專(zhuān)利名稱(chēng)：豬肺炎支原體無(wú)毒力佐劑化活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)內(nèi)容一般涉及免疫學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本公開(kāi)內(nèi)容提供了基于 豬肺炎支原體(M. hyopneumoniaeU菌株的佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體組合物，包括免 疫原性或疫苗組合物，其幫助減少由豬肺炎支原體的一種或多種強(qiáng)毒力株引起的疾病的嚴(yán) 重度和/或預(yù)防由豬肺炎支原體的一種或多種強(qiáng)毒力株引起的疾病。還提供了佐劑化無(wú)毒 力活豬肺炎支原體組合物，包括免疫原性或疫苗組合物，其進(jìn)一步包括豬環(huán)狀病毒1型_2 型嵌合體經(jīng)修飾的活疫苗(cPCVl-2)。對(duì)動(dòng)物施用一次或兩次劑量的本文公開(kāi)的佐劑化無(wú) 毒力活豬肺炎支原體組合物在提供來(lái)自豬肺炎支原體強(qiáng)毒力株感染的免疫中是有效的，所 述免疫包括細(xì)胞介導(dǎo)免疫和/或體液免疫。
背景技術(shù)：
豬肺炎支原體(也稱(chēng)為M. hyopneumoniae)是豬的支原體肺炎的病原體。該疾病引 起久咳、毛發(fā)覆蓋減少(dull hair coat)、生長(zhǎng)阻滯和持續(xù)數(shù)周的不興旺外觀(guān)(unthrifty appearance)。在受感染動(dòng)物中觀(guān)察到特別是在腹側(cè)頂葉和心葉中的紫色至灰色實(shí)變區(qū)域 的特征性損害。盡管該疾病引起很少的死亡率，但受累豬通常傾向于通過(guò)機(jī)會(huì)致病菌的繼 發(fā)感染，導(dǎo)致死亡或應(yīng)激。(R. F. Ross,Mycoplasmaldiseases，第 436-444 頁(yè)，in A. D. Laman, 等人，(編輯·)Diseasesof Swine, Iowa State University Press, 1986)。該疾病被認(rèn)為是豬中疾病相關(guān)損失的最重要病因之一(Whittlestone，第 133-176 頁(yè)，in Tully and Whitcomb (編輯),The Mycoplasma 第 2 卷Human and Animal Mycoplasmas, New York, Academic Press, (1979))。該疾病一般導(dǎo)致無(wú)效的重量獲益者， 以及矮小和多病動(dòng)物。此外，受累豬通常傾向于通過(guò)機(jī)會(huì)致病菌的繼發(fā)感染(Burch，Pig America第26-27頁(yè)，1982年12月)。該疾病的經(jīng)濟(jì)影響是顯著的。已估計(jì)單獨(dú)的經(jīng)濟(jì)損 失為每年 200，000，000 至 250，000，000 美元。豬肺炎支原體是缺乏細(xì)胞壁的生長(zhǎng)緩慢的難養(yǎng)菌。它通常難以從呼吸道中分離， 這是由于同樣定位于呼吸道中的常見(jiàn)第二種因子，豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)。 該疾病通過(guò)飛沫(aerosol)傳播，通過(guò)咳嗽并且通過(guò)與受累豬或病后帶菌豬的直接接觸產(chǎn) 生。受感染動(dòng)物和未受感染動(dòng)物相混合導(dǎo)致早期和頻繁再感染。感染通常開(kāi)始于帶菌母豬 在產(chǎn)小豬時(shí)對(duì)小豬的感染。由于獸群管理技術(shù)，感染可能直到生命晚期時(shí)才變得明顯。當(dāng)豬集中時(shí)，附加感染 通常在斷奶后觀(guān)察到。明顯疾病通常在6周大或更大的豬中觀(guān)察到。生長(zhǎng)率和飼養(yǎng)轉(zhuǎn)換率 在受累動(dòng)物中明顯減少。使用抗生素的現(xiàn)有治療是昂貴的并且需要長(zhǎng)期使用。動(dòng)物再感染 仍是問(wèn)題。因此，疫苗目前是用于避免感染及其后果的最有效方法。已存在提供用于保護(hù)豬 免受豬肺炎支原體感染的疫苗的眾多嘗試。幾個(gè)研究者已公開(kāi)包括重組產(chǎn)生的豬肺炎支 原體表面抗原的疫苗，于1990年1月16日頒發(fā)的Schaller等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，894，332; 于1988年9月28日公布的歐洲專(zhuān)利公布號(hào)283，840。于1986年1月3日公布的PCT公 布號(hào)WO 86/00019公開(kāi)了專(zhuān)一地包括豬肺炎支原體質(zhì)膜的豬肺炎支原體疫苗，其不含其他細(xì)胞組分。Etheridge等人，Res. Vet. Sci. 33 =188(1982)發(fā)現(xiàn)當(dāng)靜脈內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)給 予活疫苗時(shí)，針對(duì)經(jīng)由豬肺炎支原體的肺定居的不完全保護(hù)。Kristensen等人，Am. J. Vet. Res. 42 =784(1981)未發(fā)現(xiàn)在由熱滅活的豬肺炎支原體感染后，豬針對(duì)支原體肺炎的保護(hù)。 Ross等人，Am. J. Vet. Res. 45 =1899(1984)發(fā)現(xiàn)使用通過(guò)凍融操作制備的豬肺炎支原體提 取物免疫接種豬，僅提供可變的保護(hù)，并且在某些情況下，在經(jīng)免疫接種的豬中注意到增強(qiáng) 的損害發(fā)展。這些研究者還研究了通過(guò)福爾馬林滅活制備的全細(xì)胞疫苗。福爾馬林滅活顯 著妨礙豬肺炎支原體的保護(hù)免疫原性，并且這種疫苗是無(wú)效的。Yoshioka等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 3，917，819 (1975年11月4日頒發(fā))公開(kāi)了包括由福爾馬林滅活的支原體的幾種經(jīng)殺死的 支原體疫苗，包括用于豬肺炎支原體的滅活疫苗。Chung-Nan歐 洲專(zhuān)利公開(kāi)571，648公開(kāi)了 基于高度增殖性和抗原性株P(guān)RIT-5的豬肺炎支原體疫苗?；跍缁钬i肺炎支原體強(qiáng)毒力株的疫苗是商購(gòu)可得的。FortDodge Animal Health (FDAH)銷(xiāo)售在名稱(chēng)為Suvaxyn, 和Respifend 豬肺炎支原體的豬肺炎支原體死菌 苗，用于用作疫苗以保護(hù)健康豬免受通過(guò)豬肺炎支原體引起的臨床體征。這種死菌苗疫苗 推薦為兩次劑量疫苗用于至少一周大的豬，其中第二次劑量在第一次疫苗接種后2-3周。豬肺炎支原體J菌株是具有減少的與豬纖毛附著能力，因此減少的引起疾病 能力的非致病菌株。Castro 等人，VeterinaryMicrobiology 116 :258_269 (2006)和 Vasconcelos 等人，J. Bacteriol. 187(16) :5568_5577 (2005)(描述豬肺炎支原體 J 菌株 (ATCC 25934)的完整基因組序列)。致病性和非致病性菌株(J菌株)之間的基因組比較已 揭示在表面蛋白質(zhì)包括纖毛粘附素中的變異，所述纖毛粘附素被認(rèn)為是豬肺炎支原體菌株 之間的相對(duì)致病性質(zhì)的決定因素。Vasconcelos等人(2006)和Djordjevic等人，Infection and Immunity72(5) :2791_2802(2004)。豬肺炎支原體在其細(xì)胞表面上表達(dá)膜脂蛋白，特別是P46、P65和P97蛋白質(zhì)， 其攜帶物種特異性抗原決定簇。近來(lái)，Bouh等人描述了針對(duì)無(wú)毒力活豬肺炎支原體參 考 J 菌株 ATCC 25934 的 P46 和 P65 的單克隆抗體。Clin. Diag. Lab. Immunology 10 (3) 459-468(2003)。Blank和Stemke描述了豬肺炎支原體菌株J基因組的物理和基因圖，Can. J. Microbiol. 46 :832_840 (2000)，并且Wilton等人描述了由非致病性豬肺炎支原體J菌株 產(chǎn)生的表達(dá)文庫(kù)的篩選和那些文庫(kù)用針對(duì)豬肺炎支原體的豬高免疫抗血清的篩選。存在關(guān)于由佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體制備的組合物，包括免疫原性或疫苗組 合物的需要，所述組合物提供針對(duì)豬肺炎支原體的強(qiáng)毒力株的功效。本文任何參考文獻(xiàn)的 引用不應(yīng)視為此種參考文獻(xiàn)可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。發(fā)明概述本公開(kāi)內(nèi)容提供了包括免疫原性組合物或疫苗組合物的組合物，其包括免疫有效 量的無(wú)毒力活豬肺炎支原體和生物學(xué)上可接受的佐劑。本文公開(kāi)的組合物引發(fā)針對(duì)豬肺炎 支原體的免疫應(yīng)答，從而預(yù)防由這種生物體引起的疾病的嚴(yán)重度和/或使由這種生物體引 起的疾病的嚴(yán)重度降到最低，或改善與該疾病相關(guān)的至少一種癥狀。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在動(dòng)物中引發(fā)抗豬肺炎支原體免疫應(yīng)答的 組合物，所述組合物包括免疫有效量的豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株和生物學(xué)上可接受的 佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其基因組包括與參考J菌株的核酸序列具有至少約90%同源性的核酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其基因組包括 與參考J菌株的核酸序列具有至少約95%同源性的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其基因組包括 與參考J菌株的核酸序列具有至少約99%同源性的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其與參考J菌 株具有至少約70%多態(tài)同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其與參考J菌 株具有至少約85%多態(tài)同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其與參考J菌 株具有至少約95%多態(tài)同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本文描述的組合物中使用的豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株 的同源性百分比通過(guò)與具有ATCC登記號(hào)25934 (GenBank登記號(hào)AE017243)或27715的無(wú) 毒力參考J菌株相比較進(jìn)行測(cè)定。在其他特定實(shí)施方案中，參考菌株可以是其為強(qiáng)毒力株 的菌株，例如具有ATCC登記號(hào)25617或25095的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本文描述的組合物中使用的豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株 的多態(tài)同一性百分比通過(guò)與具有ATCC登記號(hào)25934或27715的無(wú)毒力參考J菌株相比較 進(jìn)行測(cè)定。在其他特定實(shí)施方案中，參考菌株可以是其為強(qiáng)毒力株的菌株，例如具有ATCC 登記號(hào)25617或25095的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本文描述的組合物中使用的豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株 是指定為ATCC登記號(hào)25934或27715的J菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本文描述的組合物中使用的豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株 是指定為ATCC登記號(hào)27715的J菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，由豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株引發(fā)的免疫應(yīng)答保護(hù)動(dòng)物免 受由豬肺炎支原體的強(qiáng)毒力株的感染，或減少與由豬肺炎支原體的強(qiáng)毒力株的感染相關(guān)的 至少一種癥狀的嚴(yán)重度。在一個(gè)實(shí)施方案中，給動(dòng)物施用一次劑量的本文公開(kāi)的佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支 原體組合物在給動(dòng)物提供來(lái)自支原體感染的免疫中是有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，給動(dòng)物施用兩次劑量的本文公開(kāi)的佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支 原體組合物在給動(dòng)物提供來(lái)自支原體感染的免疫中是有效的。本文公開(kāi)的佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體組合物可以適當(dāng)?shù)夭捎枚谪i中針對(duì) 由豬肺炎支原體引起的感染和疾病中使用，并且將在管理和/或預(yù)防在豬群體中由豬肺炎 支原體引起的感染和疾病傳播中有用。因此，本公開(kāi)內(nèi)容的免疫原性組合物和疫苗組合物采用與一種或多種佐劑例如生 物學(xué)上可接受的佐劑相組合的一種或多種無(wú)毒力活豬肺炎支原體。生物學(xué)上可接受的佐劑 可以任選是選自下述的一種或多種佐劑SP-0il、SL-⑶、丙烯酸聚合物(例如Carbopol ，Noveon, Inc.，Cleveland, OH)、和可代謝油例如一種或多種不飽和萜烴例如角鯊烯或角鯊 烷與聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物例如Pluronic (BASF，F(xiàn)lorham Park, New Jersey)的 混合物。
