專利名稱：結合人樹突和上皮細胞205(dec-205)的抗體的制作方法
結合人樹突和上皮細胞205(DEC-205)的抗體相關申請本申請要求2007年11月7日提交的美國臨時申請61/002253和2008年9月10 日提交的美國臨時申請61/191551的優(yōu)先權，這些申請的內容通過參考并入本文。
背景技術：
樹突細胞(DC)是免疫系統的特化細胞。DC具有通過以結合到細胞表面主要組織 相容性復合物(MHC)分子上的肽的形式呈遞抗原以啟動初級和次級T和B淋巴細胞應答的 獨特能力。樹突細胞的抗原呈遞功能已經與人樹突和上皮細胞205受體(DEC-205)的高水 平表達相關聯(Jiang 等(1995) Nature 375(11) 151)。DEC-205是主要在樹突細胞上發(fā)現的內吞受體，但是也在B細胞、腦毛細血管、骨 髓間質、腸絨毛和肺氣道的上皮以及胸腺的外質上皮和周圍淋巴器官的T細胞區(qū)域中的樹 突細胞上發(fā)現。DEC-205在淋巴器官的T細胞區(qū)域中的DC上高水平表達(Kraal等(1986) J. Exp. Med. 163 981 ；Witmer-Pack 等(1995) Cell. Immunol. 163 :157)。DEC-205 具有 10 個 膜外部的、相鄰的C型凝集素結構域(同上；Mahnke等(2000) J. Cell Biol. 151 :673)，這些 結構域介導體內抗原的有效加工和在MHC II類產物上的呈遞(Hawiger等(2001) J.Exp. Med. 194 769)。已經證明，通過DEC-205吸收途徑靶向至DC的少量的注射抗原能夠誘導實 體周圍 CD8+T 細胞耐受性(Bonifaz 等(2002) J. Exp. Med. 196(12) 1627)。盡管最近在樹突細胞的表征方面取得了進展，但是關于樹突細胞特異性受體如 DEC-205所知甚少，并且很少能夠獲得樹突細胞特異性的試劑。與樹突細胞特異性或優(yōu)先反 應(例如通過DEC-205)的試劑，特別是抗體，具有作為靶向試劑誘導對腫瘤或傳染病抗原 的強免疫應答的巨大潛力。這些細胞特異性靶向劑可以被工程化，以遞送毒素，從而消除骨 髓和器官移植或其它自身免疫病中的強抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞)。因此，這些樹突 細胞特異性結合試劑具有巨大的治療和診斷價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供結合人DEC-205并且顯示特定性質的分離的抗體，例如人抗體。本發(fā) 明也提供含有這種抗體的疫苗偶聯物、雙特異性分子和治療組合物。因此，本發(fā)明的抗體和 組合物可以在多種樹突細胞靶向的治療中使用，例如，用以增強抗原呈遞和/或誘導針對 多種靶細胞或病原體的T細胞應答，如細胞毒性T細胞(CTL)應答，或治療抗原呈遞細胞 (APC)介導的疾病。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體顯示一種或多種以下性質(1)根據表面等離 子體共振測定，以至少IO8M-1的親和常數結合人DEC-205 ； (2)在結合表達DEC-205的人樹 突細胞后內化；(3)產生或增強對抗原(可能與抗體連接)的人T細胞應答，例如CD4+和 ⑶8+(CTL)T細胞應答，適當地由MHC I類和/或II類途徑介導；和(4)誘導周圍⑶8+T細 胞耐受性。此外，抗體可以與非人靈長類動物或其它物種的樹突細胞上的DEC-205交叉反 應。再另外，抗體可以適當地顯示一種或多種另外的性質，包括，例如(1)選擇性結合位于人DEC-205胞外域上的表位，該胞外域例如是一個或組合的富含半胱氨酸的結構域、FnII 結構域，或10個C-型凝集素樣結構域中的一個或多個；和(2)定位于細胞中的抗原加工區(qū)室。本發(fā)明的抗體的具體實例包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，該可變區(qū)利用特定人種系，即 被種系基因編碼，但是包括在抗體成熟過程中發(fā)生的基因重排和突變，例如體細胞突變。在 一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)利用人種系Vh 3-33基因并且包含SEQ ID N0:4、16、28、40、52、76和88的任一個中相比SEQ ID NO :95的至少一個氨基酸置換?；蛘撸?重鏈可變區(qū)利用人種系Orph-C 16基因并且包含SEQ ID NO :64和70任一個中相比SEQ ID NO 96的至少一個氨基酸置換。在另一個實施方案中，抗體的輕鏈可變區(qū)選自一個區(qū)域，該區(qū)域(a)利用人種系 VK1-L15基因并且包含SEQ ID NO 10中相比SEQ IDNO 94的至少一個氨基酸置換；(b)利 用人種系VK1-L4基因并且包含SEQ ID NO :22或82的任一個中相比SEQ ID NO :93的至少 一個氨基酸置換；或(c)利用人種系VK3-L6基因并且包含SEQ ID NO :34、46、58的任一個 中相比SEQ ID NO 92的至少一個氨基酸置換。在另一個實施方案中，重鏈可變區(qū)CDR3序列選自SEQ ID NO :7、19、31、43、55、67、 73、79、91及其保守序列修飾(例如，保守氨基酸置換)。該抗體可以進一步包括選自SEQ ID而13、25、37、49、61、85及其保守序列修飾的輕鏈可變區(qū)0 3序列。在另一個實施方 案中，重鏈 CDR2 和 CDRl 序列分別選自 SEQ ID NO :6、18、30、42、54、66、72、78、90 和 SEQ ID NO :5、17、29、41、53、65、71、77、89，及其保守序列修飾。輕鏈CDR2和CDRl序列分別選自SEQ ID NO :12、24、36、48、60、84 和 SEQ ID NO :11、23、35、47、59、83，及其保守序列修飾。 在又另一個實施方案中，本發(fā)明提供結合DEC-205并且包括選自下組的重鏈和輕 鏈可變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的分離的抗體(i)包含SEQ ID NO 5的重鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 6的重鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 7的重鏈可變區(qū)CDR3 ；包含SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；或其保守序列修飾；(ii)包含 SEQ ID NO 17 的重鏈可變區(qū) CDRl ；包含SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)CDR3 ；包含SEQ ID NO 23的輕鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 24的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 25的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；或其保守序列修飾；(iii)包含 SEQ ID NO 29 的重鏈可變區(qū) CDRl ；包含SEQ ID NO 30的重鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 31的重鏈可變區(qū)CDR3 ；
包含SEQ ID NO 35的輕鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 36的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 37的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；或其保守序列修飾；(iv)包含 SEQ ID NO 41 的重鏈可變區(qū) CDRl ；包含SEQ ID NO 42的重鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 43的重鏈可變區(qū)CDR3 ；包含SEQ ID NO 47的輕鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 48的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 49的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；或其保守序列修飾；(ν)包含SEQ ID NO 53的重鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 54的重鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 55的重鏈可變區(qū)CDR3 ；包含SEQ ID NO 59的輕鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 60的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 61的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；或其保守序列修飾；(vi)包含 SEQ ID NO 77 的重鏈可變區(qū) CDRl ；包含SEQ ID NO 78的重鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 79的重鏈可變區(qū)CDR3 ；包含SEQ ID NO 83的輕鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 84的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；包含SEQ ID NO 85的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；或其保守序列修飾.例如，分離的抗體結合人DEC-205并且包含包含SEQ ID NO 29的重鏈可變區(qū)CDRl包含SEQ ID NO 30的重鏈可變區(qū)CDR2包含SEQ ID NO 31的重鏈可變區(qū)CDR3包含SEQ ID NO 35的輕鏈可變區(qū)CDRl ；包含SEQ ID NO 36的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口包含SEQ ID NO 37的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個實施方案中，重鏈可變區(qū)⑶R3序列包含選自共有序列(A，G，Y，S，P，-) (P，W，S，R) (Y, A, H) F D(Y，L，V) (SEQ ID NO 99)的氨基酸序列，其中“_ “表示在該共有位 點不存在氨基酸殘基的選項。該抗體可以進一步包括輕鏈可變區(qū)CDR3序列，該序列包含選 自共有序列 Q Q(R，Y，F) (R，N) (Τ, S，N) (Y，W, -) (P，-) (Y，L，H，-) (Τ, -) (SEQ ID NO 102) 的氨基酸序列，其中“_ “表示在該共有位點不存在氨基酸殘基的選項。在另一個實施方案 中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自共有序列(V，I，F，T，A)I(W，G) (Y，Τ) (D，G) G (S，G，Y) (N， Τ) (K，P)Y(Y, A, V) (A, G，-)DSVKG(SEQ ID NO 98)的氨基酸序列，其中 “_ “表示在該共有位點不存在氨基酸殘基的選項，并且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自共有序列(D，A)A S(N, S) (R，L) (A, Q，Ε) (Τ, S) (SEQ ID NO 101)的氨基酸序列。在另一個實施方案中，重鏈可變 區(qū)CDRl序列包含選自共有序列(I, N, T，S)Y(G，N, A)M(H，Y) (SEQ ID NO 97)的氨基酸序 列；且輕鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自共有序列RASQ(SjG) (I，V) SS (Y，W，A) LA (SEQ ID NO 100)的氨基酸序列。在又另一個實施方案中，本發(fā)明提供結合DEC-205并且包括重鏈和輕鏈可變區(qū) ⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的分離的抗體，其包含⑴包含選自共有序列(I，N，T，S)Y(G，N，A)M(H，Y) (SEQ IDNO 97)的氨基酸序列 的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；(ii)包含選自共有序列(V, I，F，T，A) I (W, G) (Y，T) (D，G)G(S，G，Y) (N，Τ) (K，P) Y (Y，A, V) (A, G，-) DSVKG (SEQ ID NO 98)的氨基酸序列的重鏈可變區(qū) CDR2 ；(iii)包含選自共有序列(A，G，Y，S，P，_) (P，W，S，R) (Y，A，H)FD(Y，L，V) (SEQ ID NO 99)的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R3 ；(iv)包含選自共有序列 RASQ(S, G) (I, V) SS (Y, W, A) LA(SEQ ID NO 100)的氨基 酸序列的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(ν)包含選自共有序列(DjA)AS (N, S) (R，L) (A，Q，Ε) (Τ，S) (SEQ ID NO 101)的氨 基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和(vi)包含選自共有序列 Q Q(R，Y，F) (R，N) (Τ, S,N) (Y,W,-) (P,-) (Y，L，H，_) (T，_) (SEQ ID NO 102)的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3，其中“-“表示在該共有位點不存在氨
基酸殘基的選項。在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體結合人DEC-205并且包括重鏈可變 區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO :4、16、28、40、52、64、70、76、88及其保守序列修飾的 氨基酸序列。該抗體可以進一步包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包括選自SEQ ID NO 10, 22、34、46、58、82及其保守序列修飾的氨基酸序列。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體結合人DEC-205并且包括含有選自 下組的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(a)分別為SEQ ID NO 4和10，及其保守序列修飾；(b)分別為SEQ ID NO 16和22，及其保守序列修飾；(c)分別為SEQ ID NO 28和34，及其保守序列修飾；(d)分別為SEQ ID NO 40和46，及其保守序列修飾；(e)分別為SEQ ID NO 52和58，及其保守序列修飾；和(f)分別為SEQ ID NO 76和82，及其保守序列修飾·包括與上述任何序列具有至少80 %、或至少85 %、或至少90 %、或至少95 %、或至 少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%或更高序列同一性的重鏈和輕鏈可變區(qū)的 分離的抗體也包括在本發(fā)明中。以上引用的數值中間的范圍，例如，與上述任何序列具有至 少80-85%、85-90%、90-95%或95-100%序列同一性的重鏈和輕鏈可變區(qū)，也旨在包括在 本發(fā)明中。在另一個實施方案中，分離的抗體結合人DEC-205并且包括重鏈可變區(qū)，該重鏈 可變區(qū)包含選自SEQ ID NO :4、16、28、40、52、64、70、76、88的氨基酸序列，或其中重鏈可變
