1988)；Zanetti等人，J.CellBioLlOl53(1985)；和Poole等人，J.Anat.138:13(1984)。在成年哺乳動(dòng)物中其他類型的永久性軟骨包括纖維軟骨和彈性軟骨。在纖維軟骨中，粘多糖網(wǎng)絡(luò)與占優(yōu)勢(shì)的膠原束交織，并且軟骨細(xì)胞比在透明軟骨中更廣泛分散。在這樣的關(guān)節(jié)中發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)間纖維軟骨，所述關(guān)節(jié)最多暴露于劇烈震動(dòng)且遭受頻繁移動(dòng)，例如膝的半月板。此種關(guān)節(jié)的例子包括顳-下頌、胸-鎖骨、肩-鎖骨關(guān)節(jié)。彈性軟骨包含在組織學(xué)上類似于彈性蛋白纖維的膠原纖維。此種軟骨在人體中在外耳的耳廓、耳咽管、小角軟骨和會(huì)厭中發(fā)現(xiàn)。骨形態(tài)生成蛋白-7CBMP-7，或成骨蛋白質(zhì)_1，ΟΡ_1)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族的成員。ΒΜΡ-7與激活素受體I和II型結(jié)合，但不與TGF-β受體I、II和III型結(jié)合。單體ΒΜΡ-7具有17至19kDa的分子量，并且通過(guò)其誘導(dǎo)易位骨形成的能力而被鑒定。BMP-7多肽作為同二聚體分泌，具有約35-36kDa的表觀分子量。然而，因?yàn)锽MP-7在體內(nèi)具有短半衰期(約30分鐘)，所以在純化蛋白質(zhì)注射后，維持在循環(huán)中持續(xù)水平的外源蛋白質(zhì)需要多次短間隔施用，造成非常顯著的實(shí)踐挑戰(zhàn)。此種多注射療法的成本太高而無(wú)法在獸醫(yī)學(xué)中應(yīng)用。盡管基因遞送已成功地作為用于各種疾病治療的蛋白質(zhì)療法的備選方案提出，但它通過(guò)BMP-7多肽在體內(nèi)表達(dá)用于骨關(guān)節(jié)炎預(yù)防和/或治療的可應(yīng)用性先前未得到提議，并且它的潛在有效性仍不確定。事實(shí)上，BMP-7同二聚體的低分子量(即約35kDa)在理論上將允許快速腎小球過(guò)濾。在體內(nèi)表達(dá)的BMP-7水平是否可以達(dá)到治療上有效的血漿濃度根據(jù)現(xiàn)有參考文獻(xiàn)無(wú)法預(yù)測(cè)或測(cè)定。為了使體內(nèi)表達(dá)的BMP蛋白質(zhì)的評(píng)估進(jìn)一步復(fù)雜化，依賴于所治療動(dòng)物的免疫狀態(tài)，結(jié)果可以是可變的，在免疫活性和非活性動(dòng)物之間具有顯著差異。因此，當(dāng)就整體而言綜合考慮時(shí)，參考文獻(xiàn)未教導(dǎo)體內(nèi)表達(dá)的BMP-7水平是否可以達(dá)到治療上有用的血漿濃度。任何文件在本申請(qǐng)中的引用或鑒定不構(gòu)成此種文件可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。發(fā)明_既述本發(fā)明涉及預(yù)防和治療患有骨關(guān)節(jié)炎(OA)或處于骨關(guān)節(jié)炎(OA)危險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物受試者的方法，以及用于在此種方法中使用的重組載體和藥物組合物。本發(fā)明的方法、載體和組合物可以用于減少、預(yù)防、抑制、延遲或減輕表征骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)功能的進(jìn)行性喪失。本發(fā)明的方法、重組載體和組合物對(duì)于其有用的受試者包括但不限于，已受OA折磨的受試者，以及合理預(yù)期患有與OA相關(guān)的關(guān)節(jié)功能進(jìn)行性喪失的任何受試者。特定受試者是否處于OA危險(xiǎn)中和/或受試者是否可能從本發(fā)明的方法和/或組合物中獲益，是可以通過(guò)相關(guān)醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)領(lǐng)域普通技術(shù)人員照常規(guī)進(jìn)行確定。處于OA危險(xiǎn)中的受試者顯著地是運(yùn)動(dòng)哺乳動(dòng)物，如參加接觸性運(yùn)動(dòng)或活動(dòng)例如過(guò)度賽跑的運(yùn)動(dòng)員、賽馬、賽犬、軍犬和/或警犬、肥胖哺乳動(dòng)物(即人和寵物，例如犬和貓)、具有先天性或獲得性肌肉骨骼病癥的哺乳動(dòng)物、老年哺乳動(dòng)物......。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如下載體，其可以包含且在宿主中表達(dá)前原(pre-pro)BMP_7基因、前BMP-7基因或成熟BMP-7基因。編碼前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽的BMP-7基因可以源于哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括編碼犬前原BMP-7、犬前BMP-7或犬成熟BMP-7多肽的多核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括編碼貓前原BMP-7、貓前BMP-7或貓成熟BMP-7多肽的多核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括編碼馬前原BMP-7、馬前BMP-7或馬成熟BMP-7多肽的多核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括編碼人前原BMP-7、人前BMP-7或人成熟BMP-7多肽的多核苷酸。編碼BMP-7多肽的多核苷酸可以與啟動(dòng)子和任選地與增強(qiáng)子可操作地連接。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含且表達(dá)犬前BMP-7多肽的載體，其中所述犬前BMP-7多肽缺失在N末端處的“前”肽，并且其中來(lái)自不同起源的肽信號(hào)序列與犬前BMP-7多肽融合。在另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含且表達(dá)貓前BMP-7多肽的載體，其中所述貓前BMP-7多肽缺失在N末端處的“前”肽，并且其中來(lái)自不同起源的肽信號(hào)序列與貓前BMP-7多肽融合。在另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含且表達(dá)馬前BMP-7多肽的載體，其中所述馬前BMP-7多肽缺失在N末端處的“前”肽，并且其中來(lái)自不同起源的肽信號(hào)序列與馬前BMP-7多肽融合。在另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含且表達(dá)人前BMP-7多肽的載體，其中所述人前BMP-7多肽缺失在N末端處的“前”肽，并且其中來(lái)自不同起源的肽信號(hào)序列與人前BMP-7多肽融合。有利地，肽信號(hào)序列可以是胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)或組織型纖溶酶原激活物(tPA)肽信號(hào)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括編碼犬成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽與來(lái)自BMP-7、IGF-I或tPA的肽信號(hào)序列融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括編碼貓成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽與來(lái)自BMP-7、IGF-I或tPA的肽信號(hào)序列融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括編碼馬成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽與來(lái)自BMP-7、IGF-I或tPA的肽信號(hào)序列融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括編碼人成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽與來(lái)自BMP-7、IGF-I或tPA的肽信號(hào)序列融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括表達(dá)前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽的載體(vector)和藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體(carrier)、賦形劑或媒介物(vehicle)的藥物組合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，藥物組合物可以包括改善載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞內(nèi)的功效的物質(zhì)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于將BMP-7多肽遞送給哺乳動(dòng)物的方法，所述方法可以包括將載體關(guān)節(jié)內(nèi)注射到滑液內(nèi)，所述載體能夠在體內(nèi)表達(dá)前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物宿主可以是人、犬科、馬科或貓科，顯著地是男人、女人、兒童、犬、母犬、幼犬、馬、母馬、馬駒或貓、小貓。本發(fā)明涉及此種載體就OA預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物的用途。應(yīng)當(dāng)指出在本公開內(nèi)容中且特別地在權(quán)利要求和/或段落中，術(shù)語(yǔ)例如“包含”、“含有”等可以具有在美國(guó)專利法中歸于其的含義；例如，它們可以意指“包括”等；并且術(shù)語(yǔ)例如“基本上由......組成”具有在美國(guó)專利法中歸于其的含義，例如，它們?cè)试S未明確敘述的元件，但排除在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)或影響本發(fā)明的基本或新型特征的元件。這些和其他實(shí)施方案在下述詳述中描述，或由于下述詳述而顯而易見，且由下述詳述包含。附圖簡(jiǎn)述給出作為例子但不意欲使本發(fā)明僅限制于所述具體實(shí)施方案的下述詳述結(jié)合附圖可以得到最佳理解，其中圖1提供了在通過(guò)撞擊人為制造的骨關(guān)節(jié)炎后90天尸檢時(shí)，綿羊的經(jīng)處理和未經(jīng)處理膝上顯示的肉眼觀察損害的肉眼檢查數(shù)據(jù)。圖2提供了實(shí)施例8中組1動(dòng)物之一(Y13)的左和右膝的組織學(xué)圖片。圖3提供了對(duì)于組1動(dòng)物的BMP-7處理關(guān)節(jié)和對(duì)側(cè)未經(jīng)處理關(guān)節(jié)以及對(duì)于組2的未經(jīng)處理動(dòng)物，以如通過(guò)印度墨汁保留所測(cè)量的軟骨表面粗化的平方毫米表示的損傷后軟骨保護(hù)。圖4提供了對(duì)于組1動(dòng)物的BMP-7處理關(guān)節(jié)和對(duì)側(cè)未經(jīng)處理關(guān)節(jié)以及對(duì)于組2的未經(jīng)處理動(dòng)物，使用OARSI評(píng)分的定量組織學(xué)觀察，其中對(duì)軟骨腐蝕深度指定級(jí)別和對(duì)印度墨汁染色面積指定階段(以如通過(guò)印度墨汁保留測(cè)量的軟骨表面粗化的平方毫米表不)O還包括作為本申請(qǐng)部分的是序列表，其中SEQIDNO1是犬前原BMP_7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO:2是犬前原BMP-7多肽的密碼子最佳化核苷酸序列，SEQIDNO3是犬前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO4是來(lái)自tPA的短信號(hào)肽(23個(gè)氨基酸)的核苷酸序列，SEQIDNO5是來(lái)自tPA的短信號(hào)肽(23個(gè)氨基酸)的氨基酸序列，SEQIDNO6是來(lái)自tPA的長(zhǎng)信號(hào)肽(28個(gè)氨基酸)的核苷酸序列，SEQIDNO7是來(lái)自tPA的長(zhǎng)信號(hào)肽(28個(gè)氨基酸)的氨基酸序列，SEQIDNO8是馬IGF-I信號(hào)肽的核苷酸序列，SEQIDNO:9是馬IGF-I信號(hào)肽的氨基酸序列，SEQIDNO10是馬前原BMP-7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO:11是犬IGF-I信號(hào)肽的核苷酸序列，SEQIDNO:12是犬IGF-I信號(hào)肽的氨基酸序列，SEQIDNO:13是人前原BMP-7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO14是人前原BMP-7多肽的密碼子最佳化核苷酸序列，SEQIDNO:15是人前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO:16是馬前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO17是貓前原BMP-7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO18是貓前原BMP-7多肽的密碼子最佳化核苷酸序列，和SEQIDNO:19是貓前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO20是PB1053引物的核苷酸序列，SEQIDNO21是PB1063引物的核苷酸序列，SEQIDNO22是PB1060引物的核苷酸序列，SEQIDNO23是PB1062引物的核苷酸序列，SEQIDNO24是PB1088引物的核苷酸序列，SEQIDNO25是PB1089引物的核苷酸序列，SEQIDNO26是PB1090引物的核苷酸序列，SEQIDNO27是鼠前原BMP-7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO28是鼠前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO29是LF189引物的核苷酸序列，SEQIDNO30是LF190引物的核苷酸序列，SEQIDNO31是LF191引物的核苷酸序列，SEQIDNO:32是LF192引物的核苷酸序列，SEQIDNO33是DNA接頭的核苷酸序列，SEQIDNO34是LF327引物的核苷酸序列，SEQIDNO35是LF324引物的核苷酸序列，SEQIDNO:36是LF326引物的核苷酸序列，SEQIDNO:37是LF325引物的核苷酸序列，SEQIDNO38是LF361引物的核苷酸序列，SEQIDNO39是LF334引物的核苷酸序列，SEQIDNO40是LF437引物的核苷酸序列，SEQIDNO41是LF172引物的核苷酸序列，SEQIDNO:42是LF159引物的核苷酸序列，SEQIDNO:43是LF377引物的核苷酸序列，SEQIDNO44是LF378引物的核苷酸序列，SEQIDNO45是SPH6Etrl引物的核苷酸序列，SEQIDNO46是SPH6Etr2引物的核苷酸序列，SEQIDNO:47是SPH6Etr3引物的核苷酸序列，SEQIDNO48是SPH6Etr4引物的核苷酸序列，SEQIDNO49是SPH6Etr5引物的核苷酸序列，SEQIDNO50是SPH6Etr6弓丨物的核苷酸序列，SEQIDNO51是SPH6Etr7弓丨物的核苷酸序列，SEQIDNO:52是SPH6Etr8引物的核苷酸序列，SEQIDNO53是LF394引物的核苷酸序列，SEQIDNO54是LF395引物的核苷酸序列，SEQIDNO55是LF397引物的核苷酸序列，SEQIDNO:56是LF398引物的核苷酸序列，SEQIDNO57是M13R引物的核苷酸序列，SEQIDNO58是LF409引物的核苷酸序列，SEQIDNO59是馬ILlO多肽的核苷酸序列，SEQIDNO60是馬ILlO多肽的氨基酸序列，SEQIDNO61是犬ILlO多肽的核苷酸序列，SEQIDNO62是犬ILlO多肽的氨基酸序列，SEQIDNO63是貓ILlO多肽的核苷酸序列，SEQIDNO64是貓ILlO多肽的氨基酸序列，SEQIDNO65是人ILlO多肽的核苷酸序列，SEQIDNO:66是人ILlO多肽的氨基酸序列，SEQIDNO67是病毒ILlO多肽的核苷酸序列，和SEQIDNO68是病毒ILlO多肽的氨基酸序列。碰本發(fā)明的方法和組合物可以用于OA的治療性處理。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“治療”或“治療處理”涉及OA時(shí)，并且當(dāng)它們?cè)诒疚闹幸约霸讷F醫(yī)學(xué)和人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中使用時(shí)，它們涉及治療已患有OA或從OA恢復(fù)的哺乳動(dòng)物，或旨在減緩和/或逆轉(zhuǎn)診斷為具有OA或處于具有OA的危險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物中的形態(tài)學(xué)軟骨損害的治療。特定哺乳動(dòng)物是否患有OA可以通過(guò)相關(guān)獸醫(yī)或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。如本文所使用的，如果哺乳動(dòng)物被合理預(yù)期患有與相當(dāng)大量軟骨喪失相關(guān)的關(guān)節(jié)功能的進(jìn)行性喪失、磨損顆粒產(chǎn)生、軟骨下骨中的滑膜增厚和囊失調(diào)以及在關(guān)節(jié)邊緣處的骨贅生長(zhǎng)，那么哺乳動(dòng)物被認(rèn)為患有OA。OA在哺乳動(dòng)物中的主要結(jié)果包括但不限于跛行。在人類中，OA的診斷主要基于歷史和體格檢查，但當(dāng)診斷不確定時(shí)，放射攝像發(fā)現(xiàn)包括不對(duì)稱關(guān)節(jié)間隙狹窄(JSN)、軟骨下硬化、骨贅形成、半脫位和骨關(guān)節(jié)炎改變的分布類型都是有幫助的。在X射線上的結(jié)構(gòu)形態(tài)改變也視為用于評(píng)估OA進(jìn)展的初步結(jié)果變量。幾種指示目前用于評(píng)估OA的放射學(xué)進(jìn)展，包括個(gè)體放射學(xué)特征(例如邊緣骨贅)、復(fù)合指示(例如Kellgren和Lawrence評(píng)分系統(tǒng))、和定量測(cè)量(例如關(guān)節(jié)間隙寬度(JSW)測(cè)量)(SalaffiF.等人，AgingClin.Exp.Res.，2003，15(5)391-404；Buckland-Wright,OsteoarthritisCartilage，1999，7(4)430-3)。管理機(jī)構(gòu)認(rèn)可可以授予化合物以DMOAD適應(yīng)癥，條件是它們顯示出它們可以減緩骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展；進(jìn)展可以通過(guò)關(guān)于結(jié)構(gòu)改變的替代物進(jìn)行校準(zhǔn)，通過(guò)測(cè)量在X射線平片上的關(guān)節(jié)間隙狹窄(JSN)，警告是這種延遲JSN轉(zhuǎn)化為關(guān)于該患者的臨床利益。近來(lái)，已開發(fā)新的磁共振成像(MRI)技術(shù)，以檢測(cè)比常規(guī)X射線更早的OA關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變，并且目前用于測(cè)量OA患者中的軟骨形態(tài)和完整性參數(shù)(AbadieE.等人，OsteoarthritisCartilage，2004，12(4)263-8)。如果不使用診斷技術(shù)的系列評(píng)估，OA可能未被診斷直至晚期。這通常是哺乳動(dòng)物中的情況，如犬科、貓科或馬科，對(duì)于其OA僅在晚期癥狀尤其是跛行出現(xiàn)時(shí)才得到鑒定。本發(fā)明提供了利用包括載體的藥物組合物用于OA的療法，所述載體能夠在體內(nèi)表達(dá)BMP-7多肽，以及用于誘導(dǎo)滑液BMP-7濃度中的持續(xù)增加的方法和組合物。如本文所使用的，如果施用組合物的量足以引起患有OA的哺乳動(dòng)物受試者中的疾病臨床體征或可測(cè)量標(biāo)志物的顯著改善，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物被說(shuō)成具有“治療功效”或是“治療上有效的”。如本文所使用的，如果施用組合物的量足以阻止受試者中的OA發(fā)展，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物被說(shuō)成具有“預(yù)防功效”或是“有效的”。術(shù)語(yǔ)“治療上有效的”還可以在本文中以更一般的含義使用，以指如下組合物量，其足以引起患有OA的哺乳動(dòng)物受試者中的疾病臨床體征或可測(cè)量標(biāo)志物的顯著改善，或足以阻止受試者中的OA發(fā)展。本發(fā)明的方法和組合物(例如用于使用BMP-7或BMP-7功能等價(jià)物的基因療法的方法和組合物)的功效的實(shí)驗(yàn)證明可以用各種可測(cè)量標(biāo)志物來(lái)執(zhí)行，例如，通過(guò)證實(shí)當(dāng)患有OA時(shí)，與安慰劑治療的人相比較，使用本發(fā)明的方法和組合物治療的人顯示關(guān)節(jié)間隙狹窄測(cè)量(JSN)減少的顯著下降，或通過(guò)證實(shí)當(dāng)患有OA時(shí)，與安慰劑治療的哺乳動(dòng)物受試者相比較，使用本發(fā)明的方法和組合物治療的哺乳動(dòng)物受試者顯示跛行的顯著下降和/或X射線上軟骨厚度測(cè)量減少的顯著下降。軟骨厚度測(cè)量也可以通過(guò)對(duì)馬的回波描記術(shù)來(lái)完成。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及能夠在宿主內(nèi)體內(nèi)表達(dá)骨形態(tài)生成蛋白_7(BMP-7)多肽、或其變體或片段的載體。如本文所使用的，“BMP-7多肽”可以用于指前原、前或成熟BMP-7多肽，其中所述前和成熟BMP-7多肽可以與BMP_7、IGF-I或tPA信號(hào)肽融合。本發(fā)明的BMP-7多肽優(yōu)選是犬、貓、馬或人起源的。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以包含且在宿主中表達(dá)前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽核苷酸序列或基因。編碼前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽的核苷酸序列或基因可以源于哺乳動(dòng)物，例如人、貓、馬或犬。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，BMP-7核苷酸序列或基因可以源于犬。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，BMP-7核苷酸序列或基因可以源于貓。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，BMP-7核苷酸序列或基因可以源于馬。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，BMP-7核苷酸序列或基因可以源于人。BMP-7也稱為成骨蛋白質(zhì)-1或“OP-1”，并且是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β或“TGF-β”超家族的成員。它是分泌性蛋白質(zhì)，由前蛋白質(zhì)加工以產(chǎn)生羧基末端成熟蛋白質(zhì)。在成熟蛋白質(zhì)內(nèi)，存在保守模式的7個(gè)半胱氨酸殘基，限定從SEQIDNO:3、SEQIDNO15、SEQIDNO16和SEQIDNO:19的氨基酸330延伸到氨基酸430的結(jié)構(gòu)域。激活型蛋白質(zhì)是二硫化物鍵合的同二聚體。以其成熟、天然形式，天然存在的BMP-7是具有約30-36kDa表觀分子量的糖基化二聚體，如通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(“SDS-PAGE”)測(cè)定的。當(dāng)還原時(shí)，30-36kDa蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有約16kDa和18kDa表觀分子量的2種糖基化多肽亞單位。非糖基化BMP-7蛋白質(zhì)具有約27kDa的表觀分子量。當(dāng)還原時(shí)，27kDa非糖基化蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有約14kDa和16kDa分子量的2種非糖基化多肽鏈。一般地，天然存在的BMP-7蛋白質(zhì)被翻譯成具有N末端信號(hào)肽序列、“前”結(jié)構(gòu)域和“成熟”蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的前體。所述信號(hào)肽長(zhǎng)29個(gè)殘基，并且在翻譯后在切割位點(diǎn)處快速切割掉，所述切割位點(diǎn)可以使用VonHeijne(1986)，NucleicAcidResearch，14;4683-4691的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。所述“前”結(jié)構(gòu)域在人、犬、貓、豬和牛BMP-7中具有264個(gè)殘基，并且在小鼠BMP-7中具有263個(gè)殘基。切割前BMP-7的N末端部分，以產(chǎn)生139個(gè)殘基的“成熟”C末端結(jié)構(gòu)域，其包括102個(gè)殘基的保守七半胱氨酸C末端結(jié)構(gòu)域。如本文提及的，BMP-7多肽的“前形式”指包括一對(duì)多肽的蛋白質(zhì)，所述多肽各自包括與BMP-7多肽的成熟結(jié)構(gòu)域共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的前結(jié)構(gòu)域。前形式看起來(lái)是從培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌的主要形式。“成熟形式”的蛋白質(zhì)指未與前結(jié)構(gòu)域共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的成熟C末端結(jié)構(gòu)域。