在本文描述的組合物中采用的佐劑的濃度將依賴(lài)于佐劑的性質(zhì)。佐劑一般以約 1-50% (ν/ν)的終濃度和更一般地以約10%、15%、20%、25%或30% (ν/ν)的終濃度存在 于本文描述的組合物中。在包括SP-Oil的組合物中，佐劑一般以約至約25% (ν/ν)、更 一般地約5%至約15% (ν/ν)例如以約10% (ν/ν)存在。在包括丙烯酸聚合物和可代謝油 混合物的組合物中，所述混合物包括一種或多種萜烴和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物，丙 烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的比一般是約1 25至約 1 50的比，并且一般以約至25% (ν/ν)的終濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)上可接受的佐劑包括SP-0il。在一個(gè)實(shí)施方案中， SP-Oil以約至25% (ν/ν)的濃度存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，SP-Oil以約5%至15% ν/ ν的濃度存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，SP-Oil以約10% ν/ν的濃度存在。在特定實(shí)施方案內(nèi)，本文公開(kāi)的組合物在進(jìn)一步的組合中可以采用一種或多種其 他活細(xì)菌、死菌苗、類(lèi)毒素和/或病毒抗原。因此，在這些實(shí)施方案的特定方面內(nèi)，佐劑化 無(wú)毒力活豬肺炎支原體組合物在與下述的進(jìn)一步組合中可以包括免疫有效量的無(wú)毒力活 豬肺炎支原體和一種或多種生物學(xué)上可接受的佐劑(a) —種或多種活細(xì)菌；(b) —種或 多種死菌苗；(c)來(lái)自一種或多種病原體的一種或多種經(jīng)純化的類(lèi)毒素，所述病原體例如 S1JItBfifilffe' (Haemophilus parasuis) ^^^τΕ τ Ιβ' (Pasteurella multocida)、— 球菌(Streptococcussuis)、胸膜炎月市炎放線(xiàn)桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、 支氣管炎博德特菌(Bordetella bronchis印tica)、豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella choleraesuis)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)和螺旋體細(xì)菌；和/或 (d) 一種或多種病毒抗原，其中所述病毒選自豬流感病毒(SIV)、豬繁殖和呼吸綜合征病毒 (PRRSV)、表達(dá)PRRS和/或其他抗原的浣熊痘病毒、表達(dá)PRRS和/或其他抗原的TGEV、和豬 環(huán)狀病毒(PCV)。在這些實(shí)施方案的特定方面內(nèi)，本文例示的是包括免疫原性組合物或疫 苗組合物的組合物，其在進(jìn)一步的組合中采用豬環(huán)狀病毒1型_2型嵌合體經(jīng)修飾的活疫苗 (cPCVl-2)。在這些或備選實(shí)施方案內(nèi)，包括免疫原性組合物或疫苗組合物的組合物，可以 另外或任選包括防腐劑和穩(wěn)定劑，例如SGGK、硫柳汞和/或EDTA。在本文描述的組合物中采用的此類(lèi)其他活細(xì)菌、死菌苗、類(lèi)毒素和/或病毒抗 原的濃度將依賴(lài)于這些活細(xì)菌、死菌苗、類(lèi)毒素和/或病毒抗原的性質(zhì)，并且一般存在于 本文描述的組合物中。對(duì)于其中其他抗原是細(xì)菌的此類(lèi)組合物，細(xì)菌一般以0.5xl05至 0. 5xl010/毫升的終濃度存在。備選地，細(xì)菌以約0. 5xl06至0. 5xl09/毫升的終濃度或以約 0. 5xl07至0. 5xl08/毫升的終濃度存在。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了用于產(chǎn)生針對(duì)豬肺炎支原體的免疫應(yīng)答的方法，或用 于保護(hù)動(dòng)物免受由豬肺炎支原體引起的疾病和/或用于預(yù)防或改善此類(lèi)疾病在動(dòng)物群體 中的爆發(fā)的方法，通過(guò)施用如本文所描述的佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體組合物。在相關(guān) 方面，本公開(kāi)內(nèi)容還提供了用于增強(qiáng)針對(duì)豬肺炎支原體的免疫應(yīng)答的方法。此類(lèi)方法包括 在一次或兩次劑量中給動(dòng)物例如豬施用包括一種或多種佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體菌 株的組合物。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明的方法使用豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其基因組 包括與參考J菌株的核酸序列具有至少約90%同源性的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其基因組包括與參考J菌株的核酸序列具有至少約95%同源性的核酸序列。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其基因組 包括與參考J菌株的核酸序列具有至少約99%同源性的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其與參考J 菌株具有至少約70%多態(tài)同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其與參考J 菌株具有至少約85%多態(tài)同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株，其與參考J 菌株具有至少約95%多態(tài)同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所描述的，在本發(fā)明的方法中使用的豬肺炎支原體的 無(wú)毒力活菌株是指定為ATCC登記號(hào)25934或27715的J菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所描述的，在本發(fā)明的方法中使用的豬肺炎支原體的 無(wú)毒力活菌株是指定為ATCC登記號(hào)27715的J菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)針對(duì)豬肺炎支原體的免疫應(yīng)答的方 法，該方法包括步驟a)在第一次時(shí)，給動(dòng)物施用第一種免疫原性組合物，其包括用生物學(xué)上可接受的 佐劑材料佐劑化的免疫有效量的無(wú)毒力活豬肺炎支原體菌株；b)在第二次時(shí)，給動(dòng)物施用第二種免疫原性組合物，其包括用生物學(xué)上可接受的 佐劑材料佐劑化的免疫有效量的無(wú)毒力活豬肺炎支原體。在特定實(shí)施方案中，依賴(lài)于所考慮的確切應(yīng)用，組合物可以腸胃外施用，例如通過(guò) 肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射，或通過(guò)乳膏的局部應(yīng)用。備選地，組合物可以通過(guò)氣溶膠、鼻內(nèi)或 口部途徑施用，例如通過(guò)鼻內(nèi)噴霧劑或經(jīng)由手工遞送或批量應(yīng)用的口部施用。本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了本文描述的豬肺炎支原體菌株和包括這些菌株的組 合物在制備用于治療動(dòng)物的藥劑中的用途，所述動(dòng)物患有由豬肺炎支原體的感染或患有與 由豬肺炎支原體的感染相關(guān)的至少一種癥狀。本發(fā)明的這些和其他實(shí)施方案、特征和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)本文下文闡述的詳細(xì)說(shuō)明書(shū)和所 附權(quán)利要求將變得顯而易見(jiàn)的。本文引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和其他參考文獻(xiàn)在此通過(guò) 引用整體合并。在不一致的情況下，以本公開(kāi)內(nèi)容為準(zhǔn)。發(fā)明詳述在描述本方法和治療方法前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于所述特定方法和實(shí)驗(yàn)條 件，因?yàn)榇祟?lèi)方法和條件可以改變。還應(yīng)當(dāng)理解本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方案 的目的，并且不意欲是限制性的。如本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中使用的，除非上下文另有明確說(shuō)明，單數(shù)形式“一”、 “一個(gè)”和“一種”包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如提及“方法”包括本文描述的一種或多種方法、 和/或類(lèi)型的步驟和/或在閱讀本公開(kāi)內(nèi)容后對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的那些等寸。因此，在本申請(qǐng)中，存在可以采用的在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生 物學(xué)和重組DNA技術(shù)。此類(lèi)技術(shù)在參考文獻(xiàn)中充分解釋。參見(jiàn)例如Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis, Molecular Cloning :ALaboratory Manual,第二版(1989)Cold SpringHarbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York(本文"Sambrook 等人’ 1989 “ ) ；DNA Cloning :A Practical Approach,第 I 禾Π II 卷(D. N. Glover 編輯 1985)； Oligonucleotide Synthesis(Μ. J. Gait 編輯 1984) ；Nucleic Acid Hybridization(B. D· Hames & S. J. Higgins 編 輯(1985)) ；Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higgins,編輯(1984)) ；Animal Cell Culture(R. I. Freshney，編輯(1986))； Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, (1986)) ；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984) ；F. M. Ausubel 等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，Inc. (1994)。
