專利名稱：垂枝樺花粉主要變應(yīng)原的低變應(yīng)原性變體的制作方法
垂枝樺花粉主要變應(yīng)原的低變應(yīng)原性變體本發(fā)明提供Bet v 2蛋白質(zhì)的低變應(yīng)原性序列變體、編碼其的核酸分子、包含其的 藥物組合物以及它們?cè)陬A(yù)防和治療由來自垂枝樺(Betulaverrucosa)物種的植物花粉導(dǎo) 致的變應(yīng)性疾病中的用途。
背景技術(shù)：
變態(tài)反應(yīng)由免疫系統(tǒng)功能異常導(dǎo)致，所述免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生IgE-類抗體與花粉、 螨、上皮和某些食物中含有的無(wú)害蛋白質(zhì)反應(yīng)。最近的數(shù)據(jù)表明西方國(guó)家中超過10%的人口患有該疾病，其癥狀可隨時(shí)間惡化， 導(dǎo)致例如哮喘或?qū)ζ渌儜?yīng)原致敏，由此造成選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǜ永щy。與藥理學(xué)療法不同，特定的脫敏免疫療法(SIT)是變應(yīng)性疾病的唯一病原療法， 能夠順利地改變這類疾病的特征性免疫參數(shù)。脫敏免疫療法包括施用增加劑量的獲自導(dǎo)致疾病的物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)提取物(疫苗) (1)。這樣，患者對(duì)該物質(zhì)的一類免疫耐受逐步降低，隨后變應(yīng)性癥狀消失。但是，事實(shí)上引起嚴(yán)重副作用的風(fēng)險(xiǎn)(2)限制特定脫敏免疫療法在治療變應(yīng)性疾 病中的應(yīng)用，雖然使用緩釋疫苗或使用非注射途徑施用的疫苗使該風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。近年來大部分注意力已集中在開發(fā)有效、安全的疫苗上，尤其是包含誘變處理的 重組蛋白(即能夠有利地影響疾病的自然進(jìn)程而不導(dǎo)致不希望的副作用的低變應(yīng)原性變 體)的疫苗⑶。如果IgG抗體對(duì)于致敏變應(yīng)原是特異性的，則SIT的有利因素之一是誘導(dǎo)。這類 (保護(hù))抗體能夠抑制抗原-IgE結(jié)合，特別是抑制IgE與Bet v 2抗原結(jié)合，改變?cè)摲肿拥?三維構(gòu)像(4，5)。包含具有未改變免疫原性的低變應(yīng)原性重組蛋白的疫苗的開發(fā)將改善變 應(yīng)性疾病的治療。分類學(xué)上稱為山毛櫸目(Fagales)的植物(樺樹、榿木、榛樹、橡樹、角樹)的花 粉是溫帶地區(qū)導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎和哮喘的最主要原因之一。樺樹花粉的兩種主要變應(yīng)原， Bet v 1(以登錄號(hào)X15877保存在GenBank的cDNA)和Bet v 2 (登錄號(hào)M65179)，是分子 量分別為17和14kD的蛋白質(zhì)(6，7)。Bet v2屬于抑制蛋白家族，其是涉及調(diào)節(jié)真核細(xì)胞 細(xì)胞骨架的遍在胞質(zhì)蛋白質(zhì)。它們與至少兩種細(xì)胞(大)分子相互作用，該至少兩種細(xì)胞 (大)分子即磷脂酰肌醇_4，5-二磷酸，從而阻止C-Y磷脂酶(phospholypase)對(duì)該脂肪 酸的水解(8)，和肌動(dòng)蛋白，調(diào)控其的聚合作用(9)。抑制蛋白在成熟和萌發(fā)的花粉中的高 表達(dá)暗示它們參與調(diào)節(jié)微絲前體，該微絲前體參與萌發(fā)過程(10)。抑制蛋白被認(rèn)為是來 自多種喬木和草本植物的花粉中的變應(yīng)原，和多種水果和蔬菜中的變應(yīng)原，因此拋開抑制 蛋白僅在20%對(duì)花粉變應(yīng)性的(過敏的)患者中發(fā)現(xiàn)的事實(shí)，它們被定義為“泛-變應(yīng)原 (pan-allergens)，，(11，12) 0在大部分多種來源的植物抑制蛋白中的高序列同源性(高于60%)導(dǎo)致交叉 致敏，不僅在來自相關(guān)植物(13)和不相關(guān)植物(14)的花粉之間，還在花粉和植物食品 (aliment, 15)之間，或在花粉和橡膠(latex)之間(16)。