12區(qū)構架區(qū)內的至少一個氨基酸殘基被相應的種系殘基置換的序列。該抗體可以進一步包括 輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID N0:10、22、34、46、58、82的氨基酸序列，或其中 輕鏈可變區(qū)構架區(qū)內的至少一個氨基酸殘基被相應的種系殘基置換的序列。置換的氨基酸 殘基可以包括直接非共價結合抗原的殘基；與CDR相鄰的殘基；CDR-相互作用殘基；參與 VL-VH 界面的殘基；規(guī)范殘基(canonical residue)、游標區(qū)殘基(vernier zone residue) 或鏈 1、司堆禾只殘基(interchain packingresidue)。本發(fā)明也包括與本發(fā)明的抗體競爭結合DEC-205的分離的抗體。本發(fā)明的抗體可以是全長的，例如，以下任何同種型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、 IgA l、IgA2、IgAsec、IgD和IgE?；蛘?，該抗體可以是片段，如抗原結合部分或單鏈抗體(例 如，Fab、F(ab' )2、Fv、單鏈Fv片段、分離的互補決定區(qū)(OTR)或兩個或多個分離的⑶R的 組合)。本發(fā)明也提供一種分子偶聯物，其包含連接到抗原(包括片段、表位和抗原決定 簇)如病原體、腫瘤抗原或自身抗原的成分上的本發(fā)明的抗體。例如，所述抗原可以包括 腫瘤抗原，如 β hCG、gplOO 或 Pmel 17、CEA、gplOO、TRP-2、NY-BR-1、NY-C0-58、MN(gp250)、 獨特型、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2、MUC-I、MAGE-A3和高分子量-黑素瘤相關抗原(HMW-MAA) MARTl、melan-A, NY-ES0-1、MAGE-I、MAGE-3、WTl、Her2、間皮蛋白或高分子量-黑素瘤相關 抗原(HMW-MAA)。本文使用的術語“腫瘤抗原“優(yōu)選地是指存在于(或結合于)腫瘤細胞上而一般 不存在于正常細胞上的任何抗原或抗原決定簇，或以比正常(非腫瘤)細胞上更大的量存 在于或結合于腫瘤細胞上的抗原或抗原決定簇，或以不同于在正常(非腫瘤)細胞上發(fā)現 的形式存在于腫瘤細胞上的抗原或抗原決定簇。該術語因此包括腫瘤特異性抗原，包括腫 瘤特異性膜抗原、腫瘤相關抗原，包括腫瘤相關膜抗原、腫瘤上的胚胎抗原、生長因子受體、 生長因子配體和與癌癥有關的任何其它類型的抗原。腫瘤抗原可以是，例如，上皮癌抗原 (例如，乳癌、胃腸癌、肺癌)、前列腺特異性癌抗原(PSA)或前列腺特異性膜抗原(PSMA)、膀 胱癌抗原、肺(例如，小細胞肺)癌抗原、結腸癌抗原、卵巢癌抗原、腦癌抗原、胃癌抗原、腎 細胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、頭頸癌抗原或結腸直腸癌抗原。術語“片段”是指作為全長蛋白質或多肽的一部分的氨基酸序列，例如，大約8個 至大約1500個氨基酸長度，適當地為大約8個至大約745個氨基酸長度，適當地為大約8 個至大約300個，例如大約8個至大約200個氨基酸，或大約10個至大約50或100個氨基 酸長度。在另一個實施方案中，分子復合物進一步包括治療劑，如細胞毒性劑、免疫抑制劑 或化療劑。本發(fā)明還提供一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的本發(fā)明的抗體， 該第二功能部分具有與所述抗體不同的結合特異性。還提供了包含此處所述的抗體、分子偶聯物或雙特異性分子和藥學上可接受的載 體的組合物。該組合物進一步包含治療劑(例如，免疫抑制劑或與本發(fā)明的抗體不同的抗 體)。本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子以及包含這些核酸的表達載體和包 含這些表達載體的宿主細胞。而且，本發(fā)明提供包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因的轉基因小鼠，其中該小鼠表達本發(fā)明的抗體，以及由這種小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產 生本發(fā)明的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供將抗原靶向至受試者中的細胞(例如能夠呈遞 抗原的細胞(如外周血單個核細胞(PBMC)、單核細胞(如THP-1)、B類淋巴母細胞(如ClR. A2、1518 B-LCL)和單核細胞衍生的DC)的方法，包括施用與抗原連接的結合細胞上的受體 的分子(例如，以前所述的DEC-205抗體)。在一個實施方案中，被靶向的細胞(可為B細 胞)刺激MHC I類限制的T細胞。本發(fā)明的抗體和其它組合物也可以用來在受試者中誘導或增強針對抗原的免疫 應答(例如，T細胞介導的免疫應答)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種誘 導或增強針對抗原的CTL應答的方法，包括使抗原與結合抗原呈遞細胞上的受體例如人 DEC-205的抗體形成偶聯物。然后使該偶聯物在體內或離體接觸表達人DEC-205的細胞， 使得所述抗原以誘導或增強針對抗原的CTL應答(例如，由CD8+細胞毒性T細胞介導的應 答)的方式被內化、加工和呈遞給T細胞。在另一個實施方案中，這也用來誘導針對抗原的 輔助T細胞應答(例如，由⑶4+輔助T細胞介導的應答)。因此，免疫應答可以通過MHC I 類和MHC II類途徑誘導。表達DEC-205的細胞也可以接觸佐劑、刺激樹突細胞增殖的細胞 因子和/或免疫刺激劑，以進一步增強免疫應答。在另一個實施方案中，提供了檢測樣品中是否存在DEC-205或表達DEC-205的細 胞的方法，包括(a)在允許在抗體和DEC-205之間形成復合物的條件下使樣品接觸本發(fā)明 的抗體；和(b)檢測樣品中抗體和DEC-205之間復合物的形成。本發(fā)明的范圍內也包括試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的組合物(例如，抗體、分子 偶聯物、多特異性和雙特異性分子)和任選的使用說明。該試劑盒可以進一步包括至少一 種額外的試劑，如細胞因子或補體，或一種或多種額外的本發(fā)明的人抗體(例如，與第一人 抗體結合樹突細胞上不同表位的具有補體活性的人抗體)。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點通過下面的詳述和權利要求書將是明顯的。


圖1A-1I包括通過使用LSR 儀器(BD Biosciences, NJ, USA)的熒光分析，顯示人 抗-DEC-205 抗體(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、 1G6-1G6和3A4-1C10)與表達人DEC-205的CHO-S細胞結合的圖。圖2A-2I包括通過流式細胞分析，顯示人抗-DEC-205抗體(3D6_2F4、3D6_4C8、 3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10)與人樹突細胞 上的DEC-205的結合的圖。圖 3 是顯示使用 ELISA 檢測的人抗-DEC-205 抗體(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9_2D2、 5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10)與 DEC-205 的結合的圖。圖4A-4C顯示使用共聚焦顯微鏡檢查，與對照(FITC-人IgGl)相比，FITC-標記 的HuMab (FITC-3G9-2D2)向樹突細胞的內化。圖 5 是人 VH 和 VK 種系序列與抗-DEC-205 抗體(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9_2D2、 5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5C3-2_3F6、1E6-3D10)的 VH 禾口 VK 序列的比對。該圖以出 現的順序分別披露了 SEQ ID NO 92、34、46、58、93、82、22、94、10、95、4、16、103-105、76、88、96、106 和 70。圖 6 顯示人抗 DEC-205 抗體(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、3C7_3A3、 2D3-1F5-2A9、1E6-3D10、5C3-2_3F6、5D12-5G1)的 VH CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的比對。圖 7 顯示人抗-DEC-205 抗體(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、3C7_3A3、 5C3-2-3F6)的人抗 DEC-205HuMab VK CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的比對。圖8顯示抗DEC-205/抗原融合APC靶向疫苗構建體的實例的示意圖。圖9A和B包括顯示在外周血單個核細胞(PBMC)、單核細胞(THP-I)、B類淋巴母 細胞(C1R. A2，1518 B-LCL)和單核細胞衍生的DC中使用3G9_i3 hCG APC-靶向疫苗偶聯物 的抗原特異性活性的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明提供結合人DEC-205的抗體(例如，人抗體)。在特定實施方案中，該抗體 表現出多種功能特性，例如，通過表面等離子體共振測定，以至少為IO8M-1的親和常數結合 人DEC-205 ；在結合表達DEC-205的人樹突細胞后內化；產生或增強針對可與該抗體連接的 抗原的人T細胞應答，例如⑶4+或⑶8+(CTL)或NKT細胞應答，例如，通過MHC I類和II 類途徑介導的CTL應答；定位于樹突細胞中的抗原加工區(qū)室；誘導周圍CD8+T細胞耐受性； 或與非人靈長類動物或其它物種的樹突細胞上的DEC-205交叉反應。在其它實施方案中， 該抗體包括利用了特定人種系基因并且包括特定結構特征如特定⑶R序列的重鏈和輕鏈 可變區(qū)。本發(fā)明進一步提供制備這種抗體、包括這種抗體的分子偶聯物和雙特異性分子的 方法，以及含有這種抗體的組合物。本發(fā)明也提供了在體外或體內將抗原靶向抗原呈遞細 胞(例如，外周血單個核細胞(PBMC)、單核細胞(如THP-1)、B類淋巴母細胞(如ClR. A2、 1518 B-LCL)和單核細胞衍生的DC)的方法，例如，通過使用本發(fā)明的抗DEC-205抗體。本 發(fā)明的方法也包括在受試者中誘導或增強針對抗原的免疫應答(例如，T細胞介導的免疫 應答)的方法。這些方法包括抗原通過抗原呈遞細胞上的受體(例如，DEC-205)的呈遞， 作為MHC-I和/或MHC-II偶聯物的成分(例如，T細胞應答由⑶4+和⑶8+T細胞兩者介 導，或由細胞毒性T細胞或輔助T細胞介導)。在一個實施方案中，被靶向的細胞(可以是 B細胞)刺激MHC I類限制性的T細胞。為了可以更容易地理解本發(fā)明，首先定義了一些術語。另外的定義在整個詳述中 說明。術語“人樹突和上皮細胞205受體”(DEC-205)包括由細胞天然表達的DEC-205的 任何變體或同工型(例如，以登錄號AAC17636登記于GENBANK 的人DEC-205，和以 登錄號AAL81722登記于GENBANK 的小鼠DEC-205)。因此，本發(fā)明的人抗體可以與 來自人以外的物種的DEC-205交叉反應?；蛘?，該抗體可以是人DEC-205特異性的，并且可 能不表現出任何與其它物種的交叉反應性。DEC-205或其任何變體或同工型可以從天然表 達它們的細胞或組織(例如人、小鼠和獼猴細胞)中分離，也可以利用本領域公知的技術和 /或本文描述的技術重組產生。Genbank (登錄號aac17636a)報告了如下的人dec-205的氨基酸序列(seq id no 1)1 mrtgwatprr pagllmllfw ffdlaepsgr aandpftivh gntgkcikpv ygwivaddcd61 etedklwkwv sqhrlfhlhs qkclglditk svnelrmfsc dssamlwwkc ehhslygaar0109]121 yrlalkdghg taisnasdvw kkggseeslc dqpyheiytr dgnsygrpce fpflidgtwh
0110]181 hdcildedhs gpwcattlny eydrkwgicl kpengcednw ekneqfgscy qfntqtalsw
0111]241 keayvscqnq gadllsinsa aeltylkeke giakifwigl nqlysargwe wsdhkplnf1
0112]301 nwdpdrpsap tiggsscarm daesglwqsf sceaqlpyvc rkplnntvel tdvwtysdtr
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0135]1681 vlmggliwf1 fqrhrlhlag fssvryaqgv nedeimlpsf hd
0136]人DEC-205的主要結構域可以表示如下
0137]N-CR-FNII-CTLD1-CTLD2-CTLD3-CTLD4-CTLD5-CTLD6-CTLD7-CTLD8-CTLD9-CTLD1 丨-TMC
0138]其中N是N-末端，CR表示“富含Cys的”結構域，FNII表示〃 II型纖連蛋白〃結 構域，CTLDl至CTLDlO表示10個“C-型凝集素樣”結構域，TMC表示跨膜和細胞質結構域。
0139]本文使用的術語“樹突細胞”包括未成熟和成熟的樹突細胞和能夠分化為樹突細 胞的相關的骨髓袓細胞，或相關抗原呈遞細胞(例如，單核細胞和巨噬細胞)，因為它們與 樹突細胞表達相同的抗原。本文使用的術語“相關的”包括來源于共同袓細胞或細胞譜系 的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體與樹突細胞的結合，通過將具有確定的功能的分 子或細胞(例如，腫瘤細胞、效應細胞、微生物病原體)靶向至樹突細胞，介導了對樹突細胞 生長和/或功能的效應。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體與樹突細胞的結合導致抗體向 樹突細胞的內化。
16
"MHC分子”包括兩類分子MHC I類和MHC II類。MHC I類分子將抗原呈遞給特 定的⑶8+T細胞，MHC II類分子將抗原呈遞給特定的⑶4+T細胞。外源地遞送給APC的抗 原主要為了與MHC II類結合而加工。相反，內源地遞送給APC的抗原主要為了與MHC I類 結合而加工。但是，在特定條件下，DC具有使外源抗原進入內部區(qū)室用于除結合MHC II類 分子以外還結合MHC I類分子的獨特能力。該過程被稱為“交叉引發(fā)”或“交叉呈遞”。
本文使用的術語“免疫刺激劑”是指能夠刺激APC如DC和巨噬細胞的化合物。例 如，用于本發(fā)明的合適的免疫刺激劑能夠刺激APC，使得APC的成熟過程得到加速，APC的 增殖得到加強，和/或共刺激分子(例如，⑶80、⑶86、ICAM-U MHC分子和CCR7)和促炎 細胞因子(例如，IL-I β、IL-6、IL-12、IL-15和IFN-γ )的補充或釋放得到上調。合適 的免疫刺激劑也能夠增強T細胞增殖。這些免疫刺激劑包括但不限于CD40配體；細胞因 子，如IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2 ；集落刺激因子，如G-CSF (粒細胞集落刺激因子) 和GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)；抗CTLA-4抗體；LPS(內毒素)；ssRNA ； dsRNA;卡介苗(BCG)；鹽酸左旋咪唑；和靜脈內免疫球蛋白。在一個實施方案中，免疫刺 激劑可以是Toll-樣受體(TLR)激動劑。例如，免疫刺激劑可以是TLR3激動劑，如雙鏈 肌苷胞嘧啶多核苷酸(Poly I :C，例如可以作為AmpligenTM獲自HemispherxBipharma, PA, US)，或Poly A =U ；TLR4激動劑，如單磷酰脂質A (MPL)或RC-529 (例如，獲自GSK, UK)； TLR5激動劑，如鞭毛蛋白；TLR7或TLR8激動劑，如咪唑喹啉TLR7或TLR 8激動劑，例如咪 喹莫特(例如AldaraTM)或雷西莫特(resiquimod)和相關的咪唑喹啉劑(例如，獲自3M Corporation)；或TLR 9激動劑，如具有非甲基化CpG基序的脫氧核苷酸(所謂的“CpGs”， 例如獲自ColeyPharmaceutical)。這些免疫刺激劑可以與本發(fā)明的抗體和構建體同時、分 開或順序施用，也可以物理連接到該抗體和構建體上。本文使用的術語“連接的”是指兩個或多個分子的結合。該連接可以是共價的或 非共價的。該連接也可以是遺傳的(即重組融合)。這樣的連接可以使用多種本領域公認 的技術來實現，如化學偶聯和重組蛋白質產生。本文使用的術語抗原“交叉呈遞”是指外源蛋白質抗原通過APC上的MHC I類和 II類分子向T細胞的呈遞。本文使用的術語“T細胞介導的應答”是指由包括效應T細胞(例如，⑶8+細胞) 和輔助T細胞(例如，CD4+細胞)在內的T細胞介導的任何應答。T細胞介導的應答包括， 例如，T細胞細胞毒性和增殖。本文使用的術語“細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答”是指由細胞毒性T細胞誘導 的免疫應答。CTL應答主要由⑶8+T細胞介導。這里提到的術語“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結合片段(即“抗原結合部 分”)或單鏈。在一個優(yōu)選實施方案中，“抗體”是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少 兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在 此縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕 鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為VJ和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結構域Q組成。 Vh和&區(qū)可進一步再分為高變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDR)，CDR散布在被稱為構架區(qū)(FR) 的更加保守的區(qū)域中。每個Vh和\均由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基端向羧基端 以如下順序排列=FRl，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結合結構域?？贵w的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合， 該宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)和經典補體系統的第一成分 (Clq)。