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“前原BMP-7”、“前BMP-7”、“成熟BMP-7”和“BMP-7”不僅指說(shuō)明書和伴隨序列表中舉例說(shuō)明的特定多肽和序列，還指這些蛋白質(zhì)的任何和所有已知的天然存在變體，包括但不限于衍生物、突變體、同系物、直向同源物、等位基因變體、等位基因多態(tài)物、多態(tài)變體、系統(tǒng)發(fā)育配對(duì)物，以及這些蛋白質(zhì)的任何和所有非天然存在的變體，包括但不限于衍生物、突變體、片段、融合蛋白等。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“變體”包括所有此種天然存在和非天然存在的變體。特別地，本發(fā)明包括所有此種變體，其保留對(duì)于OA的治療性或預(yù)防性處理有用的特征，和/或保留BMP-7活性。這些功能上等價(jià)的變體、衍生物和片段等顯示保留BMP-7活性的能力。如本文所使用的，功能等價(jià)物指任何BMP-7變體、衍生物、片段等，其符合下述2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的任一(a)它們與如本文所描述的BMP-7蛋白質(zhì)序列具有顯著水平的氨基酸序列同源性，或由與本文所描述的BMP-7蛋白質(zhì)序列具有顯著水平的核苷酸序列同源性的核苷酸所編碼；或(b)在哺乳動(dòng)物的骨關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校缋缦惹八龅膭?chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎模型(PTOA模型)，與安慰劑處理組相比較，它們具有提供在治療組中的統(tǒng)計(jì)學(xué)不同應(yīng)答的能力(參見HurtigMB等人，ProceedingsCombinedOrthopaedicResearchSociety,070，2004年10月；BolamC.J.等人，AJVR，2006，67(3)433-447)。在一般的PTOA模型中，在第0天(DO)時(shí)使用3cm最低限度侵入關(guān)節(jié)切開術(shù)，使動(dòng)物2個(gè)(左和右)內(nèi)側(cè)股骨踝(medialfemoralcondyles)實(shí)驗(yàn)上暴露于標(biāo)準(zhǔn)化30MPa撞擊傷。在第7天(D7)時(shí)，一半動(dòng)物接受一個(gè)劑量(IO9病毒顆粒/mL)根據(jù)本發(fā)明的ImLBMP-7腺病毒載體(Ad5-BMP-7)進(jìn)入挫傷膝的后膝關(guān)節(jié)(stiflejoint)內(nèi)。施用用注射器和針進(jìn)入股膝關(guān)節(jié)(femoropatellarjoint)而關(guān)節(jié)內(nèi)完成。在收集滑液(ImL)用于各種分析后完成注射。對(duì)側(cè)挫傷膝不用Ad5-BMP_7進(jìn)行處理。另一半動(dòng)物不接受任何處理，并且保留作為陰性對(duì)照。在DO、D14、D21、D28、D60和D90時(shí)收獲血清和滑液。在D90時(shí)，還收集組織用于肉眼檢查和組織學(xué)。對(duì)于每個(gè)動(dòng)物比較在左和右膝上的結(jié)果(即跛行進(jìn)展、在D90尸檢時(shí)膝的肉眼檢查數(shù)據(jù)、組織學(xué)結(jié)果)，并且也與對(duì)照動(dòng)物相比較。動(dòng)物模型可以是例如綿羊(參見HurtigMB等人，ProceedingsCombinedOrthopaedicResearchSociety,070，2004年10月))或馬(參見BolamC.J.等人，AJVR，2006，67(3)433-447)。通過(guò)可以由本發(fā)明包括的變體、衍生物等的舉例說(shuō)明包括但不限于BMP-7變體、衍生物等，其由與本文公開的核苷酸序列并非確切相同的核苷酸序列編碼，但其中核苷酸序列中的改變不改變所編碼的氨基酸序列，或?qū)е掳被釟埢谋Ｊ刂脫Q、一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的缺失或添加、氨基酸殘基被氨基酸類似物的置換，所述氨基酸類似物不顯著影響所編碼多肽的性質(zhì)，等等。保守氨基酸置換的例子包括甘氨酸/丙氨酸置換；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸置換；天冬酰胺/谷氨酰胺置換；天冬氨酸/谷氨酸置換；絲氨酸/蘇氨酸/甲硫氨酸置換；賴氨酸/精氨酸置換；和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸置換。如上所述，導(dǎo)致功能BMP-7衍生物的其他類型的置換、變異、添加、缺失和衍生物也由本發(fā)明包括，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易了解如何制備、鑒定或選擇此種變體或衍生物，以及如何測(cè)試那些變體或衍生物的BMP-7活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以最佳化本發(fā)明的BMP-7多肽的表達(dá)，通過(guò)去除隱藏剪接位點(diǎn)，通過(guò)采用密碼子選擇，通過(guò)在起始密碼子前引入Kozak共有序列，通過(guò)改變密碼子選擇或其組合以改善表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括與SEQIDNO3的殘基1至431具有至少97.5%、至少98%、至少98.5%或至少99%同源性或同一性的犬前原BMP-7多肽的功能等價(jià)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括與SEQIDNO15的殘基1至431具有至少98%、至少98.5%或至少99%同源性或同一性的人前原BMP-7多肽的功能等價(jià)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括與SEQIDNO19的殘基1至431具有至少98.5%或至少99%同源性或同一性的貓前原BMP-7多肽的功能等價(jià)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括與SEQIDNO16的殘基1至431具有至少97.5%、至少98%、至少98.5%或至少99%同源性或同一性的馬前原BMP-7多肽的功能等價(jià)物。對(duì)于本發(fā)明的目的，序列同一性或同源性可以通過(guò)下述進(jìn)行測(cè)定當(dāng)這樣比對(duì)時(shí)比較序列，以便使重疊和同一性達(dá)到最大，同時(shí)使序列缺口降到最低。特別地，序列同一性可以使用許多數(shù)學(xué)算法中的任何進(jìn)行測(cè)定。用于比較2個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是Karlin&Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1990,87:2264-2268的算法，如Karlin&Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993,90:5873-5877中修飾的。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)例子是Myers&Miller，CABIOS1988，4，11-17的算法。此種算法摻入ALIGN程序(版本2.0)內(nèi)，這是GCG序列比對(duì)軟件包的部分。當(dāng)利用ALIGN程序用于比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長(zhǎng)度罰分12、和缺口罰分4。用于鑒定局部序列相似性和比對(duì)區(qū)域的另一種有用算法是如Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988，85，2444-2448中描述的FASTA算法。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的用途有利的是WU-BLAST(WashingtonUniversityBLAST)版本2.0軟件。用于數(shù)種UNIX平臺(tái)的WU-BLAST版本2.0可執(zhí)行程序可以從ftp://blast.wustl.edu/blast/executables下載。這種程序基于WU-BLAST版本1.4，其依次基于公眾域NCBI-BLAST版本1.4(Altschul&Gish,1996,Localalignmentstatistics,Doolittleed.,MethodsinEnzymology266,460-480;Altschul等人，JournalofMolecularBiology1990,215，403-410；Gish&States，NatureGenetics,1993，3266-272；Karlin&Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,5873-5877；所有這些通過(guò)引用合并入本文)?！愣?，氨基酸序列的比較可以通過(guò)使已知結(jié)構(gòu)多肽的氨基酸序列與未知結(jié)構(gòu)多肽的氨基酸序列比對(duì)來(lái)完成。隨后比較序列中的氨基酸，并且使同源的氨基酸組集合在一起。這種方法檢測(cè)出多肽的保守區(qū)，并且說(shuō)明了氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之間的同源性可以通過(guò)使用商購(gòu)可得的算法進(jìn)行測(cè)定(還參見上文同源性的描述)。除本文在其他方面提及的那些外，還提及由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)提供的程序BLAST、缺口BLAST、BLASTN、BLASTP禾口PSI-BLASTo這些程序在本領(lǐng)域中廣泛用于這個(gè)目的，并且可以比對(duì)2個(gè)氨基酸序列的同源區(qū)。在套件中的所有搜索程序中，缺口比對(duì)例行程序其自身整合至數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。需要時(shí)可以關(guān)閉缺口。關(guān)于缺口長(zhǎng)度1的缺省罰分(Q)對(duì)于蛋白質(zhì)和BLASTP是Q=9，并且對(duì)于BLASTN是Q=10，但可以改變成任何整數(shù)。關(guān)于延伸缺口的缺省每殘基罰分(R)對(duì)于蛋白質(zhì)和BLASTP是R=2，并且對(duì)于BLASTN是R=10，但可以改變成任何整數(shù)?？梢允褂藐P(guān)于Q和R值的任何組合，以便比對(duì)序列，從而使重疊和同一性達(dá)到最大，同時(shí)使序列缺口降到最低。缺省氨基酸比較矩陣是BLOSUM62，但可以利用其他氨基酸比較矩陣?yán)鏟AM。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下載體，其包括編碼犬前原BMP-7多肽的多核苷酸作為插入片段，并且更優(yōu)選地包含編碼具有SEQIDNO:3氨基酸序列的多肽的多核苷酸。優(yōu)選地這種載體包含SEQIDNO1的核苷酸1至1296。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下載體，其包括編碼人前原BMP-7多肽的多核苷酸作為插入片段，并且更優(yōu)選地包含編碼具有SEQIDNO:15氨基酸序列的多肽的多核苷酸。優(yōu)選地這種載體包含SEQIDNO13的核苷酸1至1296。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下載體，其包括編碼貓前原BMP-7多肽的多核苷酸作為插入片段，并且更優(yōu)選地包含編碼具有SEQIDNO:19氨基酸序列的多肽的多核苷酸。優(yōu)選地這種載體包含SEQIDNO17的核苷酸1至1296。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下載體，其包括編碼馬前原BMP-7多肽的多核苷酸作為插入片段，并且更優(yōu)選地包含編碼具有SEQIDNO:16氨基酸序列的多肽的多核苷酸。優(yōu)選地這種載體包含SEQIDNO10的核苷酸1至1296。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽信號(hào)(前肽)序列跨越位置⑴處的Met殘基到位置(29)處的Ala殘基，其中氨基酸殘基編號(hào)是鑒定為SEQIDNO3、15、16或19的前原BMP-7多肽序列的那種。信號(hào)肽的切割可以在Ala(29)殘基后發(fā)生。在前BMP-7多肽切割后，前BMP-7多肽在序列Arg-X-X-Arg(292)后進(jìn)行二次切割，以產(chǎn)生成熟BMP-7多肽。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互換使用，以指任何長(zhǎng)度的氨基酸殘基聚合物。在特定實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括編碼成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽與肽信號(hào)序列融合，所述肽信號(hào)序列是、或包括或衍生自BMP-7信號(hào)肽。在其他實(shí)施方案中，信號(hào)肽序列可以是、或包括或衍生自其他信號(hào)肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含且表達(dá)編碼前BMP-7多肽的多核苷酸的載體，其中所述前BMP-7信號(hào)肽缺失，并且其中來(lái)自不同起源的肽信號(hào)序列與前BMP-7多肽融合。