植物抑制蛋白和哺乳動(dòng)物抑制蛋白之間的同源性較低，盡管證明了它們能夠結(jié)合來自不同物種的肌動(dòng)蛋白且顯示出可交換 性(17，18，19)。解釋是所有的抑制蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，如使用X-射線晶體學(xué)所示的 (20,21,22)。許多研究證實(shí)抑制蛋白的免疫等同物。事實(shí)上，已顯示來自對(duì)確定的花粉致敏的 患者的IgE能夠結(jié)合不同來源的抑制蛋白，結(jié)合抑制蛋白的IgE可以相互抑制(16)。不同花粉之間的高交叉反應(yīng)性使得單獨(dú)的抑制蛋白可用于變應(yīng)反應(yīng)診斷，重組 Bet v 2通常用作選擇抑制蛋白特異性IgE測(cè)定的變應(yīng)原(23，24)。存在多種測(cè)定抑制蛋白IgE表位的研究。根據(jù)同時(shí)期相同小組進(jìn)行的下述研究(26)，Vrtala(1996)在Phe44和Gln47誘變 Bet v 2，將它們變成Tyr44、Glu47和Asn47，所述研究中鑒定了單克隆抗體4A6識(shí)別的線性 表位。使用合成的十二肽(跨越Bet v2的整個(gè)氨基酸序列)對(duì)該抗體識(shí)別的表位作圖。更有 效結(jié)合該抗體的多肽含有氨基酸38-49和40-51之間的區(qū)域。IgG-肽結(jié)合中Gln47殘基的 重要性由下述證據(jù)證明4A6不能夠識(shí)別來自煙草(Nicotiana tabacum)和梯牧草(Phleum pratense)的抑制蛋白，其序列顯示谷氨酸位于Bet v 2的Gln47。與Gln47 — Glu47突變 不同，從Phe44到Tyr44的改變或從GIn47到Asn47的改變不影響抗體的結(jié)合。如免疫印記 和ELISA試驗(yàn)(25)所示，對(duì)重組Bet v 2應(yīng)用相同的誘變(Gln47到Glu，或Asn和Phe44 到Tyr44)不能夠降低抑制蛋白和IgE之間的結(jié)合。在1997年公開的隨后的研究(22)中，通過克隆樺樹抑制蛋白cDNA的隨機(jī)片段鑒 定了主要的IgE表位，該cDNA來自用對(duì)抑制蛋白變應(yīng)性的患者血清分析的表達(dá)文庫(kù)。證明 三個(gè)區(qū)域更有反應(yīng)性，即對(duì)應(yīng)于位于氨基端的a螺旋(aa 1-30)的區(qū)域。羧基端的a螺 旋(aa 106-132)的區(qū)域，以及包含殘基30_50的片段的區(qū)域。在隨后的研究(23)中，對(duì)IgE表位的研究基于來自不同植物的抑制蛋白的理論結(jié) 構(gòu)模型與樺樹或橡膠抑制蛋白晶體之間的比較。預(yù)測(cè)了 11個(gè)可能的構(gòu)象表位(包含相鄰 的氨基酸區(qū)域)，其中至少20%是暴露于表面的。氨基酸序列和構(gòu)象模型的比較得到兩類 表位物種特異性表位(由高變異性表征)和高度保守表位，后者更可能涉及不同植物抑 制蛋白之間的交叉反應(yīng)。氨基酸序列比對(duì)反映Fedorov研究(22)的結(jié)果，證明在抑制蛋白 N-端具有兩個(gè)可能的線性表位，在殘基30-80之間有三個(gè)可能的線性表位，且其余兩個(gè)在 抑制蛋白C-端。所有這些區(qū)域在該研究中所評(píng)測(cè)的植物抑制蛋白中均是高度保守的?？?能的構(gòu)象表位的預(yù)測(cè)基于橡膠抑制蛋白Hev b8的3D模型的分析。該分析證明了選自表位 中心的12個(gè)突出的殘基。雖然所有可能的表位均是構(gòu)想性的，它們包含線性序列以及保守 或可變的殘基。在該研究中沒有報(bào)導(dǎo)證實(shí)所研究的表位的特異性IgE-結(jié)合能力的測(cè)試。更為近期的出版物涉及甜瓜(Cucumis melo)抑制蛋白IgE表位的鑒定(27)。通 過測(cè)定跨越該蛋白質(zhì)的整個(gè)氨基酸序列的肽的IgE反應(yīng)性，鑒定了兩個(gè)線性表位，其中E1 被對(duì)甜瓜變應(yīng)性的患者血清強(qiáng)烈識(shí)別，包含殘基66-75和81-93，E2由氨基酸95-99和 122-131組成。另外兩個(gè)表位被較弱的IgE應(yīng)答表征，即E3(殘基2-10)和E4(35-45)。