盡管目前描述了優(yōu)選方法和材料，但與本文描述的那些相似或等價(jià)的任何方法和 材料可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中使用。本文提及的所有出版物通過(guò)引用整體合并。定義本文使用的術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)且已知的含義，然而，為了方便和完整 性起見(jiàn)，下文闡述了特定術(shù)語(yǔ)及其含義。術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意指在數(shù)值的統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義的范圍內(nèi)。此類(lèi)范圍可以是在給 定數(shù)值或范圍的數(shù)量級(jí)內(nèi)，一般在50 %內(nèi)，更一般在20 %內(nèi)，更一般在10 %內(nèi)，并且更加一 般在5%內(nèi)。由術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”包含的容許變異依賴(lài)于在研究中的特定系統(tǒng)，并且可以 由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地了解?！白魟币庵赴ㄒ环N或多種物質(zhì)的組合物，所述物質(zhì)增強(qiáng)無(wú)毒力活豬肺炎支原體 在組合物一般地疫苗組合物中的抗原性。佐劑可以充當(dāng)緩慢釋放抗原的組織儲(chǔ)存(cbpot)， 并且還充當(dāng)非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答的淋巴樣系統(tǒng)激活物(Hood，等人，Immunology，第二版， MenloPark, CA :Benjamin/Cummings, 1984.第384頁(yè))。通常，在不存在佐劑的情況下，用 單獨(dú)抗原的初次疫苗接種將無(wú)法引發(fā)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答。佐劑包括但不限于完全弗氏佐 齊U、不完全弗氏佐劑、礦物質(zhì)凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、復(fù)合多元 醇、多聚陰離子、肽、油或烴乳狀劑、鑰孔血藍(lán)蛋白、和潛在有用的人佐劑，例如N-乙酰-胞 壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰 胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺?；?L-丙氨酸-2-(1’-2’- 二棕櫚酰-sn-甘 油-3-羥基磷?；?_乙胺、BCG (卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。 優(yōu)選地，佐劑是生物學(xué)上可接受的。本文描述的組合物中采用的佐劑一般是“生物學(xué)上可接受的佐劑”，并且因此可以 在與無(wú)毒力活豬肺炎支原體的組合中使用，從而使得所得到的組合物可以在體內(nèi)施用而無(wú) 對(duì)動(dòng)物的伴隨毒性。本文例示的是包括與一種或多種生物學(xué)上可接受的佐劑相組合的無(wú)毒 力活豬肺炎支原體的組合物，所述佐劑選自SP-0il、SL-CD、CarbOpOl、和可代謝油例如一種 或多種不飽和萜烴例如角鯊烯或角鯊?fù)榕c聚氧乙烯_聚丙烯嵌段共聚物例如Pluronic 的混合物。無(wú)毒力活豬肺炎支原體菌株或來(lái)自其的分子是“抗原性的”，當(dāng)它能夠與免疫系統(tǒng) 的抗原識(shí)別分子例如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體特異性相互作用時(shí)。一般地，抗 原性分子是多肽或其變體，其包含具有至少約5個(gè)并且一般至少約10個(gè)氨基酸的“表位”。 多肽的抗原部分在本文中也稱(chēng)為“表位”，可以是對(duì)于抗體或T細(xì)胞受體識(shí)別免疫顯性的部 分，或它可以是用于產(chǎn)生針對(duì)分子的抗體的部分，通過(guò)使抗原部分與載體多肽綴合用于免疫?？乖缘姆肿悠渥陨頍o(wú)需是免疫原性，即無(wú)需載體能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)“至少”意指不小于。如本文所使 用的，“死菌苗”是這樣的細(xì)菌收獲物，其已被滅活，并且當(dāng)與特定佐劑 相組合施用于動(dòng)物時(shí)，可以引發(fā)保護(hù)性免疫以保護(hù)免受疾病或感染。丙烯酸聚合物一般是卡波姆?？ú吩谏唐访癈arbopol”下商購(gòu)可得，并且例如 在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)2，909，462和3，790，665中描述，所述專(zhuān)利各自通過(guò)引用合并入本文。術(shù)語(yǔ)“載體”指化合物或組合物與之一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、防 腐劑和/或媒介物。此類(lèi)載體可以是無(wú)菌液體，例如水和油，包括石油、動(dòng)物、蔬菜或合成來(lái) 源的那些，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。水或水溶液鹽水溶液例如磷酸鹽緩沖鹽 水、林格氏溶液和水性右旋糖和甘油溶液頻繁用作載體，特別是用于可注射溶液。載體或稀 釋劑必須是無(wú)毒的，并且不能影響抗原/免疫原的生物活性。其他另外的輔助物質(zhì)例如濕 潤(rùn)劑和/或乳化劑、表面活性劑、PH緩沖物質(zhì)等也可以在本發(fā)明的組合物中使用。防腐劑 可以包括例如硫柳汞和/或EDTA。合適的藥學(xué)載體在通過(guò)E. W. Martin的“Remington，s Pharmaceutical Sciences”，第18版中描述。廣泛多樣的載體是本領(lǐng)域眾所周知的，并且 特定載體的選擇完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員水平內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“集落形成單位”或“CFU”是用于指示在給定樣品中能夠復(fù)制的生物體數(shù)目 的測(cè)量單位。這基于集落衍生自細(xì)菌的對(duì)/簇或單細(xì)胞的復(fù)制的理論?！懊庖哂行Я俊笔菍⒁l(fā)針對(duì)豬肺炎支原體的免疫應(yīng)答的無(wú)毒力活豬肺炎支原體 的量?！懊庖哂行Я俊睂⒁蕾?lài)于受體動(dòng)物的物種、品種、年齡、大小、健康狀況，并且將受動(dòng)物 先前暴露于豬肺炎支原體的一種或多種菌株的影響，無(wú)論所述一種或多種菌株是豬肺炎支 原體的強(qiáng)毒力株還是無(wú)毒力株。如本文所使用的，當(dāng)在與合適佐劑的組合中采用時(shí)，無(wú)毒力 活豬肺炎支原體的“免疫有效量”是這樣的豬肺炎支原體量，其足以增強(qiáng)無(wú)毒力活豬肺炎支 原體的免疫原性，并且因此提供針對(duì)由豬肺炎支原體強(qiáng)毒力株的攻擊的保護(hù)性免疫。在一 個(gè)實(shí)施方案中，免疫有效量是約IxlO3生物體的最小值。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫有效量范 圍為約IXlO3集落形成單位/ml (CFU/ML)至約1X10"CFU/ML。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫有效 量是約 5X107CFU/ML。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“免疫原性，，意指無(wú)毒力活豬肺炎支原體能夠弓I發(fā)體液和/ 或細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫原性菌株也是抗原性的。免疫原性組合物是當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)，引發(fā) 體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的組合物。術(shù)語(yǔ)“免疫原性組合物”涉及包含抗原例如微生物的任何藥物組合物，所述組合物 可以用于在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以包括T細(xì)胞應(yīng)答、B細(xì)胞應(yīng)答、或T細(xì) 胞和B細(xì)胞應(yīng)答兩者。組合物可以通過(guò)在細(xì)胞表面上呈遞與MHC分子結(jié)合的抗原用于使動(dòng) 物致敏。此外，可以產(chǎn)生抗原特異性T淋巴細(xì)胞或抗體，以允許經(jīng)免疫的宿主的未來(lái)保護(hù)。 “免疫原性組合物”可以包含活、經(jīng)減毒，或經(jīng)殺死/滅活的疫苗，其包括完整微生物或衍生 自其的免疫原性部分，其誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的(T細(xì)胞)免疫應(yīng)答或抗體介導(dǎo)的(B細(xì)胞)免疫 應(yīng)答，或兩者，并且可以保護(hù)動(dòng)物免受與由微生物感染相關(guān)的一種或多種癥狀，或可以保護(hù) 動(dòng)物免受由于由微生物感染的死亡。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離的”意指所指代的材料從其天然環(huán)境中取出。因此， 經(jīng)分離的生物材料可以不含某些或所有細(xì)胞組分，即其中天然材料自然存在的細(xì)胞的組分(例如細(xì)胞質(zhì)或膜組分)。如果材料存在于細(xì)胞提取物或上清液中，那么它是經(jīng)分離的。經(jīng) 分離的蛋白質(zhì)可以與在細(xì)胞中與其結(jié)合的其他蛋白質(zhì)或核酸或兩者結(jié)合，或如果它是膜結(jié) 合蛋白質(zhì)，那么與細(xì)胞膜結(jié)合。經(jīng)分離的細(xì)胞器、細(xì)胞或組織從它在生物體中發(fā)現(xiàn)的解剖部 位中取出。經(jīng)分離的材料可以是但無(wú)需是經(jīng)純化的。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“MHDCE”指豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等價(jià)物，并且定義為用于 測(cè)定給定樣品中存在的豬肺炎支原體生物體的近似數(shù)目的測(cè)量單位。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“腸胃外施用”意指通過(guò)除通過(guò)胃腸道外的某些其他方法的 施用，特別指通過(guò)靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或髓內(nèi)注射將物質(zhì)引入生物體內(nèi)，還意指其他非口部 和非鼻部施用途徑例如腹膜內(nèi)注射或局部應(yīng)用。術(shù)語(yǔ)“與參考J菌株的多態(tài)同一性”指一種非J菌株豬肺炎支原體與豬肺炎支原 體的參考J菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)譜之間的相似性。多態(tài)同一性可以基于一種或多種蛋白質(zhì) 的一種或多種特征，包括但不限于例如在研究中的豬肺炎支原體微生物的一種或多種蛋白 質(zhì)的量或大小，一種或多種蛋白質(zhì)的沉降率，或一種或多種蛋白質(zhì)的物理或生物化學(xué)特征 中的改變。該術(shù)語(yǔ)還可以包括編碼豬肺炎支原體的一種非J菌株和豬肺炎支原體的參考J 菌株的任何一種或多種蛋白質(zhì)的核苷酸序列之間的相似性，并且包括這些序列中的任何突 變，包括缺失或置換。核苷酸或氨基酸序列中的改變是允許保留豬肺炎支原體生物體的無(wú) 毒力性質(zhì)的那種。用于觀(guān)察核苷酸和氨基酸序列中的微擾(perturbation)的廣泛多樣的 測(cè)定法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，核酸或氨基酸序列的大小和結(jié)構(gòu)通過(guò)如本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的 Northern、Southern、Western、SDS-PAGE ELISA 概況分析、PCR 和 DNA 測(cè)序方案進(jìn) 行觀(guān)察(參見(jiàn)例如，Calus，D.等人 VeterinaryMicrobiology，第 120 卷，Issues 3-4,2007 年 3 月 10 日，第 284-291 頁(yè)；Scarman，AL，等人Microbiology (1997)，第 143 卷663_673)。 此外，用于觀(guān)察核苷酸和氨基酸序列中的微擾的其他方法例如單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析是本領(lǐng) 域眾所周知的(參見(jiàn)例如，于1999年9月7日頒發(fā)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，382，510和于1995年 1月17日頒發(fā)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，952，170)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)純化的”指已在減少或消除無(wú)關(guān)材料存在的條件下分離 的材料，所述無(wú)關(guān)材料即污染物，包括由其獲得材料的天然材料。例如，經(jīng)純化的細(xì)菌或蛋 白質(zhì)一般基本上不含宿主細(xì)胞或培養(yǎng)組分，包括組織培養(yǎng)物或卵蛋白質(zhì)、非特異性病原體 等。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“基本上不含”在材料的分析測(cè)試背景中可操作地使用。一般地， 基本上不含污染物的經(jīng)純化的材料是至少50%純的；更一般地至少90%純的，并且更一般 地至少99%純的。純度可以通過(guò)色譜法、凝膠電泳、免疫測(cè)定法、組合物分析、生物測(cè)定法和 本領(lǐng)域已知的其他方法進(jìn)行評(píng)估。