專利名稱：：親吻肽拮抗劑及其用途的制作方法親吻肽拮抗劑及其用途本發(fā)明涉及親吻肽(kisspeptin)拮抗劑及其在用于治療個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥中的用途。此外，本發(fā)明還涉及用于鑒定親吻肽拮抗劑的方法。RFamide是在其C_末端具有通常的Arg-Phe_NH2基序一組肽激素，并且都與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合。已表明RFamide參與全身的許多過程，包括炎癥反應(yīng)、對(duì)食物攝入和發(fā)育的控制。RFamide發(fā)揮作用的一個(gè)主要方面是生殖，其涉及兩種RFamide促性腺激素抑制激素(GnlH)和親吻肽。KiSS-1基因位于人染色體lq32上，由四個(gè)外顯子-兩個(gè)非翻譯和兩個(gè)部分翻譯的外顯子組成，產(chǎn)生145個(gè)氨基酸(aa)的肽[1]。前體肽被剪切成54個(gè)氨基酸的長度，還可以進(jìn)一步被截短至14、13或10個(gè)氨基酸；這些截短物被統(tǒng)稱為親吻肽，并且在哺乳動(dòng)物中高度保守。目前已知這些肽是孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)(在大鼠中被稱為GPR54，在人中被稱為AX0R12)的配體[2-4]。10aa的肽，YNWNSreLRF_NH2足以激活受體。GPR54受體具有396aa的開放閱讀框架，并與甘丙肽(galanin)受體家族相關(guān)，但是其并不與甘丙肽結(jié)合。大鼠GPR54在且哺乳動(dòng)物中高度保守，與人受體有81%的同源性，與小鼠有85%的同源性[2，4，5]。在腦和外周組織中的受體和配體已得到充分表征，其中GPR54和KiSS-1位于下丘腦、主動(dòng)脈、卵巢、前列腺和胎盤，GPR54還表達(dá)于垂體中[2，4，6，7]?？紤]到受體和配體表達(dá)的位置，假設(shè)了它們在生殖中起作用，并且通過證明GPR54因雜合和純合突變性功能缺失而引起特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥(iHH)而得到證實(shí)，在iHH患者中表現(xiàn)青春期延遲或無青春期(failedpuberty)，以低或無血漿促黃體激素(LH)脈沖為特征[8-13]。這也在GPR54-/-小鼠中觀察到，其具有小的睪丸/卵巢，小的外生殖器和輸精管，發(fā)育不全的Leydig細(xì)胞和子宮角，與在iHH人患者中看到的非常相似[14]。這就使得關(guān)注KiSS-1和GPR54在控制青春期尤其是其時(shí)機(jī)中起作用的假設(shè)。之后，發(fā)現(xiàn)青春期猴子的KiSS-1mRNA水平比幼年期猴子更高[15]。小鼠在第10日(dlO)沒有KiSS-1神經(jīng)元，從第25日開始在前腹側(cè)室旁核(AnterioventralParaventricularnucleus,AVPV)中出現(xiàn)KiSS-1神經(jīng)元，并且雄性小鼠大約在第45日而雌性小鼠在第61日增加至成年水平。這與這些動(dòng)物的青春期時(shí)機(jī)相一致[16]。然而，GPR54mRNA水平在出生后的整個(gè)青春期保持恒定，因此，親吻肽輸注可在所有階段刺激LH釋放。因此，親吻肽被認(rèn)為青春期始發(fā)中GnRH分泌的主要調(diào)節(jié)劑[17]。親吻肽和GPR54在下丘腦中的表達(dá)產(chǎn)生了親吻肽可能參與調(diào)控下丘腦_垂體_性腺(HPG)軸的假設(shè)。已通過證明親吻肽在雄性大鼠和人中以劑量依賴的方式快速增加血漿促黃體激素(LH)、促卵泡激素(FSH)和睪丸素(其中其對(duì)LH的強(qiáng)效作用是對(duì)FSH的10倍)[18-20]而證實(shí)了這種假設(shè)。還進(jìn)一步證明可以通過施用促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)拮抗劑而消除所述促性腺激素的增加。這表明親吻肽在下丘腦水平發(fā)揮作用以刺激GnRH釋放[15]。有關(guān)下丘腦的中間隆起處的GnRH神經(jīng)元具有GPR54受體，而90%的KiSS-1神經(jīng)元纖維與GnRH-免疫反應(yīng)性神經(jīng)元共定位的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)[21，22]。另外，GT1-7下丘腦細(xì)胞也表達(dá)KiSS-1和GPR54mRNA，其因?qū)Υ贫挤磻?yīng)而增加，而親吻肽在24小時(shí)后刺激這些細(xì)胞釋放GnRH[23]。以上數(shù)據(jù)還表明親吻肽并不在垂體水平起作用，但是尚未排除直接在垂體水平起作用。其他研究小組還證明親吻肽在垂體中的促性腺激素細(xì)胞和生長激素細(xì)胞中表達(dá)，并且親吻肽可以直接刺激LH和生長激素的釋放[24，25]。KiSS-1神經(jīng)元定位于嚙齒動(dòng)物和靈長動(dòng)物下丘腦的弓狀核(ARC)和AVPV。然而在羊和大鼠中，僅在ARC中發(fā)現(xiàn)KiSS-1神經(jīng)元[16，26，27]。現(xiàn)在已確定ARC參與類固醇的負(fù)調(diào)節(jié)，而AVPV參與促性腺激素釋放的正反饋控制。首次注意到，在將雄性小鼠閹割之后，觀察到在ARC中，KiSS-1細(xì)胞數(shù)量和mRNA表達(dá)水平增加，并且雌激素替代使其降低至正常水平，而在AVPV中，KiSS-1細(xì)胞數(shù)量減少，并且雌激素給藥使其升高回正常水平[26]?，F(xiàn)在已證明KiSS-1細(xì)胞體表達(dá)雌激素受體a(ERa)和黃體酮受體，表明KiSS_l在類固醇反饋環(huán)中的作用[27，28]。這表明ARC在負(fù)控制下調(diào)節(jié)LH脈沖，而AVPV在正控制下可能刺激LH激增和誘導(dǎo)排卵。這通過親吻肽抗血清甚至在高雌激素存在下也抑制大鼠LH激增而得到證明，此外，還因?yàn)榇剖驛VPV中的KiSS-1神經(jīng)元比雄鼠多10倍。該類固醇控制在整個(gè)發(fā)情周期是起作用的，因?yàn)樵贏VPV中的KiSS-1-陽性細(xì)胞數(shù)量在動(dòng)情前期最高，而在動(dòng)情間期最低，而在ARC中的情形則與其相反[16，29]。對(duì)于羊，作用于ARC上的正和負(fù)反饋產(chǎn)生與其它哺乳動(dòng)物尾部區(qū)域促進(jìn)LH激增相同的反應(yīng)。除了類固醇控制，KiSS-1還通過褪黑素受到光周期的調(diào)節(jié)，而且KiSS-1神經(jīng)元在其細(xì)胞體上具有Mellc受體。與保持在長日照條件下的雌性西伯利亞倉鼠相比，保持在短日照下的雌性西伯利亞倉鼠對(duì)外源性親吻肽的反應(yīng)也降低[30-33]。瘦素(leptin)似乎也具有影響作用，因?yàn)閲?yán)格禁食的嚙齒動(dòng)物具有降低的KiSS-1mRNA、GnRH、LH和FSH以及延遲的青春期[34，35]。還在HPG軸外部的諸如心臟血管系統(tǒng)的外周組織中發(fā)現(xiàn)親吻肽，已證明親吻肽-10/13作為主動(dòng)脈平滑肌的血管收縮劑起作用[7，36]。GPR54還高度表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，腦海馬區(qū)域中，已證明其通過涉及MAP激酶的機(jī)理可逆地增強(qiáng)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞中的突觸傳遞，其中所述機(jī)理似乎受到鈣-激活激酶和酪氨酸激酶的調(diào)控[37]。KiSS-1和GPR54mRNA還定位于大鼠卵巢中，其在大鼠卵巢中的表達(dá)同樣與動(dòng)情周期相關(guān)。在卵巢中，KiSS-1定位于卵巢表面上皮細(xì)胞、間質(zhì)腺、黃體以及在卵泡中，直至動(dòng)情前期都存在于膜細(xì)胞中，而動(dòng)情前期時(shí)表達(dá)移至卵泡細(xì)胞層[6]。最近，在子宮輸卵管中發(fā)現(xiàn)KiSSmRNA,并且假設(shè)其參與防止異位妊娠[38]。然而，KiSS-1和GPR54的最高水平在胎盤中。在胎盤中，KiSS-1和GPR54定位于小鼠[39]和人[40]的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞；和大鼠的巨細(xì)胞[41]。GPR54還定位于外絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞，表明其可能有旁分泌作用[42]。在人中，妊娠前三個(gè)月配體和受體都以高水平存在，但是足月僅有KiSS-1存在，而在大鼠中到E18.5期二者都不存在。這與滋養(yǎng)層的侵入相一致，而KiSS-1由于其抗轉(zhuǎn)移性質(zhì)而被假設(shè)為該侵入的抑制劑[39，41]。還已知親吻肽是許多癌癥組織例如胰腺癌、甲狀腺癌和肝細(xì)胞癌中的抗轉(zhuǎn)移因子[43-45]。已假設(shè)了此功能的不同機(jī)制，包括基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-l(SDF-l)的拮抗作用，以抑制其趨化因子受體CXCR4的轉(zhuǎn)移性質(zhì)，以及上調(diào)調(diào)節(jié)性鈣依賴磷酸酶_相作蛋白-1(modulatorycalcineurin-interactinprotein-l，MCIP_l),MCIP_1是能夠抑制鈣依賴磷酸酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑的趨化激素[46，47]。另一個(gè)假設(shè)是親吻肽受到特異性蛋白1(SP1)和位于染色體區(qū)域6ql6.3q23的其共激活因子DRIP130的調(diào)控。當(dāng)此區(qū)域出現(xiàn)雜合性缺失(L0H)時(shí)，腫瘤常缺失KiSS-1，而這允許轉(zhuǎn)移發(fā)生。這可由抑制侵入和遷移的SP1和DRIP130補(bǔ)救[48，49]。在培養(yǎng)的細(xì)胞中也證明了這種抑制，并且作為輸出(output)以研究親吻肽所使用的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在中國卵巢倉鼠(CH0)細(xì)胞中，親吻肽-10(Kpl0)可以抑制趨化性、遷移、集落形成和生長以及可以引起細(xì)胞變圓。Kp-10還可以通過粘著斑激酶(FAK)和paxillin蛋白的磷酸化作用而引起粘著斑和應(yīng)力纖維的形成[3，50，51]。已證明親吻肽和GPR54提高肌醇-3-磷酸、細(xì)胞內(nèi)鈣和pERK，表明GPR54激活Gq/11信號(hào)傳導(dǎo)途徑[4]。這與抗轉(zhuǎn)移性質(zhì)不完全一致，因?yàn)檫@種途徑通常刺激生長和遷移。因此，表明親吻肽可能激活其它途徑,如Rho和Rac/Cdc42途徑[5，51]。在這個(gè)背景下，本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，親吻肽拮抗劑可以用于治療個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了親吻肽拮抗劑在制備用于治療個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥的藥物中的用途。第二方面，本發(fā)明提供了親吻肽拮抗劑，其用于治療個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥。具體而言，發(fā)現(xiàn)GPR54受體的拮抗劑通過在下丘腦抑制GnRH釋放，而可用于調(diào)控與促性腺激素和性類固醇相關(guān)的疾病。因此，親吻肽拮抗劑是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樗鼈兛赡芴娲糜谝种拼傩韵偌に氐腉nRH激動(dòng)劑和拮抗劑，并且它們的作用更快速和完全。GnRH類似物以抑制型形態(tài)被用于抑制促性腺激素和性激素，并且它們已經(jīng)在激素依賴性疾病(如前列腺癌、乳癌和卵巢癌)的治療中獲得廣泛的治療應(yīng)用，并在體外受精用于誘導(dǎo)排卵，以及作為新一代的避孕藥。因此，由于親吻肽是GnRH的主要刺激物(例如，已知親吻肽受體GPR54的突變引起不育)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)親吻肽拮抗劑可能與GnRH拮抗劑有相似的應(yīng)用范圍；此外，由于親吻肽操縱GnRH神經(jīng)元的上游，預(yù)期親吻肽拮抗劑的作用應(yīng)該比基于GnRH的治療法更快速和有效。本文中，“個(gè)體中的親吻肽活性”包括親吻肽在體外和/或體內(nèi)的任何特性、活性或特征。因而，本文中的“親吻肽拮抗劑”的含義包括能夠防止和/或降低親吻肽在體外和/或體內(nèi)的任何特性、活性或特征的分子。例如，親吻肽拮抗劑可以防止和/或降低親吻肽物理性地與親吻肽受體或其它細(xì)胞成分締合或結(jié)合的能力。因而，本發(fā)明的分子和拮抗劑能夠可逆地或不可逆地結(jié)合親吻肽受體和/或選擇性地結(jié)合親吻肽受體。所述“選擇性地結(jié)合”包括本發(fā)明的分子和拮抗劑與親吻肽受體結(jié)合的能力比與其它多肽結(jié)合的能力強(qiáng)至少10倍；優(yōu)選地強(qiáng)至少50倍，和更優(yōu)選地強(qiáng)至少100倍。優(yōu)選地，本發(fā)明的分子和拮抗劑在生理?xiàng)l件下，例如在體內(nèi)與親吻肽受體結(jié)合。測量肽與其配體或受體結(jié)合或締合的方法(無論是在體內(nèi)或是在體外)是生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如，如以下實(shí)施例中所顯示的，本發(fā)明的拮抗劑可以是親吻肽的競爭性拮抗劑，其結(jié)合但并不激活親吻肽同源受體(如GPR54)。親吻肽拮抗劑還可以阻止和/或降低親吻肽刺激具體細(xì)胞行為的能力，例如細(xì)胞中(例如在轉(zhuǎn)化或原代細(xì)胞系如CH0、HEK、COS、GnRHGTI神經(jīng)元細(xì)胞系以及正常滋養(yǎng)層和細(xì)胞系如JEG中)親吻肽介導(dǎo)的刺激肌醇磷酸生成。本領(lǐng)域中熟知用于肌醇磷酸生成的細(xì)胞測量的生物化學(xué)測定法。在尤其優(yōu)選的方面，拮抗劑為親吻肽的肽類似物。親吻肽的肽類似物的結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系(SAR)受到的關(guān)注相對(duì)較少，直到現(xiàn)在仍完全集中于激動(dòng)作用[52，53]。親吻肽的氨基酸序列(又被稱為親吻肽1-54)為GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF.NH2。因而，第三方面，本發(fā)明提供了包含以下序列或由以下序列組成的肽分子或者其片段或變體用于治療患者中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥的用途，或者在制備用于治療患者中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥的藥物中的用途，所述序列為X1-GZW-X2-R/(D)R-X3其中X1為F或A或任意D-氨基酸殘基；X2為L或A或任意D-氨基酸殘基；X3為F或W;且其中所述肽分子的C-末端氨基酸殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)ζ；并且所述肽序列不為F-G-L-R-F；F-G-L-R-W；或F-G-(D)F-R-F。優(yōu)選地，本發(fā)明肽分子的C-末端氨基酸殘基包含基團(tuán)ζ的情況下，該C-末端殘基上的負(fù)電荷被去除。應(yīng)理解，在本文中使用常規(guī)的用于表示氨基酸的單字母代碼來定義本發(fā)明所述的肽分子。術(shù)語“氨基酸”包括水溶性有機(jī)化合物中具有與α-碳原子連接的羧基(-C00H)和氨基(-NH2)基團(tuán)的任何基團(tuán)。氨基酸可以用通式R-CH(NH2)COOH表示；R基團(tuán)為氫或有機(jī)基團(tuán)，并且決定了任意具體氨基酸的性質(zhì)。α-碳原子周圍的四個(gè)不同基團(tuán)的四面體排列使氨基酸具有光學(xué)活性。兩種鏡像形式被稱為L-異構(gòu)體和D-異構(gòu)體。通常，僅有L-氨基酸是蛋白質(zhì)(如真核蛋白質(zhì))的組成成分。除非另作說明，本發(fā)明的肽分子包含L-氨基酸。當(dāng)D-氨基酸存在于本發(fā)明的肽分子時(shí)，用帶有前綴“(D)，，的常規(guī)單字母氨基酸代碼表示。如所述，本發(fā)明的分子可以包含在特定位置具有“任意D-氨基酸”的肽序列或由在特定位置具有“任意D-氨基酸”的肽序列組成。所述“任意D-氨基酸”包括在序列中在特定位置的任意天然或非天然(例如化學(xué)修飾的)D-氨基酸。天然D-氨基酸的實(shí)例如下D-丙氨酸；D-天冬氨酸；D-半胱氨酸；D-谷氨酸；D-苯丙氨酸；D-甘氨酸；D-組氨酸；D-異亮氨酸；D-賴氨酸；D-亮氨酸；D-蛋氨酸；D-天冬酰胺；D-脯氨酸；D-谷氨酰胺；D-精氨酸；D-絲氨酸；D-蘇氨酸；D-纈氨酸；D-色氨酸；D-酪氨酸。非天然D-氨基酸的實(shí)例如下萘基丙氨酸；D-吡啶基丙氨酸；D-叔丁基絲氨酸；D-鳥氨酸；D-ε氨基賴氨酸；D-高精氨酸；D-α甲基亮氨酸以及用鹵素取代(如F)這些和其它非天然氨基酸中的質(zhì)子。通過形成肽鍵，氨基酸結(jié)合形成短鏈(肽)或較長的鏈(多肽)。已知蛋白質(zhì)和/或肽由不同比例的大約20種常見氨基酸組成，其序列決定了蛋白質(zhì)和/或肽的形狀、性質(zhì)和生物學(xué)作用。這種肽或多肽鏈中的氨基酸殘基通常用它們在鏈上的排列位置來表示，第一位(即位點(diǎn)1)指定為鏈N-末端的氨基酸?？梢酝ㄟ^Luetal(1981)J.Org.Chem.46，3433和其中的參考文獻(xiàn)中公開的Fmoc-聚酰胺式固相肽合成法來合成本發(fā)明分子的肽序列。用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基團(tuán)提供臨時(shí)的N-氨基保護(hù)。使用含20%哌啶的N，N-二甲基甲酰胺進(jìn)行該高度堿不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)的重復(fù)去除。可以將側(cè)鏈官能團(tuán)保護(hù)成其丁基醚(對(duì)于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的情況)、丁基酯(對(duì)于谷氨酸和天冬氨酸的情況)、丁基氧羧基衍生物(對(duì)于賴氨酸和組氨酸的情況)、三苯甲基衍生物(對(duì)于半胱氨酸的情況)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰衍生物(對(duì)于精氨酸的情況)。當(dāng)C-末端殘基為谷氨酰胺或天冬酰胺時(shí)，使用4，4'-二甲氧基二苯甲基基團(tuán)保護(hù)側(cè)鏈氨基官能團(tuán)。固相載體基于由二甲基丙烯酰胺(主鏈單體)、雙丙烯酰乙二胺(交聯(lián)劑)和丙烯酰肌氨酸甲酯(功能化試劑)三種單體組成的聚二甲基-丙烯酰胺聚合物。所使用的肽_樹脂可斷裂連接劑為酸不穩(wěn)定的4-羥甲基-苯氧基乙酸衍生物。除了天冬酰胺和谷氨酰胺之外，全部氨基酸衍生物均作為它們預(yù)制的對(duì)稱酐衍生物加入，而使用反向N，N-二環(huán)己基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑介導(dǎo)的偶聯(lián)方法加入天冬酰胺和谷氨酰胺。使用茚三酮、三硝基苯磺酸或吲哚醌(isotin)檢測方法來監(jiān)測所有的偶聯(lián)和去保護(hù)反應(yīng)。合成完成時(shí)，從樹脂載體切下肽，同時(shí)用含有50%清除劑混合物的95%三氟乙酸處理去除側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)。常用的清除劑為乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，準(zhǔn)確的選擇取決于所合成的肽的氨基酸組成。通過真空蒸發(fā)去除三氟乙酸，接著通過用乙醚研磨而提供粗肽。通過簡單的萃取步驟來去除存在的任何清除劑，其中通過冷凍干燥水相提供不含清除劑的粗肽。用于肽合成的試劑通?？少徸訡albiochem-Novabiochem(UK)Ltd,NottinghamNG72QJ，UK。純化可以通過例如體積排阻色譜法、離子交換色譜法和(主要地)反相高效液相色譜法等技術(shù)中的任意一種或組合來實(shí)現(xiàn)。肽的分析可以使用薄層色譜法、反相高效液相色譜法、酸水解后的氨基酸分析以及快速原子轟擊(FAB)質(zhì)譜分析來進(jìn)行。還可以使用化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的液相法來合成本發(fā)明分子的肽序列。本發(fā)明分子的肽序列可以包含肽模擬物化合物或由肽模擬物化合物組成。術(shù)語“肽模擬物”是指模擬作為治療劑的特定肽的結(jié)構(gòu)和理想特征，同時(shí)避免了不期望特征的化合物。例如，可以口服給藥的化合物嗎啡，是腦啡肽和/或內(nèi)啡肽的肽模擬物。一般而言，由于缺乏口服生物利用度和蛋白水解的降解，涉及肽的治療應(yīng)用是受限的，并且通常通過注射給藥。通常，例如肽在體內(nèi)被外肽酶和內(nèi)肽酶快速降解，以致其生物半衰期通常非常短。肽作為潛在的治療劑的另一個(gè)缺陷是它們?nèi)狈诜o藥生物利用度。肽在胃腸道被蛋白水解酶降解很可能是重要的影響因素。然而，因?yàn)橐颜J(rèn)識(shí)到即使是不易被快速代謝失活的小環(huán)形肽或包括D-氨基酸的肽，仍然顯示出較差的口服生物利用度，而使得問題更加復(fù)雜。這可能是由于跨腸膜轉(zhuǎn)運(yùn)較差和通過肝提取而從血液快速清除并且接著排泄到腸中而造成的。這些結(jié)果表明，多個(gè)酰胺鍵可能干擾口服生物利用度。由此認(rèn)為當(dāng)肽藥物被口服給藥時(shí)，肽鏈中連接氨基酸殘基的肽鍵可能斷裂或被切割。有許多不同的方法用于設(shè)計(jì)和合成肽模擬物。在一種方法中，例如Sherman和Spatola,J.Am.Chem.Soc.,112433(1990)所公開的方法中，以基本等排(isoteric)的方式由多種化學(xué)官能團(tuán)替代一個(gè)或更多個(gè)酰胺鍵。這種分步的方法在獲得活性類似物方面取得一些成績。在一些例子中，這些類似物顯示比它們天然存在的對(duì)應(yīng)物具有更長的生物半衰期。盡管如此，這種方法有些局限性。