對(duì) 應(yīng)甜瓜抑制蛋白3D模型的表位E1和E2的肽的重疊表示具有良好定義的靜電性質(zhì)的兩個(gè) 區(qū)域E1和E2，其分別和正電性和負(fù)電性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相關(guān)。來自文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)表示IgE抑制蛋白表位位于其中的分子部分，但是未指出涉及 IgE結(jié)合的氨基酸。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過取代或缺失Bet v 2變應(yīng)原序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基使得該 變應(yīng)原對(duì)IgE抗體的反應(yīng)性降低。第一方面，本發(fā)明提供低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，其是Bet v 2變應(yīng)原的序列變體，且其 特征在于1)與野生型Bet v 2變應(yīng)原(SEQ ID NO 1)相比，對(duì)IgE的反應(yīng)性降低；2)氨基酸序列為a)與SEQ ID NO :1至少90%相同，優(yōu)選至少93%相同，進(jìn)一步優(yōu)先至少97%相 同；b)與 SEQ ID NO 1 的序列比對(duì)表明 SEQ ID NO :1 在對(duì)應(yīng)于(matching) Ser39>Lys 45> Lys88或Lys89的Ser或Lys殘基處具有至少一個(gè)取代或缺失。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Bet v 2變應(yīng)原的變體在所示位置具有1_3個(gè)中 的多個(gè)取代或缺失，其中產(chǎn)生單、雙或三取代和/或缺失變體。雖然可以在Bet v 2分子中 同時(shí)存在不同氨基酸殘基的取代和缺失，優(yōu)選在指示位點(diǎn)通過一個(gè)或多個(gè)殘基的單取代獲 得變體，特別是此類殘基被中性、極性或酸性氨基酸置換的變體，所述中性、極性或酸性氨 基酸選自 Ala、Thr、Gly、Pro、Leu、lie、Ser、Phe、Glu、Asp，更優(yōu)選選自 Ala、Thr、Ser、Gly、 Glu、Asp。本發(fā)明變體的實(shí)例示于SEQ ID NO 2 (1個(gè)殘基取代)、SEQ ID NO 3 (1個(gè)殘基取 代)、SEQ ID NO 4 (2個(gè)殘基取代)、SEQ ID NO 5 (3個(gè)殘基取代)和SEQ ID NO 6 (3個(gè)殘 基取代)。相對(duì)于野生型對(duì)應(yīng)物(counterpart)，本發(fā)明的Bet v 2變應(yīng)原取代和/或缺失 變體表現(xiàn)出與垂枝樺花粉-變應(yīng)性患者血清的IgE的反應(yīng)性，其降低至少10%，優(yōu)選至少 50%，更優(yōu)選至少90%，其中IgE反應(yīng)性通過例如ELISA測(cè)定的方法檢測(cè)。來自變應(yīng)性患者血清庫(kù)的蛋白質(zhì)SEQ ID NO :2_6的IgE反應(yīng)性由ELISA測(cè)定檢 測(cè)(圖 1)。相對(duì)于野生型 Bet v 2 變應(yīng)原(SEQ ID NO :1)，當(dāng)(SEQID NO :2)、(SEQ ID NO 3)、(SEQ ID NO 4)和(SEQ ID NO :5和6)蛋白質(zhì)與來自樺樹花粉變應(yīng)性患者的血清庫(kù)孵 育時(shí)，觀察到 IgE 反應(yīng)性平均降低 92% (SEQ IDN0 2),13% (SEQ ID NO 3),97% (SEQ ID NO 4)禾口 93% (SEQ ID NO 5 禾口 6)。這些結(jié)果由REAST抑制試驗(yàn)證實(shí)，該試驗(yàn)可以評(píng)測(cè)來自不同蛋白質(zhì)的同源表位的 反應(yīng)性。在存在1.45ng抑制物時(shí)，當(dāng)血清用相同的蛋白質(zhì)預(yù)處理過，野生型Bet v 2 (SEQ ID NO 1)與來自變應(yīng)性患者血清庫(kù)的IgE的結(jié)合82. 