用于純化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。術(shù)語(yǔ)“基本上純 的”指示使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)純化技術(shù)可以達(dá)到的最高純度。“參考菌株”指微生物例如豬肺炎支原體的菌株，其得自可靠來(lái)源，并且可以用作 其他未確定或未知培養(yǎng)物可以與之相比較的對(duì)照菌株。在本發(fā)明中，豬肺炎支原體的參 考菌株可以是無(wú)毒力J菌株，其得自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)，并且指定ATCC登記號(hào) 25934和27715。在本發(fā)明中，具有ATCC登記號(hào)25934或27715的這些“參考菌株”也已用 于制備本發(fā)明的免疫原性組合物。在本發(fā)明的其他特定實(shí)施方案中，豬肺炎支原體的參考 菌株可以得自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)，并且指定ATCC登記號(hào)25617和25095。術(shù)語(yǔ)“SL-⑶”指包括在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，610，310和6，165,995中描述的環(huán)糊精佐劑家族內(nèi)的sulpholipo-環(huán)糊精。一般地，在與可代謝油例如一種或多種不飽和萜烴例如 角鯊?fù)榍覂?yōu)選與非離子型表面活性劑例如聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯的混合物中配制 SL-CD。術(shù)語(yǔ)“SP-0il”指其為包括下述的油乳狀液的佐劑至3% vol/vol的聚氧乙 烯-聚丙烯嵌段共聚物；2%至6% vol/vol的角鯊?fù)椋?. 至0. 5% vol/vol的聚氧乙烯 失水山梨醇單油酸酯；和緩沖鹽溶液。可互換使用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”或“疫苗組合物”指這樣的藥物組合物，其包括在動(dòng)物 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護(hù)動(dòng)物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強(qiáng)活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對(duì)于藥物組合物典型的進(jìn)一步組分。疫苗或疫苗 組合物可以另外包括對(duì)于疫苗或疫苗組合物典型的進(jìn)一步組分，包括例如佐劑或免疫調(diào)節(jié) 齊U。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體，或在經(jīng)修飾的活疫苗中 作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過(guò)合適方法滅活的生物體，或包括病 毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備的遺 傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時(shí)超過(guò)一種上述組分。 如本文所使用的，“強(qiáng)毒的”指豬肺炎支原體菌株引起與豬肺炎支原體感染相關(guān)的 疾病的能力。毒力可以通過(guò)觀(guān)察動(dòng)物中的疾病進(jìn)展進(jìn)行評(píng)估。豬肺炎支原體的“強(qiáng)毒”株的 例子是通過(guò)如本發(fā)明中描述且使用的豬肺炎支原體的攻擊菌株例示的那種。豬肺炎支原體 的其他強(qiáng)毒力株可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)，指定為菌株號(hào)25617或25095。術(shù)語(yǔ) “無(wú)毒力的”指缺乏毒力的豬肺炎支原體菌株。即無(wú)毒力的菌株、分離物或構(gòu)建體是非致病 性的并且不能引起疾病。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“無(wú)毒力的”與術(shù)語(yǔ)“非強(qiáng)毒的”同義使用。 本文例示的是采用豬肺炎支原體活無(wú)毒培養(yǎng)菌株J(FCX3-Line 1，其可作為菌株號(hào)27715 得自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC))的組合物。還可得自ATCC的另一種“無(wú)毒力”株指定為 菌株號(hào)25934。指定為ATCC登記號(hào)27715的J菌株由指定為ATCC登記號(hào)25934的親本J 菌株克隆，如ATCC目錄中所述。一般描述本公開(kāi)內(nèi)容基于下述發(fā)現(xiàn)包括免疫原性組合物或疫苗組合物的豬肺炎支 原體組合物的一次或兩次劑量方案，使用一種或多種無(wú)毒力活豬肺炎支原體例如菌株 J(FCX3-Line 1 ；ATCC登記號(hào)27715)和一種或多種佐劑一般是生物學(xué)上可接受的佐劑，在 保護(hù)免受與強(qiáng)毒力豬肺炎支原體感染和/或預(yù)防或改善與強(qiáng)毒力豬肺炎支原體感染相關(guān) 的疾病中是有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，其基因組包括與參考J菌株具有至少約90%同源性、或至少 約95%同源性或至少約99%同源性的豬肺炎支原體的其他無(wú)毒力活菌株，包括但不限于J 菌株，考慮用于本發(fā)明的組合物和方法中。在一個(gè)實(shí)施方案中，其與參考J菌株的那種具有至少約70%多態(tài)同一性、或至少 約85%多態(tài)同一性或至少約95%多態(tài)同一性的豬肺炎支原體的其他無(wú)毒力活菌株，包括 但不限于J菌株，考慮用于本發(fā)明的組合物和方法中。參考J菌株可以選自指定為ATCC登記號(hào)25934或27715的豬肺炎支原體菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的組合物和方法中使用的無(wú)毒力活J菌株是指定為ATCC登記號(hào)25934或27715的J菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的組合物和方法中使用的無(wú)毒力活J菌株是指定為 ATCC登記號(hào)27715的J菌株。本文還公開(kāi)的是包括疫苗組合物的組合物也在保護(hù)免受與強(qiáng)毒力豬肺炎支原體 感染和/或強(qiáng)毒力豬環(huán)狀病毒感染、和/或預(yù)防或改善與強(qiáng)毒力豬肺炎支原體感染和/或 強(qiáng)毒力豬環(huán)狀病毒感染相關(guān)的疾病中是有效的，所述組合物在與豬環(huán)狀病毒1型_2型嵌合 體經(jīng)修飾的活疫苗(cPCVl-2)的進(jìn)一步組合中采用一種或多種無(wú)毒力活豬肺炎支原體菌 株(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2003/0170270和2004/0253270)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包括選自下述的一種或多種活細(xì)菌、 死菌苗和/或一種或多種經(jīng)純化的類(lèi)毒素副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸膜 炎肺炎放線(xiàn)桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、豬紅斑丹毒絲菌和螺旋體細(xì)菌。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包括選自豬流感病毒(SIV)抗原、豬 繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原、表達(dá)PRRS或其他抗原的浣熊痘病毒、表達(dá)PRRS或其 他抗原的TGEV、和豬環(huán)狀病毒(PCV)抗原的一種或多種病毒抗原。在特定實(shí)施 方案內(nèi)，本公開(kāi)內(nèi)容在下文中就保護(hù)免受由肺勻漿的感染而言 進(jìn)行描述，所述肺勻漿指定為L(zhǎng)I-34，包含豬肺炎支原體強(qiáng)毒力株11(參見(jiàn)J. Clin. Microbiol. 1999 Mar ；37 (3) :620_7。然而，考慮本文公開(kāi)的組合物在保護(hù)免受疾病或與疾 病相關(guān)的至少一種癥狀和/或預(yù)防或改善疾病或與疾病相關(guān)的至少一種癥狀中是有效的， 所述疾病與廣泛范圍的強(qiáng)毒力豬肺炎支原體感染相關(guān)。眾多強(qiáng)毒力豬肺炎支原體分離物是 本領(lǐng)域已知的，并且可得自各種來(lái)源，包括美國(guó)典型培養(yǎng)物中心，12301 Parklawn Drive, Rockville，Md. 20852。這些強(qiáng)毒力株的例子包括但不限于A(yíng)TCC登記號(hào)25095、27714和 25617。本公開(kāi)內(nèi)容的組合物特別是免疫原性組合物或疫苗組合物可以由凍干或新鮮收 獲的無(wú)毒力活豬肺炎支原體培養(yǎng)物進(jìn)行制備，通過(guò)本領(lǐng)域容易獲得的一種或多種方法。本 文例示的是包括無(wú)毒力活豬肺炎支原體菌株J(FCX3-line 1)的組合物，其所述菌株J作為 ATCC號(hào)27715 (ATCC號(hào)25934經(jīng)過(guò)濾且克隆3次的分離物)可獲得。無(wú)毒力活豬肺炎支原體可以通過(guò)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，338，543和5，565，205中描述的方 法進(jìn)行培養(yǎng)，所述專(zhuān)利各自通過(guò)引用整體合并。更具體而言，豬肺炎支原體可以在培養(yǎng)基例 如PPLO (類(lèi)胸膜肺炎生物體)完全培養(yǎng)基(Difco ；Becton Dickinson and Company, San Jose,California)中進(jìn)行繁殖。生物體的生長(zhǎng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如測(cè)定變色單位(CXU)進(jìn)行 監(jiān)視，并且在已達(dá)到足夠高的滴度時(shí)進(jìn)行收獲。在包括在組合物制劑中之前，母液可以通過(guò) 常規(guī)方法進(jìn)行進(jìn)一步濃縮或凍干。也可以采用其他方法例如Thomas等人，Agri-Practice 7(5) 26-30中描述的那些。豬肺炎支原體的分離物在其下生長(zhǎng)的條件可以依賴(lài)于培養(yǎng)基的確切組成和待生 長(zhǎng)的特定分離物而改變。豬肺炎支原體分離物一般生長(zhǎng)約48小時(shí)至約144小時(shí)，從溫育時(shí) 間測(cè)量到收獲時(shí)間。依賴(lài)于待配制的確切組合物，豬肺炎支原體可以通過(guò)例如超速離心法或超濾法進(jìn) 行濃縮。經(jīng)濃縮的豬肺炎支原體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行回收，并且可以與合適的 生理學(xué)上可接受的載體相混合，所述載體一般是水介質(zhì)，例如鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、最小必需培養(yǎng)基(MEM)、或含HEPES緩沖液的MEM。它隨后可以與合適佐劑進(jìn)一步相組合， 以提供根據(jù)體積/體積(v/v)的所需濃度。組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種螯合劑例如 EDTA，一般以約0.05%至約0.20% (w/v)的濃度。備選地，待在免疫原性或疫苗組合物中 使用的豬肺炎支原體菌株可以如上所述進(jìn)行濃縮，或凍干且以根據(jù)重量/體積(w/v)的所 需濃度重懸浮于合適佐劑中。