本文所用的術語抗體的“抗原結合部分”(或簡稱為“抗體部分”)是指保留特異性 地結合抗原(如人DEC-205)的能力的抗體的一個或多個片段。已經表明，抗體的抗原結合 功能可通過全長抗體的片段執(zhí)行。術語抗體的“抗原結合部分”所包括的結合片段的例子 包括(i)Fab片段，這是由Vl、Vh、CL和CHl結構域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，這 是包括在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和CHl結構域組成 的Fd片段；(iv)由抗體單臂的\和Vh結構域組成的Fv片段；(ν)由Vh結構域組成的dAb 片段(Ward 等，(1989)Nature 341 :544_546)；禾口 (vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)；或(vii) 任選地可通過合成接頭連接的兩個或多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結 構域\和Vh由不同基因編碼，但可使用重組方法通過合成接頭將它們連接在一起，該接頭 使它們能夠形成其中區(qū)配對形成單價分子的單條蛋白鏈(稱為單鏈Fv(SCFV)；參 見如 Bird 等(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也有意包括在術語抗體的“抗原結合部分”中。這些抗體 片段可采用本領域技術人員公知的常規(guī)技術獲得，且可采用與完整抗體一樣的方式篩選這 些片段的效用?？乖Y合部分可以通過重組DNA技術產生，或者通過對完整免疫球蛋白進 行酶或化學切割而產生?！半p特異性”或“雙功能性抗體”是具有兩個不同的重鏈/輕鏈對和兩個不同的結 合位點的人工雜合抗體。雙特異性抗體可以通過多種方法產生，包括雜交瘤融合或Fab'片 段的連接。參見，例如，Songsivilai& Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79 315-321 (1990)； Kostelny 等，J. Immunol. 148，1547-1553 (1992)。本文所用的術語“單克隆抗體”是指表現出對特定表位的單一結合特異性和親和 性的抗體。因此，術語“人單克隆抗體”是指表現出單一結合特異性并且具有來源于人種系 免疫球蛋白序列的可變區(qū)和任選的恒定區(qū)的抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體由包 括從轉基因非人動物如轉基因小鼠獲得的B細胞與無限增殖化細胞融合的雜交瘤產生，所 述轉基因動物具有包括人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。如此處所用的術語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達、產生或分離的所 有人抗體，例如(a)從人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體動物(例如小鼠)或由其制 備的雜交瘤中分離的抗體，(b)從經轉化表達抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體，(C) 從重組組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪切為 其他DNA序列的任何其他方法制備、表達、產生或分離的抗體。這些重組人抗體包含可變 區(qū)和恒定區(qū)，所述可變區(qū)和恒定區(qū)利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列， 但是包括隨后例如在抗體成熟過程中發(fā)生的重排和突變。如本領域公知的(參見，例如， Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9) 1117-1125)，可變區(qū)含有抗原結合域，該抗原結合 域由重排的各種基因編碼，以形成對外源抗原具有特異性的抗體。除了重排以外，可變區(qū)可 以進一步通過多個單氨基酸改變而修飾(被稱為體細胞突變或超突變)，以提高抗體對外 源抗原的親和力。恒定區(qū)在對抗原的進一步應答方面發(fā)生改變(即，同種型轉換)。因此， 編碼響應于抗原的輕鏈和重鏈免疫球蛋白多肽的重排和體細胞突變的核酸分子可能不具有與原核酸分子的序列同一性，而是基本相同或相似(即，具有至少80%的同一性)。術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存 在的話)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸 殘基(例如經體外隨機誘變或位點特異性誘變或體內體細胞突變所引入的突變)(參 見，Lonberg, N.等(1994) Nature368 (6474) :856_859) ；Lonberg, N. (1994) Handbook of ExperimentalPharmacology 113 :49_101 ；Lonberg, N.禾口 Huszar, D. (1995)Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65_93，禾Π Harding, F.禾Π Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546)。但是，術語“人抗體”不包括其中來源于另一哺乳動物物種如小鼠的種系的CDR 序列已被移植到人構架序列上的抗體(即，人源化抗體)。本文所用的“異源抗體”的定義關系到產生這種抗體的轉基因非人生物體。該術 語是指這樣的抗體，其具有的氨基酸序列或編碼核酸序列與在轉基因非人動物以外的生物 體中存在的序列相對應，而且通常所述序列來自轉基因非人動物物種以外的物種。本文使用的“分離的抗體”是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體 (例如，特異性結合人DEC-205的分離的抗體基本不含與除DEC-205以外的抗原特異性結合 的抗體)。但是，特異性結合一個表位的分離的抗體與來自不同物種的其它DEC-205蛋白可 能具有交叉反應性。但是，該抗體優(yōu)選地總是結合人DEC-205。而且，分離的抗體通?；?不含其他細胞材料和/或化學物質。在本發(fā)明的一個實施方案中，具有不同DEC-205特異 性的“分離的”抗體組合在良好確定的組合物中組合。術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。 表位可以由相鄰的氨基酸或通過蛋白質的三級折疊而靠近的不相鄰的氨基酸形成。由相鄰 的氨基酸形成的表位通常在暴露于變性溶劑后保持，而通過三級折疊形成的表位通常在變 性溶劑處理后喪失。表位通常在獨特的空間構象中包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或15個氨基酸。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術， 例如，χ-射線晶體分析法和二維核磁共振(參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996))。在此情況下，表位優(yōu)選 地位于人DEC-205的胞外域中，例如，在一個或組合的富含半胱氨酸的結構域、FnII結構域 或人DEC-205的10個C-型凝集素樣結構域中的一個或多個中。本文所用的術語“特異性結合”或“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位 的結合。典型地，當使用重組人DEC-205作為分析物并使用抗體作為配體，在BIAC0RE 2000 儀器中通過表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低于10_7M，如大約低于10_8M、 10_9M或ΙΟ,Μ或甚至更低的平衡解離常數(Kd)結合預定的抗原，并且其與預定抗原結合的 親和力比其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA、酪蛋白)結合的親 和力至少高兩倍。術語“識別抗原的抗體”和“抗原特異性抗體”在本文中可以與術語“特 異性結合抗原的抗體”互換使用。本發(fā)明也包括結合相同表位的抗體和/或與此處所述的抗體競爭結合人DEC-205 的抗體。識別相同表位或競爭結合的抗體可以使用常規(guī)技術來確認。這些技術包括，例 如，免疫測定，其顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原結合的能力，即競爭結合分析。在 一種分析中檢測競爭結合，該分析中免疫球蛋白在檢測條件下抑制參考抗體與共同抗原 如DEC-205的特異性結合。許多類型的競爭結合分析是已知的，例如固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見Stahli等， Methods in Enzymology 9 :242 (1983))；固相直接生物素-親和素 EIA(參見 Kirkland 等，J. Immunol. 137 =3614(1986))；固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見 Harlow 禾口 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPress(1988))； 使用1-125標記的固相直接標記RIA(參見Morel等，Mol. Immunol. 25(1) 7(1988))； 固相直接生物素-親和素EIA(Cheung等，Virology 176:546(1990))；和直接標記的 RIA (Moldenhauer 等，Scand. J. Immunol. 32 :77(1990))。典型地，這種分析包括使用與固體 表面結合的純化抗原或帶有其中任一種的細胞、未標記的測試免疫球蛋白和標記的參考免 疫球蛋白。競爭性抑制通過在測試免疫球蛋白的存在下測定與固體表面和細胞結合的標記 的量來測定。通常，測試免疫球蛋白過量存在。通常，當競爭抗體過量存在時，它將抑制參 考抗體與共同抗原的特異性結合至少達50-55 %、55-60 %、60-65 %、65-70 %、70-75 %或更 尚ο其它技術包括，例如，表位作圖法，如抗原抗體復合物晶體的χ-射線分析，其提 供對表位的原子解析。其它方法監(jiān)測抗體與抗原片段或抗原的突變變異的結合，其中由于 抗原序列內氨基酸殘基的修飾導致的結合的喪失通常被認為是表位成分的指示。另外，也 可以使用用于表位作圖的計算組合方法。這些方法依賴于目標抗體從組合噬菌體展示肽庫 中親和力分離特異性短肽的能力。然后這些肽被視為用于定義對應于用來篩查肽庫的抗體 的表位的線索(leads)。對于表位作圖，已經開發(fā)了證明可對構象不連續(xù)表位進行作圖的計 算算法。本文使用的術語“K/是指特定抗體_抗原相互作用的解離平衡常數。典型地，當 使用重組人DEC-205作為分析物、使用抗體作為配體，在BIAC0RE 2000儀器中通過表面等 離子體共振(SPR)技術測定時，本發(fā)明的人抗體以大約10_8M或更低，如低于10_9M或ΙΟ,Μ 或甚至更低的解離平衡常數(Kd)結合DEC-205。本文使用的術語“kd”是指抗體從抗體/抗原復合物上解離的解離速率常數。本文使用的術語“ka”是指抗體與抗原締合的結合速率常數。本文使用的術語“EC50”是指抗體或其抗原結合部分的濃度，該濃度在體外或體內 分析中誘導為最大應答50%的應答，S卩，最大應答與基線之間的中途。本文使用的術語“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或 IgGl)。在一個實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體是IgG 1同種型的抗體。在另一個實施 方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體是IgG2同種型的抗體。術語“結合固定的DEC-205”是指本發(fā)明的人抗體結合例如在細胞表面上表達或連 接于固體支持物上的DEC-205的能力。本文使用的術語“交叉反應，，是指本發(fā)明的抗體結合來自不同物種的DEC-205的 能力。例如，結合人DEC-205的本發(fā)明的抗體也可以結合獼猴DEC-205。本文使用的交叉 反應性的確定是通過在結合分析(例如，SPR，ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性， 或與生理表達DEC-205的細胞的結合或其它方式的功能性相互作用。確定交叉反應性的 方法包括如本文所述的標準結合分析，例如，使用BiaCOreTM2000 SI3R儀器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)的Biacore 表面等離子體共振(SPR)分析，或通過例如流式細胞分析技 術檢測與來自相關物種的表達DEC-205的細胞(例如，樹突細胞)的結合。
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本文所用的“同種型轉換”是指抗體的類別或同種型從一種Ig類別變成另一種其 它的Ig類別的現象。本文所用的“非轉換同種型”是指沒有發(fā)生同種型轉換時產生的重鏈的同種型類 別；編碼非轉換同種型的CH基因通常是緊接在功能性重排的VDJ基因下游的第一個CH基 因。同種型轉換分為典型或非典型同種型轉換。典型同種型轉換通過重組事件進行，所述 重組事件涉及轉基因中的至少一個轉換序列區(qū)。非典型同種型轉換可通過例如人σ μ和人 Σ μ (δ-相關性缺失)之間的同源重組進行。另外的非典型轉換機制，尤其如轉基因間和 /或染色體間重組，可以發(fā)生并實現同種型轉換。本文所用的術語“轉換序列，，是指負責轉換重組的那些DNA序列?！稗D換供體”序 列，通常為μ轉換區(qū)，位于轉換重組過程中待缺失的構建體區(qū)的5'方向(即上游)。“轉 換接納體”區(qū)在待缺失的構建體區(qū)和置換恒定區(qū)(如Y、ε等)之間。由于沒有其中經常 發(fā)生重組的特異性位點，最終基因序列通常不能從構建體預測到。本文所用的“糖基化模式”定義為共價連接到蛋白質、更具體而言連接到免疫球蛋 白的碳水化合物單位的模式。異源抗體的糖基化模式實際上可被表征為在非人轉基因動物 物種產生的抗體上天然存在的糖基化模式類似，同時本領域一般技術人員知道，異源抗體 的糖基化模式與衍生轉基因的CH基因的物種的糖基化模式相比，更類似于非人轉基因動 物物種中的所述糖基化模式。本文所用的應用于某個對象的術語“天然存在的”是指這樣的事實，即該對象可在 自然界中發(fā)現。例如，存在于可從自然界來源分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工 在實驗室中有意修飾的多膚序列或多核苷酸序列即是天然存在的。本文所用的術語“重排的”是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構型，其中V區(qū)段 以基本上分別編碼完整Vh或\結構域的構象直接位于D-J或J區(qū)段鄰近。重排的免疫球 蛋白基因座可通過與種系DNA比較來鑒別；重排的基因座具有至少一種重組的七聚體/九 聚體同源性成分。本文所用的涉及V區(qū)段的術語“非重排的”或“種系構型”是指這樣的構型，其中V 區(qū)段沒有重組而直接部近D或J區(qū)段。本文所用的術語“核酸分子”意指包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單 鏈的也可以是雙鏈的，但優(yōu)選雙鏈DNA。本文所用的涉及編碼能結合DEC-205的抗體或抗體部分(如VH、\、CDR3)的核酸 的術語“分離的核酸分子”意指這樣的核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不 含其它核苷酸序列，所述其它核苷酸序列編碼能結合除DEC-205外的抗原的抗體或抗體部 分，且其它序列可天然位于人基因組DNA中核酸的旁側。例如，SEQ ID N0:2，3(具有信號 肽)/4 (不含信號肽)和SEQ ID NO :8，9 (具有信號肽)/10 (不含信號肽)分別對應于包 含本發(fā)明的人抗DEC-205抗體3D6-2F4的重鏈(Vh)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸 序列。具體地，SEQID NO 2和3/4分別對應于3D6-2F4抗體的Vh的核苷酸和氨基酸序列， SEQ ID NO 8和9/10分別對應于3D6-2F4抗體的\的核苷酸和氨基酸序列。本發(fā)明也包括SEQ ID NO :2_91所示序列的“保守序列修飾”，即不消除由該核苷 酸序列編碼的或含有該氨基酸序列的抗體與抗原的結合的核苷酸和氨基酸序列修飾。這樣 的保守修飾包括保守的核苷酸和氨基酸置換，以及核苷酸和氨基酸添加和缺失。例如，可以通過本領域公知的標準技術，如定點誘變和PCR介導的誘變，向SEQ ID N0:2-91中引入 修飾。保守氨基酸置換包括將氨基酸殘基替換為具有相似側鏈的氨基酸殘基的置換。具 有相似側鏈的氨基酸殘基的家族在本領域中已經定義。這些家族包括具有堿性側鏈的氨 基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、 具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪 氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮 氨酸)和具有芳族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，預測的 人抗-DEC-205抗體中的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地被替換為來自相同例鏈家族的另一氨基 酸殘基。