6%抑制，當(dāng)血清用變體SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO 3預(yù)溫育時(shí)，分別是40. 4%和71 %抑制，而當(dāng)血清分別用相同量的雙取代變 體(SEQ IDN0 4)和三取代變體(SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 6)預(yù)溫育時(shí)，觀察到的抑制 僅為 13. 4%、4%和 8. 8% (圖 2)。這些結(jié)果明確表明SEQ ID NO :1第39、45、88、89位的氨基酸參與IgE對(duì)Bet v 2 變應(yīng)原的識(shí)別。另外，Balb/c小鼠免疫接種試驗(yàn)證明野生型Bet v 2變應(yīng)原和低變應(yīng)原性蛋白質(zhì) SEQ ID N0:5(選自作為示例性突變變應(yīng)原)均能誘導(dǎo)IgG-特異性免疫應(yīng)答(圖3)?？筍EQID NO 5抗體能夠識(shí)別野生型-對(duì)應(yīng)物SEQ IDN0 :1 (圖4)，證明第45、88、89位Lys-殘基 的取代并不導(dǎo)致分子免疫原性的重大改變，且改變其IgG表位。相反，不相關(guān)抗原免疫的小 鼠血清中存在的抗體不能夠識(shí)別野生型Bet v 2和SEQ ID NO :5。另一方面，本發(fā)明提供Bet v 2片段相應(yīng)的免疫活性肽，所述免疫活性肽包含至少 一種上述取代和/或缺失。所述肽優(yōu)選含有15-35個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選15-20個(gè)氨基酸 殘基。本文所用術(shù)語(yǔ)“免疫活性肽”意指能夠引發(fā)不依賴IgE的免疫應(yīng)答的肽。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和技術(shù)，通過誘變野生型Bet v 2cDNA序列(SEQ ID N0:7)可容易地制備本發(fā)明的取代和/或缺失變體。編碼SEQ ID NO :2_6所示的單、雙和三取代變體的cDNA序列報(bào)告于SEQ ID NO: 8-12。另一方面，本發(fā)明提供編碼本文公開的低變應(yīng)原性Bet v 2變體的核酸分子、衍生 自其的肽、包含該分子的表達(dá)載體，其中所述分子與真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中控制其表達(dá)的 遺傳元件(例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、信號(hào)及前導(dǎo)序列，或轉(zhuǎn)錄調(diào)控中涉及的其他序列)功 能性連接。載體的例子包括質(zhì)粒、病毒和噬菌體，然而遺傳工程中通常使用的任何其他載體 也可以使用。本發(fā)明還包含用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞。原核細(xì)胞例如大 腸桿菌(Escherichia coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)，或真核細(xì)胞例如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)通常用作克隆或cDNA表達(dá)載體。另外，本發(fā)明的低變應(yīng)原性變體可作為融合蛋白制備。由于它們降低的IgE反應(yīng)性，本發(fā)明的Bet v 2變體可方便地用于制備藥物組合 物(例如片劑)，所述藥物組合物用于預(yù)防或治療垂枝樺花粉的變應(yīng)性個(gè)體。因此本發(fā)明的另一方面在于藥物組合物，其包含有效量的本文提供的低變應(yīng)原性 Bet v 2變體，該變體任選和垂枝樺的其他變應(yīng)原，和/或藥學(xué)可接受載體和賦形劑組合。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物以疫苗形式用于預(yù)防或治療包括支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎、 變應(yīng)性皮炎和變應(yīng)性結(jié)膜炎的變應(yīng)性疾病。免疫接種的理論和操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的(28，29)。下列實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。除非另行指出，實(shí)施例中所用方法描述于 Sambrook, Fritsch ET Maniatis "Molecular cloning. A laboratorymanual，，第二版，第 1-2-3 卷，CSH Lab 出版，1989。附圖簡(jiǎn)述