很少能成功替代多于一個(gè)的酰胺鍵。因而，所得到的類似物在分子的其它部位仍然對(duì)酶促失活敏感。替代肽鍵時(shí)，優(yōu)選新的接頭部分具有與肽鍵基本上相同的電荷分布和基本上相同的平面。反轉(zhuǎn)肽模擬物(Retro-inversoρ印tidomimetics)，其中的肽鍵是反向的，可以用本領(lǐng)域中已知的方法合成，例如M6zi0reetal(1997)J.Immunol.1593230-3237中所描述的方法。該方法包括制備含有涉及主鏈變化，但不涉及側(cè)鏈定向變化的偽肽。反轉(zhuǎn)肽包含NH-CO鍵而不是CO-NH肽鍵，對(duì)蛋白酶解具有更強(qiáng)的抗性。之前已合成了某些GnRH肽的反轉(zhuǎn)肽模擬物(Fromme，2003，Endocrinology,144:3262_9)。在另一種方法中，將各種非編碼或修飾的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸用于修飾哺乳動(dòng)物肽?？蛇x擇地，通過共價(jià)修飾如環(huán)化，或者通過加入Y-內(nèi)酰胺或其他類型的橋而穩(wěn)定假定的生物活性構(gòu)象。參見例如，Veberetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，752636(1978)禾口Thurselletal，Biochem.Biophys.Res.Comm.，111166(1983)。許多合成策略的共同主題是向基于肽的骨架中引入一些環(huán)化部分(moiety)。環(huán)化部分限制肽結(jié)構(gòu)的構(gòu)象空間，并且這常常產(chǎn)生對(duì)特定生物受體的親合力增加的肽。這種策略的其他優(yōu)勢在于，向肽中引入環(huán)化部分還可獲得對(duì)細(xì)胞肽酶的敏感性減小的肽。合成環(huán)化穩(wěn)定的肽模擬物的一種策略是閉環(huán)置換反應(yīng)(RCM)。這種方法包括合成肽前體并使其接觸RCM催化劑，從而產(chǎn)生限定構(gòu)象的肽的步驟。合適的肽前體可以包含兩個(gè)或更多個(gè)不飽和的C-C鍵。該方法可使用固相肽合成技術(shù)來進(jìn)行。在這個(gè)實(shí)施方案中，錨定至固相載體的前體與RCM催化劑相接觸，然后將產(chǎn)物從固相載體切下，從而產(chǎn)生限定構(gòu)象的肽。另一種方法，由D.H.Rich在ProteaseInhabitors,Barrett禾口Selvesoneds.,Elsevier(1986)中公開，已通過在酶抑制劑設(shè)計(jì)中應(yīng)用過渡態(tài)類似物概念設(shè)計(jì)肽模擬物。例如，已知辛伐他汀(staline)的仲醇模擬胃蛋白酶底物中易斷裂的酰胺鍵的四面體過渡態(tài)。然而，過渡態(tài)類似物概念與激素激動(dòng)劑/拮抗劑設(shè)計(jì)沒有明顯關(guān)聯(lián)。為避免懷疑，用標(biāo)準(zhǔn)肽鍵連接肽序列中的氨基酸殘基并不是必需的。例如，如上所述，可以用反向肽鍵連接氨基酸殘基，或者可以通過模擬標(biāo)準(zhǔn)肽鍵的鍵長和空間定向的其它鍵將它們連接在一起。在合成之后，可以使用本領(lǐng)域中已知的方法，如HPLC和色譜法純化本發(fā)明的活性劑(agent)的肽序列。本文所述的“分子”包括包含本發(fā)明的肽序列或由本發(fā)明的肽序列組成的分子的鹽(如有機(jī)或無機(jī)酸加成鹽)、酯和溶劑化物。應(yīng)理解，該術(shù)語還包括與相關(guān)分子具有相同生物功能和/或活性的衍生物。此外，為了本發(fā)明的目的，該術(shù)語還包括相關(guān)分子的前藥(例如，酯)。術(shù)語“前藥”包括任意物質(zhì)組分，其在口服或腸胃外給藥后并且在給藥后的預(yù)定時(shí)間內(nèi)，在體內(nèi)代謝形成相關(guān)活性劑，該活性劑的量是用實(shí)驗(yàn)方法可檢測的。本發(fā)明的分子還可以由能夠使本發(fā)明的分子靶向和/或定位至靶細(xì)胞(如癌細(xì)胞)和/或能夠增加本發(fā)明分子的半衰期(tl/2)的一個(gè)或更多部分組成，或者包含能夠使本發(fā)明的分子靶向和/或定位至靶細(xì)胞(如癌細(xì)胞)和/或能夠增加本發(fā)明分子的半衰期(tl/2)的一個(gè)或更多部分。因此，所述部分可以提高本發(fā)明分子的功效。優(yōu)選地，當(dāng)該分子包括包含D-氨基酸或由D-氨基酸組成的肽序列或者由包含D-氨基酸或由D-氨基酸組成的肽序列組成時(shí)，本發(fā)明的分子中可包含一個(gè)或更多所述部分，這是因?yàn)镈-氨基酸殘基尤其易于被修飾。本發(fā)明的分子還可以由能夠使本發(fā)明的分子靶向和/或定位至靶細(xì)胞(如癌細(xì)胞)和/或能夠增加本發(fā)明分子的半衰期(tl/2)的一個(gè)或更多部分組成，或者包括能夠使本發(fā)明的分子靶向和/或定位至靶細(xì)胞(如癌細(xì)胞)和/或能夠增加本發(fā)明分子的半衰期(tl/2)的一個(gè)或更多部分。因此，所述部分可以提高本發(fā)明的分子的功效。優(yōu)選地，當(dāng)該活性劑包括包含D-氨基酸的肽序列或由包含D-氨基酸的肽序列組成時(shí)，本發(fā)明的分子中可包含一個(gè)或更多所述部分，這是因?yàn)槟切〥-氨基酸殘基尤其易于被修飾。優(yōu)選地，所述一個(gè)或更多部分為類固醇激素分子(包括例如黃體酮、睪丸酮、雌二醇或皮質(zhì)醇)，并且與D-氨基酸的側(cè)鏈結(jié)合。類固醇激素分子能夠結(jié)合血漿蛋白，且已被證明能降低肽的代謝清除率(Ratcliffeetal.，2006，Endocrinology，147:571_9)。例如，在W02004/08725中描述了與類固醇激素結(jié)合的GnRH肽，該篇文獻(xiàn)引入本文作為參考。可選擇地，所述一個(gè)或更多部分為維生素，如維生素B12或維生素D，并且與親吻肽類似物的NH2端或者天然或D-氨基酸的合適側(cè)鏈結(jié)合。已證明維生素提高肽的口服生物利用度(Russell-Jonesetal.,1995,Bioconjug.Chem.,634~42；Russell-Jonesetal.,1995,Bioconjug·Chem.，6:459_465)。優(yōu)選地，本發(fā)明的分子作為親吻肽拮抗劑的能力不受所述一個(gè)或更多部分影響和/或顯著影響。優(yōu)選地，本發(fā)明提供用途，其中所述肽序列不為F-G-A-R-W；F-G-L-(D)R-W；F-G-(D)L-R-W；或(D)F-G-L-R-W。方便地，本發(fā)明提供用途，其中X1為(D)F。優(yōu)選地，X2為選自0))F、(D)L和(D)W的D-氨基酸殘基。更優(yōu)選地，所述肽序列選自(D)F-W-L-R-W；或F-G-(D)W-R-F。在一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用途，其中所述N-末端殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。通常，X1包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。所述基團(tuán)y可選自乙?；?在本申請(qǐng)全文中以“ac”表示)；三氟乙?；?；環(huán)化氨基酸；或N-末端不帶電荷的合成氨基酸(例如氨基通過加入其它化合物(如焦谷氨酸)或化學(xué)基團(tuán)例如烷基(例如甲?；⒁阴；?、丙基、丁基和更長的烷基)而被修飾的氨基酸)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供用途，其中X3包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)ζ。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用途，其中所述序列選自I)ac.F-G-(D)F-R-ff.ζ；11)ac.F-G-(D)L-R-ff.ζ；III)ac.F-G-L-(D)R-ff.ζ；IV)ac.F-G-A-R-ff.ζ；V)ac.A-G-L-R-ff.ζ；VI)ac.(D)F-ff-L-R-ff.ζ；或VII)ac.F_G_(D)ff-R-F.ζ。在一個(gè)實(shí)施方案中，用去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y替代以上⑴至(VI)的任意一種肽的N-末端殘基上的乙酰基(以上和本申請(qǐng)中全文以“ac”表示)，并且所述基團(tuán)y優(yōu)選選自乙酰基；三氟乙?；?；環(huán)化氨基酸；或N-末端不帶電荷的合成氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明第三方面的用途涉及在本發(fā)明第三方面的肽序列的N-和/或C-末端包含額外氨基酸殘基或肽的肽序列分子，從而將肽序列加入較大的多肽或蛋白質(zhì)分子中。因而，本發(fā)明第三方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含0至10個(gè)氨基酸；或10至20個(gè)氨基酸；或20至30個(gè)氨基酸；或30至40個(gè)氨基酸；或40至50個(gè)氨基酸；或50至60個(gè)氨基酸；或60至70個(gè)氨基酸；或70至80個(gè)氨基酸；或80至90個(gè)氨基酸；或90至100個(gè)氨基酸；或多于100個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明第三方面的用途涉及在肽序列N-末端包含額外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y的分子，或者由在肽序列N-末端的額外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y組成的分子。所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列為來自果蠅觸足肽(Antennapedia)的七肽序列，所述果蠅觸足肽促進(jìn)和/或提高細(xì)胞中肽序列的遞送，從而提高本發(fā)明的肽的治療用途。所述果蠅觸足Jft七Jft描述于Fisheretal.，2003，J.P印tidesRes.，55163-72；和Wangetal.,2006,BioorganicandMedicinalChemistryLetters,16:2628_2631。因此，本發(fā)明的肽可以包含以下序列或由以下序列組成R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)F-R-ff.ζ；R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)L-R-ff.ζ；R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-L-(D)R-ff.ζ；R-R-M-K-ff-K-K-Y-F-G-A-R-ff.ζ；R-R-M-K-ff-K-K-Y-A-G-L-R-ff.ζ；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)F-ff-L-R-ff.ζ；或R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)ff-R-F.ζ。任選地，如上所定義，所述N-末端殘基在N-末端可以包含基團(tuán)y，并且優(yōu)選為乙酰基(ac)ο優(yōu)選地，本發(fā)明第三方面的肽序列加入全長親吻肽的一部分或全部序列中。更優(yōu)選地，本發(fā)明第三方面的肽序列的N-末端可以延長至包含親吻肽1-54的肽序列(即親吻肽序列的1至54個(gè)氨基酸殘基)和/或親吻肽1-45的肽序列(即親吻肽序列的1至45個(gè)氨基酸殘基)的任意長度。例如，本發(fā)明第三方面的肽序列可以在其N-末端具有以下的序列GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSo可選擇地，本發(fā)明第三方面的肽序列可以加入蛋白質(zhì)例如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入這些分子中被認(rèn)為增加本發(fā)明肽分子在個(gè)體中的半衰期并降低代謝清除率。在第四方面，本發(fā)明提供肽分子或者其片段或變體在治療患者中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥，或者在制備用于治療患者中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥的藥物中的用途，所述肽分子包含以下序列或由以下序列組成Xa-Xb-Xc-N-Xd-Xe-G-Xf-R-F其中Xa為Y或任意的D-氨基酸殘基；Xb為N或任意的D-氨基酸殘基；Xg為W或任意的D-氨基酸殘基；Xd為G或S或任意的D-氨基酸殘基；F或(D)W或(D)L；Xf為W或L或任意的D-氨基酸殘基；且其中所述肽分子的C-末端氨基酸殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)ζ；并且所述肽序列不為Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F；(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F；(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F；(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F；或(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F。優(yōu)選地，Xa為選自以下的D-氨基酸殘基(D)F和(D)Y和(D)A。通常，Xb為選自以下的D-氨基酸殘基(D)A和(D)N。在一方面，當(dāng)Xa或Xb中的一個(gè)為(D)Y時(shí)，另一個(gè)不為(D)N。在另一方面，Xa和Xb不都為D-氨基酸殘基。優(yōu)選地，當(dāng)Xf為(D)W時(shí)，Xa為(D)F0優(yōu)選地，本發(fā)明提供用途，其中Xe為選自以下的D-氨基酸殘基(D)A和(D)W。在一個(gè)實(shí)施方案中，Xd為選自以下的D-氨基酸殘基(D)A和(D)W。優(yōu)選地，當(dāng)Xd為S時(shí)，Xf為(D)W和/或Xa不為(D)Y，更優(yōu)選地，當(dāng)Xd為S時(shí)，Xf為(D)W和/或Xa為(D)A0優(yōu)選地，Xf為選自以下的D-氨基酸殘基(D)L和(D)W.在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)Xe和Xf都為_時(shí)，Xa不為(D)Y0優(yōu)選地，當(dāng)Xe和Xf都為(D)W時(shí)，(D)A0典型地，本發(fā)明提供用途，其中所述N-末端殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)1。優(yōu)選地，X1包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。所述基團(tuán)y選自乙?；?；三氟乙酰基；環(huán)化氨基酸；或N-末端不帶電荷的合成氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用途，其中所述肽分子的C-末端F殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)ζ。在一個(gè)實(shí)施方案，所述肽序列選自a)Y-N-ff-N-G-F-G-L-R-F.ζ；b)Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.ζ；c)Y-N-W-N-G-F-G-(D)ff-R-F.ζ；d)Y-N-W-N-G-(D)ff-G-L-R-F.ζ；e)ac.Y-N-W-N-G-F-G-(D)ff-R-F.ζ；f)ac.Y-N-ff-N-(D)ff-F-G-(D)ff-R-F.Z；g)ac.(D)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.Z；h)ac.Y-N-(D)ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.Z；i)ac.Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.Z；j)ac.Y-N-ff-N-(D)A-F-G-(D)ff-R-F.Z；k)ac.(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.Z；1)ac.Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)ff-R-F.Z；m)ac.Y-(D)A-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.Z；n)ac.(D)ff-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.Z；o)ac.(D)F-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.Z；p)ac.(D)Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；q)ac.(D)A-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；r)ac.(D)A-N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F.Z；s)ac.(D)-A-N-ff-N-G-F-G-ff-R-F.zt)ac.(D)A-N-ff-N-(D)S-F-G-(D)ff-R-F.z；或u)ac.(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.Zo在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明第四方面的用途涉及在本發(fā)明第四方面的肽序列的N-禾口/或c-末端包含額外氨基酸殘基或肽的肽序列分子，從而將肽序列加入較大的多肽或蛋白質(zhì)分子中。因而，本發(fā)明第四方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含0至10個(gè)氨基酸；或10至20個(gè)氨基酸；或20至30個(gè)氨基酸；或30至40個(gè)氨基酸；或40至50個(gè)氨基酸；或50至60個(gè)氨基酸；或60至70個(gè)氨基酸；或70至80個(gè)氨基酸；或80至90個(gè)氨基酸；或90至100個(gè)氨基酸；或多于100個(gè)氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明第四方面的用途涉及在肽序列的N-末端包含額外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y的分子，或者由在肽序列的N-末端的額外月太序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y組成的分子。如前所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列為來自果蠅觸足肽的七肽序列。因此，本發(fā)明第四方面的肽可以包含以下序列或由以下序列組成R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-F-G-L-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-L-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-(D)ff-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--(D)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-(D)ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-(D)A-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR-R-M-K-ff-K-K-Y-Y-(D)A-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)ff-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)F-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)ff-R-F.z；或R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。任選地，如上所定義，所述N-末端殘基在N-末端可以包含基團(tuán)y，并且優(yōu)選為乙?；?ac)0在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明第四方面的肽序列選自R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z。如以下實(shí)施例中所顯示的，本發(fā)明的肽包含保持親吻肽拮抗劑功能的N-末端果蠅觸足肽七肽。優(yōu)選地，本發(fā)明第四方面的肽序列加入全長親吻肽的一部分或全部序列中。更優(yōu)選地，本發(fā)明第四方面的肽序列的N-末端可以延長至包含親吻肽1-54的肽序列(即親吻肽序列的1至54個(gè)氨基酸殘基)和/或親吻肽1-45的肽序列(即親吻肽序列的1至45個(gè)氨基酸殘基)的任意長度。例如，本發(fā)明第四方面的肽序列可在其N-末端具有以下的序列GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLP?？蛇x擇地，本發(fā)明第四方面的肽序列可以加入蛋白質(zhì)如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入這些分子中被認(rèn)為增加本發(fā)明肽分子在個(gè)體中的半衰期和降低代謝清除率。本文所述“個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥”包括個(gè)體中的此病癥的癥狀和/或進(jìn)展和/或結(jié)局是由親吻肽活性引起、誘導(dǎo)、提高、增強(qiáng)和/或使加重的病癥。優(yōu)選地，個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥選自增殖性疾?。