如上所述，本公開(kāi)內(nèi)容的包括免疫原性組合物或疫苗組合物的組合物，一般包括 與一種或多種佐劑一般是生物學(xué)上可接受的佐劑相組合的豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株。對(duì)于一次劑量施用，組合物可以包含與約Ixio8至約SxIoiiMhdceAiI相對(duì)應(yīng)的無(wú) 毒力活豬肺炎支原體的量。備選地，組合物可以包含與約IxlO9至約3xl09MHDCE/ml相對(duì)應(yīng) 的無(wú)毒力活豬肺炎支原體的量。組合物這樣進(jìn)行配制，使得每次施用劑量對(duì)于肌內(nèi)、皮下或 腹膜內(nèi)施用，將是約一⑴ml至約五(5)ml，或約二(2)ml/動(dòng)物，或者對(duì)于經(jīng)口或鼻內(nèi)施用， 將是約一 (Dml至約十(10)ml，或約二 (2)ml至約五(5)ml。對(duì)于兩次劑量施用，組合物一般包含與約Ixio8至約SxIoiiMhdceAiI、更一般地約 IxlO9至約3xl09MHDCE/ml的無(wú)毒力活豬肺炎支原體的量。在用于兩次劑量施用的特定實(shí)施 方案中，組合物可以包含含有約103CFU/ML至約10"CFU/ML的無(wú)毒力活豬肺炎支原體的量。 組合物這樣進(jìn)行配制，使得每次施用劑量對(duì)于肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)施用，將是約一(l)ml至 約五(5)ml，優(yōu)選約二(2)ml/動(dòng)物，或者對(duì)于經(jīng)口或鼻內(nèi)施用，將是約一(l)ml至約十(10) ml，一般是約二 (2)ml至約五(5)ml。用于在本公開(kāi)內(nèi)容的免疫原性組合物和疫苗組合物中使用的佐劑混合物，通過(guò)刺 激細(xì)胞介導(dǎo)的和/或局部(分泌型IgA)免疫應(yīng)答來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。生物學(xué)上可接受的佐劑 可以例如是選自下述的一種或多種佐劑SP-0il、SL-⑶、丙烯酸聚合物(例如Carbopol)、 和可代謝油例如一種或多種不飽和萜烴例如角鯊烯或角鯊?fù)榕c聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共 聚物例如Pluronic 的混合物。佐劑可以進(jìn)一步選自細(xì)胞因子例如IL-12和IL-18 ；氫氧 化鋁；乙烯馬來(lái)酸共聚物；DEAE右旋糖；分枝桿菌細(xì)胞壁衍生的佐劑；等。在本文描述的組合物中采用的佐劑的濃度將依賴(lài)于佐劑的性質(zhì)。佐劑一般以約 1-50 %的終濃度和更一般地以約10 %、15 %、20 %、25 %或30 %的終濃度存在于本文描述 的組合物中。佐劑中的抗原濃度可以根據(jù)重量/體積(W/V)或體積/體積(ν/ν)進(jìn)行制備。 例如在本發(fā)明的組合物中的待遞送的抗原可以以?xún)龈尚问竭M(jìn)行制備，隨后為直接在佐劑中 重構(gòu)，以產(chǎn)生根據(jù)重量/體積的指定濃度。備選地，抗原可以首先在合適稀釋劑(例如緩沖 液)中重構(gòu)，隨后向其中加入佐劑，其體積足以產(chǎn)生根據(jù)體積/體積的抗原和佐劑的所需終 濃度，如上所述。在特定實(shí)施方案中，佐劑可以與抗原/免疫原一起作為單個(gè)組合物進(jìn)行施用，或 可以在施用抗原/免疫原之前、同時(shí)或之后進(jìn)行施用。佐劑的選擇依賴(lài)于包含佐劑的抗原/免疫原的穩(wěn)定性、施用途徑、給藥方案、佐劑 對(duì)于待接種疫苗的物種的功效，并且還必須是通過(guò)有關(guān)管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于在動(dòng)物或人中使 用的那種。在包括SP-Oil的組合物中，佐劑一般以約至約25% (ν/ν)、更一般地約5%至 約15% (ν/ν)例如以約10% (ν/ν)存在；在包括丙烯酸聚合物和可代謝油的混合物的組 合物中，所述混合物包括一種或多種萜烴和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物，丙烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的比一般是約1 25至約1 50的 比?？纱x油、聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物和丙烯酸聚合物可以以水包油乳狀液的形式 應(yīng)用，其中丙烯酸聚合物一般以約0. 5g/l至約10g/l的濃度應(yīng)用；可代謝油一般以約2ml/ 1至約6ml/l的濃度應(yīng)用；并且聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物一般以約lml/1至約3ml/l的 濃度采用。示例性合適的佐劑混合物包括但不限于一種或多種丙烯酸聚合物與可代謝油和 聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物的混合物，所述可代謝油例如不飽和萜烴或其氫化 產(chǎn)物，優(yōu)選角鯊?fù)?2，3，10，15，19，23-六甲基二十四烷)或角鯊烯。此類(lèi)丙烯酸聚合物可 以是同聚物或共聚物。丙烯酸聚合物一般是卡波姆?？ú吩谏唐访鸆arbopol下商購(gòu)可得，并且例如在 美國(guó)專(zhuān)利號(hào)2，909，462和3，790，665中描述，所述專(zhuān)利各自通過(guò)引用合并入本文。
聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物是表面活性劑，一般是液體表面活性劑，其幫助使 固體或液體組分懸浮。表面活性劑作為聚合物在商品名Pluronic 下商購(gòu)可得。表面活 性劑泊洛沙姆401在商品名Pluronic L121下商購(gòu)可得。佐劑混合物可以包括在水介質(zhì)中配制為乳狀液的可代謝油、丙烯酸聚合物和聚 氧乙烯_聚丙烯嵌段共聚物。在特定實(shí)施方案內(nèi)，佐劑混合物可以包括可代謝油和聚氧 乙烯_聚丙烯嵌段共聚物，例如角鯊?fù)楹蚉luronic L121 (泊洛沙姆401)的混合物， 其可以以約50ml/l至約100ml/l的量存在，并且羧基亞甲基聚合物可以是Carbopol 934P(Carbamer 934P)，其可以以約2ml/l的量存在，優(yōu)選的丙烯酸聚合物是由B. F Goodrich作為Carbopol 934 P NF和941 NF銷(xiāo)售 的那些，其是丙烯酸與聚烯丙基蔗糖(polyallylsucrose)交聯(lián)的聚合物，并且具有化學(xué)式 (CH2CHOOOH)n0這些聚合物形成水凝膠，其適當(dāng)?shù)赜伤d體配制。聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共 聚物可以是由BASF作為Pluronic L121、L61、L81或LlOl銷(xiāo)售的非離子型表面活性劑。在特定實(shí)施方案內(nèi)，本文公開(kāi)的組合物在進(jìn)一步的組合中可以采用一種或多種其 他活細(xì)菌、死菌苗、類(lèi)毒素和/或病毒抗原。因此，在這些實(shí)施方案的特定方面內(nèi)，佐劑化 無(wú)毒力活豬肺炎支原體組合物在與下述的進(jìn)一步組合中可以包括免疫接種量的無(wú)毒力活 豬肺炎支原體和一種或多種生物學(xué)上可接受的佐劑(a) —種或多種活細(xì)菌，例如副豬嗜 血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸膜炎肺炎放線(xiàn)桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門(mén)氏 菌、豬紅斑丹毒絲菌和螺旋體細(xì)菌；(b) —種或多種死菌苗；(c)來(lái)自一種或多種病原體的 一種或多種經(jīng)純化的類(lèi)毒素，所述病原體例如副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸 膜炎肺炎放線(xiàn)桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、豬紅斑丹毒絲菌和螺旋體細(xì)菌； 和/或(d) —種或多種病毒抗原，其中所述病毒選自豬流感病毒(SIV ；例如SIV毒株Hmi、 H1N2和H3N2)、豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)、表達(dá)PRRS和/或其他抗原的浣熊痘病 毒、表達(dá)PRRS和/或其他抗原的TGEV、和豬環(huán)狀病毒(PCV)。本文例示的是包括疫苗組合 物的組合物，其在與豬環(huán)狀病毒1型-2型嵌合體經(jīng)修飾的活疫苗(cPCVl-2)的進(jìn)一步組 合中采用一種或多種無(wú)毒力活豬肺炎支原體菌株(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2003/0170270和 2004/0253270)。在這些或備選實(shí)施方案內(nèi)，包括疫苗組合物或疫苗組合物的組合物，可以另外 或任選包括防腐劑，例如硫柳汞和/或EDTA。還參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2002/0131980和2003/0017171，其各自通過(guò)引用整體合并入本文。在本文描述的組合物中采用的此類(lèi)其他活細(xì)菌、死菌苗、類(lèi)毒素和/或病毒抗原 的濃度將依賴(lài)于死菌苗、類(lèi)毒素和/或病毒抗原的性質(zhì)，并且一般以0. 5x10s至0. 5X101(y毫 升的終濃度存在于本文描述的組合物中。備選地，細(xì)菌以約0. 5xl06至0. 5xl09/毫升或約 0. 5xl07至0. 5xl08/毫升的終濃度存在。 本公開(kāi)內(nèi)容的組合物將在用于保護(hù)動(dòng)物免受由豬肺炎支原體引起的疾病和/或 用于預(yù)防或改善此類(lèi)疾病在動(dòng)物群體中的爆發(fā)的方法中有用，通過(guò)施用如本文所描述的佐 劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體組合物。本文描述的組合物還可以有利地用于增強(qiáng)動(dòng)物中針對(duì) 豬肺炎支原體的免疫應(yīng)答，例如細(xì)胞介導(dǎo)和/或體液免疫應(yīng)答的方法中。此類(lèi)方法包括在 一次或兩次劑量中給動(dòng)物一般是豬施用包括一種或多種佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體菌 株的組合物的步驟。依賴(lài)于所考慮的確切應(yīng)用，組合物可以肌內(nèi)、皮下、經(jīng)口、通過(guò)氣溶膠或 鼻內(nèi)施用。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的方法，所需劑量方案涉及給豬施用一次或多次劑量的所需疫苗 組合物。一般地，當(dāng)給動(dòng)物施用兩次劑量時(shí)，劑量可以相隔約一⑴周至相隔約四⑷周施 用，更一般地相隔約兩(2)周至相隔約三(3)周施用。
實(shí)施例本公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考下述非限制性實(shí)施例將得到更好地理解實(shí)施例1 豬肺炎支原體無(wú)毒力佐劑化活疫苗的制備這個(gè)實(shí)施例公開(kāi)了根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的示例性佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體組合 物的制備。豬肺炎支原體可以得自任何容易獲得的來(lái)源。在本文描述的一個(gè)實(shí)施方案中，豬 肺炎支原體無(wú)毒活培養(yǎng)菌株J(FCX3-Line 1)以ATCC菌株號(hào)27715得自美國(guó)典型培養(yǎng)物中 心(ATCC ;Manassas，VA)。豬肺炎支原體的任何其他無(wú)毒力株可以用于制備組合物，例如 指定為ATCC登記號(hào)25934的親本J菌株。在特定的其他實(shí)施方案中，設(shè)想豬肺炎支原體 的任何無(wú)毒力活菌株可以進(jìn)行調(diào)節(jié)、減毒或突變，直至培養(yǎng)物確定為無(wú)毒力的，如通過(guò)體外 或體內(nèi)測(cè)試測(cè)定的，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的操作。ATCC 25934 J菌株的完整基因組序 列已由 Vasconcelos 等人(J. Bacteriol. (2005), 187(16) :5568_5577)公開(kāi)，并且已指定 GenBank登記號(hào)AE017243。與ATCC菌株25934相關(guān)的幾個(gè)序列可以在PubMed中發(fā)現(xiàn)，并且 具有GenBank登記號(hào)AY737012(16S核糖體RNA基因)、AY512905(粘附素基因、AF013714(前 脂蛋白P65基因)、U02538 (23S rRNA基因)和U02537多藥抗性蛋白質(zhì)同系物基因)。用于殺菌測(cè)定法的每種疫苗組合物由用20ml生理鹽水再水合的一瓶?jī)龈傻呢i肺 炎支原體培養(yǎng)物制備。疫苗組合物包括5ml再水合培養(yǎng)物和佐劑的組合，所述佐劑足以獲 得在IOml終體積中的指定佐劑濃度。還通過(guò)使5ml再水合培養(yǎng)物與5ml生理鹽水相組合來(lái) 制備對(duì)照組合物。所有組合物在取樣前混合5分鐘。樣品在混合后5分鐘(0小時(shí))、3小時(shí) 和7小時(shí)時(shí)取自所有組合物。每種疫苗的活力通過(guò)在每個(gè)取樣點(diǎn)時(shí)的集落形成單位(CFU) 進(jìn)行測(cè)定(參見(jiàn)表1)。表1 原種培養(yǎng)物的平均活力通過(guò)在0小時(shí)的所有對(duì)照活力求平均值進(jìn)行測(cè)定，平均值 9. 09xl07CFU/mlo相比之下，對(duì)于原種培養(yǎng)物測(cè)定最大概率數(shù)(MPN)，得到1. 85xl08MPN/ml。 疫苗混合和疫苗接種一般花費(fèi)小于3小時(shí)；因此，當(dāng)察看佐劑的殺菌效應(yīng)時(shí)，3小時(shí)時(shí)間點(diǎn) 是最重要的。與對(duì)照相比較在3小時(shí)取樣點(diǎn)時(shí)，關(guān)于以5%和10%的SP-Oil的趨勢(shì)分別是 2倍差異和4倍差異。通過(guò)用包含10% (v/v) SP-Oil終濃度的稀釋劑再水合成瓶的凍干培養(yǎng)物來(lái)制備 疫苗Α。安慰劑疫苗是無(wú)菌生理鹽水。實(shí)施例2 豬肺炎支原體無(wú)毒力佐劑化活疫苗在豬中的體內(nèi)功效這個(gè)實(shí)施例證實(shí)示例性佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體組合物的體內(nèi)功效?？偣?0 頭、4 至 6 周大的豬得自位于 Charles City，Iowa 的 FortDodge Animal Health' s SPF獸群。豬維持不含抗生素或生長(zhǎng)催化劑的飼養(yǎng)，并且隨意給予水和食物。接 受疫苗組合物和對(duì)照組合物的動(dòng)物飼養(yǎng)在不同室內(nèi)，并且在疫苗接種、監(jiān)控和攻擊期間，所 有豬維持在相似條件下。30頭豬如下隨機(jī)指定為三(3)組一 (1)組接受疫苗組合物，一 (1)組接受安慰 劑，并且一(1)組充當(dāng)環(huán)境對(duì)照。豬如表2中所示進(jìn)行分組。表2 4至6周大的豬用2ml劑量的合適疫苗進(jìn)行肌內(nèi)疫苗接種。組1施用疫苗A，組2 施用安慰劑。來(lái)自組3的豬不進(jìn)行疫苗接種或攻擊，并且充當(dāng)環(huán)境對(duì)照。組1中的豬進(jìn)行 2次疫苗接種，相隔2周。第二次疫苗接種后2周，組1和2中的所有豬用包含豬肺炎支原 體菌株 11 的強(qiáng)毒力株(J. Clin. Microbiol.，1999 Mar ；37 (3) :620_7)的肺勻漿(LI-34)進(jìn) 行攻擊。攻擊后4周，組1-3中的所有豬進(jìn)行尸檢，并且評(píng)估肺損害。用干豬肺炎IjJ^本] 擊菌株的肺勻漿(LI-34)的吿1丨各