圖1 :ELISA分析IgE與Bet v 2變應(yīng)原和Bet v 2低變應(yīng)原性變體的反應(yīng)性；圖2 :IgE與Betv 2變應(yīng)原結(jié)合的抑制；圖3 突變IgE與各免疫原性蛋白質(zhì)的應(yīng)答；圖4 :SEQ ID NO 5免疫的小鼠中的IgG應(yīng)答。實(shí)施例1-Bet v 2變應(yīng)原編碼cDNA的位點(diǎn)特異性誘變Bet v 2變應(yīng)原編碼cDNA (SEQ ID NO 7)的位點(diǎn)特異性誘變通過原核載體 (pBluescript，GenBank登錄號(hào)X52327)中的cDNA克隆，然后是PCR擴(kuò)增進(jìn)行。PCR反應(yīng)中 用作引物的寡核苷酸(表)具有合適的堿基取代。對(duì)于每個(gè)誘變，使用結(jié)合到DNA鏈相應(yīng) 區(qū)域的互補(bǔ)寡核苷酸(30)。擴(kuò)增后，限制酶Dpnl催化的酶促消化選擇性降解未改變的原模CN 101861331 A
板。然后用誘變的分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。根據(jù)桑格(法)對(duì)獲自單細(xì)菌菌落的克隆進(jìn)行 測(cè)序，以確定cDNA中正確的堿基修飾以及不存在非特異性突變。表.位點(diǎn)特異性誘變中用作引物的寡核苷酸序列。突變的堿基為黑體。
寡核苷酸序列Bet v2 S39ggg ccc aga gcg ctt cct tcc cac agBet v2 K45cct tcc cac agt tta cgc ctc agg aaa tcBet v2 K88-89gtc ate cgt gga ggg gag gga tct gga g實(shí)施例2-制備Bet v 2蛋白及其變體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(31，32)在大腸桿菌中克隆并表達(dá)野生型(SEQ ID NO. 7)和誘變 的(SEQ ID NO :8-12)Bet v 2cDNA。細(xì)胞離心收集，重懸于 PBS1X (6. 46mM NaH2P04、1. 47mM KH2P04、136.89mM NaCl)中并超聲裂解。離心分離重組蛋白。含有不溶蛋白質(zhì)聚集體的沉 淀重懸于PBS 1X、6M尿素(變性緩沖液)中并在4°C下攪拌60分鐘。溶解的重組蛋白從不 溶的殘?jiān)须x心分離，用PBS IX透析，濾過1 y M的濾器并通過使用用聚-脯氨酸衍生化的 瓊脂糖柱(Sigma，Milan，意大利)親和層析純化。用PBS 1X、2M尿素洗滌后，用PBS 1X、8M 尿素洗脫重組蛋白質(zhì)，并在PBS IX溶液中4°C透析16小時(shí)來重折疊。實(shí)施例3-變應(yīng)性受試者血清的表征血清收集自具有對(duì)垂枝樺花粉有季節(jié)性變態(tài)反應(yīng)臨床既往癥，并具有對(duì)Bet v 2 變應(yīng)原有RAST 3+和4+特異反應(yīng)性的個(gè)體，然后集中這些血清并以這種形式使用。來自非 變應(yīng)性患者的血清庫(kù)用作陰性對(duì)照。實(shí)施例4-Bet v 2變體對(duì)血清庫(kù)中IgE的反應(yīng)性的ELISA分析50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH 9. 6)中相同量的野生型變應(yīng)原和突變變體 (1 P g)在4°C下溫育16小時(shí)以吸附到ELISA分析用聚苯乙烯(polystirene)板的孔上。 該孔用洗滌溶液(60mM含有0. 05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH 6. 