蛔訉m內(nèi)膜異位癥；子宮肌瘤；性早熟；先兆子癇；胎兒宮內(nèi)生長遲緩(IUGR)；異位妊娠；月經(jīng)過多；高血壓；冠心病；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、胰腺和/或免疫系統(tǒng)疾?。蛔枰只蛞种婆怕?；生育病；化療引起和/或放療引起的生殖組織損傷；阻抑和/或抑制創(chuàng)傷愈合；阻抑和/或抑制生長激素生成。例如，在由促性腺激素和性類固醇激素刺激的生殖組織中，親吻肽拮抗劑將抑制GnRH分泌，從而抑制對(duì)生殖組織和生殖系統(tǒng)癌癥的刺激。因此，親吻肽拮抗劑可用于抑制內(nèi)源性促性腺激素，使得外源性促性腺激素可以以受控的方式給藥，以治療患有阻抑或抑制排卵的個(gè)體，從而誘導(dǎo)或提高個(gè)體的排卵。因此，親吻肽拮抗劑還可被用于降低或抑制生育力，從而獲得男性和女性都適用的避孕方式。此外，親吻肽拮抗劑對(duì)刺激生殖組織的抑制將允許它們應(yīng)用于防止化療引起或放療引起的生殖組織損傷，從而保護(hù)接受化療和/或放療的癌癥個(gè)體的生殖組織。如以下實(shí)施例中所顯示的，本發(fā)明的拮抗劑能夠抑制和/或減小親吻肽對(duì)細(xì)胞遷19移的抑制作用。由于在創(chuàng)傷愈合中需要出現(xiàn)細(xì)胞遷移，因此，親吻肽在抑制創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮作用。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗劑可用于有此需要的個(gè)體以誘導(dǎo)和/或促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。如以下實(shí)施例中所顯示的，令人驚奇地，本發(fā)明的拮抗劑提高測試個(gè)體中的生長激素水平。因此，本發(fā)明的拮抗劑可用于有此需要的個(gè)體以促進(jìn)和/或誘導(dǎo)生長激素生成。例如，本發(fā)明的拮抗劑可以與使用生長激素的現(xiàn)有療法一起使用，例如用于腎衰竭的治療。親吻肽獨(dú)立地抑制滋養(yǎng)層侵入子宮壁(即植入)，如在先兆子癇或IUGR中所發(fā)生的。對(duì)于先兆子癇，已證明KiSS-1mRNA增加，抑制母體血液供應(yīng)的正確的滋養(yǎng)層侵入[54]。因而，親吻肽拮抗劑可被用于減輕所述抑制，并且例如，允許在病態(tài)妊娠，如先兆子癇期間發(fā)生滋養(yǎng)層侵入。已知親吻肽獨(dú)立地誘導(dǎo)血管收縮，并且因此親吻肽拮抗劑可以被用于治療高血壓，例如在外周組織中作為高血壓藥物以降低血管的血管收縮。GPR54表達(dá)于CNS中，并且親吻肽拮抗劑可用于調(diào)節(jié)CNS功能(如在海馬齒狀回顆粒細(xì)胞中)。在一個(gè)實(shí)施方案中，由去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y替代以上(e)至(s)的任意一種肽的N-末端殘基上的乙酰基，并且所述基團(tuán)y優(yōu)選選自乙酰基；三氟乙?；?；環(huán)化氨基酸；或N-末端不帶電荷的合成氨基酸。已知親吻肽以高水平在胎盤中表達(dá)，并且參與植入。植入不良可能導(dǎo)致先兆子癇和胎兒宮內(nèi)生長遲緩，對(duì)于這些疾病至今(在本發(fā)明以前)未有有效的治療。親吻肽及其受體(GPR54)還表達(dá)于滋養(yǎng)層和子宮細(xì)胞中(Hidenetal.,2007,Rev.Endocr.Metab.Disord.，8:31_39)，如以下實(shí)施例所顯示的，本發(fā)明的發(fā)明人證明親吻肽導(dǎo)致胎兒生長遲緩。因此，親吻肽輸入的調(diào)節(jié)將可應(yīng)用于先兆子癇、胎兒宮內(nèi)生長遲緩(IUGR)和異位妊娠。此外，親吻肽和GPR54誘導(dǎo)血管收縮增強(qiáng)(Meadetal.,2007,Endocrinology,148:140-147)，并且存在于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，因此親吻肽拮抗劑可以用于治療高血壓和冠心病。親吻肽和它的受體(GPR54)還廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺和免疫系統(tǒng)中(Muiretal.,2001,J.Biol.Chem.,27628969-28975；Kotanietal.,2001,J.Biol.Chem.，276:34631_34636)，因此拮抗劑可以應(yīng)用于這些組織的疾病。優(yōu)選地，由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥為動(dòng)物的病癥。所述動(dòng)物可以是人，或可以是任何哺乳動(dòng)物，如馴養(yǎng)哺乳動(dòng)物(優(yōu)選有農(nóng)業(yè)或商業(yè)重要性的動(dòng)物，包括雞；貓；狗；豬；羊；牛；馬)。更優(yōu)選地，所述增殖性疾病選自或包括良性前列腺增生癥；癌癥；生殖組織的癌癥；婦科癌癥；前列腺癌；乳癌；卵巢癌；子宮癌；宮頸癌；子宮內(nèi)膜癌；黑色素瘤；胰腺癌；胃癌。使用本發(fā)明的分子可能治療所有表達(dá)親吻肽受體的癌癥。優(yōu)選地，所述癌癥為生殖系統(tǒng)癌癥(包括前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、卵巢癌和乳癌)，這些病癥全都表達(dá)親吻肽受體。用于檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法是本領(lǐng)域中所熟知的。合適用于檢測親吻肽受體的方法包括用于檢測編碼親吻肽受體的mRNA存在的原位雜交和/或PCR；用于檢測親吻肽受體蛋白存在的放射性配體結(jié)合法；以及使用能夠特異性結(jié)合親吻肽受體的抗體的方法(例如免疫印跡法、免疫組織化學(xué)法、免疫熒光法和ELISA)。優(yōu)選在本發(fā)明的第三和/或第四方面定義的肽分子為親吻肽拮抗劑，或者其片段或變體為親吻肽拮抗劑。優(yōu)選地，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第一和/或第二方面的拮抗劑，或者本發(fā)明第三或第四方面定義的肽分子，其用于藥物。更優(yōu)選地，所述肽分子為親吻肽拮抗劑。在第五個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含以下序列或由以下序列組成的的肽分子，或者其片段或變體X-G/ff-X'-R/(D)R-X3其中X1為F或A或任意的D-氨基酸殘基；X2為L或A或任意的D-氨基酸殘基；X3為F或W;且其中所述肽分子的C-末端氨基酸殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)z；并且所述肽序列不為F-G-L-R-F；F-G-L-R-W；F-G-(D)F-R-F；F-G-A-R-W；F-G-L-(D)R-W；F-G-(D)L-R-W；A-G-L-R-W；或(D)F-G-L-R-W。優(yōu)選地，本發(fā)明提供肽分子，其中X1為(D)F。通常，X2為選自以下的D-氨基酸殘基⑶F、(D)L和_。方便地，根據(jù)本發(fā)明的第五方面的肽分子選自(D)F-W-L-R-W；或F-G-(D)W-R_F。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述N-末端殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。優(yōu)選地，X1包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。尤其優(yōu)選基團(tuán)y選自乙?；蝗阴；画h(huán)化氨基酸；或N-末端不帶電荷的合成氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，X3包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)z。優(yōu)選地，所述肽序列選自I)ac.F-G-(D)F-R-ff.z；II)ac.F-G-(D)L-R-ff.z；III)ac.F-G-L-(D)R-ff.z；IV)ac.F-G-A-R-W.z;V)ac.A-G-L-R-W.zVI)ac.(D)F-W-L-R-W.z；或VII)ac.F-G-(D)ff-R-F.z。在一個(gè)實(shí)施方案中，以上(I)至(VI)的任意一種肽的N-末端殘基的乙酰基被去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y替代，并且優(yōu)選y基團(tuán)選自乙?；蝗阴；画h(huán)化氨基酸；或N-末端不帶電荷的合成氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明第五方面的肽分子涉及在本發(fā)明第五方面的肽序列N-和/或C-末端包含額外氨基酸殘基或肽的分子，或者由在本發(fā)明第五方面的肽序列N-和/或C-末端的額外氨基酸殘基或肽組成的分子，從而將所述肽序列加入較大的多肽或蛋白質(zhì)分子中。因而，本發(fā)明第五方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含0至10個(gè)氨基酸；或10至20個(gè)氨基酸；或20至30個(gè)氨基酸；或30至40個(gè)氨基酸；或40至50個(gè)氨基酸；或50至60個(gè)氨基酸；或60至70個(gè)氨基酸；或70至80個(gè)氨基酸；或80至90個(gè)氨基酸；或90至100個(gè)氨基酸；或多于100個(gè)氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明第五方面的肽分子包含在N-末端的額外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y,或者由在N-末端的額外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y組成。如上所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列為來自果蠅觸足肽的七肽序列。因此，本發(fā)明第五方面的肽分子可以包含以下序列或由以下序列組成R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)F-ff-L-R-ff；R-R-M-K-ff-K-K-Y-F-G-(D)ff-R-F；R-R-M-K-ff-K-K-Y-F-G-(D)F-R-ff.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-F-G-(D)L-R-ff.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-F-G-L-(D)R-ff.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-F-G-A-R-ff.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-A-G-L-R-ff.zR-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)F-ff-L-R-ff.z；或R-R-M-K-ff-K-K-Y-F-G-(D)ff-R-F.z。任選地，如上所定義，所述N-末端殘基可以在N-末端包含基團(tuán)y，并且優(yōu)選為乙?；?ac)0優(yōu)選地，本發(fā)明第五方面的肽序列加入全長親吻肽的一部分或全部序列中。更優(yōu)選地，本發(fā)明第五方面的肽序列的N-末端可以延長至包含親吻肽1-54的肽序列(即親吻肽序列的1至54個(gè)氨基酸殘基)和/或親吻肽1-45的肽序列(即親吻肽序列的1至45個(gè)氨基酸殘基)的任意長度。例如，本發(fā)明第五方面的肽序列可在其N-末端具有以下的序列GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNS。可選擇地，本發(fā)明第五方面的肽序列可以加入蛋白質(zhì)例如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入這些分子中被認(rèn)為增加本發(fā)明肽分子在個(gè)體中的半衰期并降低代謝清除率。在第六方面，本發(fā)明提供了包含以下序列或由以下序列組成的肽分子，或者其片段或變體Xa-Xb-Xc-N-Xd-Xe-G-Xf-R-F其中XA為Y或任意D-氨基酸殘基；XB為N或任意D-氨基酸殘基；XG為W或任意D-氨基酸殘基；XD為G或S或任意D-氨基酸殘基；或(D)W或(D)L；XF為W或L或任意D-氨基酸殘基；且其中所述肽分子的C-末端氨基酸殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)z；并且所述肽序列不為Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F；(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F；(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F；(D)Y-(D)N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F；或(D)Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F。優(yōu)選地，在本發(fā)明第六方面肽分子提供XA為選自以下的D-氨基酸殘基(D)F和(D)Y和(D)A。優(yōu)選XB為選自以下的D-氨基酸殘基(D)A和(D)N。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供肽分子，其中當(dāng)乂4或#中的一個(gè)為(D)Y時(shí)，另一個(gè)不為(D)N。一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案是其中不都為D-氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)V為(D)W時(shí)，(D)F。優(yōu)選地，Xe為選自以下的D-氨基酸殘基(D)A和(D)W。方便地，XD為選自以下的D-氨基酸殘基(D)A和(D)W。通常，XF為選自以下的D-氨基酸殘基(D)L和(D)W。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)XD為S時(shí)，(D)W和/或XA不為(D)Y。優(yōu)選地，當(dāng)XD為S時(shí)，(D)W和/或(D)A。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)XE和XF都為(D)ff時(shí)，XA不為(D)Y。優(yōu)選地，當(dāng)XE和XF都為(D)W時(shí)，(D)A。方便地，本發(fā)明提供了肽分子，其中所述N_末端殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。在一個(gè)實(shí)施方案中，X1包含去除此該殘基上的電荷的基團(tuán)y。通常，基團(tuán)y選自乙酰基；三氟乙?；画h(huán)化氨基酸；或N-末端不帶電荷的合成氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，肽分子的C-末端F殘基包含去除此該殘基上的電荷的基團(tuán)z。本發(fā)明第六方面的肽分子最優(yōu)選包含選自以下的肽序列或由選自以下的肽序列組成a)Y-N-ff-N-G-F-G-L-R-F.z；b)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；c)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；d)Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-L-R-F.z；e)ac.Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；f)ac.Y-N-ff-N-(D)W-F-G-(D)ff-R-F.z；g)ac.(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R_F.z；h)ac.Y-N-(D)W-N-G—F—G-(D)ff-R-F.z；i)ac.Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；23j)ack)ac1)acm)acn)aco)acp)acq)acr)acs)act)acu)ac在一Y-N-ff-N-(D)A-F-G-(D)ff-R-F.z(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zY-N-(D)A-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zY-(D)A-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z(D)ff-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z(D)F-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z(D)Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；(D)A-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；(D)A-N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F.z；或(D)-A-N-ff-N-G-F-G-ff-R-F.z；(D)A-N-ff-N-(D)S-F-G-(D)ff-R-F.z；或u)ac.(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。在一個(gè)實(shí)施方案中，由去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y替代以上(e)至(s)的任意一種肽N-末端殘基的乙?；?，并且基團(tuán)y優(yōu)選選自乙?；蝗阴；画h(huán)化氨基酸；或N-末端不帶電荷的合成氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明第六方面的肽分子涉及在本發(fā)明第六方面的肽序列N-和/或C-末端包含額外氨基酸殘基或肽的分子，或者由在本發(fā)明第六方面的肽序列N-和/或C-末端的額外氨基酸殘基或肽組成的分子，從而將肽序列加入較大的多肽或蛋白質(zhì)分子中。因而，本發(fā)明第六方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含0至10個(gè)氨基酸；或10至20個(gè)氨基酸；或20至30個(gè)氨基酸；或30至40個(gè)氨基酸；或40至50個(gè)氨基酸；或50至60個(gè)氨基酸；或60至70個(gè)氨基酸；或70至80個(gè)氨基酸；或80至90個(gè)氨基酸；或90至100個(gè)氨基酸；或多于100個(gè)氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明第六方面的肽分子涉及在肽序列N-末端包含額外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y的分子，或者由在肽序列N-末端的額外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y組成的分子。如前所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列為來自果蠅觸足肽的七肽序列。因此，本發(fā)明的肽可以包含以下序列或由以下序列組成R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-F-G-L-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-L-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-(D)ff-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--(D)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-(D)ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-ff-N-(D)A-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR--R--M--K--ff--K--K--Y--Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)ff-R-F.zR-R-M-K-ff-K-K-Y-Y-(D)A-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)ff-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)F-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F.z；R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-W-R_F.z；R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A—N—W—N-(D)S—F—G—(D)ff-R-F.z；或R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。任選地，如上文所定義，所述N-末端殘基在N-末端可以包含基團(tuán)y，并且優(yōu)選為乙?；?ac)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽序列選自R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z。如以下實(shí)施例所顯示的，本發(fā)明的肽包含保持親吻肽拮抗劑功能的N-末端果蠅觸足肽七肽。優(yōu)選地，本發(fā)明第六方面的肽序列加入全長親吻肽的一部分或全部序列中。更優(yōu)選地，本發(fā)明第六方面的肽序列的N-末端可以延長至包含親吻肽1-54的肽序列(即親吻肽序列的1至54個(gè)氨基酸殘基)和/或親吻肽1-45的肽序列(即親吻肽序列的1至45個(gè)氨基酸殘基)的任意長度。