確定不消除抗原結合的核苷酸和氨基酸保守置換的方法在本領域中是公知的(參 見，例如，Brummell 等，Biochem. 32 :1180_1187 (1993) ；Kobayashi 等 ProteinEng. 12(10) 879-884 (1999)；和 Burks 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :412_417 (1997))。此外，在另一個實施方案中，可以沿抗DEC-205抗體編碼序列的全部或部分隨機 引入突變，例如通過飽和誘變引入，得到的修飾的抗DEC-205抗體可以篩選結合活性。對于核酸，術語“基本同源性”表示兩種核酸或其指定序列當以最佳方式進行對比 和比較時，雖有適當的核苷酸插入或缺失，但至少有約80%的核苷酸是相同的，通常至少約 90 %至95 %，更優(yōu)選至少約98 %至99. 5 %的核苷酸是相同的。另外，當區(qū)段在選擇性雜交 條件下與該鏈的互補體雜交時，也存在基本同源性。兩個序列之間的百分同一性是它們共有的相同位置的數目的函數(即％同源性 =相同位置的數目/總位置數目χ 100)，其中考慮了為達到兩個序列的最佳對比而需要引 入的缺口的數目及各缺口的長度。兩條序列之間的序列比較和百分同一性的確定可用數學 算法實現，這在以下非限制性實施例中有描述。兩個核苷酸序列之間的百分同一性可以用GCG軟件包(可從http://WWW. gcg. com 獲得)中的GAP程序、使用NWSgapdna. CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位權重和1、2、3、 4、5或6的長度權重來確定。兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經整 合入 ALIGN 程序(2. O 版本)*&E.Meyers*W.Miller(CABI0S，4:ll-17(1988))的算法 來確定，其使用PAM 120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。另外，兩個氨基酸 序列之間的百分同一性也可以用已經整合入GCG軟件包(可從http://WWW. gcg. com獲得) 的 GAP 程序中的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 444-453 (1970))的算法來確定，其 使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權重，和1、2、3、4、5或 6的長度權重。本發(fā)明的核酸和蛋白質序列可以進一步用作“查詢序列”來對公共數據庫進行檢 索，例如用來鑒定相關序列。這種檢索可以用Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_10 的NBLAST和XBLAST程序(2. O版本)進行。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序進行， 得分=100，字長=12，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索 可以用XBLAST程序進行，得分=50，字長=3，以獲得與本發(fā)明的蛋白質分子同源的氨基酸 序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) =3389-3402所述的空位BLAST。當采用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用 各自程序(例如 XBLAST 和 NBLAST)的缺省參數。參見 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。
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該核酸可以存在于完整細胞、細胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存 在。當通過包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內的標準技術和本 領域公知的其他方法與其他細胞成分或其他摻雜物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離 純化時，核酸是“分離的”或“基本上純的”。參見，F. Ausubel等編，Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, NewYork(1987)。本發(fā)明的核酸組合物，雖然經常為cDNA、基因組或其混合物的天然序列(修飾的 限制位點等除外)，但可按照標準技術進行突變，以提供基因序列。對于編碼序列，這些突變 可按需影響氨基酸序列。尤其是，設想了基本上同源于或來源于本文所述的天然V、D、J、恒 定區(qū)、轉換區(qū)和其它類似序列的DNA序列(其中“來源于”表示某序列與另一序列相同或從 后者修飾得到)。當使一核酸與另一核酸序列處于功能性關系時，所述核酸即是“有效連接”的。例 如，啟動子或增強子如果能影響序列的轉錄，即是與編碼序列“有效連接的”。對于轉錄調 節(jié)序列，有效連接指被連接的DNA序列是相鄰的，且當需要連接兩個蛋白質編碼區(qū)時，所述 DNA序列是相鄰的并位于讀框中。對于轉換序列，有效連接表示序列能夠實現轉換重組。本文所用的術語“載體”意指能夠轉運與其連接的另一種核酸的核酸分子。載體 的一種類型是“質?！?，它指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其它DNA區(qū)段可連接到其中。另一種載體類型 是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可連接到病毒基團組內。某些載體能夠在其引入的宿主細 胞中進行自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載 體(如非附加型哺乳動物載體)可在引入到宿主細胞時整合到宿主細胞基因組中，從而與 宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導其有效連接的基因的表達。這樣的載體在 本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。一般而言，在重組DNA技術中有用 的表達載體通常為質粒的形式。在本說明書中，“質粒”和“載體”可互換使用，因為質粒是 最常用的載體形式。但是，本發(fā)明有意包括能提供等同功能的其它類型的表達載體，如病毒 載體(如復制缺陷型反轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。本文所用的術語“重組宿主細胞”(或簡稱為“宿主細胞“)意指其中引入了重組 表達載體的細胞。應該理解，這樣的術語不但意指特定細胞，也指這樣的細胞的后代。因為 由于突變或環(huán)境影響在以后各代中可能發(fā)生某些修飾作用，這樣的后代可能實際上與親代 細胞不相同，但仍包括在本文所用的術語“宿主細胞”的范圍內。術語“抗原呈遞細胞”或“APC”是在其表面上展示與MHC復合的外來抗原的細胞。 T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種復合物。APC的例子包括但不限于樹突細胞(DC)、外 周血單個核細胞(PBMC)、單核細胞(如THP-1)、B類淋巴母細胞(如ClR. A2，1518 B-LCL) 和單核細胞衍生的樹突細胞(DC)。某些APC通過吞噬作用或者受體介導的胞吞作用內化抗 原。APC受體的例子包括但不限于C型凝集素，如人樹突和上皮細胞205受體(DEC-205)， 和人巨噬細胞甘露糖受體。術語“抗原呈遞”是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如，作 為MHC-I和/或MHC-II偶聯物的成分。術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可以互換使用，是指刺激對特定抗原的 免疫應答(即，被動或適應性的)。本文使用的術語“治療”是指此處所述的治療性的或預防性的措施?！爸委煛狈椒ㄊ菍π枰@種治療的受試者，例如，需要增強針對特定抗原的免疫應答的受試者，或最終可 能患上這種疾病的受試者，施用本發(fā)明的人抗體，以預防、治愈、延遲疾病或復發(fā)疾病、減輕 其嚴重程度，或緩解其一個或多個癥狀，或使受試者的生存期延長超過不使用這處治療時 預期的生存期。術語“有效劑量”被定義為足以達到或至少部分達到所需效果的量。術語“治療有 效量”被定義為足以治愈或至少部分停滯已患有疾病的患者的疾病及其并發(fā)癥的量。對于 此用途有效的量取決于所治療的疾病的嚴重程度和患者自身免疫系統的總體狀況。術語“患者”包括接受預防或治療性處置的人和其它哺乳動物受試者。本文使用的術語“受試者”包括任何人或非人動物。例如，本發(fā)明的方法和組合物 可以用來治療患有免疫疾病的受試者。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如，哺乳動 物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲類、爬行類動物等。本發(fā)明的各個方面在下面的部分中進一步詳細說明。I.抗DEC-205抗體的產牛本發(fā)明包括結合DEC-205例如人DEC-205的抗體，例如，完全人抗體。示例性 的結合 DEC-205 的單克隆抗體包括 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、 3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6、5C3-2_3F6、1E6-3D10 和 3A4-1C10。本發(fā)明的單克隆抗體可以使用多種已知的技術產生，例如Kohler和Milstein， Nature 256 =495(1975)所述的標準體細胞雜交技術。盡管體細胞雜交方法是優(yōu)選的，但是 原則上也可以使用其它生產單克隆抗體的技術，例如，B淋巴細胞的病毒或致癌性轉化、使 用人抗體基因文庫的噬菌體展示技術。因此，在一個實施方案中，使用雜交瘤方法產生結合人DEC-205的抗體。在該方 法中，小鼠或其它合適的宿主動物可以用合適的抗原免疫，以誘導出產生或能夠產生特異 性結合免疫所用抗原的抗體的淋巴細胞?；蛘?，淋巴細胞可以在體外免疫。然后可以使用 合適的融合劑，如聚乙二醇，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding， Monoclonal Antibodies :Principles and Practice,pp. 59-103(Academic Press,1986))。 檢測培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中針對該抗原的單克隆抗體的產生。確認了產生具有所需 特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，可以通過有限稀釋程序對克隆進行 亞克隆，并且使用標準方法進行培養(yǎng)(Goding, Monoclonal Antibodies =Principlesand Practice, pp. 59-103 (Academic Press，1986))。用于該目的的合適的培養(yǎng)基包括，例如， D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可以作為腹水腫瘤在動物體內生長?？梢酝?過常規(guī)免疫球蛋白純化方法，例如，蛋白A-S印harose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或 親和層析，從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離由該亞克隆分泌的單克隆抗體。在另一個實施方案中，結合人DEC-205的抗體和抗體部分可以從利用如下所述的 技術產生的抗體噬菌體文庫中分離例如，McCafferty等，Nature, 348 :552_554 (1990). Clackson 等，Nature, 352 :624_628 (1991)，Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991)和 Hoet 等(2005) Nature Biotechnology 23，344-348 ；Ladner 等的美國專利 No. 5，223，409 ； 5，403，484 ；和 5，571，698 ；Dower 等的美國專利 No. 5，427，908 和 5，580，717 ；McCafferty 等的美國專利 No. 5，969，108 和 6，172，197 ；和 Griffiths 等的美國專利 No. 5，885，793 ； 6，521，404 ；6，544，731 ；6，555，313 ；6，582，915 和 6，593，081。另外，也可以采用通過鏈改組產生高親和力(nM 范圍)的人抗體(Marks 等，Bio/Technology, 10 779-783 (1992)), 以及感染和體內重組的組合作為構建極大噬菌體文庫的策略(Waterhouse等，Nuc. Acids. Res. ,21 :2265-2266(1993))。在特別的實施方案中，利用Hoet等(同上)所述的噬菌體展示技術產生結合人 DEC-205的抗體。該技術包括產生具有從人供體分離的免疫球蛋白序列的獨特組合并且在 重鏈⑶R中具有合成多樣性的人Fab文庫。然后針對結合人DEC-205的Fab篩查該文庫。優(yōu)選的用于制備產生本發(fā)明抗體的雜交瘤的動物系統是鼠系統。在小鼠中產生雜 交瘤是本領域中公知的，包括免疫方案和分離和融合被免疫的脾細胞的技術。在一個實施方案中，使用攜帶人免疫系統而不是小鼠系統的部分的轉基因或轉染 色體小鼠來產生抗DEC-205抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明使用在本文中稱為“HuMAb 小鼠”的轉基因小鼠，該小鼠包含編碼未重排的人重鏈(μ和Y)和κ輕鏈免疫球蛋白序 列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內源μ和κ鏈基因座失活的定向突變(Lonberg， N.等(1994)Nature 368(6474) :856_859)。因此，該小鼠表現為小鼠IgM或κ表達降 低，并且響應于免疫，導入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變，從而產生 高親禾口力人 IgGK 單克隆抗體(Lonberg, N.等(1994)， supra ；reviewed in Lonberg, N. (1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113 49~101 ；Lonberg, N.禾口 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65_93，禾口 Harding，F.禾口 Lonberg，N. (1995) Ann. N.Y.Acad. Sci 764:536-546)。HuMAb小鼠的制備在下面的第II部分和以下文獻中詳細 描述Taylor，L.等(1992) NucleicAcids Research 20 6287-6295 ；Chen, J.等(1993) InternationalImmunology 5 :647_656 ；Tuaillon 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA90 3720-3724 ；Choi 等(1993)Nature Genetics 4 117-123 ；Chen, J.等(1993)EMBO J. 12 821-830 ；Tuaillon 等(1994)J. Immunol. 152 :2912_2920 ;Lonberg 等，(1994)Nature 368(6474) 856-859 ；Lonberg, N. (1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113 49-101 ；Taylor, L.等(1994)International Immunology 6 579-591 ；Lonberg, N.禾口 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65_93 ；Harding, F.禾口 Lonberg, N. (1995)Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546 ；Fishwild, D.等(1996)NatureBiotechnology 14 :845-851。進一步參見，Lonberg 和 Kay，和 GenPharm International 的美國專利 No. 5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，789，650 ；5，877，397 ；5，661，016 ； 5，814，318 ；5, 874, 299 ；和 5，770，429 ；Surani 等的美國專利 No. 5，545,807 ； 1998 年 6 月 11 日公布的國際公布WO 98/24884 ； 1994年11月10日公布的W094/25585 ； 1993年6月24日 公布的WO 93/1227 ;1992年12月23日公布的WO 92/22645 ;1992年3月19日公布的WO 92/03918。免疫為了產生抗DEC-205的完全人抗體，含有人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體 小鼠(例如，HCo 12、HCo7或KM小鼠)可用純化的或富集的DEC-205抗原制品和/或表 達 DEC-205 的細胞進行免疫，如 Lonberg 等(1994)Nature 368(6474) 856-859 ；Fishwild 等(1996)Nature Biotechnology 14 :845_851 和 WO 98/24884 所述。