7 頭雜種豬得自 Spring Prairie Colony Farms (Genetipork)，并且用 IOml 豬肺 炎支原體菌株11的10%肺粗勻漿物(LI31)的1 30稀釋物進(jìn)行氣管內(nèi)接種。LI31肺粗 勻漿物已通過(guò)下述產(chǎn)生在無(wú)特定病原體的豬中傳代包含豬肺炎支原體的肺勻漿，并且在 疾病的早中期時(shí)收獲所得到的肺炎肺。肺勻漿貯藏于_70°C直至需要時(shí)。在到達(dá)后和在尸檢時(shí)從所有豬中收集血清，并且在ISUVeterinary Diagnostic Laboratory (ISU-VDL)就針對(duì)TGE (PRCV)、SW和PRV的抗體的證據(jù)進(jìn)行評(píng)估。此外，執(zhí)行關(guān) 于PRRSV和豬肺炎支原體抗體的ELISA，并且所有樣品對(duì)于所有上述呼吸道病原體都是陰 性的。所有豬都進(jìn)行尸檢。戊巴比妥用于在放血前誘導(dǎo)豬的深度麻醉。打開(kāi)腹側(cè)胸壁， 并且無(wú)菌取出豬肺炎支原體一般的肺炎損害區(qū)域，并且個(gè)別放置到無(wú)菌容器內(nèi)。將每個(gè)肺的小部分磨碎，并且在血瓊脂平板、牛心浸液肉湯和Friis培養(yǎng)基上就 純度進(jìn)行檢查。在Friis培養(yǎng)基中執(zhí)行管稀釋?zhuān)缘味ǔ鲐i肺炎支原體。將其余肺碎片冷 凍于-70°C下在50ml離心管中，直至細(xì)菌學(xué)和支原體分離物的結(jié)果已知時(shí)。來(lái)自7頭豬中 的3頭的肺葉用于產(chǎn)生豬肺炎支原體肺接種物。葉塊解凍自豬#329、331和332，并且在不含抗生素的Fri i s培養(yǎng)基中磨碎。通過(guò)在 牛心浸液、血瓊脂和Friis培養(yǎng)基上培養(yǎng)證實(shí)肺接種物的純度。僅在一塊平板上發(fā)現(xiàn)與環(huán) 境污染相一致的微球菌。肺接種物就豬肺炎支原體水平進(jìn)行滴定，并且發(fā)現(xiàn)包含約IO7CCU/ ml。將等分試樣提交給ISU-VDL，用于關(guān)于SN、EMS、腸病毒、HEV、PRCV、PRRSV、假性狂犬病、 TGE、細(xì)小病毒和輪狀病毒的病毒分離測(cè)定法。所有測(cè)定法的結(jié)果都是陰性的。經(jīng)磨碎的肺 接種物(經(jīng)標(biāo)記的LI34)的終體積是來(lái)自178. 1克肺組織的1780ml。將這等分成100X5ml 和IlOXlOml體積。在該研究的第二個(gè)階段中，9頭豬用于測(cè)定在最低限度80%的豬中誘導(dǎo)平均8% 肺炎肺損害所需的肺接種物濃度。所有豬如上所述用LI34豬肺炎支原體菌株11進(jìn)行氣管 內(nèi)攻擊。攻擊稀釋度包括1 30、1 100和1 500。豬進(jìn)行尸檢。戊巴比妥用于在放血前誘導(dǎo)深度麻醉。取出肺并且在標(biāo)準(zhǔn)肺橫膈膜 (diaphrams)上草擬(sketch)肺損害。從所有豬中收集血清，并且通過(guò)ELISA就針對(duì)豬肺炎 支原體的抗體進(jìn)行測(cè)定。所有豬對(duì)于豬肺炎支原體是低陽(yáng)性或血清反應(yīng)陰性的，暗示在到 達(dá)前先前未暴露于豬肺炎支原體。從所有豬中無(wú)菌收集氣管拭子。分別從4和3頭豬中分 離出多殺巴斯德菌和副豬嗜血桿菌。從所有受攻擊的柱中分離出豬肺炎支原體。用Zeiss Image分析系統(tǒng)評(píng)估肺草圖(Iimgsketch)，以測(cè)定肺炎肺損害百分比。Mrk對(duì)豬的攻擊是成功的，并且1 100的稀釋度將是使用的最佳稀釋度。所誘導(dǎo)的肺 炎平均百分比是10. 17+/-6. 6，這高于正常值，然而，這可以歸于豬中多殺巴斯德菌和/或 副豬嗜血桿菌的存在。此外，用攻擊接種物接種的豬100%具有明顯肺損害?？傊?，這些結(jié) 果是在我們的豬肺炎支原體研究中觀(guān)察到的相當(dāng)?shù)湫偷哪欠N，因?yàn)槿绻嬖谄渌≡w， 那么出現(xiàn)肺炎中的增加。這可以是由于病原體和免疫系統(tǒng)之間的相互作用。我們產(chǎn)生了 1，600ml豬肺炎支原體肺接種物在實(shí)驗(yàn)性攻擊實(shí)驗(yàn)中使用。當(dāng)以1 100稀釋度氣管內(nèi)使 用時(shí)，接種物將在最低的80%接種豬中產(chǎn)生至少8%或更高的肺炎肺損害。疫苗在疫苗接種當(dāng)天前進(jìn)行滴定，并且執(zhí)行殺菌測(cè)定法以測(cè)定待使用的合適佐劑系統(tǒng)(參見(jiàn)實(shí)施例1)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，選擇10% SP-Oil佐劑系統(tǒng)用于進(jìn)一步研究。平均 活力/小瓶原種培養(yǎng)物是3. 64x109CFU/瓶。在第一次施用當(dāng)天，如下制備疫苗組合物疫苗A-3小瓶無(wú)毒力豬肺炎支原體凍 干培養(yǎng)物各自用IOml 10% SP-Oil稀釋劑進(jìn)行再水合。將用于每個(gè)稀釋劑類(lèi)型的3小瓶疫 苗組合物合并，并且允許在攪拌平板上用攪拌棒混合20分鐘。安慰劑是等分到無(wú)菌瓶?jī)?nèi)用 于施用的生理鹽水。組合物在2小時(shí)的疫苗接種過(guò)程期間保持在冰上。在第二次施用當(dāng)天，如下制備疫苗組合物疫苗A-3小瓶無(wú)毒力豬肺炎支原體凍 干培養(yǎng)物各自用IOml 10% SP-Oil稀釋劑進(jìn)行再水合。將用于每個(gè)稀釋劑類(lèi)型的3小瓶再 水合培養(yǎng)物合并，并且允許在攪拌平板上用攪拌棒混合20分鐘。安慰劑是等分到無(wú)菌瓶?jī)?nèi) 用于施用的生理鹽水。組合物在疫苗接種過(guò)程期間保持在冰上共2小時(shí)。在施用前和后測(cè)定每種組合物中的存活豬肺炎支原體的濃度。通過(guò)測(cè)定集落形成 單位(CFU/ml)來(lái)評(píng)估活力。成瓶的凍干原種培養(yǎng)物用IOml生理鹽水進(jìn)行再水合，允許混 合20分鐘，并且充當(dāng)用于活力測(cè)定法的對(duì)照。因?yàn)榈谝淮螌?duì)照活力低于測(cè)試疫苗活力，所 以在第二次施用期間，使2小瓶再水合且合并，以充當(dāng)對(duì)照(對(duì)于測(cè)試疫苗活力和對(duì)照活力 參見(jiàn)表3)。表3 所有豬就溫度和臨床癥狀每天進(jìn)行觀(guān)察，從每次施用前2天開(kāi)始，并且在每次施 用后持續(xù)7天。豬就臨床癥狀進(jìn)行觀(guān)察，所述臨床癥狀包括但不限于咳嗽、噴嚏、流涕、沮 喪、食欲不振(inappetance)和用力呼吸。在第二次施用后14天，組1中的豬用豬肺炎支原體的強(qiáng)毒力株經(jīng)氣管進(jìn)行攻擊。在攻擊當(dāng)天，冷凍(-70°C )肺勻漿(LI-34)的強(qiáng)毒力豬肺炎支原體攻擊原種在溫 水中進(jìn)行快速解凍，并且用進(jìn)行稀釋(1 100稀釋度)。用由50mg/ml賽拉嗪、50mg/ml氯 胺酮和100mg/ml Telazol組成的賽拉嗪-氯胺酮-Telazol 的混合物使豬鎮(zhèn)靜。每頭豬 經(jīng)氣管給予IOml攻擊材料。為了確保針?lè)胖?，在施用攻擊材料前將空氣抽取到注射器?nèi)。 所有豬在攻擊后就臨床癥狀每天進(jìn)行觀(guān)察。在第0、14、28和56天時(shí)，豬就血清進(jìn)行采血。通過(guò)ELISA測(cè)定豬針對(duì)豬肺炎支原 體攻擊的血清學(xué)應(yīng)答。在攻擊后4周，對(duì)來(lái)自組1-3的所有豬實(shí)施安樂(lè)死，并且取出肺。測(cè) 試組是不知情的并且對(duì)于肉眼可見(jiàn)的肺損害進(jìn)行評(píng)分。非典型豬肺炎支原體損害進(jìn)行福爾 馬林固定用于后續(xù)組織病理學(xué)評(píng)估。收集來(lái)自受累肺的拭子樣品用于細(xì)菌分離。關(guān)于組1中的豬的平均肺損害得分(5. 9% )比安慰劑組(14. 8% )小約50%。當(dāng) 統(tǒng)計(jì)分析就窩進(jìn)行調(diào)整時(shí)，當(dāng)與對(duì)照相比較時(shí)，關(guān)于組1的減輕部分是肺損害嚴(yán)重度中的 69. 2%減少。這些數(shù)據(jù)概括于表4中。所有豬在第一次施用當(dāng)天時(shí)是血清反應(yīng)陰性的，指 示豬對(duì)豬肺炎支原體感染敏感。除SP-Oil組中的一頭(1)豬外，豬在第一次疫苗接種后并
19未血清轉(zhuǎn)化。接受SP-Oil佐劑化疫苗組合物的所有豬在第二次接種疫苗(shot)后發(fā)展抗 體應(yīng)答。血清學(xué)應(yīng)答證實(shí)引發(fā)針對(duì)豬肺炎支原體的免疫應(yīng)答(關(guān)于血清學(xué)結(jié)果參考表9)。表 4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析必須符合對(duì)于視為對(duì)豬肺炎支原體有效的疫苗，關(guān)于肺損害中的 減少的減輕部分(< 50%低置信水平> 30% )的標(biāo)準(zhǔn)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)證實(shí)當(dāng)在體內(nèi) 施用于動(dòng)物時(shí)，無(wú)毒活佐劑化豬肺炎支原體可以有利地用于引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。盡管本發(fā)明已在其各種實(shí)施方案各自中進(jìn)行描述，但預(yù)期其的特定修飾可以由本 領(lǐng)域技術(shù)人員采取并且實(shí)現(xiàn)，而不背離如先前說(shuō)明書(shū)中所述且如下述權(quán)利要求中進(jìn)一步體 現(xiàn)的本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍。本公開(kāi)內(nèi)容并不限于通過(guò)本文描述的特定實(shí)施方案的范圍 內(nèi)。事實(shí)上，根據(jù)前述說(shuō)明書(shū)和附圖