例如，本發(fā)明第六方面的肽序列在其N-末端可具有以下的序列GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLP?？蛇x擇地，本發(fā)明第六方面的肽序列可以加入蛋白質(zhì)例如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入這些分子中被認(rèn)為增加本發(fā)明肽分子在個(gè)體中的半衰期和降低代謝清除率。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了肽分子，其中所述z為NH2或N-丙基酰胺或N-乙基酰胺(NHEt)或N-甲基酰胺或N-丁基酰胺。優(yōu)選地，z具有的分子量小于200，優(yōu)選小于150，優(yōu)選小于100。優(yōu)選地，z為NHR，，其中R’為H或Q至C4烷基或z為0R”，其中R”為Q至C4烷基。優(yōu)選地，z為酰胺。優(yōu)選地，z為NH2或N-丙基酰胺或N-乙基酰胺(NHEt)或N-甲基酰胺或N-丁基酰胺。在第七實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的拮抗劑或本發(fā)明的肽分子和藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑，或者由有效量的本發(fā)明的拮抗劑或本發(fā)明的肽分子和藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑組成。本文所述“有效量”是指本發(fā)明分子的量足夠減輕和/或緩解和/或防止個(gè)體中與由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥相關(guān)的癥狀。例如，“有效量”可以通過在動(dòng)物(并且，如果可能，人)中進(jìn)行用于抑制促性腺激素和/或類固醇激素的劑量研究而確定；劑量范圍可以是通過皮下或腹膜內(nèi)或口服遞送每日l-100mg。還可以通過使用實(shí)施例中所描述的方法在體外確定有效量(例如，用于監(jiān)測細(xì)胞中對(duì)親吻肽與親吻肽受體結(jié)合的拮抗作用和/或?qū)τH吻肽介導(dǎo)的刺激肌醇磷酸生成的拮抗作用的方法)或通過監(jiān)測個(gè)體中(如動(dòng)物)與由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥相25關(guān)的癥狀的減輕和/或緩解和/或防止而在體內(nèi)確定所述有效量，其中所述癥狀是相關(guān)醫(yī)藥領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。關(guān)于在體外監(jiān)測親吻肽拮抗作用的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以監(jiān)測其它或另外的細(xì)胞和酶活性來測量親吻肽介導(dǎo)的刺激。例如，已知GqG蛋白激活磷脂酶(其生成IP和二?；视停M(jìn)而分別動(dòng)員Ca2+和激活蛋白激酶C)和蛋白激酶C磷酸化并激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)和/或絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)及其成員；因此，技術(shù)人員可監(jiān)測那些細(xì)胞成分中任意一種或全部成分的活性和/或存在來確定親吻肽介導(dǎo)的刺激。在第八個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥的方法，所述方法包括以下步驟或由以下步驟組成向所述個(gè)體施用本發(fā)明第七方面的藥物組合物，或有效量的本發(fā)明第一或第二方面的親吻肽拮抗劑，或有效量的本發(fā)明第二、第三、第四和/或第五方面的肽分子?？梢允褂米⑸湫途忈屗幬镞f送系統(tǒng)遞送本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物。這些特別設(shè)計(jì)用于減少注射頻率。所述系統(tǒng)的實(shí)例為NutropinD印ot，其將重組人生長激素(rhGH)封裝在生物可降解的微粒中，一旦注射，在持續(xù)時(shí)間內(nèi)緩慢釋放rhGH。優(yōu)選地，進(jìn)行肌內(nèi)(i.m.)和/或皮下(s.c.)和/或靜脈內(nèi)(i.v.)遞送?？梢酝ㄟ^將藥物直接釋放至所需位置的手術(shù)植入器械施用本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物。例如，Vitrasert直接釋放更昔洛韋(ganciclovir)至眼睛，以治療CMV視網(wǎng)膜炎。將該有毒活性劑直接施用至患病部位，來實(shí)現(xiàn)有效治療而沒有藥物的明顯全身副作用。還可以利用電穿孔治療(EPT)系統(tǒng)來施用本發(fā)明的活性劑、藥物和藥物組合物。向細(xì)胞遞送脈沖電場的設(shè)備提高了細(xì)胞膜對(duì)藥物的滲透性，導(dǎo)致細(xì)胞中的藥物遞送顯著增強(qiáng)。本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物還可以通過電導(dǎo)入(electroincorporation，EI)遞送。當(dāng)皮膚表面上直徑至多30微米的小微粒經(jīng)歷與電穿孔中所使用的電脈沖相同或類似的電脈沖時(shí)，出現(xiàn)EI。在EI中，這些微粒被驅(qū)動(dòng)通過角質(zhì)層并進(jìn)入更深層的皮膚。所述微?？梢载?fù)載或包被藥物或基因，或者可以簡單地作為“子彈”而在皮膚上產(chǎn)生藥物可以進(jìn)入的孔。本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物的另外的遞送方法是熱敏的ReGel可注射系統(tǒng)。低于體溫時(shí)，ReGel是可注射液體，而在體溫下，其立即形成緩慢消蝕并溶解成已知安全的生物可降解聚合物的凝膠儲(chǔ)庫。活性物質(zhì)隨著生物聚合物溶解而被遞送。本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物還可以口服遞送。所述過程利用體內(nèi)口服攝入維生素B12和/或維生素D的自然過程來共遞送蛋白質(zhì)和肽。借助于維生素B12和/或維生素D的攝入系統(tǒng)，本發(fā)明的核酸、分子和藥物制劑可以通過腸壁。在維生素B12類似物和/或維生素D類似物與藥物之間形成復(fù)合物，其既保持復(fù)合物中維生素B12部分/維生素D部分對(duì)內(nèi)因子(IF)的有效親合力，又保持了復(fù)合物中活性物質(zhì)的有效生物活性。本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物可以通過“木馬肽(Trojanp印tide)”引入細(xì)胞。這些是一類稱為穿透肽(penetratin)的多肽，其具有轉(zhuǎn)位性質(zhì)，并且能夠攜帶親水化合物穿過質(zhì)膜。該系統(tǒng)允許將寡肽直接靶向細(xì)胞質(zhì)和核，并且可以是非細(xì)胞類型特異性的和高度有效的。參見Derossietal.(1998),TrendsCellBiol8,84-87優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物和/或藥物組合物為單位劑型，該單位劑型包含日劑量或單位、日亞劑量或其適當(dāng)部分的活性成分。本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物通常以包含活性成分的藥物組合物的形式，以藥學(xué)上可接受的劑型，通過口服或通過任何腸胃外途徑施用，所述活性成分任選為無毒的有機(jī)或無機(jī)酸或堿、加成鹽的形式。所述組合物可以以不同劑量施用，這取決于待治療的疾病和患者以及給藥途徑。在人治療中，本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物可以單獨(dú)給藥，但是通常與根據(jù)要給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐而選擇的合適的賦形劑、稀釋劑或載體混合給藥。例如，本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物可以以可包含調(diào)味劑或著色劑的片劑、膠囊、卵形栓劑(ovule)、酏劑、溶液或混懸劑的形式口服、口含或舌下給藥，用于速釋、延時(shí)釋放或控釋。本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物還可以通過海綿體中注射給藥。所述片劑可以包含賦形劑，如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸；崩解劑如淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復(fù)合硅酸鹽，以及顆粒粘合劑如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此外，可以包含潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石。相似類型的固體成分還可以用作明膠膠囊的填料。在這方面優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、乳糖或高分子量聚乙二醇。對(duì)于含水混懸劑和/或酏劑，本發(fā)明的活性劑可以與各種甜味劑或調(diào)味劑、著色劑或染料組合，與乳化劑和/或助懸劑組合，以及與稀釋劑如水、乙醇、丙二醇和甘油組合，及其組合物組合。本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物還可以腸胃外給藥，例如，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)或皮下，或它們可以通過輸注技術(shù)給藥。它們最好以無菌水溶液的形式使用，所述無菌水溶液可包含其他物質(zhì)，例如，足夠的鹽或葡萄糖以使溶液與血液等滲。若有必要，水溶液應(yīng)當(dāng)適當(dāng)緩沖(優(yōu)選PH3至9)。在無菌條件下制備合適的腸胃外制劑易于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)完成。適合用于腸胃外給藥的藥物和藥物組合物包括水和非水無菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與預(yù)定接受者的血液等滲的溶質(zhì)；并且含水和非水無菌混懸劑可以包含助懸劑和增稠劑。所述藥物和組合物可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在凍干條件下保存，在使用前僅需直接加入無菌液體載體例如用于注射的水?？梢杂芍懊枋龅母鞣N無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備即用型注射溶液和混懸劑。對(duì)于向人患者的口服和腸胃外給藥，本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物的日劑量水平通常為每成人每日單次或分次劑量給藥0.1至lOOmg。因而，本發(fā)明分子的片劑或膠囊例如可以包含0.lmg至lOOmg的活性劑，根據(jù)需要用于一次單片(粒)或兩片(粒)或更多給藥。無論如何，醫(yī)生可確定最合適任何個(gè)體患者的實(shí)際劑量，并且隨著具體患者的年齡、體重和反應(yīng)而變化。以上劑量是示例性的平均情況。當(dāng)然也可以有更高或更低劑量范圍的個(gè)體實(shí)例，并且這些都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物還可以鼻內(nèi)或通過吸入給藥，并且以干粉末吸入器的形式或以從具有使用合適拋射劑的壓力容器、泵、噴霧或霧化器提供的氣霧劑噴霧的形式方便地被遞送，所述拋射劑如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氫氟烷烴如1，1，1，2_四氟乙烷(HFA134A)或1，1，1，2，3，3，3_七氟丙烷(HFA227EA)、二氧化碳或其它合適的氣體。對(duì)于壓力氣霧劑來說，可以通過提供遞送計(jì)量的量的閥來確定劑量單位。所述壓力容器、泵、噴霧或霧化器可以包含活性劑的溶液或混懸劑，例如使用乙醇和拋射劑的混合物作為溶劑，其可以另外包含潤滑劑，如失水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒(例如由明膠制成)可以配制成包含本發(fā)明的活性劑和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。優(yōu)選配制氣霧劑或干粉制劑，使得每個(gè)計(jì)量的劑量或“吸(puff)”包含至少0.lmg本發(fā)明的分子，用于遞送至患者。應(yīng)理解氣霧劑的每日總劑量將因患者不同而改變，并且可以以單次劑量給藥，或更常見是全天分次劑量給藥?？蛇x擇地，本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物可以以栓劑或陰道栓的形式給藥，或它們可以以洗劑、溶液、乳膏、凝膠、軟膏或撲粉(dustingpowder)的形式局部應(yīng)用。本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物還可以以透皮給藥，例如，通過利用皮膚貼膏給藥。它們還可以通過眼部途徑給藥，尤其是用于治療眼部疾病的情況下。對(duì)于眼科使用，本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物可以配制成在等滲的、pH經(jīng)調(diào)節(jié)的無菌生理鹽水中的微粒化混懸劑，或優(yōu)選地，配制成在等滲的、PH經(jīng)調(diào)節(jié)的無菌生理鹽水中的溶液，任選地，與諸如苯扎氯銨的防腐劑組合?？蛇x擇地，它們可以配制于軟膏，如礦脂中。對(duì)于向皮膚的局部應(yīng)用，本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物可以配制成合適的包含所述活性劑的軟膏，所述活性劑懸浮或溶解于例如一種或多種以下的混合物中礦物油、液體礦脂、白礦脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯劑、乳化蠟和水?？蛇x擇地，它們可以配制成合適的洗劑或乳膏，懸浮或溶解于例如一種或多種以下的混合物中礦物油、山梨糖醇酐單硬脂酸酯、聚乙二醇、液體石蠟、聚山梨糖醇酯60、十六烷基酯蠟、十六醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。適合用于口腔局部給藥的制劑包括糖錠，其包含在調(diào)味基質(zhì)中的活性成分，所述調(diào)味基質(zhì)通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠；錠劑，其包含在惰性基質(zhì)中的活性成分，所述惰性基質(zhì)如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠；以及漱口水，其包含在合適的液體載體中的活性成分。通常，對(duì)于人，優(yōu)選的途徑是口服或腸胃外給藥本發(fā)明的活性劑的分子、藥物和藥物組合物，這樣最為方便。對(duì)于獸醫(yī)使用，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)獸醫(yī)實(shí)踐將本發(fā)明的分子、藥物和藥物組合物作為合適的可接受的制劑施用，并且獸醫(yī)將確定最適合具體動(dòng)物的給藥方案和給藥途徑。方便地，所述制劑為藥物制劑。有利地，所述制劑為獸醫(yī)用制劑。尤其優(yōu)選的是，使用醫(yī)學(xué)和制藥領(lǐng)域已知的肽制劑配制本發(fā)明的分子，如在GnRH肽激動(dòng)劑制劑中使用的那些(例如，包括聚甘氨酰丙交酯共聚物和/或聚乙二醇和/或油和/或微晶懸浮液或由聚甘氨酰丙交酯共聚物和/或聚乙二醇和/或油和/或微晶懸浮液或由其組成的制劑，可以用于注射本發(fā)明的分子)。在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提供用于鑒定親吻肽拮抗劑的方法，所述方法包括28以下步驟或由以下步驟組成i)提供待測試的化合物；ii)確定(i)中的化合物結(jié)合親吻肽受體的能力；iii)確定⑴中的化合物拮抗細(xì)胞中親吻肽介導(dǎo)的刺激肌醇磷酸生成的能力；和iv)在所述化合物能夠結(jié)合親吻肽受體并能夠拮抗細(xì)胞中親吻肽介導(dǎo)的刺激肌醇磷酸生成的情況下鑒定該化合物作為親吻肽拮抗劑。因而，本發(fā)明第九方面的方法可以用于確定具體測試化合物或測試分子(例如，包含以下肽序列或由以下肽序列組成的測試化合物或測試分子親吻肽的部分或全部肽序列的類似物)是否具有結(jié)合親吻肽受體和功能性拮抗細(xì)胞內(nèi)(例如用人親吻肽受體GPR54瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，如CHO、HEK或COS細(xì)胞系)親吻肽介導(dǎo)的刺激肌醇磷酸生成的能力。以下實(shí)施例描述適合用于確定化合物結(jié)合親吻肽受體的能力和用于測量細(xì)胞中親吻肽介導(dǎo)的刺激肌醇磷酸生成的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它適當(dāng)?shù)姆椒ā＠?，如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以監(jiān)測其它或另外的細(xì)胞和酶活性來測量親吻肽介導(dǎo)的刺激。例如，已知GqG蛋白激活磷脂酶(其生成IP和二?；视?，進(jìn)而分別動(dòng)員Ca2+和激活蛋白激酶C)和蛋白激酶C磷酸化并激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)和/或絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)及其成員；因此，技術(shù)人員可監(jiān)測那些細(xì)胞成分的任意或全部成分的活性和/或存在來確定親吻肽介導(dǎo)的刺激。優(yōu)選地，若是其具有<lOOnM的結(jié)合親合力(即Kd)，則確認(rèn)所述測試化合物或分子能夠結(jié)合親吻肽受體。優(yōu)選地，如以下實(shí)施例所描述，可根據(jù)能夠拮抗lOnM親吻肽刺激細(xì)胞內(nèi)肌醇磷酸生成的能力而鑒定所述測試化合物或分子。優(yōu)選地，根據(jù)能夠達(dá)到至少40%抑制lOnM親吻肽刺激而鑒定所述測試化合物或分子；更優(yōu)選地，可達(dá)到至少50%或60%或70%或80%或90%或100%抑制。例如，能夠達(dá)到40%或以下地抑制lOnM親吻肽刺激的化合物不被認(rèn)為是拮抗劑。能夠達(dá)到40%至80%地抑制lOnM親吻肽刺激的化合物可以被認(rèn)為是“弱”拮抗劑。能夠達(dá)到80%或以上地抑制lOnM親吻肽刺激的化合物可以被認(rèn)為是“強(qiáng)”拮抗劑。優(yōu)選地，本發(fā)明第九方面的方法還包括以下步驟或由以下步驟組成根據(jù)本文描述的方法或本領(lǐng)域中已知的方法，制備或合成在步驟(iv)中鑒定為親吻肽拮抗劑的化合物或分子。更優(yōu)選地，所述方法還包括以下步驟或由以下步驟組成根據(jù)在此描述的方法或本領(lǐng)域中已知的方法，將本發(fā)明第九方面鑒定的化合物或分子(或合成的化合物或分子)配制成藥物組合物或藥物。在本申請(qǐng)中列出或討論的在先公開文件不應(yīng)當(dāng)必然地被視為承認(rèn)所述文件是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或公知常識(shí)。優(yōu)選地，現(xiàn)在將參考以下附圖描述具體體現(xiàn)本發(fā)明的某些方面的非限制性實(shí)施例表1親吻肽類似物刺激肌醇磷酸(IP)和抑制lOnM親吻肽刺激IP。圖1:A_GPR54穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞中親吻肽的結(jié)合劑量反應(yīng)。B-GPR54穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞中親吻肽的IP劑量反應(yīng)。圖2:A_在完整的雄性大鼠中重復(fù)注射化合物210(0、60、120min)干擾親吻肽-lO(lOOpmol)(120min)的有效LH-和睪丸酮釋放作用的能力。B-在完整的雄性大鼠中重復(fù)注射化合物234干擾親吻肽-lO(lOOpmol)的有效LH-和睪丸酮釋放作用的能力。C-在睪丸切除雄性大鼠中重復(fù)注射化合物210(0、60、120min)降低升高的LH水平的能力。圖3中央輸注親吻肽拮抗劑抑制0VX母羊中LH的分泌脈沖。顯示用親吻肽拮抗劑處理的母羊(實(shí)心柱)或?qū)φ漳秆?空心柱)中LH的濃度。箭頭指示如材料和方法中定義的LH脈沖。圖4劑量反應(yīng)結(jié)合曲線和劑量反應(yīng)IP曲線和肽拮抗劑的IP競爭試驗(yàn)。圖5用拮抗劑234抑制親吻肽刺激的GnRH神經(jīng)元放電。圖6親吻肽處理導(dǎo)致較差植入，降低胎兒體重。因此親吻肽在胎兒生長遲緩中發(fā)揮作用，表明拮抗劑可以用于治療有較差植入(其將導(dǎo)致例如流產(chǎn)和先兆子癇)病史的女性。圖7:N-末端取代和C-末端截短產(chǎn)生部分激動(dòng)劑。在親吻肽-10的N-末端進(jìn)行氨基酸取代并在c-末端進(jìn)行截短。截短至7個(gè)氨基酸(a)或5個(gè)氨基酸(b)長度引起部分激動(dòng)作用。當(dāng)截短至5個(gè)氨基酸并與在Leu8位有(D)-Leu組合時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)了所述部分激動(dòng)作用(c)。圖8對(duì)人gpr-54受體的氨基酸取代產(chǎn)生拮抗劑，其中用Gly55和D_Trp8取代是關(guān)鍵的。(a，b)用甘氨酸或D-Ala氨基酸取代絲氨酸5和用D_氨基酸取代Leu8的組合產(chǎn)生部分激動(dòng)劑。(c，d)進(jìn)一步用D-Ala或D-Tyr取代Tyr1增強(qiáng)了該拮抗作用，進(jìn)一步產(chǎn)生對(duì)gpr-54受體的完全拮抗劑。然而，從Tyr1位為D-氨基酸的拮抗劑去除Gly5和D_Trp8降低或消除類似物的拮抗特性。(e)當(dāng)用D-Tyr替代Tyr1時(shí)，這是最為明顯的，因?yàn)橐粋€(gè)或兩個(gè)取代的去除即消除了拮抗作用。