例如，在特定實(shí)施方案中，肽信號(hào)序列可以是胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)或組織型纖溶酶原激活物(tPA)肽信號(hào)序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由多核苷酸編碼的前BMP-7是犬前BMP-7多肽。有利地，前BMP-7由如下多核苷酸編碼，其是、或包括、或衍生自SEQIDNO1的核苷酸88至1296，并且編碼、或包括與SEQIDNO3的氨基酸殘基30至431相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用與SEQIDNO:2相對(duì)應(yīng)的密碼子最佳化犬核苷酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由多核苷酸編碼的前BMP-7是人前BMP-7多肽。有利地，前BMP-7由如下多核苷酸編碼，其是、或包括、或衍生自SEQIDNO:13的核苷酸88至1296，并且編碼、或包括與SEQIDNO:15的氨基酸殘基30至431相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用與SEQIDNO:14相對(duì)應(yīng)的密碼子最佳化人核苷酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由多核苷酸編碼的前BMP-7是貓前BMP-7多肽。有利地，前BMP-7由如下多核苷酸編碼，其是、或包括、或衍生自SEQIDNO:17的核苷酸88至1296，并且編碼、或包括與SEQIDNO:19的氨基酸殘基30至431相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用與SEQIDNO:18相對(duì)應(yīng)的密碼子最佳化貓核苷酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由多核苷酸編碼的前BMP-7是馬前BMP-7多肽。有利地，前BMP-7由如下多核苷酸編碼，其是、或包括、或衍生自SEQIDNO:10的核苷酸88至1296，并且編碼、或包括與SEQIDNO16的氨基酸殘基30至431相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。在不同物種中的密碼子優(yōu)先性可以顯著不同。為了增強(qiáng)異種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，相關(guān)的是使異種蛋白質(zhì)的密碼子頻率與宿主表達(dá)系統(tǒng)的那種相匹配(Kim等人，Gene，1997，199(1-2)293-301)。密碼子最佳化還最佳化mRNA的穩(wěn)定性及其至細(xì)胞質(zhì)的輸出過(guò)程。對(duì)于密碼子最佳化，可以考慮除密碼子頻率外的其他因素，例如DNA基序和重復(fù)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、GC含量、重復(fù)密碼子、限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)、功能基序如剪接位點(diǎn)或終止子結(jié)構(gòu)。已制備算法以促進(jìn)最佳核苷酸序列的設(shè)計(jì)。GeneartGmbH(Regensburg，Germany)已開發(fā)有專利權(quán)的GeneOptimizer軟件(W0-A-04/059556和WO-A-06/013103)，其在一個(gè)單次操作中實(shí)現(xiàn)多參數(shù)最佳化。平行考慮最重要的參數(shù)，該軟件在進(jìn)化方法中產(chǎn)生總共高達(dá)500,000個(gè)靶序列的最佳化變體，并且選擇最合適的那種。已報(bào)告與原始基因序列相比較，此種最佳化基因具有表達(dá)得率中高達(dá)100倍的增加(Bradel-Tretheway等人，J.Virol.Methods，2003，111(2)145-56；Disbrow等人，Virology,2003，311(1)105-14)。在其中核苷酸序列是密碼子最佳化的實(shí)施方案中，密碼子最佳化可以通過(guò)GeneartGmbH(Regensburg，Germany)使用GeneOptimizer軟件來(lái)完成。密碼子最佳化僅改變核酸序列并且不改變所編碼的氨基酸序列。在其中信號(hào)肽衍生自IGF-I信號(hào)肽的實(shí)施方案中，優(yōu)選肽信號(hào)可以是、或可以包括、或可以衍生自馬IGF-I肽信號(hào)，并且優(yōu)選由SEQIDNO:9的氨基酸殘基1至25限定，并且由SEQIDNO8的核苷酸1至75編碼的那種。在備選實(shí)施方案中，IGF-I肽信號(hào)可以是、或可以包括、或可以衍生自犬IGF-I肽信號(hào)，并且優(yōu)選地是、或包括、或衍生自如下犬IGF-I肽信號(hào)，其由SEQIDNO:12的氨基酸殘基1至25限定，并且由SEQIDNO11的核苷酸1至75編碼。在其他實(shí)施方案中，肽信號(hào)可以是、或可以包括、或可以衍生自tPA肽信號(hào)，例如人tPA信號(hào)肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所使用的tPA信號(hào)肽是、或包括或衍生自SEQIDNO5的人tPA信號(hào)肽序列的氨基酸殘基1至23，并且由SEQIDNO4的核苷酸1至69編碼。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，人tPA信號(hào)肽可以是、或可以包括、或可以衍生自SEQIDNO7的氨基酸殘基1至28，并且由SEQIDNO6的核苷酸1至84編碼。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)有利實(shí)施方案，表達(dá)載體可以包括如下多核苷酸，其編碼與缺失信號(hào)肽的前原BMP-7多肽(與殘基30至殘基431相對(duì)應(yīng))融合的，根據(jù)SEQIDNO5、7、9或12的IGFl或tPA信號(hào)肽。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，表達(dá)載體包括如下多核苷酸，其編碼與成熟BMP-7(與殘基293至殘基431相對(duì)應(yīng))融合的IGFl或tPA信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如下載體，其能夠表達(dá)犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬成熟BMP-7、人前原BMP-7、人前BMP-7、人成熟BMP-7、馬前原BMP-7、馬前BMP-7、馬成熟BMP-7、貓前原BMP-7、貓前BMP-7、貓成熟BMP-7、或其變體或片段。對(duì)于成熟BMP-7或前BMP-7，優(yōu)選編碼肽的核苷酸序列緊在框內(nèi)編碼肽信號(hào)的核苷酸序列后，以便促進(jìn)BMP-7分泌到細(xì)胞外介質(zhì)內(nèi)。信號(hào)序列可以是來(lái)自前原BMP-7的天然序列，或來(lái)自分泌性蛋白質(zhì)的肽信號(hào)，例如來(lái)自組織型纖溶酶原激活物蛋白(tPA)特別是人tPA的信號(hào)肽(S.FrieznerDegen等人J.Biol.Chem.1996，261，6972-6985；R.Rickles等人J.Biol.Chem.1988，263，1563-1569；D.Berg.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.1991，179，1289-1296)，或來(lái)自胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGFl)的信號(hào)肽，特別是馬IGFl(K.Otte等人Gen.Comp.Endocrinol.1996，102(1)，11-15)、犬IGFl(P.Delafontaine等人Gene1993，130，305-306)、貓IGFl(WO-A-03/022886)、牛IGFl(S.Lien等人Mamm.Genome2000，11(10)，877-882)、豬IGFl(M.Muller等人NucleicAcidsRes.1990,18(2)，364)、雞IGFl(Y.Kajimoto等人Mol.Endocrinol.1989，3(12)，1907-1913)、火雞IGFl(GenBank登記號(hào)AF074980)。來(lái)自IGFl的信號(hào)肽可以是天然的或最佳化的，特別是通過(guò)去除隱藏剪接位點(diǎn)和/或通過(guò)采用密碼子選擇而最佳化的。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”用于指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式，其包含脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步包括包含且表達(dá)編碼BMP-7多肽的多核苷酸的載體，所述BMP-7多肽與啟動(dòng)子元件可操作地連接且任選地還與增強(qiáng)子連接。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因的啟動(dòng)子，優(yōu)選來(lái)自人或鼠類衍生的CMV。在其他實(shí)施方案中，增強(qiáng)子和/或啟動(dòng)子可以選自本領(lǐng)域已知且適合于在本發(fā)明的載體中表達(dá)BMP-7的那些啟動(dòng)子。許多此種啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，并且合適啟動(dòng)子可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇。例如，存在各種細(xì)胞和/或組織特異性啟動(dòng)子(例如，肌肉、內(nèi)皮細(xì)胞、肝、體細(xì)胞和干細(xì)胞特異性啟動(dòng)子)，以及各種病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，和BMP-7啟動(dòng)子，例如對(duì)于每個(gè)動(dòng)物物種同基因特異性的那些。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，如果犬BMP-7待在犬滑膜細(xì)胞中表達(dá)，那么可以使用對(duì)于犬滑膜細(xì)胞特異的增強(qiáng)子和/或啟動(dòng)子，以便使犬BMP-7的表達(dá)對(duì)于所需應(yīng)用進(jìn)行最佳化?？梢栽诒景l(fā)明中采用的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子包括但不限于，勞斯肉瘤病毒LTR、HSV-I的TK基因、SV40的早期或晚期啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(MLP)、磷酸甘油酸酯激酶基因、金屬硫蛋白基因、α-1抗胰蛋白酶基因、白蛋白基因、膠原酶基因、彈性蛋白酶I基因、β-肌動(dòng)蛋白基因、β-珠蛋白基因、Y-珠蛋白基因、α-甲胎蛋白基因、和肌肉肌酸激酶基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。一般而言，采用在真核細(xì)胞中有功能的強(qiáng)啟動(dòng)子是有利的。優(yōu)選的強(qiáng)啟動(dòng)子是人或鼠類起源，或任選具有另一個(gè)起源例如大鼠或豚鼠的立即早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV-IE)。CMV-IE啟動(dòng)子可以包括實(shí)際啟動(dòng)子部分，這可以與增強(qiáng)子部分結(jié)合或不結(jié)合?？梢詤⒖鸡ウ?Α-260148、ΕΡ-Α-323597,美國(guó)專利號(hào)5,168,062、5,385,839和4,968,615，以及PCT申請(qǐng)?zhí)朩087/03905。CMV-IE啟動(dòng)子有利地是人CMV_IE(BoshartΜ.等人，Cell.，1985，41，521-530)或鼠類CMV-IE。在更一般的術(shù)語(yǔ)中，啟動(dòng)子具有病毒或細(xì)胞起源?？梢栽诒景l(fā)明的實(shí)踐中有利地采用的除CMV-IE外的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子是SV40病毒的早期/晚期啟動(dòng)子或勞斯肉瘤病毒的LTR啟動(dòng)子?？梢栽诒景l(fā)明的實(shí)踐中有利地采用的強(qiáng)細(xì)胞啟動(dòng)子是對(duì)于滑膜細(xì)胞特異的基因的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子的功能亞片段，即這些啟動(dòng)子維持足夠的啟動(dòng)活性的部分，包括在本發(fā)明內(nèi)，例如根據(jù)PCT申請(qǐng)?zhí)朩098/00166或美國(guó)專利號(hào)6,156,567的截短CMV-IE啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中。在本發(fā)明的實(shí)踐中的啟動(dòng)子因此包括全長(zhǎng)啟動(dòng)子的衍生物和亞片段，其維持足夠的啟動(dòng)活性并且因此充當(dāng)啟動(dòng)子，優(yōu)選是與衍生物或亞片段由其衍生的實(shí)際或全長(zhǎng)啟動(dòng)子的那種基本上相似的啟動(dòng)活性，例如美國(guó)專利號(hào)6,156,567的截短CMV-IE啟動(dòng)子的活性類似于全長(zhǎng)CMV-IE啟動(dòng)子的活性。