如本文所述，用重 組DEC-205蛋白或表達DEC-205的細胞作為免疫原免疫HuMAb小鼠。或者，可以用編碼人 DEC-205的DNA免疫小鼠。優(yōu)選地，小鼠第一次輸注時鼠齡在6_16周。例如，可以使用純化的或富集的重組DEC-205抗原制品(5-50 μ g)經腹膜內免疫HuMab小鼠。如果用純化的或 富集的重組DEC-205抗原制品免疫不能導致抗體產生，也可用表達DEC-205的細胞例如細 胞系免疫小鼠，以促進免疫應答。示例性的細胞系包括過量表達DEC-205的穩(wěn)定的CHO和 Raji細胞系。應用各種抗原積累的經驗證明，當最初使用完全弗氏佐劑 中的抗原腹膜內(IP) 或皮下(SC)免疫，接著每隔一周用弗氏不完全弗氏佐劑中的抗原IP/SC免疫(最多共10 次)時，HuMAb轉基因小鼠產生最佳應答。在免疫方案進程中可以用眼眶后取血獲得的血 漿樣品監(jiān)測免疫應答?？赏ㄟ^ELISA (如下所述)篩選血漿，具有足夠抗DEC-205人免疫球 蛋白效價的小鼠可用于進行融合。用抗原對小鼠進行靜脈內加強免疫，3天后處死并且取出 脾臟。產生抗DEC-205單克隆抗體的雜交瘤的產生為了制備產生抗DEC-205單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細胞和 /或淋巴結細胞，并且與合適的無限增殖化細胞系(例如小鼠骨髓瘤細胞系)融合。然后抗 原特異性抗體的產生篩選得到的雜交瘤。例如，使用50% PEG(w/v)，將來自被免疫小鼠的 脾淋巴細胞的單細胞懸液與SP2/0-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL1580)融 合。將細胞以大約Ix IO5的密度接種于平底微量滴定板中，接著在除常用試劑外含有10% 胎克隆血清、5-10% origen雜交瘤克隆因子(IGEN)和IX HAT(Sigma)的選擇性培養(yǎng)基中 溫育兩周。大約兩周之后，在用HT替換了 HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。然后通過ELISA人抗 DEC-205單克隆IgM和IgG抗體篩選各孔，或者通過FLISA (熒光連接的免疫吸附測定)根 據與表達DEC-205的細胞(例如表達DEC-205的CHO細胞系)表面的結合篩選各孔。一旦 發(fā)生廣泛的雜交瘤生長，則通常在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平 板接種，再次篩選，如果對于人IgG仍然是陽性，則可以通過有限稀釋將抗DEC-205單克隆 抗體至少亞克隆兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產生少量抗體用于 表征。產生抗DEC-205單克隆抗體的轉染瘤的產生例如，利用的重組DNA技術和基因轉染方法的組合(例如，Morrison, S. (1985) science 229 1202)，也能在宿主細胞轉染瘤中產生本發(fā)明的抗體。例如，在一個實施方案中，感興趣的基因，例如，人抗體基因，可以連接到表達載體 如真核表達質粒中，如WO 87/04462、W089/01036和EP 338 841公開的GS基因表達系統 或本領域公知的其它表達系統所使用的載體。具有克隆的抗體基因的純化質?？梢员灰?入真核宿主細胞如CHO細胞或NSO細胞或其它真核細胞如植物來源的細胞、真菌或酵母 細胞中。用來引入這些基因的方法可以是本領域中描述的方法，如電穿孔、lipofectine, lipofectamine或其它方法。在將這些抗體基因引入宿主細胞后，可以確認和選擇表達該抗 體的細胞。這些細胞代表轉染瘤，它們然后可以進行表達水平的擴增并擴大規(guī)模以產生抗 體?？梢詮倪@些培養(yǎng)上清液和/或細胞中分離和純化重組抗體?；蛘撸@些克隆的抗體基因可以在其它表達系統中如大腸桿菌中或在完整生物體 中表達，或者可以合成表達。應用部分抗體序列表達完整的抗體抗體主要是通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(OTR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此原因，在各抗體之間，CDR內的氨基酸序列比CDR之外的序列更加多樣 性。因為⑶R序列負責大多數抗體-抗原相互作用，可以通過構建一種表達載體來表達模 擬天然存在的特異性抗體的性質的重組抗體，該構建體包含來自天然存在的特異性抗體的 CDR序列，這些序列已被移植到來自具有不同性質的不同抗體的構架序列上(參見，例如， Riechmann, L 等，1998，Nature332 :323_327 Jones, P.等，1986，Nature 321 :522_525 ；禾口 Queen, C.等，1989，Proc. Natl. Acad. See. U. S. Α. 86 10029-10033)。這些構架序列可以從 包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫獲得。這些種系序列將不同于成熟抗體基因序 列，因為它們將不包括完全裝配的可變基因，后者是在B細胞成熟過程中通過V (D) J連接形 成的。種系基因序列在對應的單個可變區(qū)中也將不同于高親和力次級全套抗體(secondary repertoire antibody)的序列。例如，構架區(qū)的氨基末端部分的體細胞突變是相對少見的。 例如，體細胞突變在構架區(qū)1的氨基末端部分和構架區(qū)4的羧基末端部分相對少見。此外， 許多體細胞突變不會顯著改變抗體的結合性質。由于此原因，為了產生具有與原抗體類似 的結合性質的完整重組抗體，不一定要獲得特定抗體的完整DNA序列(參見1999年3月12 日提交的PCT/US99/05535)。對于此目的，跨過CDR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列一般是足夠 的。利用該部分序列確定哪些種系可變基因和連接基因區(qū)段貢獻于重組抗體可變基因。然 后利用種系序列補平可變區(qū)中丟失的部分。重鏈和輕鏈前導序列在蛋白質成熟過程中被切 割，并且對最終抗體的性質沒有貢獻。為了添加丟失的序列，通過連接或PCR擴增，克隆的 cDNA序列可以與合成的寡核苷酸組合。此外，完整的可變區(qū)可以合成為一組短的、重疊的 寡核苷酸，并且通過PCR擴增組合，以產生完全合成的可變區(qū)克隆。這一方法具有一定的優(yōu) 點，例如消除或包含特定的限制性位點，或者優(yōu)化特定的密碼子。利用來自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉錄物的核苷酸序列設計一組重疊的合成寡核苷 酸，以產生具有與天然序列相同的氨基酸編碼能力的合成V序列。合成重鏈和κ鏈序列可 能在三個方面不同于天然序列打斷了重復核苷酸堿基串，以利于寡核苷酸合成和PCR擴 增，根據 Kozak 原則(Kozak, 1991，J. Biol. Chem. 266 19867-19870)引入最佳翻譯起始位 點；并且將HindIII位點構建在翻譯起始位點的上游。對于重鏈和輕鏈可變區(qū)，將優(yōu)化的編碼鏈序列和相應的非編碼鏈序列分解成接近 相應非編碼寡核苷酸的中點的30-50個核苷酸。因此，對于每條鏈，寡核苷酸可以裝配為重 疊的雙鏈組，它們跨過150-400個核苷酸的區(qū)段。然后使用該集合作為模板，產生150-400 個核苷酸的PCR擴增產物。典型地，單可變區(qū)寡核苷酸組將分解為兩個集合，它們分別擴增 以產生兩個重疊的PCR產物。這些重疊的產物然后通過PCR擴增進行組合，以形成完整的可 變區(qū)。也可能希望在PCR擴增中包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段(包括κ輕鏈的BbsI 位點，或、重鏈的AgeI位點)，以產生能夠容易地克隆到表達載體構建體內的片段。重構的重鏈和輕鏈可變區(qū)然后與克隆的啟動子、前導序列、翻譯起點、前導序列、 恒定區(qū)、3’非翻譯區(qū)、聚腺苷酸化和轉錄終止序列組合，以形成表達載體構建體。重鏈和輕 鏈表達構建體可以組合到一個載體中，共轉染，系列轉染，或分別轉染宿主細胞，然后將該 宿主細胞融合，形成表達兩條鏈的宿主細胞。構建用于構建表達載體的質粒，使得可以利用PCR擴增的V重鏈和V κ輕鏈cDNA 序列重新構建完整的重鏈和輕鏈小基因。這些質?？梢杂脕肀磉_完全人IgG1K或IgG4K 抗體。本發(fā)明的完全人抗體和嵌合抗體也包括IgG2、IgG3、IgE、IgA、IgM和IgD抗體。為了表達其它重鏈同種型，或者為了表達包含λ輕鏈的抗體，可以構建類似的質粒。因此，在本發(fā)明的一個方面，利用本發(fā)明的抗DEC-205抗體的結構特征產生結構 上相關的抗DEC-205抗體，該抗體保留本發(fā)明的抗體的至少一種功能性質，例如，根據表面 等離子體共振測定，以至少IO8M4的親和常數結合人DEC-205 ；在結合表達DEC-205的人樹 突細胞后內化；定位于人樹突細胞中的抗原加工區(qū)室；激活表達DEC-205的人樹突細胞；與 非人靈長類動物或其它物種的樹突細胞上的DEC-205交叉反應；和產生或增強針對抗原的 人T細胞應答，如CTL應答，優(yōu)選由MHC I類和II類途徑兩者介導的CTL應答。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的一個或多個CDR區(qū)可以與已知的構架區(qū)和 ⑶R重組組合，以產生另外的重組構建的本發(fā)明的抗DEC-205抗體。其重鏈和輕鏈可變構 架區(qū)可以來源于相同或不同的抗體序列?？贵w序列可以是天然存在的抗體的序列，或者可 以是幾種抗體的共有序列。參見 Kettleborough 等，Protein Engineering 4:773(1991)； Kolbinger 等，Protein Engineering 6 971 (1993)，和 Carter 等，WO 92/22653。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗DEC-205抗體的方法，包括制備一種抗體，該抗體包括(1)重鏈構架區(qū)和重鏈⑶R，其中至少一個重鏈⑶R包 括選自 SEQ ID NO :5、6、7、17、18、19、29、30、31、41、42、43、53、54、55、65、66、67、71、72、73、 77、78、79、89、90或91所示的⑶R氨基酸序列的氨基酸序列；和(2)輕鏈構架區(qū)和輕鏈⑶R， 其中至少一個輕鏈 CDR 包括選自 SEQID NO :11、12、13、23、24、25、35、36、37、47、48、49、59、 60、61、83、84或85所示的⑶R氨基酸序列的氨基酸序列，其中該抗體保留結合DEC-205的 能力。抗體結合DEC-205的能力可以使用標準結合分析來檢測，如實施例所述的分析(例 如，ELISA 或 FLISA)。本領域公知，抗體的重鏈和輕鏈CDR3結構域在抗體對于抗原的結合特異性/親和 力中起特別重要的作用(參見，Hall 等，J. Imunol.，149 1605-1612 (1992) ；Polymenis 等， J. Immunol.，152 :5318_5329 (1994) Jahn 等，Immunobiol.，193 400-419 (1995) ；Klimka 等，Brit. J. Cancer, 83 252-260 (2000) ；Beiboer 等，J. Mol. Biol，296 :833_849 (2000)； Rader 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 8910-8915 (1998) ；Barbas 等，J. Am. Chem. Soc.， 116 2161-2162(1994) ；Ditzel 等，J. Immunol.，157 :739_749 (1996))。因此，如上所述制備 的本發(fā)明的重組抗體優(yōu)選地包含抗體3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、 3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6和3A4-1C10的重鏈和/或輕鏈CDR3。該抗體可進一步包 含抗體 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、OT12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的 CDR2。該抗體可進一步包含抗體 3D6_2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8_1F1、 2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、OT12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的 CDR1。該抗體可進一步包含 CDR 的任何組合。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明進一步提供了抗DEC-205抗體，該抗體包含 (1)重鏈構架區(qū)、重鏈⑶Rl區(qū)、重鏈⑶R2區(qū)和重鏈⑶R3區(qū)，其中重鏈⑶R3區(qū)選自3D6-2F4、 3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的 ⑶R3，例如，如SEQ ID NO 7所示的3D6-2F4的重鏈⑶R3區(qū)；和(2)輕鏈構架區(qū)、輕鏈 CDRl區(qū)、輕鏈CDR2區(qū)和輕鏈CDR3區(qū)，其中輕鏈CDR3區(qū)選自3D6-2F4、3D6_4C8、3G9_2D2、 5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的 CDR3,例如，如 SEQ ID N0:13所示的3D6-2F4的輕鏈⑶R3區(qū)，其中該抗體結合DEC-205。該抗體可進一步包含抗體 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2。該抗體可進一步包含3D6-2F4、3D6_4C8、3G9_2D2、 5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、OT12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的重鏈 CDRl 和 / 或輕鏈 CDRl。具有修飾序列的抗體的產生在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗DEC-205抗體的可變區(qū)序列或其部分被修飾， 從而產生結構上相關的抗DEC-205抗體，該抗體保留了結合(即，與修飾抗體結合相同的 表位)能力，因此在功能上是等同的。確認可以被改變而不消除抗原結合的殘基的方法是 本領域公知的(參見，例如，Marks等(Biotechnology (1992) 10 (7) :779_83 (通過用固定 的⑶R3序列改變改組輕鏈可變區(qū)，然后改組重鏈可變區(qū)，使單克隆抗體多樣化)，Jespers 等(1994) Biotechnology 12(9) :899_903 (從針對抗原單表位的噬菌體展示譜中選擇人抗 體)，Sharon等(1986) PNASUSA 83(8) :2628_31 (抗體的可變-多樣性區(qū)段連接處的不變氨 基酸殘基的定點誘變)；Casson等(1995) J. Immunol. 155(12) :5647_54 (抗體重鏈可變區(qū) 隨機誘變產生的特異性的丟失和變化的進化)。因此，在本發(fā)明的一個方面中，上述工程化抗體的⑶Rl、2和/或3區(qū)可以包含準 確的氨基酸序列，如此處公開的抗體3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、 3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6和3A4-1C10的氨基酸序列。但是，在本發(fā)明的其它方面，所述 抗體包含 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和3A4-1C10的確切⑶R序列的衍生物，而仍然保留有效結合DEC-205的能力。這些序列修 飾可以包括一個或多個氨基酸添加、缺失或置換，例如上述保守序列修飾。序列修飾也可以 基于抗體 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和3A4-1C10的特定CDR1、CDR2和CDR3序列的上述共有序列。因此，在另一個實施方案中，工程化抗體可以包含一個或多個⑶R，所述⑶R與 抗體 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10的一個或多個⑶R例如90%、95%、98%或99. 5%相同。在上述數值中間的范圍， 例如，與上述序列中的一個或多個90-95 %、95-98 %或98-100 %相同的⑶R，也包括在本發(fā)明中。在另一個實施方案中，可以改變CDR的一個或多個殘基，以改變結合，從而達到更 有利的結合速率、更有利的解離速率，或這兩者，從而達到理想的結合常數。使用這一策略， 可以獲得具有例如IOkT1或更高的超高結合親和力的抗體。本領域公知的和本文描述的親 和力成熟技術可以用來改變CDR區(qū)，然后針對希望的結合改變篩選得到的結合分子。因此， 當一個或多個CDR改變時，可以監(jiān)測到結合親和力以及免疫原性的改變，并且進行評分，從 而獲得為了結合和低免疫原性的最佳組合而優(yōu)化的抗體。除了 CDR內的修飾以外或者作為其替代，也可以在抗體重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的 一個或多個構架區(qū)、FR1、FR2、FR3和FR4內進行修飾，只要這些修飾不消除抗體的結合親和 力。例如，將本發(fā)明抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的構架區(qū)中的一個或多個非種系氨基酸 殘基置換為種系氨基酸殘基，即，與該抗體具有顯著序列同一性的重鏈或輕鏈可變區(qū)的人 種系序列中相應的氨基酸殘基。例如，抗體鏈可以同與之具有顯著序列同一性的種系抗體 鏈對齊，在抗體構架序列和種系鏈構架之間不匹配的氨基酸殘基可以用來自種系序列的相