(f)用D-Ala替代Tyr1時(shí)的作用不太明顯，但拮抗作用仍被降低(*=p<0.05，**=p<0.01，***=p<0.001)。圖9肽234以與親吻肽-10相同的親合力結(jié)合。當(dāng)I125-標(biāo)記的親吻肽-10與親吻肽-10(a)或肽234(b)競爭時(shí)，它們結(jié)合的親合力都為2nM。圖10肽234拮抗親吻肽-10對(duì)GnRH神經(jīng)元的刺激。GnRH神經(jīng)元放電頻率隨著時(shí)間變化的代表性記錄。(a)在InM親吻肽-10(柱)之后增加的GnRH放電頻率。下行的峰值是個(gè)體的動(dòng)作電流。(b)肽234(InM，柱)抑制親吻肽-10(InM)的刺激作用。(c)總柱狀圖顯示在基線(白柱)和親吻肽_10(黑柱)期間放電頻率倍數(shù)變化的平均值士SEM，親吻肽-10顯著增加了GnRH神經(jīng)元的放電活動(dòng)(n=7，*p<0.002)。對(duì)親吻肽-10的反應(yīng)隨著l、10、100nM肽234的出現(xiàn)而顯著降低(InMn=5，10nMn=6，lOOnMn=7，#p<0.001所有組)。圖11肽234阻抑體內(nèi)GnRH釋放。顯示來自肽234對(duì)GnRH釋放的影響和組平均值(士Sem，n=6)的代表性實(shí)例。(a)通過輸注lOnM肽234至柄-中間隆起區(qū)域，阻抑GnRH在下丘腦的脈沖式釋放(深色陰影柱)。短箭頭指示用PULSAR確定的GnRH峰。(b)相反地，作為對(duì)照的載體輸注未引起GnRH釋放的任何顯著變化(淺色陰影柱)。(c)數(shù)據(jù)分析表明，與肽234使用之前以及載體對(duì)照的水平相比，肽234顯著阻抑了GnRH釋放(p<0.05)。(d)載體輸注未引起任何顯著變化?；谖覀冎暗脑u(píng)估，相似尺寸的透析膜通過10%的肽，估計(jì)肽234在柄-中間隆起區(qū)域的濃度為InM。與肽234處理之前相比，*p<0.05；與相應(yīng)時(shí)間段的對(duì)照相比，P<0.05。圖12肽234對(duì)完整和閹割的雄性大鼠中基礎(chǔ)和親吻肽-10刺激的血漿LH的影響。在完整的雄性大鼠中，肽234(a)抑制親吻肽-10誘導(dǎo)的LH分泌。在0和60min時(shí)給動(dòng)物兩次推注肽234，接著在120min—次輸注親吻肽-10。根據(jù)所計(jì)算的曲線下面積(AUC；p<0.05)，所述肽顯著抑制此后2小時(shí)的LH生成。還用柱圖顯示親吻肽輸注60min之后(即在實(shí)驗(yàn)180-min)的睪丸酮水平。此外，閹割雄性大鼠接受三次輸注肽234，其抑制LH分泌(b)。圖13中央輸注肽234抑制0VX母羊中LH的分泌脈沖。顯示用肽234處理的母羊(實(shí)心柱)或?qū)φ漳秆?空心柱)中的LH濃度。箭頭指示材料和方法中定義的LH脈沖。分析顯示在肽234輸注之后平均LH濃度和脈沖幅度顯著降低。表2在用肽234輸注之前、期間和之后的平均LH脈沖幅度、LH濃度和GH濃度(ng/ml)。在載體和肽-234處理母羊之前(0-180min)、期間(180-240min)和之后(240-360min)輸注的數(shù)據(jù)為平均值士SEM。重復(fù)測量AN0VA顯示處理和時(shí)間之間的顯著相互作用(P<0.05)。顯示各時(shí)間段的個(gè)體P值。圖14中央輸注拮抗劑234對(duì)0VX母羊中GH的影響。顯示用肽234處理的母羊(實(shí)心柱)或?qū)φ漳秆?空心柱)中的GH濃度。分析顯示在肽234輸注期間平均GH濃度顯著增加。圖15中央輸注拮抗劑234對(duì)0VX母羊中催乳素的影響。顯示用肽234處理的母羊(實(shí)心柱)或?qū)φ漳秆?空心柱)中的催乳素濃度。分析顯示肽234輸注對(duì)催乳素?zé)o影響。圖16中央輸注拮抗劑234對(duì)0VX母羊中皮質(zhì)醇的影響。顯示用肽234處理的母羊(實(shí)心柱)或?qū)φ漳秆?空心柱)中的皮質(zhì)醇濃度。分析顯示肽234輸注對(duì)皮質(zhì)醇無影響。圖17拮抗劑對(duì)細(xì)胞遷移的影響肽233、234和273在HUVEC和CH0細(xì)胞中作為人gpr_5的拮抗劑起作用，因?yàn)樗鼈儙缀跬耆种朴H吻肽對(duì)遷移的作用。(A)在CH0(中國卵巢倉鼠)細(xì)胞中，lOOnM親吻肽抑制了50%的細(xì)胞遷移。肽234完全消除了這種抑制。⑶在HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中，InM親吻肽抑制了50%向傷口內(nèi)的遷移。然而，存在肽233、234或273時(shí)，抑制減少至僅為10%。實(shí)施例1-關(guān)于親吻肽類似物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)材料和方法用于表1中劑量反應(yīng)結(jié)合(IC50)欄的方法全細(xì)胞受體結(jié)合試驗(yàn)-以11000稀釋比在加入1251_標(biāo)記的親吻肽的HEPES改_白勺Dulbecco白勺Eagle(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium,DMEM)巾制備親吻肽-10和類似物，以形成100，000每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)。將單層細(xì)胞置于冰上并接觸0.5ml肽(10pM-luM)；然后在4°C孵育所述細(xì)胞4h。4h之后，用冰冷的杜氏(Dulbecco)磷酸鹽緩沖液(DPBS；含有鈣和鎂)洗滌細(xì)胞兩次，然后加入0.5ml0.1M氫氧化鈉(NaOH)至31細(xì)胞，保持20分鐘，搖動(dòng)裂解細(xì)胞。將裂解物轉(zhuǎn)移至塑料管，并在、計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行結(jié)合放射性計(jì)數(shù)60秒。測量IC50，其為受體結(jié)合的50%被類似物競爭的濃度。用于表1中劑量反應(yīng)IP(EC50)欄的方法肌醇-3-磷酸刺激試驗(yàn)-在37°C下將單層細(xì)胞在加入青霉素/鏈霉素的0.5mlHEPES改良的DMEM中放置30min，以阻止IP3降解。然后在37°C下用0.5ml以11000稀釋于上述培養(yǎng)基的親吻肽-10和類似物(lOpM-luM)刺激細(xì)胞lh，接著將所述細(xì)胞在4°C下置于10mM甲酸lh，以裂解細(xì)胞。然后將裂解物轉(zhuǎn)移至含有0.5mlDowex樹脂的塑料管，以結(jié)合放射性IP3，接著用1mlH20沖洗樹脂。隨后，再用60mMNH4甲酸鹽/5mM四硼酸鈉沖洗該樹脂，接著用1MNH4甲酸鹽/0.1M甲酸沖洗，以釋放結(jié)合的放射物。然后將800yl放射性溶液轉(zhuǎn)移至含有2.5ml閃爍液的閃爍瓶中，并在3-計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)60秒。測量EC50，其為刺激出現(xiàn)50%最大刺激反應(yīng)的濃度。用于表1中拮抗劑IP抑制(IC50)欄的方法肌醇-3-磷酸拮抗作用試驗(yàn)_在37°C下將單層細(xì)胞在加入1%青霉素/鏈霉素的0.5mlHEPES改良的DMEM中放置30min，以阻止IP3降解。然后在37°C下用以11000稀釋于上述培養(yǎng)基的0.25ml10nM親吻肽-10和0.25ml10nM親吻肽-10或類似物(10pM_10uM)刺激細(xì)胞lh，接著將所述細(xì)胞在4°C下置于10mM甲酸lh，以裂解細(xì)胞。然后將裂解物轉(zhuǎn)移至含有0.5mlDowex樹脂的塑料管，以結(jié)合放射性IP3，并且接著用lmlH20沖洗樹脂。隨后再用60mMNH4甲酸鹽/5mM四硼酸鈉沖洗該樹脂，接著用1MNH4甲酸鹽/0.1M甲酸沖洗，以釋放結(jié)合的放射物。然后將800u1放射性溶液轉(zhuǎn)移至含有2.5ml閃爍液的閃爍瓶中，并在3-計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)60秒。計(jì)算作為50%抑制lOnM親吻肽-10刺激所需濃度的IC50。使用學(xué)生T-檢驗(yàn)計(jì)算P-值，并且提供各類似物的最顯著值。IP刺激是指可估計(jì)的內(nèi)在殘留激動(dòng)劑活性。IC50為50%抑制lOnM親吻肽-10刺激IP所需的拮抗劑劑量。親吻肽拮抗劑中央處理0VX母羊所有的實(shí)驗(yàn)步驟都在Monash學(xué)院生物醫(yī)學(xué)〃A〃動(dòng)物道德委員會(huì)(MonashSchoolofBiomedicalSciences"A"AnimalEthicsCommittee)認(rèn)可的協(xié)議下進(jìn)行。在自然光照下飼養(yǎng)成年考力代(Corriedale)母羊，并在任何實(shí)驗(yàn)處理前至少一個(gè)月對(duì)其進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除(0VX)。接著按照之前描述的外科手術(shù)步驟植入永久存在于第三腦室(3V)的套管(Barker-Gibbetal.，1995，J.Endocrinol.，147:565_79)。3V外科手術(shù)之后大約2周，向一支頸外靜脈插入套管以采集血樣，并將動(dòng)物飼養(yǎng)于單獨(dú)的圈內(nèi)；套管用肝素化鹽水保持通暢。母羊被分配成兩個(gè)處理組(n=4/組)親吻肽拮抗劑(稀釋于人工腦脊液，aCSF；150mMNaCl,1.2mMCaCl2,ImMMgCl2,2.8mMKC1)或?qū)φ?僅有aCSF)。第二天,將輸注管道連接至3V套管，在07.00h開始采集血樣。每隔10分鐘收集樣品。取樣3h之后，在lh內(nèi)以40yg/h的劑量將親吻肽拮抗劑(或?qū)φ?輸注入3V中，初始劑量為10yg。親吻肽拮抗劑和載體都用GrasebyMS16A輸注泵(SmithMedicalAustralasiaPty.Ltd.)以200ul/h的速度輸注lh。輸注之后，3V管道保持于原位，并繼續(xù)采集血樣2h(總計(jì)6h)。立即從樣品收集血漿，并在試驗(yàn)前冷凍于-20°C。使用Lee等的方法(1976,J.Reprod.Fertil.,461_6)，用NIH_oLH_S18作為標(biāo)準(zhǔn)，測量血漿LH濃度，一式兩份。使用Burger等的程序(1972,J.Lab.Clin.Med.,80:302_12)計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)的靈敏度為0.08ng/ml，并且試驗(yàn)組間變異系數(shù)在0.3-12.8ng/ml范圍之內(nèi)小于10%?；诿枋鲇糜贕nRH的方法(Clarke,1993,Endocrinology,1331624-32)進(jìn)行LH數(shù)據(jù)的脈沖分析。結(jié)果親吻肽拮抗劑中央處理0VX母羊中央輸注親吻肽拮抗劑似乎抑制0VX母羊的LH分泌脈沖(圖3)。LH脈沖分析顯示，在對(duì)照處理的0VX母羊-和在親吻肽拮抗劑處理之前的0VX母羊中-可明顯地分辨出LH的主要分泌期。通過心室施用親吻肽拮抗劑后分泌脈沖的數(shù)量減少。在鑒別出LH脈沖的情況下，發(fā)現(xiàn)這些脈沖具有降低的振幅。實(shí)施例2-關(guān)于親吻肽類似物的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)_既述促性腺激素釋放激素(GnRH)是生殖系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)劑，并且GnRH類似物被廣泛用于治療不育和激素依賴性疾病，如前列腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥。GnRH神經(jīng)元活動(dòng)受許多因素調(diào)節(jié)，包括光周期、營養(yǎng)、應(yīng)激和類固醇激素。關(guān)于gpr-54中的突變引起低促性腺激素型性腺功能減退癥的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致認(rèn)識(shí)到其同源配體(親吻肽)介導(dǎo)這些在GnRH神經(jīng)元上的作用。我們報(bào)道了親吻肽拮抗劑的開發(fā)并將其應(yīng)用于闡明親吻肽在青春期和類固醇激素反饋中的作用。通過親吻肽-10中的氨基酸取代確定了一系列的有效拮抗劑。選擇的拮抗劑抑制小鼠大腦中的GnRH神經(jīng)元放電和消除青春期雌性恒河猴的GnRH脈沖；后者支持親吻肽在青春期開始時(shí)的關(guān)鍵作用。此外，所述拮抗劑減弱了大鼠中黃體生成激素(LH)對(duì)外源性親吻肽的反應(yīng)，以及抑制母羊、大鼠和小鼠在性腺切除之后的LH增加，間接地證明了親吻肽-神經(jīng)元是性類固醇反饋?zhàn)饔玫陌袠?biāo)。因而，親吻肽拮抗劑的開發(fā)提供了用于探尋親吻肽在調(diào)節(jié)生殖中的生理學(xué)和病理生理學(xué)作用的新工具，以及用于干擾激素相關(guān)疾病的治療法。引言促性腺激素釋放激素(GnRH)是促性腺激素分泌的主要效應(yīng)物，促性腺激素對(duì)于睪丸和卵巢生成配子和類固醇激素的下游調(diào)節(jié)至關(guān)重要。生成GnRH的神經(jīng)元受許多因素調(diào)節(jié)，包括光周期、代謝信號(hào)、應(yīng)激和生殖腺類固醇，它們通過激活或抑制下丘腦中的神經(jīng)回路而控制GnRH分泌，但是傳導(dǎo)這些作用以改變GnRH分泌的機(jī)理仍然不清楚(1_3)?，F(xiàn)在通過發(fā)現(xiàn)被稱為低促性腺激素型性腺功能減退癥的獨(dú)特不育類型與G蛋白偶聯(lián)受體(gpr-54)突變有關(guān)而發(fā)現(xiàn)了這些機(jī)理(4，5)。Gpr-54是被稱為親吻肽的神經(jīng)肽家族的同源受體(6，7)，并且親吻肽/gpr-54信號(hào)傳導(dǎo)作為生殖過程的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)樞紐出現(xiàn)(8)。確實(shí)已顯示親吻肽(由Kissl基因編碼)是有效的GnRH促分泌素，并且GnRH神經(jīng)元表達(dá)親吻肽受體(9，10)。此外，親吻肽神經(jīng)元已作為將環(huán)境和激素輸入傳遞至GnRH神經(jīng)元的通路而參與(11-16)。通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸，GnRH類似物廣泛地應(yīng)用于治療激素依賴性疾病，包括前列腺癌、乳癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤和性早熟，以及用于不育和IVF中的排卵誘導(dǎo)(17，18)。由于親吻肽對(duì)GnRH和促性腺激素分泌產(chǎn)生如此有力的刺激作用，在親吻肽/gpr-54系統(tǒng)水平的干擾可能具有用于治療這些病癥的潛力，并且可能獲得比由GnRH類似物所實(shí)現(xiàn)的更強(qiáng)且更有效的控制。在懷孕期間親吻肽顯著提高(19)并由滋養(yǎng)層生成(20)，并且通過滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮上皮中的gpr-54受體抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)而抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入(植入)(21)。因而親吻肽/gpr-54調(diào)節(jié)異?？赡茉谔ケP和胎兒病理如先兆子癇、胎盤植入(acretia)、異位妊娠和胎兒宮內(nèi)生長遲緩中發(fā)揮作用，但是對(duì)此缺少直接證據(jù)。在人脈管中的選擇區(qū)域，通過gpr-54，親吻肽也是有效的血管收縮劑(22)。因而，親吻肽拮抗劑的開發(fā)為闡明親吻肽在對(duì)GnRH細(xì)胞的正和負(fù)性腺反饋中的作用以及在介導(dǎo)對(duì)生殖系統(tǒng)的代謝和應(yīng)激效應(yīng)中的作用提供了必要的條件。親吻肽拮抗劑還提供了在許多激素依賴性疾病中的潛在治療干擾，還可能用于胎盤和脈管功能失調(diào)的治療。我們報(bào)道了對(duì)親吻肽類似物的系統(tǒng)性結(jié)構(gòu)_活性研究和在實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物、羊和非人的靈長動(dòng)物具有體外和體內(nèi)活性的有效和特異性的拮抗劑。這些研究表明親吻肽在青春期和類固醇激素反饋中的關(guān)鍵作用，表明了這些拮抗劑的廣泛應(yīng)用。結(jié)果親吻肽-10中氨基酸的取代對(duì)穩(wěn)定表達(dá)人gpr-54的CH0細(xì)胞中刺激肌醇磷酸(IP)釋放的影響由于親吻肽-10是用于全部受體結(jié)合和激活所需的最小序列，我們研究了系統(tǒng)取代該范圍內(nèi)氨基酸的影響，監(jiān)測穩(wěn)定表達(dá)人gpr-54的細(xì)胞中的IP生成。因?yàn)樵谶@個(gè)巨大而古老肽家族中C-末端序列的RF.NH2是保守的，我們推斷這對(duì)于受體結(jié)合來說是必須的，并將我們的注意力集中于在前的八個(gè)氨基酸。我們截去N-末端的5個(gè)氨基酸，并引入不同的D-氨基酸取代。這導(dǎo)致IP生成效率降低和減弱了抑制lOnM-親吻肽-10刺激IP的能力(圖7；表1)。這表明最前的5個(gè)氨基酸與受體激活有關(guān)。然后我們在全長10個(gè)氨基酸肽中取代單個(gè)或組合的殘基，并且監(jiān)測所述取代對(duì)內(nèi)在IP刺激的影響，和這些取代對(duì)用10nM親吻肽-10刺激IP的任何抑制作用。氨基酸的這一系統(tǒng)取代使得我們開發(fā)出對(duì)此受體具有部分刺激和拮抗性質(zhì)的一系列類似物(表1)。許多這些類似物加入了取代Ser6的甘氨酸并與在Leu8位的D-氨基酸(色氨酸或亮氨酸)相組合。雖然這些取代單獨(dú)顯著抑制了10nM親吻肽-10的刺激IP(P<0.01)，但是它們通常沒將此刺激降低至基礎(chǔ)水平(圖8a，b；表1)。為開發(fā)完全拮抗劑，在Tyi^Asn2和Trp3位進(jìn)一步進(jìn)行D_氨基酸取代。在這些位點(diǎn)取代中，最有效的拮抗劑是肽230、232、233、234、235和236，它們單獨(dú)幾乎沒有或沒有刺激IP，但是具有<10_8M的IC5(1和最大抑制66-93%的親吻肽刺激IP(圖8b-d；表1)。用D-Ala1取代(表1中234；圖8d)實(shí)現(xiàn)了最完全的抑制。這種取代組合抑制93%的lOnM親吻肽-10刺激IP，具有的IC5(I為7nM，并且沒有內(nèi)在IP刺激，表明其高拮抗劑活性。這些研究還突出顯示了在Ser6位的甘氨酸取代和在Leu8位的D-Trp取代的重要意義，因?yàn)閺囊陨项愃莆镏袑⑦@些取代中的一個(gè)或兩個(gè)都去除，當(dāng)在D-Tyr取代Tyr1時(shí)降低了拮抗劑活性(圖8e)，或當(dāng)D-Ala被取代時(shí)減小了拮抗作用(圖8f)。這表明這些殘基對(duì)于受體激活來說具有重要意義。使用1251_親吻肽-10，所述活性類似物顯示高結(jié)合親合力，例如肽234具有的結(jié)合親合力為2.7nM(圖9)。肽234抑制親吻肽-10刺激的GnRH神經(jīng)元放電如之前所證明(23)(J.Pieleka-Fortuna,ZChu,SMMeonter,EndocrineSocietyMeeting2006，AbstractPl_8)，InM親吻肽-10顯著增強(qiáng)GnRH神經(jīng)元放電活動(dòng)(圖10a,c)。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，單獨(dú)的肽234對(duì)GnRH神經(jīng)元放電活動(dòng)沒有影響(InM之前0.18士0.12Hz,之后0.27士0.08Hz,n=5，P>0.05；10nM之前0.34士0.15Hz,之后0.29士0.17Hz，n=6，P>0.05；100nM之前0.45士0.12Hz，0.62士0.14Hz，n=7，P>0.05，成對(duì)t檢測)。與肽234缺少對(duì)基礎(chǔ)放電的作用相反，與用親吻肽-10單獨(dú)處理細(xì)胞(圖10b,c)相比，用肽234預(yù)處理阻斷了對(duì)InM親吻肽-10的反應(yīng)(所有劑量P<0.001)。肽234抑制雌性恒河猴脈沖式GnRH釋放由于肽234抑制GnRH神經(jīng)元放電，我們使用之前描述的方法(24)，測試這是否導(dǎo)致抑制青春期雌性恒河猴的GnRH釋放。在30min內(nèi)，通過位于柄-中間隆起區(qū)域的微透析探針輸注10nM肽234迅速且持續(xù)地阻抑GnRH脈沖以及平均GnRH水平(圖11a，c)。相反地，通過探針輸注載體并未引起GnRH釋放發(fā)生顯著變化(圖llb，d)。肽234-誘導(dǎo)的GnRH阻抑與在肽234輸注之前以及載體對(duì)照的值具有顯著差異(兩種情況下均為p<0.05)?；谖覀冎暗脑u(píng)估，用相似尺寸的透析膜通過10%的肽(25)，估計(jì)肽234在柄-中間隆起區(qū)域中的濃度為InM。肽234抑制完整雄性大鼠中親吻肽-10刺激的LH并在閹割之后LH增加使用成年雄性大鼠在體測試肽234的推定的親吻肽拮抗劑活性作用。為了評(píng)估拮抗劑對(duì)基礎(chǔ)LH水平的可能作用，藥理學(xué)測試包括重復(fù)(x3)腦內(nèi)注射化合物和連續(xù)取血樣。為了監(jiān)測肽234抑制親吻肽-10通過刺激GnRH而刺激LH和睪丸酮的能力，第三次注射同時(shí)還有亞最大劑量(lOOpmol)的親吻肽-10和lnmol劑量的肽234共同施用。在注射15、60,75和120min之后，icv施用lnmol肽234并沒有顯著改變基礎(chǔ)LH水平；向載體處理的動(dòng)物中央注射lpmol親吻肽_10(在120min)引起預(yù)期的血清LH水平升高(圖12a)。盡管缺少對(duì)基礎(chǔ)水平的作用，共同施用肽234顯著減弱由中央注射親吻肽-10誘導(dǎo)的LH分泌反應(yīng)，并且在共同注射肽234和親吻肽-10之后120min的時(shí)間內(nèi)顯著(P<0.01)減少LH凈分泌量(AUC)。與此一致的是，聯(lián)合注射肽234和親吻肽-10之后60min時(shí)的睪丸酮水平顯著(P<0.01)低于單獨(dú)注射親吻肽-10的動(dòng)物(圖12a)。在240min監(jiān)測期內(nèi)，閹割大鼠的LH水平升高。在0、60和120min向閹割雄性大鼠施用lnmol肽234有降低血清LH水平的趨勢；降低在240min達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖12b)。