因此，在本發(fā)明的實(shí)踐中的CMV-IE啟動(dòng)子可以包括下述或基本上由下述組成或由下述組成全長(zhǎng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子部分和/或全長(zhǎng)啟動(dòng)子的增強(qiáng)子部分，以及衍生物和亞片段。優(yōu)選地，載體包括其他表達(dá)控制元件。特別有利的是摻入一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定序列，例如一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子序列，優(yōu)選hCMV-IE的第一個(gè)內(nèi)含子(PCT申請(qǐng)?zhí)朩089/01036)、兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II(vanOoyen等人，Science，1979，206，337-344)。關(guān)于用于除痘病毒外的病毒載體的多腺苷酸化信號(hào)(多聚A)，可以使用牛生長(zhǎng)激素(bGH)基因的多聚(A)信號(hào)(參見美國(guó)專利號(hào)5,122,458)、或兔β-珠蛋白基因的多聚(A)信號(hào)或SV40病毒的多聚(A)信號(hào)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“載體”指包括例如在體內(nèi)待遞送到靶細(xì)胞內(nèi)的異源多核苷酸的重組腺病毒。異源多核苷酸可以包括用于治療用途的目的序列，并且可以任選以表達(dá)盒的形式。異源多核苷酸可以包括另外的序列，例如在相同轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的另外編碼序列，控制元件例如啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止子，多腺苷酸化位點(diǎn)，在相同或不同啟動(dòng)子控制下的另外轉(zhuǎn)錄單位，允許克隆、表達(dá)、同源重組和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的序列，以及如提供本發(fā)明的實(shí)施方案可能需要的任何此種構(gòu)建體。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“重組體”意指半合成或合成起源的多核苷酸，其在自然界中不存在，或以在自然界中未發(fā)現(xiàn)的排列與另一種多核苷酸連接。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“異源的”衍生自與它與之相比較的實(shí)體其余部分在遺傳上不同的實(shí)體。例如，多核苷酸可以通過(guò)基因工程技術(shù)放置到衍生自不同來(lái)源的質(zhì)?；蜉d體內(nèi)，并且因此是異源多核苷酸。從其天然編碼序列中取出且與除天然序列外的編碼序列可操作地連接的啟動(dòng)子因此是異源啟動(dòng)子。用于表達(dá)犬ΒΜΡ-7或貓ΒΜΡ-7或人ΒΜΡ-7或馬ΒΜΡ-7的元件有利地存在于本發(fā)明載體中。以最低限度方式，這可以包括下述、可以基本上由下述組成、或可以由下述組成起始密碼子(ATG)、終止密碼子和啟動(dòng)子，以及任選地用于特定載體例如除痘病毒外的病毒載體的多腺苷酸化序列。當(dāng)有利地在載體中的多核苷酸編碼多肽片段，例如犬ΒΜΡ-7時(shí)，ATG可以置于讀碼框的5'處，并且終止密碼子可以置于3'處?？梢源嬖谟糜诳刂票磉_(dá)的其他元件，例如增強(qiáng)子序列、穩(wěn)定序列例如內(nèi)含子和允許蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)序列。用于制備和/或施用在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明基因的基因產(chǎn)物的載體或重組體的方法可以是任何所需方法，例如由下述參考文獻(xiàn)中公開或下述參考文獻(xiàn)中引用的文件中公開或類似的方法ChroboczekJ等人，Virol.1992，186280-285；Yarosh等人，Vaccine,1996，14(13)1257-64;Lutze-Wallace等人，Biologicals，1995，23(4)271-7；FallouxF.等人，HumanGeneTherapy，1998，91909-1917;ShriverJ.等人，Nature,2002，415331-335;GrahamF.等人，MethodsinMolecularBiology，第7卷GeneTransferandExpressionProtocolsEditedbyE.Murray,TheHumanPressInc,1991,ρ109-128；IlanY.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1997，94:2587-2592；TripathyS.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,1994，91:11557-11561;TapnellB.，Adv.DragDeliv.Rev.，1993，12:185-199；DanthinneX.等人，GeneTherapy,2000，71707-1714;BerknerK.,BioTechniques,1988，6616-629;BerknerK.等人，Nucl.AcidRes.，1983，11:6003-6020；ChavierC.等人，J.Virol.，1996，70:4805-4810。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以是病毒載體，特別是體內(nèi)表達(dá)載體。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以是腺病毒載體。有利地，腺病毒可以是人腺病毒5型(hAd5)載體、El缺失和/或E3缺失型hAd5。有利地，腺病毒可以是犬腺病毒2型(CAV-2)載體、E3缺失型CAV-2和/或位于E4區(qū)和右ITR區(qū)之間的區(qū)域中的插入型CAV-2。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒載體可以是通過(guò)病毒基因組El區(qū)中的缺失使得無(wú)法復(fù)制的人腺病毒，特別是血清型5腺病毒，所述缺失特別是約核苷酸459至約核苷酸3510，通過(guò)參考在登記號(hào)M73260下在Genbank中以及在參考的出版物J.Chroboczek等人Virol.1992，186，280-285中公開的hAd5序列。缺失型腺病毒可以在表達(dá)El的HEK293(F.Graham等人J.Gen.Virol.1977，36，59-72)或PER細(xì)胞中繁殖，特別是PER.C6細(xì)胞系(F.Falloux等人HumanGeneTherapy1998,9,1909-1917)。有利地，Ad5載體可以在提供病毒缺失的El基因組區(qū)域的反式互補(bǔ)的任何細(xì)胞系中繁殖。人腺病毒還可以在E3區(qū)中缺失，特別是約核苷酸28592至約核苷酸30470。進(jìn)一步地，El區(qū)中的缺失可以與E3區(qū)中的缺失組合完成(參見例如，J.Shriver等人Nature，2002，415,331-335,F.Graham等人MethodsinMolecularBiology第7卷GeneTransferandExpressionProtocolsEditedbyE.Murray,TheHumanPressInc，1991,pl09_128;Y.Ilan等人Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，2587-2592；US6,133,028；US6,692,956；S.Tripathy等人Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91，11557-11561；B.TapnellAdv.DragDeliv.Rev.1993，12，185-199；X.Danthinne等人GeneThrapy2000，7，1707-1714;K.BerknerBioTechniques1988，6，616-629；K.Berkner等人Nucl.AcidRes.1983，11，6003-6020;C.Chavier等人J.Virol.1996，70，4805-4810)。插入位點(diǎn)可以是最終在El和/或E3區(qū)的部分或完全缺失后的El和/或E3基因座(區(qū))。有利地，將待表達(dá)的多核苷酸插入在真核細(xì)胞中有用的啟動(dòng)子控制下，例如強(qiáng)啟動(dòng)子，優(yōu)選巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動(dòng)子(CMV-IE啟動(dòng)子)，特別是在M.Boshart等人Cell1985，41，521-530中的約核苷酸-734至約核苷酸+7的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)，或來(lái)自PROMEGACorp的pCI載體的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)。CMV-IE啟動(dòng)子有利地是鼠或人起源。還可以使用延伸因子Ia的啟動(dòng)子。強(qiáng)啟動(dòng)子也在本文中就質(zhì)粒載體而言討論。在一個(gè)實(shí)施方案中，剪接序列可以位于增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)的下游。例如，從CMV-IE基因中分離的內(nèi)含子l(R.Stenberg等人J.Virol.1984，49，190)、從兔或人珠蛋白基因中分離的內(nèi)含子、特別是來(lái)自珠蛋白基因的內(nèi)含子2、從免疫球蛋白基因中分離的內(nèi)含子、來(lái)自SV40早期基因的剪接序列或從來(lái)自PromegaCorp.的pCI載體中分離的嵌合內(nèi)含子序列，包括與小鼠免疫球蛋白受體序列(在登記號(hào)CVU47120下在Genbank中的約核苷酸890至約核苷酸1022)融合的人β-珠蛋白供體序列。多聚(A)序列和終止序列可以插入待表達(dá)的多核苷酸下游，所述多核苷酸例如牛生長(zhǎng)激素基因，特別是在登記號(hào)BOVBMP-7下在Genbank中的約核苷酸2339至約核苷酸2550，兔β-珠蛋白基因或SV40晚期基因多腺苷酸化信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒載體可以是犬腺病毒(CAV)，特別是CAV_2(參見例如L.Fischer等人Vaccine，2002，20，3485-3497；美國(guó)專利號(hào)5,529,780；美國(guó)專利號(hào)5,688,920；PCT公開號(hào)W095/14102)。對(duì)于CAV，插入位點(diǎn)可以在E3區(qū)中和/或在位于E4區(qū)和右ITR區(qū)之間的區(qū)域中(參見美國(guó)專利號(hào)6,090,393；美國(guó)專利號(hào)6,156,567)。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以是CAV-2，并且插入片段可以是編碼犬前原BMP-7、犬前BMP-7或犬成熟BMP-7多肽的核酸序列，在啟動(dòng)子控制下，例如巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動(dòng)子(CMV-IE啟動(dòng)子)或已描述用于人腺病毒載體的啟動(dòng)子。多聚(A)序列和終止序列可以插入待表達(dá)的多核苷酸下游，所述多核苷酸例如牛生長(zhǎng)激素基因或兔珠蛋白基因多腺苷酸化信號(hào)。除編碼前原ΒΜΡ-7多肽、前ΒΜΡ-7多肽或成熟ΒΜΡ-7多肽的多核苷酸外，每種人腺病毒載體可以包括下述或可以包含下述或可以基本上由下述組成與啟動(dòng)子可操作地連接或在啟動(dòng)子控制下或依賴于啟動(dòng)子的，優(yōu)選來(lái)自犬起源、馬起源、貓起源、人起源的BMP-7多肽，變體、類似物或片段。本發(fā)明還涉及包括載體的藥物組合物，所述載體在體內(nèi)在合適或適當(dāng)?shù)臈l件下或在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)。藥物組合物可以包括下述、可以基本上由下述組成、或可以由下述組成一種或多種載體，例如表達(dá)載體，例如體內(nèi)表達(dá)載體，其包括下述、基本上由下述組成或由下述組成且表達(dá)下述在藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體、賦形劑或媒介物中，任選與BMP-7、IGF-I或tPA信號(hào)肽融合，編碼BMP-7多肽的一種或多種多核苷酸。有利地，載體可以是人腺病毒，并且可以包括下述、可以基本上由下述組成、或可以由下述組成并且表達(dá)在藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體、賦形劑或媒介物中，任選與BMP-7、IGF-I或tPA信號(hào)肽融合，編碼犬BMP-7多肽或馬BMP-7多肽或貓BMP-7多肽或人BMP-7多肽的至少一種多核苷酸。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，組合物中的其他一種或多種載體可以包括如下多核苷酸，其編碼并且在合適環(huán)境下表達(dá)除犬BMP-7多肽或馬BMP-7多肽或貓BMP-7多肽或人BMP-7多肽外的一種或多種其他蛋白質(zhì)、多肽或肽。