，除本文描述那些外的本發(fā)明的各種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技 術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。此類(lèi)修飾預(yù)期包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。應(yīng)進(jìn)一步理解所有 值都是近似的，并且提供用于描述。本文引用的所有專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引用合并入 本文。實(shí)施例3 豬肺炎支原體無(wú)毒力活菌株_經(jīng)修飾的活的豬環(huán)狀病毒1型_2型嵌合 體中豬肺炎支原體部分的初步免疫原性研究在3-4周大的豬中的聯(lián)合疫苗這個(gè)實(shí)施例公開(kāi)了當(dāng)在3-4周大的豬中肌內(nèi)(IM)或鼻內(nèi)(IN)施用時(shí)聯(lián)合疫苗的 功效，所述聯(lián)合疫苗包括佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體J(FCX3-linel)菌株和豬環(huán)狀病毒 (PCV) 1型-2型嵌合體活疫苗(cPCVl-2 ；參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，279，166和7，276，353)。這種 聯(lián)合疫苗(PCV/MH)適合于用于健康豬的疫苗接種，作為幫助預(yù)防和/或減少由豬肺炎支原 體和豬環(huán)狀病毒引起的疾病的嚴(yán)重度。靶向的測(cè)試疫苗應(yīng)包含約4.0 Log10 FAID5tl/劑量的cPCVl經(jīng)修飾的活病毒和 4xl08CFU/劑量的豬肺炎支原體J菌株(關(guān)于FAID方法，參見(jiàn)King等人，Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29 :85_89(1965)和美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，824，785)。韁 疫苗佐劑化為包含10% (v/v) SP-Oil終濃度。安慰劑疫苗是無(wú)菌生理鹽水。在這個(gè)研究中采用總共66頭3-4周大的豬。16頭豬肌內(nèi)施用一次2ml PCV/MH活 疫苗并且進(jìn)行攻擊(組1) ；15頭豬肌內(nèi)施用2次(相隔2周)2ml PCV/MH活疫苗并且進(jìn)行 攻擊(組2) ；15頭豬鼻內(nèi)施用2次(相隔2周)2ml(lml/鼻孔)PCV/MH活疫苗并且進(jìn)行攻 擊(組3) ;15頭豬不施用PCV/MH活疫苗并且進(jìn)行攻擊(組4)；并且5頭豬充當(dāng)環(huán)境對(duì)照 (組 5)。在本文公開(kāi)的研究中使用的疫苗是MH凍干活抗原(批次#1744-56)和包含PCV(LotC108-56)活疫苗的稀釋物的組合。在疫苗接種當(dāng)天，凍干的活MH團(tuán)塊用包含PCV 活病毒的稀釋物(用10% SP Oil佐劑化的4. OLogltlFAID5ciAiL)進(jìn)行再水合。最終疫苗指 定Lot#2315-30。關(guān)于MH部分的活力在疫苗接種前和后分別測(cè)定為3. 18xl08CFU/mL (前) 和1. 65xl08CFU/mL (后)。疫苗接種前和后關(guān)于疫苗的PCV滴度分別為4. 09Log10FAID50和 3. 7Log10FAID50O關(guān)于第二次疫苗接種的疫苗如上制備并且指定Lot# 2315-32。關(guān)于MH部 分的活力在疫苗接種前和后分別為1. 24xl08CFU/mL和1. 5xl08CFU/mL。關(guān)于PCV部分的活 力分別為 4. 36Log10FAID50 和 3. 83Log10FAID50。豬在疫苗接種后就對(duì)疫苗的任何不良反應(yīng)觀(guān)察7天。3頭豬由于非MH或PCV相關(guān) 病因在疫苗接種后的觀(guān)察期內(nèi)死亡。來(lái)自疫苗接種后時(shí)期的臨床觀(guān)察的概括在表5中。表 5 NA:未應(yīng)用IN:鼻內(nèi)IM:肌內(nèi) 組1-4中的所有豬用豬肺炎支原體的強(qiáng)毒力株(包含強(qiáng)毒力MH(LI_34)的豬肺勻 漿)進(jìn)行攻擊。來(lái)自組1的豬在第一次疫苗接種后4周進(jìn)行攻擊。組2-4中的豬在第二次 疫苗接種后2周進(jìn)行攻擊。在攻擊后4周時(shí)，組1-5中的所有豬進(jìn)行尸檢，并且評(píng)估肺損害。
疫苗在疫苗接種當(dāng)天前進(jìn)行滴定，無(wú)毒力豬肺炎支原體的凍干培養(yǎng)物在疫苗接種 當(dāng)天進(jìn)行再水合。疫苗中的豬肺炎支原體生物體的濃度是約2xl08CFU/ml。保留疫苗樣品， 并且在疫苗接種前和后執(zhí)行活力測(cè)定法，以證實(shí)實(shí)際CFU/ml。疫苗在疫苗接種過(guò)程期間保 持在冰上。所有豬就溫度和臨床體征每天進(jìn)行觀(guān)察，從每次疫苗接種前2天開(kāi)始，在每次疫 苗接種后持續(xù)7天。豬就臨床癥狀進(jìn)行觀(guān)察，所述臨床癥狀包括但不限于咳嗽、噴嚏、流涕、 沮喪、食欲不振和用力呼吸。在第二次疫苗接種后14天，組1-4中的豬用豬肺炎支原體的 強(qiáng)毒力株經(jīng)氣管進(jìn)行攻擊。在攻擊當(dāng)天，強(qiáng)毒力豬肺炎支原體攻擊原種，冷凍(-70°C)肺勻漿(LI-34)在溫水 中進(jìn)行快速解凍，并且使用無(wú)菌豬肺炎支原體生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋(1 100稀釋度)。用 包括50mg/ml賽拉嗪、50mg/ml氯胺酮和100mg/ml Telazol的賽拉嗪-氯胺酮-Telazol 的混合物使豬鎮(zhèn)靜。每頭豬經(jīng)氣管給予IOml攻擊材料。為了確保針?lè)胖茫谑┯霉舨牧?前將空氣抽取到注射器內(nèi)。所有豬在攻擊后就臨床體征每天進(jìn)行肉眼觀(guān)察。對(duì)于任何異常臨床體征每天進(jìn)行 觀(guān)察。在研究的第0、14、28和56天時(shí)，豬就血清進(jìn)行采血(不超過(guò)13ml全血)。收集血清 但不進(jìn)行評(píng)估。在未來(lái)使用在研究期間收集的血清可以執(zhí)行ELISA，以測(cè)定豬的血清學(xué)應(yīng)答。在攻擊后4周，對(duì)來(lái)自組1-5的所有豬實(shí)施安樂(lè)死，并且取出肺。非典型豬肺炎支 原體損害進(jìn)行福爾馬林固定，并且就組織病理學(xué)檢查樣品。收集來(lái)自受累肺的拭子樣品用 于細(xì)菌分離。對(duì)在攻擊后死亡的豬進(jìn)行尸檢，并且如上所述收集樣品。疫苗功效定義為比 對(duì)照的組合平均肺損害得分小50%的疫苗接種的組合平均肺損害得分。在尸檢當(dāng)天時(shí)，對(duì)所有豬實(shí)施安樂(lè)死，并且給肺損害評(píng)分，并且擦拭用于細(xì)菌分 離。從拭子中分離的細(xì)菌由下述組成溶血葡萄球菌(Staphylococcus heamolyticus)、 豬鏈球菌(P322)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、化膿棒狀桿菌 (A. pyogenes)、氣球菌屬(aerococus)物種、乳房鏈球菌(S. uberis)、支氣管炎博德特菌 (P344)和微桿菌屬。關(guān)于肺損害得分的統(tǒng)計(jì)分析在表6中。表6 LCL一低置信水平
MF一減輕部分
數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析必須符合關(guān)于肺損害中減少的減輕部分(<50％，其中LCL>30％)的標(biāo)準(zhǔn)。這個(gè)實(shí)施例證實(shí)(a)用以3．18Xlo‘CFU／mL工M施用的2ml劑量，MH／PCV疫苗關(guān)于MH部分的功效，和(b)由于缺乏在疫苗接種后與MH或PCV相關(guān)的臨床體征，MH/PCV疫 苗的安全性。實(shí)施例4 在3-4周大的豬中，豬肺炎支原體無(wú)毒力活菌株_豬環(huán)狀病毒1型-2型 嵌合體經(jīng)修飾的活的聯(lián)合疫苗中豬肺炎支原體部分的免疫原性研究這個(gè)實(shí)施例公開(kāi)了支持來(lái)自實(shí)施例4中呈現(xiàn)的研究的結(jié)果的免疫原性研究，并且 證實(shí)當(dāng)肌內(nèi)施用時(shí)，豬肺炎支原體無(wú)毒力活菌株-豬環(huán)狀病毒1型-2型(cPCVl-2)嵌合體 經(jīng)修飾的活疫苗的聯(lián)合疫苗(MH/PCV)中豬肺炎支原體部分的功效。本文公開(kāi)的MH/PCV疫 苗可以適當(dāng)?shù)赜糜诮】地i的疫苗接種，作為幫助預(yù)防由豬肺炎支原體和豬環(huán)狀病毒引起的 疾病的嚴(yán)重度和/或使由豬肺炎支原體和豬環(huán)狀病毒引起的疾病的嚴(yán)重度降到最低。在本研究中使用的豬是如通過(guò)ELISA測(cè)定對(duì)于豬肺炎支原體血清反應(yīng)陰性的?？偣?9頭3-4周大的豬隨機(jī)化為4個(gè)組。24頭豬，組1，用聯(lián)合PCV/MH活疫苗的 單劑量進(jìn)行疫苗接種。24頭豬，組2，用聯(lián)合疫苗進(jìn)行疫苗接種2次，相隔2周；24頭豬，組 3，用生理鹽水進(jìn)行疫苗接種2次，相隔2周，以充當(dāng)攻擊對(duì)照。所有疫苗肌內(nèi)施用。4頭豬， 組4，不進(jìn)行疫苗接種也不進(jìn)行攻擊，并且充當(dāng)環(huán)境對(duì)照。在該研究中使用的疫苗是MH凍干活抗原(Lotl744_66)和包含PCV(cPCVl_2 LotC108-56)活疫苗的稀釋物的組合。在疫苗接種當(dāng)天，凍干的活MH團(tuán)塊用包含PCV活 病毒的稀釋物(用10% SP Oil佐劑化的3. 5Log10FAID50/mL)進(jìn)行再水合。最終疫苗指 定Lot2315-40。關(guān)于MH部分的活力在疫苗接種前和后分別測(cè)定為2. 09xl08CFU/mL和 1. 56xl08CFU/mL。安慰劑疫苗是無(wú)菌生理鹽水。用于第二次疫苗接種的疫苗如上制備并且指定Lot# 2315-42。關(guān)于MH部分的活 力在疫苗接種前和后分別為1. 05xl08CFU/mL和6. 72xl07CFU/mL。關(guān)于PCV部分稀釋物的 活力為 3. 44Log10FAID50O疫苗在疫苗接種當(dāng)天前進(jìn)行滴定。無(wú)毒力豬肺炎支原體的凍干培養(yǎng)物在疫苗接種 當(dāng)天進(jìn)行再水合。保留疫苗樣品，并且在疫苗接種前和后執(zhí)行活力測(cè)定法，以測(cè)定CFU/ml。 疫苗在疫苗接種過(guò)程期間保持在冰上。所有豬就溫度和臨床體征每天進(jìn)行觀(guān)察，從每次疫苗接種前2天開(kāi)始，在每次疫 苗接種后持續(xù)7天。豬就臨床癥狀進(jìn)行觀(guān)察，所述臨床癥狀包括但不限于咳嗽、噴嚏、流涕、 沮喪、食欲不振和用力呼吸。豬在疫苗接種后就對(duì)疫苗的任何不良反應(yīng)觀(guān)察7天。3頭豬由于非MH或PCV相 關(guān)病因在疫苗接種后的觀(guān)察期內(nèi)死亡。來(lái)自疫苗接種后時(shí)期的臨床觀(guān)察的概括在表7中發(fā) 現(xiàn)。表 7 NA:未應(yīng)用組1-3中的所有豬在約7周大時(shí)用豬肺炎支原體的強(qiáng)毒力株進(jìn)行攻擊。來(lái)自組1 的豬在第一次疫苗接種后4周進(jìn)行攻擊。組2和3中的豬在第二次疫苗接種后2周進(jìn)行攻 擊。強(qiáng)毒力豬肺炎支原體攻擊原種，冷凍(-70°C )肺勻漿(LI-34)在溫水中進(jìn)行快速解凍， 并且使用無(wú)菌豬肺炎支原體生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋(1 100稀釋度)。用包括50mg/ml賽 拉嗪、50mg/ml氯胺酮和100mg/ml Telazol的賽拉嗪-氯胺酮-Telazol 的混合物使豬鎮(zhèn) 靜。每頭豬經(jīng)氣管給予IOml攻擊材料。在研究的第0、14、28和56天時(shí)，豬就血清進(jìn)行采血。使用本領(lǐng)域眾所周知的ELISA 方法，對(duì)從這個(gè)研究中收集的血清樣品可以進(jìn)行測(cè)試，以評(píng)估針對(duì)豬肺炎支原體和PCV2的 動(dòng)物血清學(xué)應(yīng)答。使用商購(gòu)可得的ELISA測(cè)試試劑盒，可以就針對(duì)豬肺炎支原體、豬流感 (HlNl)以及豬繁殖和呼吸綜合征(PRRS)的抗體對(duì)從疫苗接種后0天(ODPV)和攻擊后0天 (ODPC)收集的血清樣品進(jìn)行測(cè)試。在攻擊后4周(28DPC)，對(duì)來(lái)自組1_4的所有豬實(shí)施安樂(lè)死，并且取出肺。記錄肺 損害得分，并且對(duì)典型豬肺炎支原體損害進(jìn)行福爾馬林固定。就組織病理學(xué)檢查樣品。收 集來(lái)自一個(gè)豬肺炎支原體受累肺葉的拭子樣品用于細(xì)菌分離，用于繼發(fā)感染的檢測(cè)。此外， 收集支氣管肺泡灌洗液。肺用磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行灌洗，并且將所得到的液體等分用于通 過(guò)PCR的測(cè)試。對(duì)于肺損害嚴(yán)重度中的減少的評(píng)估，評(píng)估量是減輕部分(MF)統(tǒng)計(jì)值。減輕部分計(jì) 算為
其中W1 = Wilcoxon 秩和統(tǒng)計(jì)值nc =對(duì)照組中的受試者數(shù)目nv =疫苗接種組中的受試者數(shù)目計(jì)算關(guān)于減輕部分的95%置信區(qū)間。對(duì)于肺損害嚴(yán)重度中的減少的要求H0 =Mv = Mc