肽234抑制卵巢切除母羊的LH脈沖頻率和振幅在肽234施用之前，對(duì)照卵巢切除母羊和經(jīng)處理母羊的LH主要分泌期是明顯不同的(圖13)。在經(jīng)心室施用肽234之后，分泌脈沖數(shù)量減少。在鑒別出LH脈沖的情況下，肽234輸注后這些LH脈沖的振幅減小(P<0.05，表2)。在輸注之前和期間，平均LH水平相似，但在肽234輸注后減小(P<0.05)。輸注肽234顯著(P<0.05)增加0VX母羊中GH的平均濃度(圖14和表2)。這種作用僅在輸注期間觀察到，而輸注之前和之后，對(duì)照母羊和肽234處理母羊之間的平均GH水平相似。有趣的是，這種刺激作用似乎比對(duì)LH的抑制作用更直接。在輸注之前、期間或之后，肽234對(duì)催乳素或皮質(zhì)醇的濃度沒有影響(圖15和圖16)。如圖15所示，令人驚奇地，拮抗劑施用升高羊的生長激素水平。因此，本發(fā)明的拮35抗劑可以用于促進(jìn)和/或誘導(dǎo)個(gè)體生長激素生成。例如，本發(fā)明的拮抗劑可以與使用生長激素療法的現(xiàn)有治療一起使用，例如用于腎衰竭的治療。肽234抑制卵巢切除母羊中LH脈沖頻率和振幅使用從新生兒臍帶分離的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，因?yàn)樗鼈儍?nèi)源性地表達(dá)gpr-54,而gpr-54被認(rèn)為參與胎盤內(nèi)的細(xì)胞遷移。使用穩(wěn)定表達(dá)人gpr-54受體的中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞作為創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)的模型細(xì)胞系。用移液管尖端從12-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的各孔中間刮下穩(wěn)定表達(dá)人gpr-54的WTHUVEC或CH0細(xì)胞的單層細(xì)胞，然后用PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)板，以去除任何松散細(xì)胞。在各個(gè)細(xì)胞類型中，與完全培養(yǎng)基一起加入最佳濃度的親吻肽-10以抑制細(xì)胞遷移(創(chuàng)傷愈合)對(duì)于HUVEC細(xì)胞，在有和沒有拮抗劑233、234、273和276存在下，加入InM親吻肽-10；對(duì)于CH0細(xì)胞，在有和沒有拮抗劑234存在下，加入lOOnM親吻肽-10。然后將細(xì)胞在37°C下含5%C02的空氣中孵育22小時(shí)。細(xì)胞在axiovert2000顯微鏡上以20x倍放大率進(jìn)行相差拍照(Horietal.,2001.MetastinsuppressesthemotilityandgrowthofCH0cellstransfectedwithitsreceptor.BiochemBiophysResCommun286,958-963；Staffordetal.,2002,Identificationandcharacterizationofmousemetastasis-suppressorKiSSlanditsG-protein-coupled.CancerRes62,5399-5404)。在圖17(A)中，結(jié)果表明，在CH0細(xì)胞中，lOOnM親吻肽抑制50%的細(xì)胞遷移，而肽234完全消除了這種抑制。在圖17(B)中，結(jié)果表明，在HUVEC中，InM親吻肽抑制50%向傷口的遷移。然而，當(dāng)肽233、234或273存在時(shí)，此抑制降低至僅為10%。基于此，我們認(rèn)為肽233、234和273在這些細(xì)胞中作為對(duì)人gpr-54的拮抗劑起作用，因?yàn)樗鼈儙缀跬耆种屏擞H吻肽對(duì)遷移的作用。因此，本發(fā)明的拮抗劑可以用于誘導(dǎo)和/或促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。向肽234的N-末端添加果蠅觸足肽七肽如上所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列為來自果蠅觸足肽的七肽序列。向肽234的N-末端添加所述肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y，所得到的肽命名為肽271。因此，肽271的序列為ac.R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z如表1所示，包含N_末端果蠅觸足肽七肽的肽271保持了親吻肽拮抗劑的功能。討論親吻肽作為抗轉(zhuǎn)移劑和在調(diào)節(jié)HPG軸以及可能調(diào)節(jié)植入、血管收縮和CNS神經(jīng)元中的多效作用使得gpr-54受體成為引人注意的治療靶。迄今主要的重點(diǎn)在于開發(fā)作為抗轉(zhuǎn)移劑的親吻肽激動(dòng)劑(26-28)。然而，大多數(shù)在親吻肽在HPG軸、植入和血管收縮中的治療干預(yù)作用需要開發(fā)拮抗劑。為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，我們系統(tǒng)地取代了生物活性所需的最小親吻肽結(jié)構(gòu)(親吻肽-10)中的氨基酸，并且開發(fā)在體外和體內(nèi)具有高結(jié)合親合力和效力的拮抗齊U。尋求親吻肽激動(dòng)劑的研究已確定Phe6、Arg9和Phe1Q.朋2構(gòu)成結(jié)合藥效團(tuán)(26)。RF.NH2部分在巨大而古老的肽家族中的進(jìn)化保守性預(yù)示這些C-末端殘基對(duì)于受體結(jié)合是必需的，這與其在藥效團(tuán)中的認(rèn)定相一致。我們對(duì)親吻肽氨基酸取代的初探研究證實(shí)RF.NH2部分中的變化可減低結(jié)合。因此，在尋找拮抗劑結(jié)構(gòu)時(shí)，我們將注意力集中于其它殘基。我們首先截去嚙齒動(dòng)物和人親吻肽-10序列中的N-末端5個(gè)氨基酸，并發(fā)現(xiàn)這降低激動(dòng)劑活性和拮抗劑性能。在這些截短肽中取代Phe6或Leu8顯示，用D-Trp取代Leu8產(chǎn)生最有前景的拮抗劑。在十肽全長序列中加入該取代產(chǎn)生更好的拮抗劑，尤其是當(dāng)同時(shí)用非手性氨基酸Gly取代Ser5的情況下，Gly使肽的柔韌性更大，并且能夠避免其它具有龐大側(cè)鏈的氨基酸(如D-Trp)取代的一些立體位阻。進(jìn)一步研究顯示，用D-氨基酸取代N-末端Tyr1對(duì)于拮抗活性來說也是可以接受的，但是若是D-Tyr1或D-Trp1同時(shí)還有D_Trp8取代則不可以。如所預(yù)期的，藥效團(tuán)殘基Phe6的取代導(dǎo)致激動(dòng)劑活性下降并產(chǎn)生一些拮抗劑活性(如211和212)。然而，與單獨(dú)用D-Trp8取代相比，用D-Trp6取代Phe6并與用D_Trp8取代Leu8相組合降低了拮抗作用(用210與213、245和246比較)。Asn2(如232和236)和Trp3(如231和235)的某些取代與用D-Trp8取代Leu8組合對(duì)于拮抗作用來說也是可接受的?？偟恼f來，用于拮抗作用的共有序列為Xi-X'-XS-N-G-F-G-XS-R-F.NH2，其中X1為D_Tyr或D_Ala，X2為Asn或D_Ala或D_Trp，X3為Trp或D-Trp或D_Ala以及X8為D_Leu、D-Phe或D_Trp。我們的研究還鑒定出看起來參與受體激活的氨基酸，因?yàn)镾er6、Leu8的取代，和某種程度上Tyr1、Asn2和Trp3的取代有助于拮抗作用。這是令人感興趣的，因?yàn)槠竦难芯繑?shù)據(jù)表明N-末端包含活性結(jié)構(gòu)域，而C-末端包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域。然而，我們的研究表明，該兩個(gè)區(qū)域交疊，因?yàn)橐炎C明Phe6、Arg9和Phe"1構(gòu)成用于結(jié)合的藥效團(tuán)(26)，因此Leu8活性殘基位于結(jié)合位點(diǎn)中。在顯示較好的體外拮抗劑活性的類似物中，我們選擇肽234用于離體和體內(nèi)研究。由于認(rèn)為親吻肽在HPG軸的作用主要是通過刺激GnRH分泌(10，29)，我們首先研究了肽234抑制親吻肽-10刺激GnRH神經(jīng)元放電的能力，使用新鮮制備的小鼠腦切片進(jìn)行記錄。發(fā)現(xiàn)lOOnM、10nM,甚至InM肽234都阻斷親吻肽-10刺激的GnRH神經(jīng)元放電，所述濃度與用于刺激GnRH神經(jīng)元的親吻肽-10濃度相同。通過肽234抑制親吻肽對(duì)GnRH神經(jīng)元放電的作用表明，所述拮抗劑可以在體內(nèi)減少下丘腦的GnRH釋放。因此，我們通過直接向青春期雌性恒河猴柄-中間隆起區(qū)域施用肽234，確定親吻肽是否改變脈沖式GnRH釋放。在肽234輸注期間阻抑GnRH釋放首次提供了直接證據(jù)證明來自下丘腦中親吻肽神經(jīng)元的輸入是GnRH釋放的明顯重要信號(hào)。親吻肽在GnRH脈沖中的重要性進(jìn)一步得到之前觀察的支持，其中表明親吻肽-54釋放是脈沖式的，并且親吻肽-54脈沖與GnRH脈沖有75%的時(shí)間是一致的(24)。然而，因?yàn)榕R床研究表明具有g(shù)pr-54突變的患者表現(xiàn)具有近似正常脈沖頻率的減弱LH脈沖(4，5)，(30)，親吻肽神經(jīng)元是否是GnRH脈沖產(chǎn)生的關(guān)鍵，或其僅是GnRH脈沖幅度的調(diào)節(jié)劑的問題，仍然有待研究。因此，完全消除猴模型的GnRH脈沖和卵巢切除羊的LH脈沖可以簡單地反映對(duì)振幅而不是頻率的完全抑制。肽234還在2小時(shí)期間內(nèi)阻斷成年雄性大鼠親吻肽_10對(duì)LH和睪丸酮的刺激(圖12a)，估計(jì)是通過阻斷親吻肽-10對(duì)GnRH分泌的作用。用肽234抑制完整雌性恒河猴GnRH分泌表明，前一種解釋是最有可能的。在閹割雄性大鼠中，肽234阻斷了隨閹割和去除負(fù)反饋之后發(fā)生的LH增加。該發(fā)現(xiàn)表明，去除性腺類固醇導(dǎo)致親吻肽活性升高，而這被轉(zhuǎn)化成增加的GnRH和LH分泌。以前證明，性腺切除的雄性和雌性大鼠弓狀核中KiSS_l基因表達(dá)增加(10，29)和用GnRH拮抗劑消除所導(dǎo)致的LH上升的能力(10)，與猜測親吻肽形成神經(jīng)元是性類固醇反饋?zhàn)饔玫陌袠?biāo)的假設(shè)相一致(11)。然而，mRNA水平可能沒有反映結(jié)合GnRH神經(jīng)元中g(shù)pr-54的親吻肽的生物合成和分泌。我們現(xiàn)在用新親吻肽拮抗劑的研究提供了親吻肽通過性腺負(fù)反饋調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元的直接證據(jù)，并且強(qiáng)調(diào)了親吻肽拮抗劑用于闡明生理學(xué)機(jī)理的價(jià)值。反復(fù)取血樣(每隔lOmin)以及在卵巢切除母羊中的拮抗劑處理允許我們探究內(nèi)源性親吻肽對(duì)LH脈沖頻率和振幅的作用。通過icv施用肽234顯著降低LH脈沖的頻率和振幅，表明GnRH分泌的振幅減小以及其頻率也可能降低。這與我們驗(yàn)證的肽234抑制小鼠GnRH神經(jīng)元放電頻率和抑制恒河猴GnRH脈沖相一致。這些發(fā)現(xiàn)暗示，親吻肽的內(nèi)源性分泌本質(zhì)上是脈沖式的，并且促使GnRH節(jié)律性分泌。用親吻肽-10增加GnRH神經(jīng)元放電的能力和用親吻肽拮抗劑降低GnRH神經(jīng)元放電的能力表明親吻肽類似物在與LH脈沖頻率功能失調(diào)有關(guān)的病理病癥中的治療潛力，如多囊卵巢綜合征特有的LH脈沖頻率增加(31)和在心理疾病、應(yīng)激(32)和營養(yǎng)不足(如神經(jīng)性厭食癥)中發(fā)現(xiàn)的LH脈沖頻率降低(33)。肽234的作用看起來是特異性的，因?yàn)樗鼘?duì)卵巢切除母羊催乳素和皮質(zhì)醇分泌沒有影響(圖15和圖16)，并且不結(jié)合GnRH或LH受體(數(shù)據(jù)未顯示)。全部4只母羊在輸注肽234期間生長激素看起來增加，表明內(nèi)源性親吻肽抑制生長激素(圖14)。我們尚未深入檢測這種現(xiàn)象，但是已觀察到親吻肽受體(gpr-54)唯一地表達(dá)于垂體中的生長激素細(xì)胞中。在嚙齒動(dòng)物和羊中顯示雌激素的正反饋誘導(dǎo)排卵的LH激增，同時(shí)伴隨著下丘腦特定區(qū)域中Kiss-1基因表達(dá)的增加(34-36)。雌性大鼠(37)和女性(38)的研究還顯示，在排卵LH激增時(shí)LH對(duì)外源性親吻肽有更大的靈敏度，表明增加親吻肽輸入介導(dǎo)雌激素的正反饋(37)。這與雌激素治療后KiSS-1基因表達(dá)增加的證明(34，35)，以及在雌性大鼠中通過施用親吻肽抗血清而消除的LH激增相一致(35)。我們目前利用肽234來確定親吻肽在對(duì)GnRH和LH分泌正反饋中的作用。我們通過icv施用拮抗劑的研究主要是為了使親吻肽輸入更直接干預(yù)GnRH神經(jīng)元，并更清楚地闡述親吻肽在HPG軸的生理調(diào)控中的作用。然而，系統(tǒng)性給藥是親吻肽類似物治療應(yīng)用的前提。由于靜脈注射和皮下注射施用親吻肽刺激男性(39)和女性(38)LH釋放，因此所述肽顯然進(jìn)入了大腦，或作用于血-腦屏障之外的位置如弓狀核或中間隆起，并且作用于GnRH神經(jīng)元。因此，有理由認(rèn)為系統(tǒng)性遞送親吻肽拮抗劑也會(huì)到達(dá)在中間隆起處的GnRH神經(jīng)元或它們的軸突，由此提供了有效的和可行的治療靶。許多病理與HPG軸的功能失調(diào)有關(guān)，并且性類固醇刺激使許多癥狀加重。這些包括不育、多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、月經(jīng)出血過多、青春期延遲和性早熟、以及乳癌、前列腺癌和卵巢癌。獲得強(qiáng)力、特異且有效的親吻肽拮抗劑將提供用于這些病癥的新療法和用于探尋HPG軸的生理調(diào)節(jié)作用的可能性。除了這些主要的適應(yīng)癥，親吻肽拮抗劑還可能具有調(diào)節(jié)血管收縮(22)、CNS功能(40)和滋養(yǎng)層侵入以及形成充足的母體血液供應(yīng)(19，21，41)的潛力。方法月太材料人親吻肽-10以及肽類似物186-191、200-203、206-213和228-248(10iig)由EZBiolabs按常規(guī)方法合成。其他全部試劑來源都在文中指明。體外測試拮抗活性細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)人gpr-54受體的中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞(CHO/gpr-54)由布魯塞爾大學(xué)(Univ.Brussels)G.Vassart教授提供。在37°C，5%C02，加濕環(huán)境下，將細(xì)胞保存于添加10%胎牛血清、2%谷氨酰胺和青霉素(10，000單位/ml)/鏈霉素(10，000mg/ml)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM；Sigma)中。肌醇磷酸(IP)刺激試驗(yàn)在刺激CHO/gpr-54細(xì)胞之前，用杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS；不含鈣或鎂)沖洗細(xì)胞兩次，然后在37°C下用含有1%青霉素/鏈霉素的3H-肌醇標(biāo)記的HEPES改良的DMEM孵育過夜。向細(xì)胞添加青霉素/鏈霉素和氯化鋰(0.5ml)的HEPES改良的DMEM，在37°C下保持30分鐘以阻止IP水解。然后，用以1100的配比稀釋于上述培養(yǎng)基的0.5ml親吻肽-10和類似物(10pM-liiM)于37°C下刺激細(xì)胞lh，再用10mM甲酸于4°C下裂解細(xì)胞lh。將裂解物轉(zhuǎn)移至含有0.5mlDowex樹脂的塑料管中以結(jié)合放射性IP，再用lml水沖洗樹脂。然后用60mM甲酸銨/5mM四硼酸鈉沖洗樹脂。接著用1M甲酸銨/0.1M甲酸沖洗樹脂，以釋放結(jié)合的放射物。然后將800yl放射性溶液轉(zhuǎn)移至含2.5ml閃爍液的閃爍瓶中，于粒子計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)60sec。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3-5次。IP產(chǎn)量以平均值士SEM標(biāo)出，并通過學(xué)生t-檢驗(yàn)進(jìn)行分析(p彡0.05)。肌醇磷酸(IP)拮抗試驗(yàn)單獨(dú)用0.25ml親吻肽(10nM)或與0.25ml肽類似物(lOOpM-1uM)組合刺激CH0/gpr-54單層細(xì)胞，以研究對(duì)親吻肽刺激IP生成的抑制。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3-5次。IP產(chǎn)量以平均值士SEM標(biāo)出，并通過學(xué)生t-檢驗(yàn)進(jìn)行分析(p彡0.05)。GnRH神經(jīng)元放電動(dòng)物記錄來自轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的腦切片中GnRH神經(jīng)元的放電，該小鼠中GFP遺傳性地靶向GnRH神經(jīng)元(42)。小鼠在14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗循環(huán)下飼養(yǎng)，并有1630小時(shí)關(guān)燈，按Harlan2916嚙齒動(dòng)物食譜(Harlan)喂食和隨意飲水。所有方法均經(jīng)維吉尼亞大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷和應(yīng)用委員會(huì)(AnimalCareandUseCommitteeofUniversityofVirginia)認(rèn)可，并按照美國國家研究委員會(huì)關(guān)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的關(guān)懷和應(yīng)用指南(NsyionslResearchCouncil’sGuildfortheCareandUseofLaboratoryAnimals)白勺}t貝!JiS^f。性GnRH-GFP小鼠在異氟烷(AbbottLaboratories)麻醉下切除卵巢。用長效局部麻醉劑(0.25%布比卡因；7.5iU/位點(diǎn)；AbbottLaboratories)提供術(shù)后無痛。手術(shù)時(shí)，小鼠接受含有于芝麻油中的0.625iig雌二醇的硅橡膠(Silastic)(DowCorning)膠囊。手術(shù)之后2-4日在AM時(shí)進(jìn)行記錄，在AM時(shí)已證明雌二醇有負(fù)反饋?zhàn)饔?43)。記錄來自于單只動(dòng)物的不多于4個(gè)細(xì)胞，全部在不同的切片中。腦切片制作使用之前描述的方法(44)制作腦切片。簡要而言，在整個(gè)試驗(yàn)過程中以及在接觸組織之前至少15min，向所有溶液中通入95%02/5%C02混合物使溶液起泡。迅速取下大腦并置于冰冷的高糖鹽溶液中，該溶液含有250mM蔗糖、3.5mMKCl、26mMNaHC03、10mM葡萄糖、1.25mMNa2HP04、l.2mMMgS04和2.5mMMgCl2。用Vibratome3000(TechnicalProducts,International,Inc.,St.Louis,M0)切取冠狀300-iim腦切片。切片于30_32°C下在溶液中孵育30min，所述溶液為50%高糖鹽溶液和50%生理鹽溶液(NS)，其含有135mMNaCl、3.5mMKCl、10mM葡萄糖、1.3mMNa2HP04、1.2mMMgS04和2.5mMCaCl2。然后將切片轉(zhuǎn)移至室溫下的100%NS溶液中，并記錄之前保持至少30min，但不超過6h。電生理記錄使用靶向細(xì)胞外記錄(又被稱為松膜片)來研究親吻肽-10和肽234對(duì)GnRH神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響(45)。由于低阻封接(<50MQ)不會(huì)影響細(xì)胞膜，這種方法是用于監(jiān)測單個(gè)細(xì)胞內(nèi)源性電學(xué)活性的微創(chuàng)方法。雖然這些事件不是動(dòng)作電位本身，但是它們精確地反映了動(dòng)作電位放電頻率的變化。簡要而言，我們使用詞組放電頻率、放電模式和/或放電活動(dòng)來指代這些事件。將個(gè)體腦切片置于用氧化NS溶液連續(xù)灌注的記錄槽中，并保持在29-31°C。用OlympusBX50WI正置熒光顯微鏡和紅外微分干涉相襯顯微鏡(Opelco)使細(xì)胞成像。通過由470nm的短暫照明成像的GFP信號(hào)來鑒別GnRH神經(jīng)元。用標(biāo)準(zhǔn)HEPES緩沖溶液裝滿范圍為1.5-3QM的膜片硼硅酸鹽移液管(WorldPrecisionInstruments)，所述標(biāo)準(zhǔn)HEPES緩沖溶液含有150mMNaClUOmMHEPES、10mM葡萄糖、2.5mMCaCl2、l.3mMMgCl2和3.5mMKC1。使用MP-285顯微操縱器(SutterInstruments)放置移液管，使其與GnRH神經(jīng)元相接觸。封接電阻范圍從8MQ開始并且在記錄期間保持穩(wěn)定或增加達(dá)到高達(dá)50MQ。使用EPC-8放大器(HEKA)獲得電流追蹤記錄，并用在G4Macintosh計(jì)算機(jī)(AppleComputer)上的IgorPro軟件(ffavemetrics)運(yùn)行的脈沖ControlX0P軟件(Instrutech)獲得數(shù)據(jù)。使用電壓鉗模式進(jìn)行記錄，其中吸管的鉗制電位(holdingpotential)為OmV，在10kHz進(jìn)行過濾，并使用ITC-18獲得界面(ITC-18acquisitioninterface,Instrutech)進(jìn)行數(shù)字化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過孵育池應(yīng)用人親吻肽-10，lnM(PhoenixPharmaceuticals)。使用不同劑量(InM,10nM,100nM)的肽234來檢測它對(duì)親吻肽-10活化的gpr-54的拮抗作用。對(duì)于陽性對(duì)照細(xì)胞，記錄10-min的穩(wěn)定基線，然后用親吻肽-10處理5min，接著沖洗15-min。