包含一種或多種載體的組合物可以包括多核苷酸、可以基本上由多核苷酸組成、或可以由多核苷酸組成，所述多核苷酸編碼且有利地在體內(nèi)表達(dá)犬BMP-7多肽或馬BMP-7多肽或貓BMP-7多肽或人BMP-7多肽或其融合蛋白。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明可以提供治療有效量的制劑的施用，用于在靶細(xì)胞中遞送且表達(dá)BMP-7多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包括包含多核苷酸的表達(dá)載體，所述多核苷酸表達(dá)BMP-7多肽和藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體、媒介物或賦形劑。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體、媒介物或賦形劑可以促進(jìn)載體的轉(zhuǎn)染和/或可以改善載體的保存。例如，藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體或媒介物或賦形劑可以是水或0.9%NaCl(例如鹽水)溶液或磷酸鹽緩沖液。可以用于本發(fā)明的方法的其他藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體或媒介物或賦形劑包括但不限于，多聚(L-谷氨酸鹽)或聚乙烯吡咯烷酮。對(duì)于Ad5載體，藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體或媒介物或賦形劑是TrisHCllOmM>MgCl2ImM>NaCl150mM、Tween_8054mg/L、蔗糖1M，pH8.5。藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體或媒介物或賦形劑可以是如下任何化合物或化合物的組合，其促進(jìn)載體的施用、增加表達(dá)水平或增加表達(dá)持續(xù)時(shí)間。劑量和劑量體積在本文一般描述中討論，并且還可以通過(guò)技術(shù)人員根據(jù)結(jié)合本領(lǐng)域知識(shí)閱讀的本公開內(nèi)容進(jìn)行確定，無(wú)需任何過(guò)度實(shí)驗(yàn)。與其他復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體一樣，Ad5病毒載體受其引發(fā)強(qiáng)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的傾向限制。事實(shí)上，由宿主發(fā)展的針對(duì)載體的體液免疫應(yīng)答導(dǎo)致中和抗體，并且已顯示阻礙反復(fù)施用的功效。聚乙二醇聚合物(PEG)與Ad5病毒表面的共價(jià)附著是通過(guò)掩蔽載體表面而避開中和抗體的策略。因?yàn)锳d5的PEG化與病毒感染力相容，并且使病毒與中和抗體掩蔽，所以PEG化改善在反復(fù)基礎(chǔ)上施用Ad5載體的能力。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，Ad5病毒載體可以是PEG化的，即PEG聚合物與Ad5病毒表面共價(jià)附著。此種PEG化可以通過(guò)包括下述步驟的方法來(lái)完成-(I)PEG與Ad5表面的共價(jià)附著可以使用激活型PEGtresyl單甲氧基聚乙二醇(TMPEG)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述TMPEG優(yōu)先與病毒六鄰體、纖維和五鄰體堿基的賴氨酸殘基的ε-氨基末端反應(yīng)，同時(shí)使顆粒保留低于100的感染單位定量。根據(jù)DelgadoC.等人，BiotechnoLAppLBiochem.,1990,12(2)II9-28的操作制造的TMPEG可以從ShearwaterPolymers(Hultsville,AL)商購(gòu)獲得。TMPEG的優(yōu)點(diǎn)與下述事實(shí)相關(guān)它可以在弱生理?xiàng)l件下驅(qū)動(dòng)偶聯(lián)，導(dǎo)致較大的生物學(xué)活性。-(2)在用TMPEG進(jìn)行PEG化前，病毒制備物(在PBS5%蔗糖中)用包含5%蔗糖的130mM磷酸鈉，pH7稀釋2倍，至約IxlO12顆粒/ml的最終病毒顆粒濃度。-(3)為了維持病毒的最高感染力，使用51(摩爾摩爾)的PEG與病毒比以及使用以5%(w/v)的TMPEG來(lái)執(zhí)行PEG化。在旋轉(zhuǎn)式混合器上在室溫下(通常23-24°C)在30分鐘過(guò)程中執(zhí)行PEG偶聯(lián)反應(yīng)。隨后通過(guò)使反應(yīng)溫度降低至4°C來(lái)終止反應(yīng)。-⑷為了增加用TMPEG的PEG化水平，起始TMPEG可以在30分鐘過(guò)程中增至10%(w/V)。然而，這個(gè)操作與pH中的減少相關(guān)，這對(duì)病毒和反應(yīng)都不利。因?yàn)榭刂苝H是關(guān)鍵，所以反應(yīng)可以在130mM磷酸鹽，pH7中執(zhí)行，這提供超過(guò)2小時(shí)的pH穩(wěn)定性，并且因此允許使用10%TMPEG的PEG化。-(5)隨后通過(guò)CsCl梯度離心或通過(guò)針對(duì)PBS-蔗糖(5%)透析，使PEG化的載體與未反應(yīng)的PEG分離。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，藥物組合物可以在體內(nèi)直接施用到待治療的關(guān)節(jié)內(nèi)，并且所編碼的產(chǎn)物由在宿主關(guān)節(jié)中載體的表達(dá)?？梢孕薷脑隗w內(nèi)關(guān)節(jié)內(nèi)遞送載體的方法，所述載體編碼BMP-7多肽，有利地犬BMP-7多肽或馬BMP-7多肽或貓BMP-7多肽或人BMP-7多肽，以將本發(fā)明的BMP-7多肽遞送給人、犬科、馬科或貓科，尤其是男人、女人、兒童、犬、母犬、幼犬、馬、母馬、馬駒、貓或小貓。編碼且表達(dá)本文所述BMP-7的載體的關(guān)節(jié)內(nèi)體內(nèi)遞送可以通過(guò)人類或獸醫(yī)學(xué)普通技術(shù)人員來(lái)完成。有利地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物和/或制劑包括有效量的一種或多種表達(dá)載體，或基本上由有效量的一種或多種表達(dá)載體組成，或由有效量的一種或多種表達(dá)載體組成，以引發(fā)如本文討論的治療性應(yīng)答；并且有效量可以根據(jù)本公開內(nèi)容包括本文合并的文件和本領(lǐng)域知識(shí)進(jìn)行確定，無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。治療和/或藥物組合物每劑量包含表達(dá)BMP-7多肽的重組人腺病毒的約IO7至約1011、有利地約IO8至約IOw且更有利地約IO9至約IOw病毒顆粒(VP)。如果治療和/或藥物組合物基于PEG化的人腺病毒載體，尤其是基于PEG化的hAd5載體，上述劑量范圍仍是可用的。在基于犬腺病毒載體尤其是CAV-2載體的治療和/或藥物組合物的情況下，劑量可以是表達(dá)犬BMP-7多肽的重組犬腺病毒的約IO5VP至約109VP、有利地約IO6至約108、更有利地約IO6至約10VP。在病毒顆粒(VP)中表達(dá)的腺病毒滴度可以通過(guò)如RoitschC.等人，JChromatography，2001，752263-280的段落2.3中描述的HPLC和色譜法進(jìn)行測(cè)定?；谙俨《据d體用于哺乳動(dòng)物的組合物的劑量體積，例如犬組合物的劑量體積，一般可以是約0.1至約2.0ml，優(yōu)選約0.1至約1.0ml，且更優(yōu)選約0.5ml至約1.0ml。本發(fā)明可以考慮給哺乳動(dòng)物至少施用一次有效量的根據(jù)本發(fā)明制備的治療組合物。哺乳動(dòng)物可以是雄性、雌性、妊娠雌性。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物可以是人、犬科或馬科或貓科，尤其是男人、女人、兒童、犬、母犬、幼犬、馬、母馬、馬駒、貓、雌貓或小貓。根據(jù)本發(fā)明的治療組合物可以通過(guò)注射器和針進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)施用。施用可以通過(guò)經(jīng)過(guò)待治療關(guān)節(jié)的滑液襯里并且通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的治療組合物注射到滑液內(nèi)來(lái)完成。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以實(shí)例的方式提供本文關(guān)于本發(fā)明的組合物施用的公開內(nèi)容，并且本發(fā)明并不限于所述的具體實(shí)例。根據(jù)本文的公開內(nèi)容，并且根據(jù)本領(lǐng)域的知識(shí)，技術(shù)人員可以確定施用次數(shù)、施用途徑、和對(duì)于本發(fā)明組合物的每次施用的待使用劑量，無(wú)需任何過(guò)度實(shí)驗(yàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽、人前原BMP-7、人前BMP-7、人成熟BMP-7、馬前原BMP-7、馬前BMP-7、馬BMP-7成熟多肽、貓前原BMP-7、貓前BMP-7、貓成熟BMP-7，或其變體、衍生物或片段。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包括能夠在體內(nèi)表達(dá)BMP-7多肽的載體，并且提供用于OA的療法，也可以施用于哺乳動(dòng)物受試者，其同時(shí)用至少一種活性非類固醇抗炎藥(NSAID'S)成分進(jìn)行治療。本發(fā)明還提供了治療患有骨關(guān)節(jié)炎的哺乳動(dòng)物受試者的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物受試者關(guān)節(jié)內(nèi)施用治療有效量的組合物，所述組合物包括至少一種藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體、賦形劑或媒介物，包含編碼與啟動(dòng)子可操作地連接的BMP-7多肽的核酸序列的重組腺病毒載體，其中所述哺乳動(dòng)物受試者同時(shí)用至少一種活性NSAID’S成分進(jìn)行治療，并且所述BMP-7多肽在哺乳動(dòng)物受試者內(nèi)體內(nèi)表達(dá)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在包括能夠在體內(nèi)表達(dá)BMP-7多肽的載體的藥物組合物的施用前約10天和后約10天之間，將活性NSAID’S成分提供給被治療的哺乳動(dòng)物受試者。優(yōu)選地，在包括能夠在體內(nèi)表達(dá)BMP-7多肽的載體的藥物組合物的施用前約5天和后約5天之間，提供活性NSAID’S成分。最優(yōu)選地，在包括能夠在體內(nèi)表達(dá)BMP-7多肽的載體的藥物組合物的施用前約2天和后約2天之間，提供活性NSAID’S成分。NSAID，S的施用可以在劑量單位制劑中經(jīng)口、局部、腸胃外、通過(guò)吸入噴霧或經(jīng)直腸完成，所述劑量單位制劑包含常規(guī)無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體、佐劑和媒介物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)腸胃外的包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。包含活性NSAID’S成分的藥物組合物可以以適合于經(jīng)口使用的形式，例如作為片劑、糖錠、錠劑、水或油懸浮液、可分散粉劑或顆粒、乳狀液、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。預(yù)期用于經(jīng)口使用的組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知用于制造藥物組合物的任何方法進(jìn)行制備，并且此種組合物可以包含選自下述的一種或多種試劑甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑，以便提供藥學(xué)上精致和可口的制劑。片劑包含與適合于制造片劑的無(wú)毒藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合的活性NSAID’S成分。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；?；捅澜鈩?，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠，和潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是未經(jīng)包被的，或它們可以通過(guò)已知技術(shù)進(jìn)行包被，以延長(zhǎng)在胃腸道中的崩解和吸收并且因此提供經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)期的持續(xù)作用。例如，可以采用時(shí)間延遲材料，例如單硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯。它們還可以通過(guò)美國(guó)專利號(hào)4,256,108;4,166,452；和4,265,874中描述的技術(shù)進(jìn)行包被，以形成用于控制釋放的滲透治療片劑。