29應的殘基置換。當抗體可變構架區(qū)和相當的人種系序列可變構架區(qū)之間的氨基酸不同時， 抗體構架氨基酸通常應當用相應的人種系序列氨基酸代替，如果合理地預期該氨基酸落入 以下類別之一中(1)直接非共價結合抗原的氨基酸殘基，(2)與⑶R區(qū)相鄰的氨基酸殘基，(3)以其它方式與CDR區(qū)相互作用的氨基酸殘基(例如，通過計算機建模確定，在 ⑶R區(qū)的大約3-6人內)，或 (4)參與VL-VH界面的氨基酸殘基?！爸苯臃枪矁r結合抗原”的殘基包括非?？赡芡ㄟ^確定的化學力如氫鍵鍵合、范德 華力、疏水相互作用等與抗原上的氨基酸直接相互作用的構架區(qū)內位置處的氨基酸。因此， 在一個實施方案中，本發(fā)明抗體的構架區(qū)中的氨基酸殘基被置換為直接與抗原非共價結合 的相應的種系氨基酸殘基?！芭c⑶R區(qū)相鄰的”殘基包括與抗體一級序列中的一個或多個⑶R直接鄰近的位置 中的氨基酸殘基，例如，在直接鄰近根據Kabat定義的⑶R，或者根據Chothia定義的⑶R的 位置中的氨基酸殘基(參見，例如，Chothia和Lesk J. Mol. Biol. 196 :901 (1987))。因此， 在一個實施方案中，本發(fā)明抗體的構架區(qū)內的氨基酸殘基被置換為與CDR區(qū)相鄰的相應的
種系氨基酸殘基?！耙云渌绞脚c⑶R區(qū)相互作用的”殘基包括通過二級結構分析確定的、其空間定 向足以影響⑶R區(qū)的殘基。這些氨基酸通常具有⑶R中某些原子的大約3埃單位(人)內的 側鏈原子，并且必然含有能夠根據確定的化學力(如以上所列出的)與CDR原子相互作用 的原子。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明抗體的構架區(qū)內的氨基酸殘基被置換為以其它方 式與CDR區(qū)相互作用的相應的種系氨基酸殘基。已知在許多抗體中，構架中的幾個位置處的氨基酸對于確定CDR構象是重要的 (例如，能夠與CDR相互作用)(Chothia和Lesk,同上，Chothia等，同上，和Tramontano等， J. Mol. Biol. 215 :175 (1990)，所有這些都通過引用并入本文)。這些作者通過分析幾種已 知抗體的結構，確定了對CDR構象重要的保守構架殘基?；贑DR的構象，所分析的抗體落 入有限數量的結構或“規(guī)范”類別中。規(guī)范類別成員內的保守的構架殘基被稱為“規(guī)范”殘 基。規(guī)范殘基包括輕鏈的殘基2、25、29、30、33、48、64、71、90、94和95以及重鏈的殘基24、 26、29、34、54、55、71和94。另外的殘基(例如，決定CDR結構的殘基)可以按照Martin和 Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263 800的方法進行確認。特別是，已知輕鏈位置2、48、64和 71和重鏈位置26-30、71和94處的氨基酸(根據Kabat編號)能夠與多種抗體中的⑶R相 互作用。輕鏈位置35和重鏈位置93和103處的氨基酸也可能與⑶R相互作用?？梢詫崿F CDR構象的另外的殘基可以按照Foote和Winter (1992) J. Mol. Biol. 224 487的方法進行 確認。這些殘基被稱為“游標”殘基，并且是接近地位于CDR下(即，在CDR下形成“平臺”) 的構架區(qū)中的殘基?！皡⑴cVL-VH界面的”殘基或“堆積殘基”包括如例如Novotny和Haber，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，82 :4592-66(1985)或Chothia等(同上)定義的在VL和VH之間界面處的殘基。偶然地，關于特定氨基酸是否落于一個或多個上述類別中，有一些不明確。在這些情況下，產生替代的變異抗體，其中之一具有所述特定的置換，另一個沒有。這樣產生的替 代的變異抗體可以在此處所述的任何分析中檢測希望的活性，并且選擇優(yōu)選的抗體。構架區(qū)內置換的另外的候選物是在該位置處對于抗體而言不常見的或“罕見的” 氨基酸。這些氨基酸可以被置換為來自人種系序列的等同位置或來自更典型抗體的等同位 置的氨基酸。例如，當抗體構架區(qū)中的氨基酸對于該位置是罕見的，并且種系序列中相應的 氨基酸對于免疫球蛋白序列中的該位置是常見的；或者當抗體中的氨基酸對于位置是罕見 的，并且種系序列中相應的氨基酸相對于其它序列也是罕見的時，置換可能是需要的。預期 通過將不常見的氨基酸置換為恰好是抗體典型的來自種系序列的氨基酸，可以使抗體的免 疫原性較低。本文使用的術語“罕見的”表示在代表性的序列樣本中，在低于大約20%、優(yōu)選 地低于大約10%、更優(yōu)選地低于大約5%、甚至更優(yōu)選地低于大約3%、甚至更優(yōu)選地低于 大約2%、甚至更優(yōu)選地低于大約的序列中在該位置處出現該氨基酸，本文使用的術語 “常見的”表示在代表性樣品中，在超過大約25%、通常超過大約50%的序列中出現該氨基 酸。例如，所有輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別分組為序列“亞組”，它們彼此特別同源，并且在 某些關鍵位置處具有相同的氨基酸(Kabat等，同上)。當確定抗體序列中的氨基酸在序列 之間是“罕見的”還是“常見的”時，通常優(yōu)選地只考慮那些與所述抗體序列屬于相同亞組 的序列。通常，抗體的構架區(qū)與它們所來源的人種系序列的構架區(qū)基本上相同，更通常的 是相同。當然，構架區(qū)中的許多氨基酸對抗體的特異性或親和力沒有直接貢獻或只有很小 的貢獻。因此，構架殘基的許多保守置換可以耐受，而不會明顯地改變得到的免疫球蛋白的 特異性或親和力。因此，在一個實施方案中，抗體的可變構架區(qū)與人種系可變構架區(qū)序列或 這些序列的共有序列具有至少85%的序列同一性。在另一個實施方案中，抗體的可變構架 區(qū)與人種系可變構架區(qū)序列或這些序列的共有序列具有至少90%、95%、96%、97%、98% 或99%的序列同一性。除了簡單結合DEC-205以外，可以根據本發(fā)明抗體的其它功能特性的保留來選擇 抗體，例如(a)根據表面等離子體共振測定，以至少IO8M4的親和常數結合人DEC-205 ；(b)在結合表達DEC-205的人樹突細胞后內化；(c)定位于樹突細胞的抗原加工區(qū)室；(d)激活表達DEC-205的人樹突細胞；(e)與非人靈長類動物或其它物種的樹突細胞上的DEC-205交叉反應；(f)產生或增強由MHC I類和II類途徑兩者介導的人T細胞應答，優(yōu)選T細胞應 答；(g)產生或增強人CD4+、CD8+或NKT細胞應答；和(h)誘導周圍⑶8+T細胞耐受性?？笵EC-205單克隆抗體的表征可以利用多種已知的技術表征本發(fā)明的單克隆抗體與DEC-205的結合。通常，最 初通過ELISA表征抗體。簡要地說，微量滴定板可以用PBS中的純化的DEC-205包被，然后 用PBS稀釋的無關蛋白質如牛血清清蛋白(BSA)封閉。將來自DEC-205免疫的小鼠的血漿
31稀釋液加至各孔中，并在37°C下溫育1-2小時。用PBS/Tween 20洗板，然后與偶聯至堿性 磷酸酶的山羊-抗-人IgG Fc特異性多克隆試劑于37°C溫育1小時。洗滌后，用ABTS底 物使板顯色，并在OD 405處分析。優(yōu)選地，形成最高效價的小鼠用于融合。如上所述的ELISA測定可以用來篩選抗體，并因此篩選可產生顯示與DEC-205免 疫原具有陽性反應性的抗體的雜交瘤。然后可以將優(yōu)選地以高親和力結合DEC-205的雜交 瘤進行亞克隆并進一步表征。然后可以從每個雜交瘤選擇一個保留親本細胞反應性(根據 ELISA)的克隆，用于制備細胞庫(cell bank)，以及用于抗體純化。為了純化抗DEC-205抗體，選擇的雜交瘤可以在搖瓶、2升旋瓶或其它培養(yǎng)系統中 生長?？梢赃^濾并濃縮上清液，然后使用蛋白A-s印harose (Pharmacia，Piscataway，NJ) 進行親和層析，以純化該蛋白質。將緩沖液更換為PBS后，可以使用1. 43的消光系數根據 OD280或優(yōu)選地通過濁度分析確定濃度。IgG可以通過凝膠電泳和抗原特異性方法來檢查。為了確定選擇的抗DEC-205單克隆抗體是否結合獨特表位，每種抗體可以用商購 試劑(Pierce，Rockford, IL)生物素化。生物素化的MAb的結合可以用鏈霉親和素標記的 探針來檢測。為了確定純化抗體的同種型，可以使用本領域公認的技術進行同種型ELISA。 例如，微量滴定板的孔可以用10yg/ml抗Ig包被，4°C過夜。用5% BSA封閉后，培養(yǎng)板與 10yg/ml單克隆抗體或純化的同種型對照在環(huán)境溫度下反應2小時?？兹缓罂梢耘cIgGl 或其它同種型特異性偶聯探針反應。如上所述使板顯色并且進行分析。為了檢測單克隆抗體與表達DEC-205的活細胞的結合，可以采用流式細胞術。簡 要地說，表達膜結合DEC-205的細胞系和/或人PBMC (在標準生長條件下生長)與在含有 0. 1 % BSA和0. 01 % NaN3的PBS中的各種濃度的單克隆抗體于4°C混合1小時。洗滌后，細胞 與熒光素標記的抗IgG抗體在與第一抗體染色相同的條件下反應。樣品可以通過FACScan 儀器進行分析，利用光散射和側散射性質，以圈選單細胞，并確定標記的抗體的結合。(除了 流式細胞分析以外或者代替它)可以采用使用熒光顯微鏡的替代分析?？梢酝耆缟纤?染色細胞，并進行熒光顯微鏡檢查。該方法允許顯示各細胞，但是根據抗原的密度，可能靈 敏度降低?？梢酝ㄟ^Western印跡法進一步檢測抗DEC_205IgG對于DEC-205抗原的反應性。 簡言之，可以制備來自表達DEC-205的細胞的細胞提取物，并且進行十二烷基硫酸鈉聚丙 烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉移到硝酸纖維素膜上，用20%小鼠血清封閉，并 用將要檢測的單克隆抗體探查。IgG結合可以使用抗IgG堿性磷酸酶來檢測，并用BCIP/NBT 底物片(Sigma Chem. Co.，St. Louis, MO)顯色。分析各種抗DEC-205抗體的結合親和力、交叉反應性和結合動力學的方法包括本 領域中已知的標準分析,例如,使用Biacore 2000SPR儀器(Biacore AB, Uppsala, Sweden) 的Biacore 表面等離子體共振(SPR)分析，如本文中的實施例2所述。II.分子偶聯物/免疫毒素本發(fā)明提供多種治療性分子偶聯物(例如，疫苗偶聯物)，其包括與結合APC上受 體的抗體(例如，結合DEC-205的抗體)連接的抗原如腫瘤或病毒抗原。這允許將抗原靶 向至APC，如表達DEC-205的細胞(例如，樹突細胞和B細胞)，以增強加工、呈遞及最終對 抗原的免疫應答，例如CTL應答。這種偶聯物的示意圖示于圖8中。在所示的實例中，抗原 與基本上完整的抗DEC-205抗體的每一個重鏈的CH3域遺傳融合。但是，應當理解，抗原也可以連接到這種抗體或其片段的其它部分上，并且也可以使用其它形式的偶聯如化學偶 聯，如下文進一步所述。用于本發(fā)明的合適的抗原包括，例如，希望發(fā)生針對它們的保護性或治療性免疫 應答的傳染病抗原和腫瘤抗原，例如，腫瘤細胞表達的抗原或病原體生物或傳染病抗原。例 如，合適的抗原包括用于預防或治療癌癥的腫瘤相關抗原。腫瘤相關抗原的例子包括但不 限于包含 3hCG、gplOO 或 Pmell7、HER2/neu、WTl、間皮蛋白、CEA、gplOO、MARTI、TRP-2、 melan-A、NY-ESO-U NY-BR-U NY-C0-58、MN(gp250)、獨特型、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪 氨酸酶、端粒酶、SSX2和MUC-I抗原和生殖細胞來源的腫瘤抗原的序列的全部或部分的序 列。腫瘤相關抗原也包括血型抗原，例如，Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-l、B-2抗原。此外，本 發(fā)明的抗原-抗體構建體內也可以包含一種以上的抗原。例如，MAGE抗原可以與其它抗原 如黑色素A、酪氨酸酶和gplOO以及佐劑如GM-CSF或IL-12 —起組合，并且連接至抗APC抗 體上。其它合適的抗原包括用于預防或治療病毒性疾病的病毒抗原。病毒抗原的 例子包括但不限于HIV-I gag、HIV-I env、HIV-I nef、HBV(表面或核心抗原)、HPV、 FAS、HSV-1、HSV-2、ρ 17、0RF2和0RF3抗原。細菌抗原的例子包括但不限于鼠弓形蟲 (Toxoplasmagondii)或蒼白密螺旋體(Ti^ponema pallidum)。本發(fā)明的抗體-細菌抗原偶 聯物可以用于治療或預防多種細菌性疾病如炭疽、肉毒中毒、破傷風、衣原體、霍亂、白喉、 萊姆病、梅毒和結核病。上述抗原的序列在本領域中是公知的。例如，MAGE-3 cDNA序列的實例在US 6, 235, 525 (Ludwig Institute for Cancer Research)中提供；NY-ESO-l 核酸和蛋白質序 列的實例在US 5，804，381 和US6, 069，233 (Ludwig Institute for Cancer Research)中提 供；Melan-A 核酸和蛋白質序列的實例在 US 5，620，886 和 US 5, 854, 203 (LudwigInstitute for Cancer Research)中提供；NY-BR-I核酸和蛋白質序列的實例在US 6，774，226和US 6，911，529 (Ludwig Institute for CancerResearch)中提供；NY-C0-58 核酸和蛋白質序 列的實例在 W002090986 (Ludwig Institute for Cancer Research)中提供；HER-2/neu 蛋白的氨基酸序列的實例可從GENBANK 登錄號AAA58637獲得；人癌胚抗原-樣 1 (CEA-I)的核苷酸序列(mRNA)可從GENBANK 登錄號NM_020219獲得?？捎糜诒景l(fā)明藥物組合物和方法中的HPV抗原可包括，例如，HPV-16抗原、HPV-18 抗原、HPV-31抗原、HPV-33抗原和/或HPV-35抗原；合適地是HPV-16抗原和/或HPV-18抗 原。HPV-16的基因組在Virology，145 181-185 (1985)中有描述，編碼HPV-18的DNA序列在 美國專利No. 5，840，306中有描述，其公開內容通過引用全文并入本文中。HPV-16抗原(例 如，HPV-16的El和/或E2蛋白的血清反應區(qū))在美國專利No. 6，531，127中有描述，HPV-18 抗原(例如，HPV-18的Ll和/或L2蛋白的血清反應區(qū))在美國專利No. 5，840，306中有 描述，其公開內容通過引用全文并入本文中。類似地，HBV的全基因組可從GENBANK 登錄號NC_003977獲得，其公開內容通過引用全文并入本文中。HCV的基因組在歐洲專利申 請No. 318216中有描述，其公開內容通過引用全文并入本文中。通過引用全文并入本文中 的PCT/US90/01348公開了 HCV基因組克隆的序列信息、HCV病毒蛋白的氨基酸序列以及制 備和使用這些組合物用于包含由其衍生的HCV蛋白和肽的HCV疫苗的方法。蛋白質的抗原性肽(即含有T細胞表位的那些)可以用本領域公知的多種方式確認。例如，T細胞表位可以通過利用基于web的預測性算法(BIMAS & SYFPEITHI)分析蛋白 質的序列來預測，以產生潛在的MHC I類和II結合肽，它們匹配10，000個良好表征的以前 用CTL定義的MHC結合肽的內部數據庫?？梢詫⒏叩梅值碾呐判颍⑶一趯o定MHC分 子的高親和力選擇它們作為“感興趣的”。另外一種確認含有T細胞表位的抗原性肽的方法是將蛋白質分為所需長度的非 重疊肽或所需長度的重疊肽，它們可以通過重組、合成方法或在某些限制情況下通過化學 切割蛋白質來產生，并檢測其免疫原性，例如，引發(fā)T細胞應答(S卩，增殖或淋巴因子分泌)。為了通過例如精細作圖技術確定蛋白質的精確的T細胞表位，通過T細胞生物學 技術測定，具有T細胞刺激活性并因此包含至少一個T細胞表位的肽可以通過在該肽的氨 基或羧基末端添加或刪除氨基酸殘基來進行修飾，并進行檢測，以確定對修飾的肽的T細 胞反應性的變化。如果通過T細胞生物學技術測定，發(fā)現在天然蛋白質序列中具有重疊區(qū) 的兩個或多個肽具有人T細胞刺激活性，可以產生包含這些肽的全部或一部分的另外的 肽，并且可以通過類似的方法檢測這些另外的肽。利用這一技術，重組或合成地選擇和產生 肽。肽的選擇基于多種因素，包括對肽的T細胞應答的強度(例如，刺激指數)。然后可以 檢測這些選擇的肽的物理和化學性質(例如，溶解性、穩(wěn)定性)，以確定這些肽是否適用于 治療組合物，或者這些肽是否需要修飾。另外，疫苗偶聯物可以包含一種或多種也能增強針對抗原的免疫應答的免疫刺激 劑。本發(fā)明的抗體-抗原疫苗偶聯物可以通過遺傳學或化學方法制備。在任一情況下，偶 聯物的抗體部分可以由完整抗體或該抗體的一部分組成，如Fab片段或單鏈Fv。另外，偶聯 物中可以包含一種以上的抗原和/或免疫刺激劑?；瘜W構建的抗體-抗原偶聯物可以使用多種眾所周知的并且易于使用的交聯試 劑制備。這些交聯試劑可以是同功能的或異功能的化合物，如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡 啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、4_ (N-馬來酰 亞氨基甲基)環(huán)己基-1-羧酸磺基琥珀酰亞氨酯(磺基-SMCC) ,5,5'-聯硫基雙(2-硝基 苯甲酸)(DTNB)，它們與抗樹突細胞抗體和選擇的抗原上的不同的反應性氨基酸或碳水化 合物側鏈形成共價鍵。