對(duì)于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，記錄在NS中的5-min穩(wěn)定基線，接著在肽234(1，10或100nM)中記錄lOmin，然后在親吻肽-10和相同劑量的拮抗劑中記錄5min，接著用NS清洗。用含有拮抗劑的溶液清洗產(chǎn)生相似結(jié)果(InM肽234，n=5個(gè)細(xì)胞，未顯示)。在lOnM肽234組中的一個(gè)細(xì)胞顯示沒有活性；加入15mMKC1以確定細(xì)胞的生存能力和記錄完整性。數(shù)據(jù)分析使用為IgorPro編寫的程序，以1-min的間隔計(jì)數(shù)和儲(chǔ)存細(xì)胞外記錄的事件，由此確定GnRH神經(jīng)元放電頻率的變化。使用微軟Excel(MicrosoftCorp)分析儲(chǔ)存的事件數(shù)據(jù)，從而分析在親吻肽-10處理之前(基線，注意在拮抗劑治療組中，這是在肽234處理細(xì)胞期間)、親吻肽-10應(yīng)用(處理)期間和洗脫期間的平均放電頻率。對(duì)于拮抗劑處理組的細(xì)胞，還比較了在親吻肽-10應(yīng)用之前在NS中與在拮抗劑中的放電頻率。通過由檢測到的事件總數(shù)除以在每個(gè)條件下的記錄期間確定平均放電頻率；藥物變化之后略過兩分鐘以排除過渡期。由于GnRH神經(jīng)元放電活動(dòng)隨時(shí)間變化(44，45)，計(jì)算各治療組的倍數(shù)變化。先后使用AN0VA和Bonferroni事后比較檢驗(yàn)(Bonferroniposthoctest)對(duì)所述組進(jìn)行比較。肽234對(duì)雌性恒河猴GnRH釋放的影響動(dòng)物本研究中使用生長并喂養(yǎng)于威斯康星國家靈長類研究中心(WisconsinNationalPrimateResearch)的四只雌性恒河猴。動(dòng)物成對(duì)地喂養(yǎng)(籠172X86X86cm)于12h光照和12h黑暗，并且控制溫度(22°C)的房間。每日用Harlan20%蛋白質(zhì)靈長動(dòng)物飲食(ProteinPrimateDiet)的標(biāo)準(zhǔn)飲食飼喂動(dòng)物兩次，每周補(bǔ)充幾次新鮮水果。隨意飲水。本研究的協(xié)議經(jīng)威斯康星大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷和應(yīng)用委員會(huì)(AnimalCareandUseCommittee,UniversityofWisconsin)審閱和批準(zhǔn)，并且在NIH和USDA制定的準(zhǔn)則下進(jìn)行全部實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用微透析法檢測肽234對(duì)GnRH釋放的影響。如前所述(25)，(24)，這種方法允許在肽234通過半透膜輸注時(shí)，收集用于GnRH測量的透析液樣品。通過微透析探針將溶解于CNS輸注液的肽234輸注入柄中間隆起區(qū)域，輸注30min同時(shí)連續(xù)收集透析液。對(duì)于對(duì)照，類似地輸注載體。在同一實(shí)驗(yàn)中，對(duì)每只動(dòng)物按隨機(jī)順序檢測肽234(10nM濃度)或載體，在兩次測試之間最小間隔為2小時(shí)。四只動(dòng)物中的兩只在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中檢測兩次，總計(jì)6次實(shí)驗(yàn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，猴子置于同伴猴附近，持續(xù)供給食物和水，并經(jīng)常提供水果、谷物、葡萄干和其他小吃。樣本的平均年齡為33.1士0.4個(gè)月。盧頁基架(cranialpedestal)植入如前所述(24)，為了收集柄-中間隆起區(qū)域中的輸注液，我們使用微透析法。實(shí)驗(yàn)之前，讓年齡為29.1士1.2個(gè)月的猴子(體重3.6士0.lkg)充分適應(yīng)靈長動(dòng)物椅子、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和研究者。使用類似于之前所述推挽式灌流法中的方法(46)，在異氟醚麻醉下向所述動(dòng)物植入顱基架。在實(shí)驗(yàn)之前，允許動(dòng)物恢復(fù)至少1個(gè)月。微透析法實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將猴子在氯胺酮(ketamine，15mg/kgb.w.)和美托咪啶(medetomidine，0.03-0.05mg/kgb.w.)麻醉下置于立體定位儀中。定制的導(dǎo)向套管(CMA12)由不銹鋼軸(長76.0mm，外徑(o.d.)0.91mm)和從導(dǎo)向套管末端伸出20mm的可移動(dòng)不銹鋼通管針(長96.0mm，外徑(o.d.)0.6mm)組成。用液壓微驅(qū)動(dòng)裝置(M095-B)將其插入至顱骨S-ME上方5mm處。該微驅(qū)動(dòng)裝置可以精確地調(diào)整末端的三維位置。使用腦室造影術(shù)計(jì)算S-ME的x、y和z坐標(biāo)，并且在顱基架植入手術(shù)期間得到最終的射線照片。用射線拍照成像確認(rèn)套管放置。在放置導(dǎo)向套管后，將猴子從立體定位儀移走，并置于靈長動(dòng)物椅子中。如前所述(25)，(24)，當(dāng)恰當(dāng)?shù)姆胖糜谝巫又袝r(shí)，將內(nèi)部的通管針從導(dǎo)向套管移出，并將配置有膜(長5mm，外徑0.5mm)的定制微透析探針(不銹鋼軸，長96.0mm,外徑0.6mm)通過導(dǎo)向套管插入至S-ME。為逆轉(zhuǎn)美托咪啶的作用，向動(dòng)物注射(i.v.)阿替美唑(atipamazole，0.15-0.25mg/kg)。在探針插入之后lh內(nèi)，動(dòng)物完全清醒。用裝配1或2.5mlHamilton氣密注射器(Reno)的CMA/102微透析泵以2u1/min的速度通過流入管道輸注加入桿菌肽(4U/ml)的CNS輸注液(購自CMA/Microdialysis)，所述CNS輸注液由NaCl147mM,KC12.7mM，CaCl2l.2mM，MgCl20.85mM組成。在冰上使用部分收集器(ModelFC203B)以lOmin的間隔將通過流出管道的輸注液連續(xù)收集至12X75mm硼硅酸鹽試管中，連續(xù)收集達(dá)12h。立即用干冰冷凍輸注液樣品，并貯存于-80°C。GnRHRIA41如前所述(46)，用Dr.TerryNett(科羅拉多州立大學(xué)，ColoradoStateUniversity)饋贈(zèng)的抗血清R42進(jìn)行RIA。試驗(yàn)靈敏度為0.02pg/管，并且組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為8.和11.3%。數(shù)據(jù)分析如前所述(47)，使用PULSAR算法確定GnRH釋放峰。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)中在肽234(或載體)測試之前和之后30min時(shí)間內(nèi)收集的GnRH的平均值。接著，計(jì)算全部實(shí)驗(yàn)中各時(shí)間段期間的平均值(士sem)，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。先后使用雙因素方差分析和Tukey多重比較法檢驗(yàn)分析處理之前、期間和之后(治療之內(nèi))，以及治療(肽234vs.載體)之間的差異。P<0.05被認(rèn)為是差異顯著。肽234抑制雄性大鼠LH的動(dòng)力學(xué)研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用飼養(yǎng)于科爾多瓦大學(xué)(UniversityofCordoba)動(dòng)物園的成年雄性大鼠(BW280-310g)。動(dòng)物飼養(yǎng)于光照(14h光照，從0700h開始)和溫度(22°C)恒定的條件下，并且在套管植入之前，以每籠四只大鼠為一組飼養(yǎng)，自由取食粒狀食物和自來水。實(shí)驗(yàn)步驟經(jīng)科爾多瓦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)道德委員會(huì)(C6rdobaUniversityEthicalCommitteeforanimalexperimentation)認(rèn)可，并且按照歐盟關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的關(guān)懷和應(yīng)用規(guī)范(EuropeanUnionnormativeforcareanduseofexperimentalanimals)進(jìn)行。動(dòng)物在輕度乙醚麻醉下植入icv套管，此后單只分籠飼養(yǎng)。為了將化合物遞送至側(cè)腦室，套管低于顱骨表面下方4mm深度；插入點(diǎn)為前因后部1mm和側(cè)向1.2mm。在植入套管至少24-48h之后進(jìn)行功能測試。完整雄性大鼠的藥理學(xué)測試包括以60min間隔注射(icv)含lnmol劑量的肽234的5yl注射物。最后一次注射時(shí)，同時(shí)注射有效劑量(但為亞最大量)的lOOpmol親吻肽-10(PhoenixPharmaceuticalsLtd)。用載體(生理鹽水)注射的動(dòng)物作為對(duì)照。在每次icv注射之后15-min和60-min，通過頸部靜脈穿刺采集血樣(250uL)。此外，在開始實(shí)驗(yàn)之前(時(shí)間0-min)和最后一次注射之后120-min(時(shí)間240-min)立即采集血樣?；谥暗难芯?16，34，48)選擇實(shí)驗(yàn)步驟和親吻肽劑量。對(duì)于各時(shí)間點(diǎn)，每組采集10-12份樣Pmo此外，還在睪丸切除(0RX)大鼠中進(jìn)行肽234的重復(fù)icv注射。通過陰囊途徑對(duì)動(dòng)物實(shí)施雙側(cè)0RX，并且在手術(shù)一周之后進(jìn)行如前所述的套管植入。測試包括三次腦內(nèi)注射拮抗劑(lnmol；在該方法中的0-min、60-min和120-min)，并且在基礎(chǔ)條件(0_min)和每次icv注射之后15-min通過頸部靜脈穿刺采集血樣。在中央施用肽234之后180-min和240-min采集額外的血樣。對(duì)于各時(shí)間點(diǎn)，每組采集10-12份樣品。激素測量使用雙抗法和NIH(Dr.AFParlow,NIDDK)提供的放射性免疫測定試劑盒測量50ill體積中的血清LH水平。參照制造商(Pierce)的說明書，使用Iodo-Gen涂層試管用1251標(biāo)記大鼠LH-I-10，并且使用參照制劑LH-RP-3作為標(biāo)準(zhǔn)表示激素濃度。試驗(yàn)組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別低于8%和10%。試驗(yàn)的靈敏度為5pg/管。此外，對(duì)在共施用kp-10和肽234之后60-min(時(shí)間180-min)采集的血樣選擇性地進(jìn)行血清睪丸酮(T)測量。為此，參照制造商的說明書，使用購自MPBiomedicals的商業(yè)試劑盒。試驗(yàn)的靈敏度為0.lng/管，42且試驗(yàn)組內(nèi)變異系數(shù)為4.5%。對(duì)于各激素，全部樣品都在相同試驗(yàn)中測量。通過評(píng)定大鼠血清樣品已知激素濃度作為外部對(duì)照，證實(shí)激素確定的準(zhǔn)確度。數(shù)據(jù)分析進(jìn)行激素測定，一式兩份，每組最少總計(jì)10份樣品。適當(dāng)時(shí)，除單獨(dú)的時(shí)間點(diǎn)測量外，按照梯形法則計(jì)算作為曲線下面積(AUC)的累積LH分泌反應(yīng)。激素?cái)?shù)據(jù)表示為平均值士SEM。先后使用學(xué)生t-檢驗(yàn)或AN0VA和Student-Newman-Keuls多重范圍檢驗(yàn)(SigmaStat2.0)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異分析。P<0.05被認(rèn)為是顯著。肽234對(duì)卵巢切除母羊LH的影響實(shí)驗(yàn)過程全部實(shí)驗(yàn)步驟都在莫納什學(xué)院生物醫(yī)學(xué)動(dòng)物道德委員會(huì)(MonashSchoolofBiomedicalSciencesAnimalEthicsCommittee)認(rèn)可的協(xié)議下進(jìn)行。在自然光照下飼養(yǎng)成年考力代母羊，并在任何實(shí)驗(yàn)操作前至少一個(gè)月對(duì)其進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除(0VX)。隨后按照如前所述的外科手術(shù)步驟(49)植入永久存在于第三腦室(3V)的套管。3V外科手術(shù)之后大約2周，向一支頸外靜脈插入套管以采集血樣，并將動(dòng)物飼養(yǎng)于單獨(dú)的圈內(nèi)；套管用肝素化鹽水保持通暢。母羊被分配成兩個(gè)治療組(4/組)；肽234(用人工腦脊液稀釋，aCSF；150mMNaCl、l.2mMCaCl2、lmMMgCl2、2.8mMKC1)或?qū)φ?僅有aCSF)。第二天，將輸注管道連接至3V套管，在07.OOh開始采集血樣。每隔10分鐘收集樣品。取樣3h之后，在lh內(nèi)以40yg/h的劑量將肽234(或?qū)φ?輸注至3V，初始劑量為10ug。肽234和載體都用GrasebyMS16A輸注泵(SmithMedicalAustralasiaPty.Ltd.)以200ii1/h的速度輸注。輸注之后，3V管道保持于原位，并繼續(xù)進(jìn)一步采集血樣2h(總計(jì)6h)。立即從樣品收集血漿，并在試驗(yàn)前冷凍于-20°C。測量血漿LH濃度，一式兩份，使用NIH-OLH-S18作為標(biāo)準(zhǔn)(49)。試驗(yàn)的靈敏度為0.lng/ml，并且試驗(yàn)組間變異系數(shù)在0.3-12.8ng/ml范圍之內(nèi)小于10%。血漿LH數(shù)據(jù)的脈沖分析如前所述(36)。使用標(biāo)準(zhǔn)NIDDK-oGH-I-4和NIDDK-抗_oGH_2抗血清化驗(yàn)血漿樣品GH(50)，一式兩份。試驗(yàn)的靈敏度為lng/ml，試驗(yàn)組間CV在4-51ng/ml之間小于10%，并且試驗(yàn)組內(nèi)CV為20%。測量血漿催乳素濃度，一式兩份，使用Sigma，Lot114F-0558，N0L-7135作為標(biāo)準(zhǔn)(50)。試驗(yàn)的靈敏度為lng/ml。試驗(yàn)組間CV在l-22ng/ml之間小于10%。使用抗血清no.3368(BioquestLtd)和1251_標(biāo)記皮質(zhì)醇(AmershamPharmaciaBiotechLtd)化驗(yàn)血漿皮質(zhì)醇濃度，一式兩份。試驗(yàn)的靈敏度為3ng/ml。試驗(yàn)組間CV在3-18ng/ml之間小于10%，并且試驗(yàn)組內(nèi)CV為15%。數(shù)據(jù)分析對(duì)于LH、GH、催乳素和皮質(zhì)醇的數(shù)據(jù)分析，計(jì)算輸注之前(O-lSOmin)、期間(180-240min)和之后(240-360min)的時(shí)間段內(nèi)各母羊的平均血漿值。此外，還計(jì)算注射之前、期間和之后各母羊的平均LH脈沖幅度。使用重復(fù)測量AN0VA來確定各時(shí)間段內(nèi)肽234處理對(duì)激素水平的影響，利用適當(dāng)?shù)膯我蛩谹N0VA評(píng)估各時(shí)間段內(nèi)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)施例3-示例性藥物制劑盡管本發(fā)明的分子可以單獨(dú)施用，但是更優(yōu)選與一種或更多種可接受的載體一起作為藥物制劑提供。載體必須是“可接受的”，意指其與本發(fā)明的活性劑相容并且對(duì)其接受者沒有危害。通常，載體為無菌和無熱源的水或鹽水。以下實(shí)例舉例說明了本發(fā)明的藥物和藥物組合物，其中所述活性成分為本發(fā)明的分子。優(yōu)選以10iig至500mg的量提供本發(fā)明的分子。應(yīng)理解，可以制備含有10yg至500mg量的本發(fā)明分子的以下示例性藥物和藥物組合物。例如，本發(fā)明的活性劑的存在量可以為以下示例性藥物和藥物組合物中所示量的1/10或1/100或1/200或1/500，同時(shí)相應(yīng)地改變其余成分的量。實(shí)例A片劑活性成分lmg乳糖200mg淀粉50mg聚乙烯吡咯烷酮5mg硬脂酸鎂4mg片劑通過以下方法制備用以上成分通過濕法制粒，隨后壓制。實(shí)例B眼用溶液活性成分lmg氯化鈉，分析級(jí)0.9g硫柳汞0.OOlg加純水至100mlpH調(diào)節(jié)至7.5實(shí)例C:片劑制劑以下制劑A和B通過以下方法制備將所述成分和聚維酮溶液通過濕法制粒，接著加入硬脂酸鎂并壓制。制劑Aml片mgZ片(a)活性成分i1(b)乳糖B.P.21026(c)聚維酮B.P.159(d)羥基乙酸淀粉鈉2012(e)硬脂酸鎂53-25151制劑Bml片m/片(a)活性成分ii(b)乳糖150-(c)AvicelPH101(d)聚維酮B.P.159(d)羥基乙酸淀粉鈉2012(e)硬脂酸鎂制劑C活性成分乳糖淀粉聚維酮硬脂酸鎂251mgZ片120050551260以下制劑D和E通過直接壓制混合成分制備。制劑E中使用的乳糖為直接壓制型。制劑Dmg/膠囊活性成分1預(yù)膠化淀粉NF15150制劑E活性成分乳糖Avicel151ml膠囊1150100251制劑F(控釋制劑)所述制劑制備方法如下將(以下)成分和聚維酮溶液通過濕法制粒，接著加入硬鎂并壓制。m/片(a)活性成分1(b)羥丙基甲基纖維素112(MethocelK4MPremium)(g)(c)乳糖B.P.53(d)聚維酮B.P.C.28(e)硬脂酸鎂7201藥物釋放發(fā)生在大約6-8小時(shí)期間，并在12小時(shí)之后完成。實(shí)例D膠囊制劑制劑A膠囊制劑通過以下方法制備混合以上實(shí)施例C中制劑D的成分，裝入由兩部分組成的硬明膠膠囊中。以類似的方法制備(以下)制劑B。制劑Bmg/膠囊(a)活性成分1(b)乳糖B.P.143(c)羥基乙酸淀粉鈉25(d)硬脂酸鎂2-171制劑Cmg/膠囊(a)活性成分1(b)聚乙二醇4000BP350-351膠囊通過以下方法制備熔化聚乙二醇4000BP(Macrogol4000BP)，將活性成分分散于所述熔體中，并將所述熔體裝入由兩部分組成的硬明膠膠囊中。制劑Dmg/膠囊活性成分1卵磷脂100花生油100-201膠囊通過以下方法制備將活性成分分散于卵磷脂和花生油中，并將分散體裝入彈性明膠軟膠囊中。制劑E(控釋膠囊)以下控釋膠囊制劑通過以下方法制備使用擠壓機(jī)擠出成分a、b和c，接著滾圓擠出物并干燥。然后用控釋膜(d)包被干燥的丸粒，并裝入由兩部分組成的硬明膠膠囊中。mg/膠囊(a)活性成分1(b)微晶纖維素125(c)乳糖BP125(d)乙基纖維素13-26446實(shí)例E灃射型制劑活性成分加入無菌無熱源磷酸鹽緩沖液(pH7.0)至10ml將活性成分溶解于大部分磷酸鹽緩沖液中(35-40°C)，然后定容并通過無菌微孔過濾器過濾至無菌的10ml琥珀色玻璃小瓶(1型)中，用無菌蓋和頂部封條密閉。實(shí)例F肌內(nèi)灃射加入注射用水q.s.至3.00ml將活性成分溶解于四氫呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)中。然后加入苯甲醇并溶解，并加入水至3ml。然后通過無菌微孔過濾器過濾混合物，并密封于無菌3ml玻璃小瓶(1型)。實(shí)例G糖漿混懸劑活性成分lmg山梨糖醇溶液1.5000g甘油2.OOOOg可分散纖維素0.0750g苯甲酸鈉0.0050g調(diào)味劑，Peach17.42.31690.0125ml加入純水q.s.至5.0000ml將苯甲酸鈉溶解于部分純水中，并加入山梨糖醇溶液。加入活性成分并分散。在甘油中分散增稠劑(可分散纖維素)。混合兩種分散物并加純水定容至需要的體積。按需要通過額外剪切懸浮液實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步增稠。實(shí)例H栓劑mg/栓劑活性成分(63iim)*1固體脂肪BP(Wit印solH15-DynamitNobel)1770-1771*使用的活性成分為粉末，其中至少90%顆粒的粒徑為63i!m或更小。在最高45°C下將五分之一的Wit印solH15熔化于蒸汽夾套盤中。活性成分通過200um篩，在使用裝配有刀頭的silverson攪拌機(jī)混合下加入至熔化的基質(zhì)中，直至獲得均勻的分散體。混合物保持于45°C，將剩余的Wit印solH15加入至懸浮液中，并攪拌確?；旌暇鶆?。全部懸浮液通過250i!m不銹鋼絲網(wǎng)，并連續(xù)攪拌，并使其冷卻至40°C。在38°C至40°C的溫度下，將2.02g混合物裝入合適的塑料模具中。使栓劑冷卻至室溫。實(shí)例I陰道檢mg/陰道栓活性成分1活性成分苯甲醇Glycofurol75lmg0.10g1.45g47無水葡萄糖380馬鈴薯淀粉363硬脂酸鎂7-751通過以下方法制備直接混合以上成分并直接壓制所得到的混合物。本發(fā)明的活性劑還可以按照用于諾雷德(Zoladex)、亮脯利特(Leuprolide)、替維瑞克(Teverelix)、阿巴瑞克(Abarelix)、加尼瑞克(Ganarelix)、戈舍瑞林(Goserelin)等的方式進(jìn)行制備。實(shí)施例4-使用本發(fā)明的活性劑治療增殖性疾病對(duì)前列腺癌患者(該患者對(duì)抗雄激素治療沒有反應(yīng))每日肌內(nèi)施用本發(fā)明的活性劑lmg，或者根據(jù)本發(fā)明的方法遞送該劑量的長效制劑(cbpotpr印aration)。該拮抗劑降低雄激素。實(shí)施例5-使用本發(fā)明的活性劑治療增殖性疾病對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥或子宮肌瘤或乳癌患者每日肌內(nèi)注射施用本發(fā)明的活性劑lmg，或者根據(jù)本發(fā)明的方法遞送該劑量的長效制劑。實(shí)施例6-使用本發(fā)明的活性劑治療先兆子癇對(duì)先兆子癇患者每日肌內(nèi)注射施用本發(fā)明的活性劑lmg，或者根據(jù)本發(fā)明的方法遞送該劑量的長效制劑。參考文獻(xiàn)說明書中引用的編號(hào)的參考文獻(xiàn)1.West,A.，etal.，ChromosomelocalizationandgenomicstructureoftheKiSS-1metastasissuppressorgene(KISS1).Genomics,1998.54(1):p.145-8.2.Lee,D.K.，etal.