用于經(jīng)口使用的制劑還可以呈現(xiàn)為其中活性成分與惰性固體稀釋劑相混合的硬明膠膠囊，所述惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土，或呈現(xiàn)為其中活性成分與水或可混溶劑或油介質(zhì)相混合的軟明膠膠囊，所述可混溶劑例如丙二醇、PEGs和乙醇，所述油介質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄欖油。水懸浮液包含與適合于制造水懸浮液的賦形劑相混合的活性NSAID’S材料。此種賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹膠；崩解劑或濕潤(rùn)劑可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯基氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如十七乙烯氧鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯去水山梨糖醇單油酸酯。水懸浮液還可以包含一種或多種防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酸乙酯或?qū)αu基苯甲酸正丙酯，一種或多種著色劑，一種或多種調(diào)味劑，和一種或多種甜味劑，例如蔗糖、糖精或阿斯巴甜。油懸浮液可以通過(guò)將活性NSAID’S成分懸浮于植物油或礦物油例如液體石蠟中進(jìn)行制備，所述植物油例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油。油懸浮液可以包含增稠劑例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？梢蕴砑犹鹞秳├缟衔乃瞿切┮约罢{(diào)味劑，以提供可口的經(jīng)口制備物。這些組合物可以通過(guò)添加抗氧化劑例如抗壞血酸進(jìn)行保存。適合于通過(guò)添加水制備水懸浮液的可分散粉劑和顆粒提供與分散劑或濕潤(rùn)劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑相混合的活性NSAID’S成分。合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑由上文已提及的那些進(jìn)行例示。還可以存在另外的賦形劑例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。NSAID’S還可以是水包油乳狀液的形式。油相可以是植物油例如橄欖油或花生油，或礦物油例如液體石蠟或這些的混合物。合適的乳化劑可以是天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂、和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如去水山梨糖醇單油酸酯，和所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯。乳狀液還可以包含甜味劑和調(diào)味劑。糖漿劑和酏劑可以用甜味劑進(jìn)行配制，所述甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。此種制劑還可以包含緩和劑、防腐劑以及甜味劑和著色劑。NSAID’S的組合物可以以無(wú)菌可注射水或油懸浮液的形式。這種懸浮液可以根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行配制，使用上文已提及的那些合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑。無(wú)菌可注射制備物還可以是在無(wú)毒腸胃外可接受的懸浮劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液，例如作為在1，3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受媒介物和溶劑中有水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。還可以使用共溶劑例如乙醇、丙二醇或聚乙二醇。此外，無(wú)菌、不揮發(fā)性油照常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個(gè)目的，可以采用任何品牌的不揮發(fā)性油，包括合成的甘油單或二酯。此外，脂肪酸例如油酸在注射劑的制備中有用。NSAID'S化合物還可以以栓劑形式進(jìn)行施用，用于藥物的直腸施用。這些組合物可以通過(guò)使藥物與合適的非刺激性賦形劑相混合進(jìn)行制備，所述非刺激性賦形劑在常溫下是固體，但在直腸溫度下是液體，并且因此在直腸中將融化以釋放藥物。此種材料是可可脂和聚乙二醇。對(duì)于局部使用，采用包含NSAID’S化合物的乳膏劑、軟膏、凝膠劑、溶液或懸浮液等。局部制劑一般可以包括藥學(xué)轉(zhuǎn)運(yùn)體、共溶劑、乳化劑、滲透促進(jìn)劑、防腐系統(tǒng)和軟化劑。約O.Olmg至約140mg/kg體重/天、或備選地約0.5mg至約7g/患者/天級(jí)別的劑量水平在治療上述病狀中是有用的。例如，通過(guò)施用約0.01至50mg化合物/千克體重/天、或備選地約0.5mg至約3.5g/患者/天可以有效治療炎癥?？梢耘c轉(zhuǎn)運(yùn)體材料相組合以產(chǎn)生單個(gè)劑型的活性NSAID’S成分量將依賴于待治療的宿主和具體施用方式而改變。例如，預(yù)期用于人的經(jīng)口使用的制劑可以包含與合適和方便量的轉(zhuǎn)運(yùn)體材料化合的0.5mg至5g活性試劑，其可以是約5至約95%總組合物。劑量單位形式一般將包含約Img至約500mg活性成分，一般是25mg、50mg、lOOmg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或1OOOmg。然而，應(yīng)當(dāng)理解對(duì)于任何具體患者的特定劑量水平將依賴于各種因素，包括年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄率、藥物組合和骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重度。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，NSAID，S可以是COX_2(環(huán)氧化酶-2)抑制劑。COX-2抑制劑可以如先前所述共施用于哺乳動(dòng)物受試者用于治療和/或預(yù)防OA，所述哺乳動(dòng)物受試者通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的治療組合物的關(guān)節(jié)內(nèi)注射進(jìn)行治療。與其他NSAID一樣，COX-2抑制劑在治療環(huán)氧化酶介導(dǎo)的疾病中有效，所述疾病例如炎癥、痛覺(jué)缺失和發(fā)熱。這些化合物在治療癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎中特別有效。這些化合物具有不影響胃腸道的完整性和腎血流量的優(yōu)點(diǎn)。這些化合物的例子包括(甲磺酰)苯基-2-5(H)-呋喃酮衍生物。這些衍生物例如在US-B1_5.981.576中描述。優(yōu)選地，COX-2抑制劑選自如授權(quán)專利US-B1_6.169.188中描述的式I的化合物。特別優(yōu)選的COX-2抑制劑包括3-(環(huán)丙基甲氧基)-5，5-二甲基-4-(4-甲磺酰)苯基)_5H_呋喃-2-酮、或3-(環(huán)丙基乙氧基)-5，5-二甲基-4-(4-甲磺酰)苯基)-5H_呋喃-2-酮、或這些化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或水合物。特別優(yōu)選的COX-2抑制劑是3-(環(huán)丙基甲氧基)-4_[4(甲磺酰)苯基|-5，5-二甲基-5H-呋喃-2-酮的多態(tài)形式B。對(duì)于馬，作為經(jīng)口或腸胃外施用(尤其是靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)施用)，COX-2抑制劑的劑量可以是約0.05至約0.5mg/kg/12-24小時(shí)，并且更優(yōu)選約0.1mg/kg/24小時(shí)。優(yōu)選地，COX-2抑制劑是經(jīng)口液體懸浮液或溶液、粘稠液、凝膠劑、糊劑或靜脈內(nèi)/皮下/肌內(nèi)制劑。對(duì)于犬，COX-2抑制劑的劑量可以是約2至約10mg/kg/12-24小時(shí)，優(yōu)選約5至約10mg/kg/24小時(shí)，并且更優(yōu)選約5mg/kg/24小時(shí)。優(yōu)選地，COX-2抑制劑是經(jīng)口片劑(常規(guī)硬咀嚼片或軟咀嚼片)、經(jīng)口液體懸浮液或溶液、或靜脈內(nèi)/皮下/肌內(nèi)制劑。包含COX-2抑制劑的糊劑的某些例子在專利申請(qǐng)EP-A1-1.688.149中，尤其是在表10-12中描述。本發(fā)明提供了用于OA的進(jìn)一步療法，其利用包括能夠在體內(nèi)表達(dá)BMP-7多肽和至少一種IL-IO(ILlO)的載體的藥物組合物，并且從而提供用于誘導(dǎo)滑液BMP-7濃度和ILlO濃度中的持續(xù)增加的方法和組合物。本發(fā)明提供了治療患有骨關(guān)節(jié)炎的哺乳動(dòng)物受試者的進(jìn)一步方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物受試者關(guān)節(jié)內(nèi)施用治療有效量的組合物，所述組合物包括至少一種藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體、賦形劑或媒介物，包含編碼與啟動(dòng)子可操作地連接的BMP-7多肽的核酸序列的重組腺病毒載體，和包含編碼與啟動(dòng)子可操作地連接的ILlO多肽的核酸序列的重組病毒載體，其中所述BMP-7多肽和ILlO多肽在哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)表達(dá)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體和另一種病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽、人前原BMP-7、人前BMP-7、人成熟BMP-7、馬前原BMP-7、馬前BMP-7、馬BMP-7成熟多肽、貓前原BMP-7、貓前BMP-7、貓成熟BMP-7，或其變體、衍生物或片段，所述另一種病毒載體編碼且能夠表達(dá)白介素-IO(ILlO)，尤其是馬IL10、犬IL10、貓IL10、人IL10、病毒IL10。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體和另一種病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽，或其變體、衍生物或片段，所述另一種病毒載體編碼且能夠表達(dá)犬IL10。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體和另一種病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)馬前原BMP-7、馬前BMP-7、馬BMP-7成熟多肽，或其變體、衍生物或片段，所述另一種病毒載體編碼且能夠表達(dá)馬IL10。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體和另一種病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)貓前原BMP-7、貓前BMP-7、貓BMP-7成熟多肽，或其變體、衍生物或片段，所述另一種病毒載體編碼且能夠表達(dá)貓IL10。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體和另一種病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)人前原BMP-7、人前BMP-7、人BMP-7成熟多肽，或其變體、衍生物或片段，所述另一種病毒載體編碼且能夠表達(dá)人IL10。優(yōu)選地，“另一種病毒載體”是腺病毒載體，尤其是人腺病毒或犬腺病毒，特別是hAd5載體或CAV2載體。當(dāng)使用此種載體組合時(shí)，施用如先前對(duì)于僅包括表達(dá)BMP-7多肽的腺病毒載體的組合物所描述的來(lái)完成，除治療和/或藥物組合物每劑量包含約IO7至約IO11VP的表達(dá)BMP-7多肽的腺病毒載體，和約IO7至約IO11VP的表達(dá)ILlO多肽的腺病毒載體外；有利地約IO8至約IOiciVP的表達(dá)BMP-7多肽的腺病毒載體，和約IO8至約IOiciVP的表達(dá)ILlO多肽的腺病毒載體；和更有利地約IO9至約IOltlVP的表達(dá)BMP-7多肽的腺病毒載體，和約IO9至約IOiciVP的表達(dá)ILlO多肽的腺病毒載體。在基于犬腺病毒載體，尤其是基于CAV-2載體的治療和/或藥物組合物的情況下，劑量可以是約IO5VP至約109VP、有利地約IO6至約108、更有利地約IO6至約IO7VP的重組犬腺病毒。