5)洗滌，并用稀釋溶 液(150mM磷酸鹽緩沖液中的25%山羊血清、ImM EDTA.0. 05% Tween 20、0. 01%乙基汞硫 代水楊酸鈉，pH 7. 4)封閉。70 u 1人血清RAST 3+和4+庫(kù)(在稀釋緩沖液中)的整分試 樣加入至每個(gè)樣品，并于25°C溫育2小時(shí)。洗滌三次后，加入過氧化物酶綴合的抗人-IgE 血清(稀釋緩沖液中1 1500)，接著25°C溫育1. 5小時(shí)。洗滌三次后加入100 u 1 TMB試 劑(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)并在25°C溫育15分鐘進(jìn)行比色反應(yīng)。加入 100 til IN HC1 終止反應(yīng)并使用酶標(biāo)儀(microplate reader spectrophotometer)在 450nm 處讀數(shù)。實(shí)施例5-REAST抑制測(cè)定。Bet v 2變體抑制生物素化Bet v 2與血清庫(kù)中包含 的IgE的結(jié)合1 3稀釋于稀釋緩沖液(150mM磷酸鹽緩沖液中的25%山羊血清、ImM EDTA、 0. 05% Tween 20、0. 01 %乙基汞硫代水楊酸鈉，pH 7.4)中的對(duì)Bet v 2的人血清庫(kù)RAST
74+和3+的整分試樣(50 u 1)與野生型變應(yīng)原及其突變體的連續(xù)稀釋物(從67ng/ml開 始)在25°C下預(yù)溫育1.5小時(shí)。然后將混合物加入ELISA聚苯乙烯(polystirene)平板 的小孔中并在25°C溫育1. 5小時(shí)，該小孔吸附人抗-IgE。用0. 06M的磷酸緩沖液、0. 05% Tween-20，pH6. 5洗滌三次后，加入稀釋緩沖液中的0. lml生物素化Bet v 2抗原(85. 3ng/ ml)并在25°C溫育1小時(shí)。洗滌三次后，25°C下加入過氧化物酶-鏈霉親和素(0. 1 y g/ ml) 30分鐘。用lOOiil IN HC1進(jìn)行比色反應(yīng)并使用分光光度儀在450nm處讀數(shù)。抑制百分?jǐn)?shù)計(jì)算如下100x[ (A_B)/A]，其中A是無(wú)抑制物時(shí)450nm處測(cè)量的吸光 度，而B是存在抑制物時(shí)的吸光度。實(shí)施例6-免疫接種Balb/c小鼠的方案5只雌性Balb/c小鼠(Charles River)的兩個(gè)組用200 yl的乳劑皮下免疫，該乳 劑含有100 ill完全弗氏佐劑和lOOyl鹽水中的20i! g抗原(SEQ IDN0:1，SEQ ID NO :5)。 另外三次加強(qiáng)免疫以1周的間隔進(jìn)行，用不完全佐劑替換完全佐劑。作為對(duì)照，5只小鼠施 用不相關(guān)的抗原。末次免疫后7天，從頸靜脈獲取血樣，用于ELISA以檢驗(yàn)抗體與每種免疫 原性物質(zhì)的應(yīng)答。對(duì)于SEQ ID NO :5免疫的小鼠，還分析了識(shí)別野生型蛋白質(zhì)的能力。實(shí)施例7-ELISA分析免疫小鼠中的IgG_特異性應(yīng)答50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH 9. 6)中相同量的野生型Bet v 2和變體SEQ ID NO 5(0. 25 ug)在4°C下溫育16小時(shí)以吸附到ELISA分析用聚苯乙烯板的孔上。該孔用洗 滌溶液(60mM含有0. 05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH 6. 5)洗滌，并用稀釋溶液(150mM 磷酸鹽緩沖液中的25%馬血清、ImM EDTA.0. 05% Tween 20、0. 01 %乙基汞硫代水楊酸鈉， PH 7.4)封閉。100 yl每只小鼠血清的連續(xù)稀釋物(在稀釋緩沖液中)的整分試樣置于每 孔中，并于25°C溫育2小時(shí)。洗滌三次后，在稀釋緩沖液中1 2000稀釋過氧化物酶綴合的抗小鼠IgG血 清，并加入到小孔中，接著25°C溫育1.5小時(shí)。洗滌三次后加入lOOylTMB試劑(BioFX Laboratories, Owings Mills,MD)并在 25°C溫育 15 分鐘進(jìn)行比色反應(yīng)。用 100 ii 1 IN HC1 終止反應(yīng)并使用分光光度儀在450nm處讀數(shù)。圖3和4顯示通過分析每組的5只小鼠的血 清獲得的平均反應(yīng)性。參考文獻(xiàn)1) Mai 1 ing H. 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1權(quán)利要求