，Discoveryofareceptorrelatedtothegalaninreceptors.FEBSLett,1999.446(1):p.103-7.3.Kotani,M.，etal.，ThemetastasissuppressorgeneKiSS-1encodeskisspeptins，thenaturalligandsoftheorphanGprotein-coupledreceptorGPR54.JBiolChem，2001.276(37):p.34631-6.4.Muir,A.I.，etal.，AX0R12，anovelhumanGprotein-coupledreceptor，activatedbythepeptideKiSS-1.JBiolChem,2001.276(31):p.28969-75.5.Stafford,L.J.,etal.,Ident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-末端氨基酸殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)z；并且其中所述肽序列不為Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F；(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F；(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F；(D)Y-(D)N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F；或(D)Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)W-R-F。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中選自由(D)F和(D)Y和(D)A組成的組中的D-氨基酸殘基。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的用途，其中XB為選自由(D)A和(D)N組成的組中的D-氨基酸殘基。16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)乂4或#中的一個(gè)為(D)Y時(shí)，另一個(gè)不為(D)N。17.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的用途，其中XB不都為D-氨基酸殘基。18.根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)?shù)V為(D)W時(shí)，(D)F。19.根據(jù)權(quán)利要求13至18中任一項(xiàng)所述的用途，其中Xe為選自由(D)A和(D)W組成的組中的D-氨基酸殘基。20.根據(jù)權(quán)利要求13至19中任一項(xiàng)所述的用途，其中XD為選自由(D)A和(D)W組成的組中的D-氨基酸殘基。21.根據(jù)權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)XD為S時(shí)，壙為(D)W和/或XA不為(D)Y。22.根據(jù)權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)XD為S時(shí)，XF為(D)W和/或?yàn)?D)A。23.根據(jù)權(quán)利要求13至22中任一項(xiàng)所述的用途，其中壙為選自由(D)L和(D)W組成的組中的D-氨基酸殘基。24.根據(jù)權(quán)利要求13至23中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)鏟和壙都為(D)W時(shí)，XA不為0>)Y。25.根據(jù)權(quán)利要求13至23中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)鏟和壙都為①”時(shí)，乂八為OOA。26.根據(jù)權(quán)利要求13至25中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述N-末端殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的用途，其中X1包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的用途，其中基團(tuán)y選自由以下基團(tuán)組成的組乙?；蝗阴；?；環(huán)化氨基酸；或在N-末端不帶電荷的合成氨基酸。29.根據(jù)權(quán)利要求13至28中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述肽分子的C-末端F殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)z。30.根據(jù)權(quán)利要求13至29中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述序列選自由以下序列組成的組a)Y-N-ff-N-G-F-G-L-R-F.z；b)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；c)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；d)Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-L-R-F.z；e)ac.Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；f)ac.Y-N-ff-N-(D)ff-F-G-(D)ff-R-F.z；g)ac.(D)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；h)ac.Y-N-(D)ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；i)ac.Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；j)ac.Y-N-ff-N-(D)A-F-G-(D)ff-R-F.z；k)ac.(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；l)ac.Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；m)ac.Y-(D)A-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；n)ac.(D)ff-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；o)ac.(D)F-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；p)ac.(D)Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；q)ac.(D)A-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；r)ac.(D)A-N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F.z；s)ac.(D)A-N-ff-N-G-F-G-ff-R-F.z；t)ac.(D)A-N-ff-N-(D)S-F-G-(D)ff-R-F.z；或u)ac.(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。31.根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥選自包含下述病癥的組增殖性疾?。蛔訉m內(nèi)膜異位癥；子宮肌瘤；性早熟；先兆子癇；胎兒宮內(nèi)生長遲緩(IUGR)；異位妊娠；月經(jīng)過多；高血壓；冠心??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、胰腺和/或免疫系統(tǒng)疾病；阻抑或抑制排卵；生育??；化療引起和/或放療引起的生殖組織損傷；阻抑或抑制創(chuàng)傷愈合；阻抑或抑制生長激素生成。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的用途，其中所述增殖性疾病選自包含下述病癥的組良性前列腺增生癥；癌癥；生殖組織的癌癥；婦科癌癥；前列腺癌；乳癌；卵巢癌；子宮癌；宮頸癌；子宮內(nèi)膜癌；黑色素瘤；胰腺癌；胃癌。33.如權(quán)利要求3至32中任一項(xiàng)所定義的肽分子，其中所述肽分子為親吻肽拮抗劑或者其片段或變體，該片段或變體為親吻肽拮抗劑。34.權(quán)利要求1或2中所定義的拮抗劑或權(quán)利要求3至33中任一項(xiàng)所定義的肽分子，其用于藥物中。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的肽分子，其中所述肽分子為親吻肽拮抗劑。36.包含以下序列的肽分子或者其片段或變體，所述序列為X'-G/ff-X'-R/(D)R-X3其中X1為F或A或任意D-氨基酸殘基；X2為L或A或任意D-氨基酸殘基；X3為F或W；且其中所述肽分子的C-末端氨基酸殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)z；并且其中所述肽序列不為F-G-L-R-F；F-G-L-R-W；F-G-(D)F-R-F；F-G-A-R-W；F-G-L-(D)R-W；F-G-(D)L-R-W；A-G-L-R-W；或(D)F-G-L-R-W。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的肽分子，其中X1為(D)F。38.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的肽分子，其中X2為選自由(D)F、(D)L和(D)W組成的組中的D-氨基酸殘基。39.根據(jù)權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中所述肽序列選自由以下序列組成的組(D)F-W-L-R-W；或F-G-(D)W-R-F。40.根據(jù)權(quán)利要求36至39中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中所述N-末端殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的肽分子，其中X1包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。42.根據(jù)權(quán)利要求40或41所述的肽分子，其中基團(tuán)y選自由以下基團(tuán)組成的組乙?；蝗阴；?；環(huán)化氨基酸；或在N-末端不帶電荷的合成氨基酸。43.根據(jù)權(quán)利要求36至42中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中X3包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)z。44.根據(jù)權(quán)利要求36至43中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中所述肽序列選自由以下序列組成的組I)ac.F-G-(D)F-R-ff.z；II)ac.F-G-(D)L-R-ff.z；III)ac.F-G-L-(D)R-ff.z；IV)ac.F-G-A-R-ff.z；V)ac.A-G-L-R-ff.z；VI)ac.(D)F-ff-L-R-ff.z；或VII)ac.F-G-(D)ff-R-F.z。45.包含以下序列的肽分子或者其片段或變體，所述序列為xa-xb-xc-n-xd-xe-g-xf-r-f其中或任意D-氨基酸殘基；XB為N或任意D-氨基酸殘基；或任意D-氨基酸殘基；XD為G或S或任意D-氨基酸殘基；XlF或_或(D)L；XF為W或L或任意D-氨基酸殘基；且其中所述肽分子的C-末端氨基酸殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)z；并且其中所述肽序列不為Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F；(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F；(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F；(D)Y-(D)N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F；或(D)Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)W-R-F。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的肽分子，其中選自由(D)F和(D)Y和(D)A組成的組中的D-氨基酸殘基。47.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的肽分子，其中XB為選自由(D)A和(D)N組成的組中的D-氨基酸殘基。48.根據(jù)權(quán)利要求45至47中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中當(dāng)乂4或#中的一個(gè)為(D)Y時(shí)，另一個(gè)不為_。49.根據(jù)權(quán)利要求45至48中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中t和XB不都為D-氨基酸殘基；50.根據(jù)權(quán)利要求45至49中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)?shù)V為(D)W時(shí)，(D)F。51.根據(jù)權(quán)利要求45至50中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中鏟為選自由(D)A和(D)W組成的組中的D-氨基酸殘基。52.根據(jù)權(quán)利要求45至51中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中XD為選自由(D)A和(D)W組成的組中的D-氨基酸殘基。53.根據(jù)權(quán)利要求45至52中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)XD為S時(shí)，壙為(D)W和/或XA不為(D)Y。54.根據(jù)權(quán)利要求45至52中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)XD為S時(shí)，壙為(D)W和/或?yàn)镺OA。55.根據(jù)權(quán)利要求45至54中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中壙為選自由(D)L和(D)W組成的組中的D-氨基酸殘基。56.根據(jù)權(quán)利要求45至55中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)鏟和壙都為(D)W時(shí)，XA不為0>)Y。57.根據(jù)權(quán)利要求45至55中任一項(xiàng)所述的用途，其中當(dāng)鏟和壙都為(⑴評(píng)時(shí)，乂八為OOA。58.根據(jù)權(quán)利要求45至57中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中所述N-末端殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的肽分子，其中X1包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)y。60.根據(jù)權(quán)利要求58或59所述的肽分子，其中基團(tuán)y選自由下述基團(tuán)組成的組乙?；?；三氟乙酰基；環(huán)化氨基酸；或在N-末端不帶電荷的合成氨基酸。61.根據(jù)權(quán)利要求58至60中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中所述肽分子的C-末端F殘基包含去除該殘基上的電荷的基團(tuán)z。62.根據(jù)權(quán)利要求58至61中任一項(xiàng)所述的肽分子，其中所述肽序列選自由以下序列組成的組a)Y-N-ff-N-G-F-G-L-R-F.z；b)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；c)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；d)Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-L-R-F.z；e)ac.Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；f)ac.Y-N-ff-N-(D)ff-F-G-(D)ff-R-F.z；g)ac.(D)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；h)ac.Y-N-(D)ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；i)ac.Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；j)ac.Y-N-ff-N-(D)A-F-G-(D)ff-R-F.z；k)ac.(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；l)ac.Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；m)ac.Y-(D)A-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；n)ac.(D)ff-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；o)ac.(D)F-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；p)ac.(D)Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；q)ac.(D)A-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z；r)ac.(D)A-N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F.z；s)ac.(D)A-N-ff-N-G-F-G-ff-R-F.z；t)ac.(D)A-N-ff-N-(D)S-F-G-(D)ff-R-F.z；或u)ac.(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。63.如權(quán)利要求3至62中任一項(xiàng)所定義的肽分子，其中z為NH2或N-丙酰胺或N-乙酰胺(NHEt)或N-甲酰胺或N-丁酰胺。64.如權(quán)利要求3至63中任一項(xiàng)所定義的肽分子，其中所述肽在N-末端還包含序列R-R-M-K-W-K-K-Y。65.如權(quán)利要求64所定義的肽分子，其中所述肽序列選自由以下序列組成的組R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z；或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z。66.一種藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1或2中所定義的拮抗劑或者權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的肽分子和藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑。67.一種治療個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用權(quán)利要求66所述的藥物組合物，或者有效量的權(quán)利要求1或2中所定義的親吻肽拮抗劑，或者有效量的權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的肽分子的步驟。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥選自由以下病癥組成的組增殖性疾??；子宮內(nèi)膜異位癥；子宮肌瘤；性早熟；先兆子癇；胎11宮內(nèi)生長遲緩(IUGR)；異位妊娠；月經(jīng)過多；高血壓；冠心?。恢袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)、胰腺和/或免疫系統(tǒng)疾病；阻抑或抑制排卵；生育?。换熞鸷?或放療引起的生殖組織損傷；阻抑或抑制創(chuàng)傷愈合；阻抑或抑制生長激素生成。69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述增殖性疾病選自由以下病癥組成的組良性前列腺增生癥；癌癥；生殖組織的癌癥；婦科癌癥；前列腺癌；乳癌；卵巢癌；子宮癌；宮頸癌；子宮內(nèi)膜癌；黑色素瘤；胰腺癌；胃癌。70.一種鑒定親吻肽拮抗劑的方法，所述方法包括以下步驟i)提供待測試的化合物；ii)確定(i)中的化合物結(jié)合親吻肽受體的能力；iii)確定(i)中的化合物拮抗細(xì)胞中親吻肽介導(dǎo)的刺激肌醇磷酸生成的能力；和iv)在所述化合物能夠結(jié)合親吻肽受體并能夠拮抗細(xì)胞中親吻肽介導(dǎo)的刺激肌醇磷酸生成的情況下，將該化合物鑒定為親吻肽拮抗劑。71.基本如本文描述的拮抗劑或肽分子或藥物組合物。72.基本如本文描述的用途或方法。全文摘要本發(fā)明涉及親吻肽拮抗劑在制備用于治療個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了某些定義的肽分子，其可以作為親吻肽拮抗劑，用于治療個(gè)體中由親吻肽活性引起和/或使惡化的病癥。此外，本發(fā)明提供鑒定和/或使用親吻肽拮抗劑和/或所述定義的肽及其藥物組合物的方法。文檔編號(hào)C07K14/72GK101861160SQ200880116666公開日2010年10月13日申請(qǐng)日期2008年10月8日優(yōu)先權(quán)日2007年10月8日發(fā)明者安東尼婭·凱瑟琳·羅思韋爾,羅伯特·彼得·米勒申請(qǐng)人:醫(yī)藥研究委員會(huì)