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HA :MV MC其中Mv =疫苗接種組中的肺損害得分的中值Mc =對(duì)照組中的肺損害得分的中值使用PROC UNIVARIATE評(píng)估連續(xù)輸出變量的頻率分布，所述PROCUNIVARIATE執(zhí) 行來(lái)自單個(gè)群體的樣品的參數(shù)和非參數(shù)分析。(SASInstitute Inc. , Cary NC) 0抗體滴度 的對(duì)數(shù)變換用于達(dá)到對(duì)于參數(shù)檢驗(yàn)所需的正態(tài)假設(shè)。通過(guò)卡方進(jìn)行基線(xiàn)評(píng)估，以評(píng)估組就 窩和室而言的可比性。通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較每個(gè)疫苗接種組和對(duì)照組之間的肺損 害嚴(yán)重度(PROC NPAR1WAY，其中肺損害得分作為因變量并且處理包括作為自變量。PROC NPAR1WAY執(zhí)行關(guān)于跨越單向分類(lèi)的位置和比例差異的非參數(shù)檢驗(yàn)；PROC NPAR1WAY還提供 基于經(jīng)驗(yàn)分布函數(shù)關(guān)于原始數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的變量的標(biāo)準(zhǔn)分析。(SAS Institute Inc. ,Cary NC)。所有統(tǒng)計(jì)分析將使用SAS系統(tǒng)執(zhí)行。在其中如通過(guò)常態(tài)性W檢驗(yàn)測(cè)定的，變換不 改善關(guān)于任何經(jīng)變換的變量的殘數(shù)分布的情況下，需要時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。顯著水平將設(shè) 為 ρ < 0. 05。在尸檢當(dāng)天，對(duì)所有豬實(shí)施安樂(lè)死，給肺損害評(píng)分，并且擦拭用于細(xì)菌分 離。還收集支氣管肺泡灌洗(BAL)。從拭子中分離的細(xì)菌由下述組成放線(xiàn)桿菌屬 ^J 禾中(Actinobacillus species) > τ Ρ ^ fe ^ (Moraxella osloensis)、il 求胃 (Streptococcus sanguinis)、化膿棒狀桿菌和支氣管炎博德特菌。通過(guò)PCR方法就MH測(cè)試 BAL樣品；記錄具有損害的來(lái)自環(huán)境對(duì)照組的2個(gè)樣品，以及在疫苗接種和對(duì)照組中的具有 低損害得分的2個(gè)樣品。關(guān)于具有損害的來(lái)自環(huán)境對(duì)照組的2頭豬的BAL樣品是陰性的， 并且在疫苗接種組中具有低損害得分的2頭豬是陽(yáng)性的。關(guān)于肺損害得分的統(tǒng)計(jì)分析在表 8中。表8 LCL =低置信水平MF =減輕部分 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析必須符合關(guān)于肺損害中的減少的減輕部分(< 50%，其中LCL > 30% )的標(biāo)準(zhǔn)。用以2. 09xl08CFU/mL單劑量或雙劑量IM施用的2ml劑量，疫苗對(duì)于MH部 分視為有效的。此外，由于在疫苗接種后缺乏與MH或PCV相關(guān)的臨床體征，該疫苗視為安全的。表9關(guān)于實(shí)施例2的血清學(xué)結(jié)果 組1 :SP Oil疫苗(接種疫苗且攻擊)組2 對(duì)照/攻擊(未接種疫苗且攻擊)組3 非攻擊對(duì)照(未接種疫苗且未攻擊)ODPVl和0DPV2 數(shù)目指示在疫苗的第一次劑量(ODPVl)后或在疫苗的第二次劑量 (0DPV2)后，在ELISA測(cè)試中為陽(yáng)性的最高稀釋度。ODPC 數(shù)目指示攻擊后的ELISA結(jié)果。較高數(shù)指示血清轉(zhuǎn)換。肺得分?jǐn)?shù)目指示動(dòng)物肺中的損害百分比。較高數(shù)指示由于缺乏保護(hù)性免疫，肺損 害的較大數(shù)目。較低數(shù)指示由于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，具有較少損害的較健康的豬。
權(quán)利要求
用于在動(dòng)物中引發(fā)抗豬肺炎支原體免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包括免疫有效量的豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株和生物學(xué)上可接受的佐劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株是其基因組包括與參 考J菌株的核酸序列具有至少約90%同源性的核酸序列的菌株。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株是與參考J菌株具有 至少約70%多態(tài)同一性的菌株。
4.權(quán)利要求2或3中任一的組合物，其中所述參考J菌株是具有ATCC登記號(hào)25934或 27715的菌株。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其中所述豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株是指定為 ATCC登記號(hào)25934或27715的J菌株。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株是指定為ATCC登記號(hào) 27715的J菌株。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其中所述生物學(xué)上可接受的佐劑選自SL-⑶、 Carbopol和SP-Oil中的一種或多種。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述生物學(xué)上可接受的佐劑包括SP-0il。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述SP-Oil以約至約25%的濃度存在。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述SP-Oil以約10%的濃度存在。
11.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步包括選自下述的一種或多種活細(xì)菌、 死菌苗和/或一種或多種經(jīng)純化的類(lèi)毒素副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸膜 炎肺炎放線(xiàn)桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、豬紅斑丹毒絲菌和螺旋體細(xì)菌。
12.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步包括選自豬流感病毒(SIV)抗原、豬 繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原、表達(dá)PRRS或其他抗原的浣熊痘病毒、表達(dá)PRRS或其 他抗原的TGEV、和豬環(huán)狀病毒(PCV)抗原的一種或多種病毒抗原。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述豬環(huán)狀病毒(PCV)抗原是豬環(huán)狀病毒1型-2型 (cPCVl-2)嵌合體。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的組合物，其中通過(guò)豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株引發(fā)的 所述免疫應(yīng)答保護(hù)動(dòng)物免受由豬肺炎支原體的強(qiáng)毒力株的感染，或減少與由豬肺炎支原體 的強(qiáng)毒力株的感染相關(guān)的至少一種癥狀的嚴(yán)重度。
15.用于保護(hù)動(dòng)物免受與豬肺炎支原體的強(qiáng)毒力株相關(guān)的疾病，或用于預(yù)防或減少與 所述疾病相關(guān)的至少一種癥狀的方法，所述方法包括給所述動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求1-14 中任一項(xiàng)的組合物的步驟。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述施用步驟通過(guò)腸胃外施用來(lái)實(shí)現(xiàn)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述腸胃外施用步驟通過(guò)肌內(nèi)注射來(lái)實(shí)現(xiàn)。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述施用步驟通過(guò)口部施用來(lái)實(shí)現(xiàn)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述口部施用步驟通過(guò)手工遞送或批量應(yīng)用來(lái)實(shí)現(xiàn)。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述施用步驟通過(guò)鼻部施用來(lái)實(shí)現(xiàn)。
21.權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述動(dòng)物是豬。
22.預(yù)防或改善豬肺炎支原體的爆發(fā)的方法，其包括給動(dòng)物施用權(quán)利要求1-14中任一 項(xiàng)的組合物的步驟。
23.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物是免疫原性組合物。
24.權(quán)利要求23的免疫原性組合物，其中所述生物學(xué)上可接受的佐劑選自SL-CD、 Carbopol和SP-Oil中的一種或多種。
25.權(quán)利要求24的免疫原性組合物，其中所述生物學(xué)上可接受的佐劑包括SP-Oil。
26.權(quán)利要求25的免疫原性組合物，其中所述SP-Oil以約至約25%的濃度存在。
27.權(quán)利要求26的免疫原性組合物，其中所述SP-Oil以約10%的濃度存在。
28.權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包括選自下述的一種或多 種活細(xì)菌、死菌苗和/或一種或多種經(jīng)純化的類(lèi)毒素副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈 球菌、胸膜炎肺炎放線(xiàn)桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、豬紅斑丹毒絲菌和螺旋 體細(xì)菌。
29.權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包括選自豬流感病毒(SIV) 抗原、豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原、表達(dá)PRRS或其他抗原的浣熊痘病毒、表達(dá) PRRS或其他抗原的TGEV、和豬環(huán)狀病毒(PCV)抗原的一種或多種病毒抗原。
30.權(quán)利要求29的免疫原性組合物，其中所述豬環(huán)狀病毒(PCV)抗原是豬環(huán)狀病毒1 型-2型(cPCVl-2)嵌合體。
31.用于增強(qiáng)針對(duì)豬肺炎支原體的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給動(dòng)物施用一次或 多次劑量的根據(jù)權(quán)利要求23-30中任一項(xiàng)的免疫原性組合物的步驟。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株是其基因組包括與參 考J菌株的核酸序列具有至少約90%同源性的核酸序列的菌株。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株是與參考J菌株具有 至少約70%多態(tài)同一性的菌株。
34.權(quán)利要求32-33中任一的方法，其中所述參考J菌株是具有ATCC登記號(hào)25934或 27715的菌株。
35.權(quán)利要求32-33中任一的方法，其中所述豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株是指定為 ATCC登記號(hào)25934或27715的J菌株。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株是指定為ATCC登記號(hào) 27715的J菌株。
37.用于增強(qiáng)針對(duì)豬肺炎支原體的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括步驟a)在第一次時(shí)，給動(dòng)物施用第一種免疫原性組合物，其包括用生物學(xué)上可接受的佐劑 材料佐劑化的免疫有效量的無(wú)毒力活豬肺炎支原體菌株；b)在第二次時(shí)，給動(dòng)物施用第二種免疫原性組合物，其包括用生物學(xué)上可接受的佐劑 材料佐劑化的免疫有效量的無(wú)毒力活豬肺炎支原體。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述豬肺炎支原體的無(wú)毒力活菌株是如權(quán)利要求2-10中 任一項(xiàng)中定義的菌株。
全文摘要
提供了免疫原性和疫苗組合物以及關(guān)于其制備和使用的方法，所述組合物在保護(hù)免受豬肺炎支原體感染、使豬肺炎支原體感染的嚴(yán)重度降到最低、預(yù)防或改善豬肺炎支原體感染中是有效的。給動(dòng)物施用一次或兩次劑量的本文公開(kāi)的佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體組合物在給動(dòng)物提供免疫和保護(hù)免受由豬肺炎支原體的強(qiáng)毒力株感染中是有效的，從而減少由豬肺炎支原體的一種或多種強(qiáng)毒力株引起的疾病的嚴(yán)重度、和/或預(yù)防由豬肺炎支原體的一種或多種強(qiáng)毒力株引起的疾病。還提供了組合物，其進(jìn)一步包括一種或多種抗原，例如一種或多種活細(xì)菌、死菌苗、類(lèi)毒素和/或病毒和/或病毒抗原。例示的是包括佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體的免疫原性組合物，和在與佐劑化無(wú)毒力活豬肺炎支原體的進(jìn)一步組合中包括豬環(huán)狀病毒1型-2型嵌合體經(jīng)修飾的活疫苗(cPCV1-2)的組合物。
文檔編號(hào)C07K14/30GK101883581SQ200880118541
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月6日
發(fā)明者H-J·楚, N·R·吉布森, W·李, Z·徐 申請(qǐng)人:惠氏有限責(zé)任公司