低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，其是Bet v 2主要變應(yīng)原的序列變體，并且特征在于a)與野生型Bet v 2變應(yīng)原(SEQ ID NO1)相比，對(duì)IgE的反應(yīng)性降低；2)氨基酸序列為a)與SEQ ID NO1至少90％相同，優(yōu)選至少93％相同，進(jìn)一步優(yōu)先至少97％相同；b)與SEQ ID NO1的序列比對(duì)表明SEQ ID NO1在對(duì)應(yīng)于Ser39、Lys 45、Lys88或Lys89的Ser或Lys殘基處具有至少一個(gè)取代或缺失。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，其中所述Ser或Lys殘基被中性、極性或酸性 氨基酸取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，其中所述中性、極性或酸性氨基酸選自Ala、 Gly、Pro、Leu、lie、Phe、Thr、Ser、Glu、Asp。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸是Ala、Thr、Ser、Gly、Glu、Asp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，其選自SEQID NO2-6
6.權(quán)利要求1的低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)的免疫活性肽片段，其包含15至35個(gè)氨基酸，更優(yōu) 選15至20個(gè)氨基酸，并具有如上定義的至少一個(gè)取代和/或缺失。
7.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-5的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求6的肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的核酸分子，其選自SEQID NO :8_12。
9.載體，其含有權(quán)利要求7-8的核酸分子。
10.宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求9的載體。
11.藥物組合物，其含有有效量的權(quán)利要求1-5的低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求6的 肽片段，以及可藥用載體和賦形劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其為疫苗形式。
13.權(quán)利要求1-5的低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)或權(quán)利要求6的肽片段在制備用于預(yù)防或治療 變應(yīng)性疾病的藥物組合物中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其用于治療支氣管哮喘和變應(yīng)性結(jié)膜炎。
全文摘要
本發(fā)明提供垂枝樺植物花粉的Bet v 2主要變應(yīng)原的低變應(yīng)原性變體，及其預(yù)防或治療變應(yīng)性疾病的用途。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101861331SQ200880116680
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2008年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月19日
發(fā)明者D·龍卡羅洛, G·米斯特雷洛, P·法拉賈尼, S·扎諾塔 申請(qǐng)人:洛法瑪有限公司