本發(fā)明提供了治療患有骨關(guān)節(jié)炎的哺乳動(dòng)物受試者的進(jìn)一步方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物受試者關(guān)節(jié)內(nèi)施用治療有效量的組合物，所述組合物包括至少一種藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體、賦形劑或媒介物，包含編碼與啟動(dòng)子可操作地連接的BMP-7多肽的核酸序列、和編碼與第二啟動(dòng)子可操作地連接的ILlO多肽的核酸序列的重組腺病毒載體，其中所述BMP-7多肽和ILlO多肽在哺乳動(dòng)物受試者內(nèi)體內(nèi)表達(dá)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)兩者——犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽、人前原BMP-7、人前BMP-7、人成熟BMP-7、馬前原BMP-7、馬前BMP-7、馬BMP-7成熟多肽、貓前原BMP-7、貓前BMP-7、貓成熟BMP-7，或其變體、衍生物或片段，并且編碼白介素-10(ILlO)，尤其是馬IL10、犬IL10、貓IL10、人IL10。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)兩者——犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽，或其變體、衍生物或片段，和犬IL10。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)兩者——馬前原BMP-7、馬前BMP-7、馬BMP-7成熟多肽，或其變體、衍生物或片段，和馬IL10。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)兩者——貓前原BMP-7、貓前BMP-7、貓BMP-7成熟多肽，或其變體、衍生物或片段，和貓IL10。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療和/或預(yù)防OA的病毒載體的用途，以及包括病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼且能夠表達(dá)兩者——人前原BMP-7、人前BMP-7、人BMP-7成熟多肽，或其變體、衍生物或片段，和人IL10。當(dāng)使用此種2種插入載體時(shí)，施用如先前對(duì)于僅包括表達(dá)BMP-7多肽的腺病毒載體的組合物所描述的來(lái)完成。編碼ILlO的核酸序列可以在互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，尤其是對(duì)于馬ILlO在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中在登記號(hào)U38200和區(qū)域[1-537]下，對(duì)于犬ILlO在XM_850467.1和區(qū)域[2-541]下，對(duì)于貓ILlO在NM_001009209.1和區(qū)域[1-537]下，對(duì)于人ILlO在NM_000572.2和區(qū)域[60-596]下，并且對(duì)于病毒ILlO在AF182315下。如對(duì)于BMP-7限定的，ILlO功能等價(jià)物、ILlO變體、ILlO衍生物等由本發(fā)明所包括。ILlO的功能等價(jià)物由ILlO的生物學(xué)活性和性質(zhì)限定，其活性和性質(zhì)尤其在SchlaakJF等人，JImmunolMethods，1994，168(1)49-54中描述。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括與SEQIDNO:60具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的馬ILlO多肽的功能等價(jià)物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括與SEQIDNO62具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的犬ILlO多肽的功能等價(jià)物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括與SEQIDNO64具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的貓ILlO多肽的功能等價(jià)物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括與SEQIDNO66具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的人ILlO多肽的功能等價(jià)物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括與SEQIDNO68具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的病毒ILlO多肽的功能等價(jià)物。用于表達(dá)ILlO的啟動(dòng)子與先前對(duì)于BMP-7表達(dá)描述的那些不同。本發(fā)明現(xiàn)在將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步描述。實(shí)施例實(shí)施例1貓BMP-7基因的產(chǎn)牛。使用從貓腎細(xì)胞中純化的RNA通過(guò)RT-PCR獲得BMP-7的cDNA。使用RNeasyMiniKit(Qiagen，Courtaboeuf,France)根據(jù)制造商的方案，由得自貓仔(foal)腎的貓腎細(xì)胞制備總RNA。使用OneStepSuperscriptIIIKit(Invitrogen，NewJersey,USA,Ref12574.035)根據(jù)制造商的方案執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)步驟。隨后根據(jù)GenBank可獲得序列(人BMP-7在登記號(hào)AL122058下，鼠類在登記號(hào)NM_007557下，并且犬在登記號(hào)XM_862341下)，使用2對(duì)引物PB1053-PB1063和PB1060-PB1062，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增與貓BMP-7基因相對(duì)應(yīng)的cDNA片段。PB1053(SEQIDNO20)(31聚體)5，GGATCCCTAGTGGCAGCCACAGGCTCGGACG3，PB1063(SEQIDNO21)(24聚體)5，GCCACCAGCAACCACTGGGTGGTC3，PB1060(SEQIDNO22)(24聚體)5，TTCAGCCTGGACAACGAGGTGCAC3，PB1062(SEQIDNO23)(20聚體)5’TGGTTGGTGGCGTTCATGTA3’RT-PCR條件是權(quán)利要求1.治療患有骨關(guān)節(jié)炎的哺乳動(dòng)物受試者的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物受試者關(guān)節(jié)內(nèi)施用治療有效量的組合物，所述組合物包括至少一種藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的轉(zhuǎn)運(yùn)體、賦形劑或媒介物，和包含編碼與啟動(dòng)子可操作地連接的BMP-7多肽的核酸序列的重組腺病毒載體，其中所述BMP-7多肽在所述哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)表達(dá)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述重組腺病毒載體是人腺病毒。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述人腺病毒是人腺病毒5型(hAd5)。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述人腺病毒5型(hAd5)是PEG化的。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述重組腺病毒載體是犬腺病毒。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述犬腺病毒是犬腺病毒2型(CAV2)。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物受試者選自人、犬科、馬科和貓科。8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物受試者是犬、母犬或幼犬。9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物受試者是貓或小貓。10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物受試者是馬、母馬或馬駒。11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述BMP-7多肽選自前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽和成熟BMP-7多肽。12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述BMP-7多肽選自犬前原BMP-7多肽、犬前BMP-7多肽、犬成熟BMP-7多肽、貓前原BMP-7多肽、貓前BMP-7多肽、貓成熟BMP-7多肽、馬前原BMP-7多肽、馬前BMP-7多肽、馬成熟BMP-7多肽、人前原BMP-7多肽、人前BMP-7多肽和人成熟BMP-7多肽。13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中編碼所述BMP-7多肽的核酸序列選自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO10、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO17、SEQIDNO18，及其編碼具有BMP-7活性的多肽的片段、變體、衍生物和同系物。14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述BMP-7多肽具有選自SEQIDNO3、SEQIDNO:15、SEQIDNO16、SEQIDNO19的氨基酸序列，及其具有BMP-7活性的片段、變體、衍生物和同系物。15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述BMP-7多肽包括信號(hào)肽。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述信號(hào)肽選自BMP-7信號(hào)序列、IGF-I信號(hào)序列和tPA信號(hào)序列。17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述信號(hào)肽由選自SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO11的核苷酸序列，及其編碼具有信號(hào)肽活性的肽的片段、變體、衍生物和同系物編碼。18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述信號(hào)肽具有選自SEQIDNO:5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO12的氨基酸序列，及其具有信號(hào)肽活性的片段、變體、衍生物和同系物。19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述啟動(dòng)子選自CMVIE啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、HSV-ITK啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、磷酸甘油酸酯激酶基因啟動(dòng)子、金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子、α-1抗胰蛋白酶基因啟動(dòng)子、白蛋白基因啟動(dòng)子、膠原酶基因啟動(dòng)子、彈性蛋白酶I基因啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子、β-珠蛋白基因啟動(dòng)子、Y-珠蛋白基因啟動(dòng)子、α-甲胎蛋白基因啟動(dòng)子、和肌肉肌酸激酶基因啟動(dòng)子。20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述ΒΜΡ-7多肽選自犬前原ΒΜΡ-7多肽、犬前ΒΜΡ-7多肽、犬成熟ΒΜΡ-7多肽，并且所述啟動(dòng)子是犬滑膜細(xì)胞特異性啟動(dòng)子或其中編碼所述ΒΜΡ-7多肽的核酸序列選自SEQIDNO:1、SEQIDNO2，及其編碼具有ΒΜΡ-7活性的多肽的片段、變體、衍生物和同系物，并且所述啟動(dòng)子是犬滑膜細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。全文摘要本發(fā)明涉及在宿主細(xì)胞中表達(dá)BMP-7多肽的重組載體和包括此種重組載體的藥物組合物。本發(fā)明還包括通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)施用本發(fā)明的重組載體和藥物組合物用于預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物中的骨關(guān)節(jié)炎的方法，所述哺乳動(dòng)物有利地是人、犬、馬和貓。文檔編號(hào)C07K14/51GK102027114SQ200880115829公開日2011年4月20日申請(qǐng)日期2008年10月7日優(yōu)先權(quán)日2007年10月5日發(fā)明者L·B·菲舍申請(qǐng)人:梅里亞有限公司