也可以使用其它偶聯劑和交聯劑產生共價鍵，如蛋白A、碳二亞胺和 鄰亞苯基二馬來酰亞胺(oPDM)；(參見，例如，Karpovsky 等(1984) J. Exp. Med. 160 1686 ； Liu, MA 等(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括 Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78，118-132) ；Brennan 等(Science (1985) 229 :81_83)，和 Glennie 等 (J. Immunol. (1987) 139 =2367-2375)所描述的方法。優(yōu)選的偶聯劑為SATA和硫代-SMCC, 兩者均可從Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)獲得。也可以使用上述相同的連接方法 將免疫刺激劑與本發(fā)明的分子偶聯物化學連接。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體與治療性部分如細胞毒素、藥物或放射性同 位素連接。當與細胞毒素偶聯時，這些抗體偶聯物被稱作“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒 劑包括對細胞有害(例如殺傷細胞)的任何試劑。實例包括紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌 肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉 素、柔紅霉素、二羥基蒽醌(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、 1-脫氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似 物或同系物。治療劑包括但不限于，抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥、噻替派苯丁酸 氮芥(thio印achlorambucil)、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白 消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉬(II) (DDP)順鉬)，蒽環(huán)類 抗生素(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素類(例如，放線菌素D(以 前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))，抗有絲分裂劑(例如，長春新堿 和長春堿)。本發(fā)明的抗體可以與放射性同位素例如放射性碘偶聯，以產生細胞毒性放射性 藥物，用于治療樹突細胞相關的疾病，如自身免疫病或炎性疾病，或移植物抗宿主病。本發(fā)明的抗體偶聯物可以用來改變特定的生物學反應，且藥物部分不應理解為局 限于經典的化療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質或多肽。這樣的 蛋白質包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單 胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，如腫瘤壞死因子或干擾素-Y ；或生物反應調節(jié)物，如淋 巴因子、白介素_1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素_6( “IL-6”)、粒細胞巨噬細胞 集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。將這種治療性部分與抗體偶聯的技術是眾所周知的，參見，例如，Arnon 等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld 等(eds. ), pp.243-56(Alan R. Liss,Inc.1985) ；Hellstrom 等，"Antibodies For Drug Delivery" ,in Controlled Drug Delivery(2nd Ed·), Robinson 等(eds·), pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc.1987)； Thorpe, " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review", in Monoclonal Antibodies ' 84 :Biological and Clinical Applications,Pinchera 等(eds·), pp.475-506 (1985) ； " Analysis, Results, and FutureProspectiVe Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies InCancer Therapy" , in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy,Baldwin等(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985)， 禾口 Thorpe 等， "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates" , Immunol. Rev. , 62 :119-58(1982)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可以用來將完整細胞例如腫瘤細胞、效應細 胞或微生物病原體直接靶向至樹突細胞。例如，抗DEC-205抗體可以在細胞表面直接表達， 例如，通過用含有編碼本發(fā)明抗體的核酸序列的載體轉染或轉導細胞。這可以通過例如用 編碼含有跨膜域和抗樹突細胞抗體或其抗原結合片段的融合蛋白的核酸轉染靶細胞來完 成。產生這種核酸、融合蛋白和表達這種融合蛋白的細胞的方法例如在美國專利申請No 09/203, 958中有描述，在此通過引用并入本文?；蛘?，利用化學連接體、脂質標簽或其它 相關方法，抗樹突細胞抗體或其抗原結合片段可以結合到細胞或病原體上(deKruif，J.等 (2000) Nat. Med. 6 :223_227 ；Nizard, P.等(1998) FEBS Lett. 433 :83_88)。表面錨定有抗 DEC-205抗體的細胞可以用來誘導針對細胞例如腫瘤細胞或微生物病原體的特異性免疫應 答。III.藥物組合物在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學上 可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發(fā)明的單克隆抗體。也提供了含有包含本發(fā)明 的抗體的雙特異性分子或分子偶聯物的組合物。在一個實施方案中，組合物包括多種(例如兩種或多種)本發(fā)明的分離的抗體的組合。優(yōu)選地，組合物中的每種抗體結合DEC-205 的不同的、預先選擇的表位。本發(fā)明的藥物組合物也可以在聯合治療中施用，即與其他藥劑聯用。例如，聯合治 療可包括本發(fā)明的組合物聯合至少一種或多種另外的治療劑，如抗炎劑、DMARD(疾病改善 抗風濕藥)、免疫抑制劑和化療劑。本發(fā)明的藥物組合物也可以與放射療法一起施用。與其 它抗體如CD4特異性抗體或IL-2特異性抗體的共施用也包括在本發(fā)明中。這種與CD4特異 性抗體或IL-2特異性抗體的組合被認為在治療自身免疫病和移植排斥方面特別有用。與 針對CTLA4、CD40等的抗體的組合在癌癥和傳染病的治療中特別有用。在另一個實施方案中，被APC快速內化的疫苗偶聯物可以與增強樹突細胞的抗原 呈遞細胞活性(例如，免疫刺激性細胞因子的釋放)的單克隆抗體組合。本文所用的“藥學上可接受的載體”包括任何和所有生理上兼容的溶劑、分散介 質、包衣料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適用于靜脈內、肌 內、皮下、胃腸外、脊髓或表皮給藥(如通過注射或輸注)。取決于給藥途徑，活性化合物 (即抗體、雙特異性和多特異性分子)可包被以某種材料，以保護所述化合物免受可能使其 失去活性的酸和其它自然條件的作用?？梢耘c本發(fā)明的抗體和構建體一起使用的佐劑的例子包括弗氏不完全佐劑和完 全佐齊Ll (Difco Laboratories, Detroit, Mich. ) ；MerckAdjuvant 65 (Merck and Company, Inc.，Rahway，N. J.) ；AS-2 (SmithKline Beecham，Philadelphia，Pa.)；鋁鹽，如氫氧化鋁凝 膠(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅的鹽；酰化酪氨酸的不溶性懸液；?；?；陽離子或陰離子 衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球；細胞因子，如GM-CSF、白介素-2、-7、-12和其它 類似因子；3D-MPL ；CpG寡核苷酸；和單磷酰脂質A，例如3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|A。MPL 佐劑可從 Corixa Corporation (Seattle, Wash ；參見，例如，美國專利 No. 4, 436, 727 ；4, 877, 611 ；4，866，034 和 4，912，094)獲得。含有 CpG 的寡核苷酸(其 中CpG 二核苷酸未甲基化)是公知的，并且在例如WO 96/02555，WO 99/33488和美國專 利No. 6，008，200和5，856，462中有描述。也描述了免疫刺激性DNA序列，例如，Sato等， Science273 :352，1996。其它替代佐劑包括，例如，皂草苷，如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc. , Framingham, Mass.)；七葉素；洋地黃阜苷；或石頭花屬 (Gypsophila) 或奎奴亞藜(Chenopodiumquinoa)皂草苷 ；Montanide ISA 720(Seppic, France) ；SAF(Chiron, California, United States) ；ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron) ；SBAS 系列佐劑(例如，SBAS-2 或 SBAS-4，可獲自 SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium)； Detox (Enhanzyn ) (Corixa, Hamilton, Mont.) ；RC—529 (Corixa, Hamilton, Mont.)禾口其它 氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)；聚氧乙烯醚佐劑，如WO 99/52549A1中所述的那些； 合成》餅喧#，如咪喹莫特[S-26308，R-837], (Harrison，等，Vaccine 19 1820-1826, 2001 ； 和瑞喹莫德[S-28463，R-848] (Vasilakos，等，Cellularimmunology 204 :64_74，2000 ；在 抗原呈遞細胞和T細胞表面組成型表達的羰基和胺的席夫堿，如妥卡雷瑣(Rhodes，J.等， Nature 377 =71-75,1995)；作為蛋白質或肽的細胞因子、趨化因子和共刺激分子，包括例 如促炎細胞因子，如干擾素、GM-CSF, IL-I α、IL-I β、TGF-α和TGF-β，Thl誘導物，如干 擾素 Y > IL-2、IL-12、IL-15、IL-18 和 IL-21，Th2 誘導物，如 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和IL-13，和其它趨化因子和共刺激基因，如 MCP-I、MIP-I α、MIP-I β、RANTES, TCA-3、CD80、 ⑶86和⑶40L ；免疫刺激劑靶向配體，如CTLA-4和L-選擇素，凋亡刺激蛋白和肽，如Fas ；基 于合成脂質的佐劑，如 vaxfectin，(Reyes 等，Vaccine 19 :3778_3786，2001)、鯊烯、α-生 育酚、聚山梨醇酯 80、DOPC 和膽固醇；內毒素，[LPS], (Beutler, B. , CurrentOpinion in Microbiology 3 =23-30,2000)；引發(fā)Toll受體產生Thl-誘導細胞因子的配體，如合成分 枝桿菌脂蛋白，分枝桿菌脂蛋白P19、肽聚糖、磷壁酸和脂質AjP CT(霍亂毒素，亞單位A和 B)和LT (來自大腸桿菌的不耐熱腸毒素，亞單位A和B)，熱休克蛋白家族(HSP)和LLO (單 核細胞增多性李斯特菌素0;W0 01/72329)。這些和各種其它Toll-樣受體(TLR)激動劑 例如在 Kanzler 等，Nature Medicine, May2007, Vol 13，No 5 中有描述。“藥學上可接受的鹽”是指保持了親代化合物的所需生物活性而不引起任何不期 望的毒理學作用的鹽(參見如Berge，S.M.等(1977) J. Pharm. Sci. 66 1-19)。這樣的鹽的 例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些由諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、 氫碘酸、亞磷酸等無毒性無機酸衍生的鹽，以及由諸如脂族單羧酸和脂族二羧酸、苯基取代 的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等無毒性有機酸衍生的鹽。堿加成鹽包括 那些由諸如鈉、鉀、鎂、鈣等堿土金屬衍生的鹽，以及由諸如N，N’_ 二芐基乙二胺、N-甲基葡 糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒性有機胺衍生的鹽。本發(fā)明的組合物可以利用本領域公知的多種方法給藥。本領域技術人員應當理 解，給藥途徑和/或方式根據期望的結果而不同?；钚曰衔锟梢耘c保護該化合物不被 快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊化遞送系統。可 以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、 聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護或者通常為本領域技術人 員所公知。參見，例如，Sustained andcontrolled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson，ed.，MarcelDekker, Inc.，New York，1978。為通過某些給藥途徑施用本發(fā)明化合物，可能有必要使所述化合物包被以某種材 料，或使所述化合物與某種材料一起給藥，以防止其失去活性。例如，所述化合物可在適當 的載體如脂質體或稀釋劑中給予患者。藥學上可接受的稀釋劑包括鹽水和含水緩沖溶液。 脂質體包括水包油包水型CGF乳液以及常規(guī)脂質體(Strejan等(1984) J. Neuroimmunol. 7 27)。藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射液或分 散液的無菌粉末劑。這些用于藥學活性物質的介質和試劑的使用是本領域公知的。除非任 何常規(guī)介質或試劑與活性化合物不相容，涉及其在本發(fā)明的藥物組合物中的應用。還可以 向組合物中摻入補充的活性化合物。治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物 配制成溶液、微乳狀液、脂質體或其他適合高藥物濃度的有序結構。載體可以是含有例如 水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散 介質。例如，通過使用諸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大 小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當的流動性。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包含 等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇，或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸 收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實現注射型藥物的延長的吸收。
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通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據需要加入以上列舉的 成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻 入到含有基本分散介質和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對于用于制備 無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，該方法由其預 先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末。調節(jié)劑量方案，以提供最佳的所需反應(例如，治療反應)。例如，可以給予單次團 注(single bolus)，可以隨時間施用幾個分開的劑量，或者根據治療狀況的緊急情況所需， 可以按比例減小或增加劑量。例如，本發(fā)明的抗體可以通過皮下注射每周施用一次或兩次， 或者通過皮下注射每月施用一次或兩次。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此 處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每 個單位含有預定量的活性化合物，經計算該預定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產 生所需的治療效果。對本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合 物的獨特特性和要達到的特定治療效果，和(b)本領域中固有的對于配制這種用于治療個 體敏感性的活性化合物的限制。藥學上可接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半 胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、 丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合 劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。對于治療性組合物，本發(fā)明制劑包括適于經口給藥、鼻內給藥、局部給藥(包括口 腔和舌下給藥)、直腸給藥、陰道給藥和/或胃腸外給藥的那些劑型。所述制劑可方便地以 單位劑型的形式提供，且可通過藥物技術領域公知的任何方法制備。能與載體材料組合以 產生單一劑型的活性成分的量根據待治療的受試者和特定給藥方式而變化。能與載體材料 組合以產生單一劑型的活性成分的量通常為產生治療效果的組分量。通常，以總共百分之 百計，這個量為約0. 001%至約99%活性成分，優(yōu)選約0. 005%至約70%，最優(yōu)選約0. 01% 至約30%。適于通過陰道給藥的本發(fā)明制劑也包括陰道栓劑、衛(wèi)生栓、霜劑、凝膠劑、糊劑、泡 沫劑或噴霧劑，它們含有如本領域公知的適當的載體。用于本發(fā)明組合物的局部給藥或透 皮給藥的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、霜劑、洗劑、凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑。 活性化合物可在無菌條件下與藥學上可接受的載體混合，需要時也可與任何防腐劑、緩沖 劑或拋射劑混合。本文所用的短語“腸胃外給藥”是指不同于腸和局部給藥的給藥模式，通常是通過 注射，包括但不限于靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮 下、表皮下、關節(jié)內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。可用于本發(fā)明的藥物組合物中的適當的水性或非水性載體的例子包括水、乙醇、 多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其適當的混合物，植物油如橄欖油，和注射用有 機酯如油酸乙酯。例如通過應用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆 粒大小，和通過應用表面活性劑，可維持適當的流動性。這些組合物也可含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包含各種抗細菌和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等 來確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通 過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實現注射型藥物的延長的吸收。當本發(fā)明化合物作為藥物給予人和動物時，可單獨給予和作為藥用組合物給予， 該組合物中包含例如0. 001-90% (更優(yōu)選0. 005-70%，如0. 01-30% )的活性成分及與其 組合的藥學上可接受的載體。不管所選擇的給藥方式如何，本發(fā)明的化合物(可以適當的水合形式使用)和/ 或本發(fā)明的藥用組合物可通過本領域技術人員公知的常規(guī)方法配制成藥學上可接受的劑型。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可能變化，以獲得可有效實現對特 定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應，而對患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量 水平取決于多種藥物代謝動力學因素，包括應用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的 活性、給藥途徑、給藥時間、所應用的特定化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時間、與應用的特 定組合物聯合應用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀 況、總體健康情況和病史、以及醫(yī)學領域中公知的其它因素。在本領域具有普通技術水平的 醫(yī)師或獸醫(yī)可容易地確定和開出所需的藥用組合物的有效量。例如，醫(yī)師或獸醫(yī)開始開出 的藥物組合物中使用的本發(fā)明化合物的劑量水平低于為達到希望的治療效果所需要的劑 量水平，然后逐漸增加劑量，直至達到所希望的效果。通常，合適的本發(fā)明組合物的日劑量 為有效產生治療效果的最低劑量的化合物的量。這個有效劑量通常取決于上述因素。優(yōu)選 給藥方式為靜脈、肌內、腹膜內或皮下給藥，優(yōu)選在最接近目標部位處給藥。如需要，治療性 組合物的有效日劑量可以兩個、三個、四個、五個、六個或更多分劑量的形式在一天中以合 適的間隔分開給藥，且任選地以單位劑型給藥。雖然本發(fā)明化合物有可能單獨給藥，但優(yōu)選 將所述化合物作為藥用制劑(組合物)來給藥。治療性組合物可應用本領域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個優(yōu)選實施方 案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國專利No. 5，399，163、 5，383，851,5, 312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 中公開的裝置。可 用于本發(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括美國專利No. 4，487，603，該專利公開了用 于以受控速率分散藥物的可植入式微量輸注泵；美國專利No. 4，486，194，該專利公開了用 于通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利No. 4，447，233，該專利公開了用于以精確的輸注速 率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國專利No. 4，447，224，該專利公開了用于連續(xù)遞送藥物的變 流可植入式輸注裝置；美國專利No. 4，439，196，該專利公開了具有多腔室的滲透藥物遞送 系統和美國專利No. 4，475，196，該專利公開了一種滲透藥物遞送系統。本領域技術人員 知道許多其他這樣的植入物、遞送系統和模塊。在某些實施方案中，可以配制本發(fā)明的抗體以確保在體內的正確分布。例如， 血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物 能夠穿過BBB(如果需要時)，可將它們配制在如脂質體中。至于制備脂質體的方法， 參見，例如，美國專利4，522，811 ；5，374，548 ；和5，399，331。脂質體可以包含可被選 擇性地轉運入特定細胞或器官內的一個或多個部分，從而增強定向藥物遞送(參見， 例如，V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 685)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等人的美國專利5，416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 1038)；抗體(P. G. Bloeman 等(1995) FEBS Lett. 357 140 ；M. Owais 等(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39 180)；表面活性劑蛋白 A 受體(Briscoe等(1995) Am. J. Physiol. 1233 134)，其不同種類可包括本發(fā)明的制劑 以及本發(fā)明的分子組分；pl20 (Schreier等(1994) J. Biol. Chem. 269 9090)；也參見 K. Keinanen ；M. L. Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346 123 J. J. Killion ；I. J. Fidler (1994) Immunomethods4 :273。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的治療性化合物配制于脂質體 中；在更優(yōu)選的實施方案中，所述脂質體包括定向部分。在最優(yōu)選的實施方案中，脂質體中 的治療性化合物通過團注遞送到最接近腫瘤或感染的部位。組合物的流動性必須達到易于 注射的程度。它在生產和儲藏的條件下必須穩(wěn)定，并且必須防止微生物如細菌和真菌的污 染作用?；衔镆种瓢┌Y的能力可以在預測對于人腫瘤的有效性的動物模型系統中評價。 或者，組合物的這種特性可以通過利用熟練技術人員已知的分析檢查該化合物抑制如體外 抑制的能力進行評價。治療有效量的治療性化合物可以減少腫瘤大小，或者以其它方式緩 解受試者的癥狀。本領域普通技術人員能夠根據以下因素來確定所述化合物的量，如受試 者的體型、受試者癥狀的嚴重程度以及選擇的特定組合物或給藥途徑。也可以根據本領域公知的方法評價抗體增強抗原呈遞或誘導針對多種靶細胞或 病原體的細胞毒性T細胞(CTL)應答的能力。組合物必須是無菌的，其流動性必須達到能使組合物可通過注射器遞藥的程度。 除水之外，載體可為等滲緩沖鹽水溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等) 及其合適的混合物。例如，通過使用如卵磷脂的包衣，在分散液情況下通過維持需要的顆粒 大小，和通過使用表面活性劑，能夠維持適當的流動性。在許多情況下，優(yōu)選地在組合物中 包括等滲劑，如糖類、多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇，以及氯化鈉?？赏ㄟ^在組合物中加入 能延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁或明膠，來實現注射用組合物的長期吸收。當活性化合物如上所述被適當地保護時，它可經口給藥，例如與惰性稀釋劑或可 同化的食用載體一起給藥。IV.本發(fā)明的應用和方法在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體、雙特異性分子和分子偶聯物可以用來治療和/ 或預防(例如，針對其進行免疫)多種疾病和病癥?？梢杂帽景l(fā)明的抗體治療的一種主要的疾病適應癥是癌癥。包括但不限于結腸 癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、肥大細胞瘤、乳房腺 癌、白血病或類風濕性成纖維細胞瘤(fibroblastsoma)。另一種主要的疾病適應癥是傳 染性疾病，包括但不限于HIV、肝炎(例如甲、乙、丙型肝炎)、流感、皰疹、賈第蟲病、瘧疾、 利什曼原蟲病、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。另一種主要的疾病適應癥包括自身免疫病。為了用于治療，本發(fā)明的疫苗偶聯物可以單獨或與免疫刺激劑一起直接施用于受 試者(即，在體內)。在一個方面，免疫刺激劑與偶聯物連接。或者，偶聯物可以間接施用于 受試者，這是通過首先使偶聯物與APC如樹突細胞接觸(例如，通過培養(yǎng)或溫育)，然后將該 細胞施用給受試者(即來自體內地)。偶聯物向APC的接觸和遞送，使得它們在施用前被APC加工和呈遞，也被稱為抗原或細胞“加載”。向APC加載抗原的技術在本領域中公知，包 括，例如，Gunzer 和 Grabbe，Crit Rev Immunol 21(1-3) 133-45 (2001)，和 Steinman，Exp Hemato124(8) :859_62(1996)。在所有情況中，疫苗偶聯物和免疫刺激劑以有效量施用，以發(fā)揮它們的理想的治 療效果。術語"有效量"是指實現希望的生物學效應所所需的或足以實現該效應的量。例 如，有效量可以是消除腫瘤、癌癥或細菌、病毒或真菌感染所必需的量。用于任何特定用途 的有效量可以根據如下因素而變化，如所治療的疾病或病癥、施用的具體偶聯物、受試者的 大小、或疾病或病癥的嚴重程度。本領域普通技術人員可以根據經驗確定特定多特異性分 子的有效量，而無需過多的實驗。疫苗偶聯物的優(yōu)選施用途徑包括，例如，注射(例如，皮下、靜脈內、腸胃外、腹膜 內、鞘內)。注射可以是團注或連續(xù)輸注。其它施用途徑包括口服。本發(fā)明的疫苗偶聯物也可以與佐劑和其它治療劑共施用。應當理解，本文使用的 術語“共施用”包括本發(fā)明的抗體和偶聯物與佐劑和其它藥物同時、分開或順序施用的任何 一種或全部，包括作為給藥方案的一部分施用。偶聯物一般配制在單獨的或與這些藥物組 合的藥學可接受的載體中。這些載體的例子包括溶液、溶劑、分散介質、延遲劑、乳劑等。這 些介質用于藥物活性物質的應用是本領域公知的。適用于分子的任何其它常規(guī)載體落入本 發(fā)明的范圍內。適合與疫苗偶聯物共施用的藥物包括其它抗體、細胞毒素和/或藥物。在一個實 施方案中，該藥物是已知有助于或誘導免疫應答的抗CTLA-4抗體。在另一個實施方案中， 該藥物是化療劑。疫苗偶聯物也可以與放射一起施用。適于在腫瘤治療中與本發(fā)明的抗體和偶聯物共施用的化療劑包括，例如紫杉醇、 細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長 春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基蒽醌、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-脫氫 睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同 系物。其它治療劑包括，例如，抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿 糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥、噻替派苯丁酸氮芥 (thioepa chlorambucil)、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消 安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉬(II) (DDP)順鉬)，蒽環(huán)類抗 生素(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素類(例如，放線菌素D(以 前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有絲分裂劑(例如，長春新 堿和長春堿)和替莫唑胺?？上蛞种评缑庖呒毎?例如調節(jié)性T細胞、NKT細胞、巨噬細胞、骨髓來源 的抑制細胞、未成熟的或抑制性樹突細胞)或在腫瘤局部微環(huán)境中由腫瘤或宿主細胞產生 的抑制性因子(例如，16 3、口引哚胺2，3雙加氧酶-100)的免疫抑制活性的藥物，也可以與 本發(fā)明的抗體和偶聯物一起施用。這些藥物包括抗體和小分子藥物，如IDO抑制劑，如1甲 基色氨酸或衍生物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可以用來治療患有自身免疫病、免疫系統疾 病或炎性疾病的患者，該疾病例如是以與樹突細胞的免疫調節(jié)有關的異?；虿幌Ｍ拿庖?活性為特征的疾病?？赡苁芤嬗诒景l(fā)明的抗樹突細胞治療的自身免疫、免疫系統和炎性疾病包括類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、免疫介導的或1型糖尿病、重癥肌無力、惡性貧血、阿 狄森病、干燥綜合征、銀屑病、紅斑狼瘡、炎性腸病如克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎、硬皮病/ 雷諾氏綜合征、萊特爾綜合征和自身免疫性甲狀腺病如橋本甲狀腺炎和格雷夫斯病。例如， 患有自身免疫病的患者可以受益于樹突細胞介導的自身抗原呈遞的抑制。本發(fā)明的抗體也可以用于預防和治療所有形式的變態(tài)反應和變應性疾病，包括但 不限于眼科變應性疾病，包括變應性結膜炎、春季結膜炎、春季角結膜炎和巨乳頭狀結膜 炎；鼻變應性疾病，包括變應性鼻炎和竇炎；耳變應性疾病，包括咽鼓管搔癢，上呼吸道和 下呼吸道的變應性疾病，包括內源性和外源性哮喘；皮膚的變應性疾病，包括皮炎、濕疹和 風疹；和胃腸道的變應性疾病。與本發(fā)明的抗體共施用的用于治療這類免疫疾病的合適的藥物包括，例如，免疫 抑制劑，如雷帕霉素、環(huán)孢菌素和Π(506 ；抗TNFa劑，如依那西普、阿達木單抗和英夫利昔 單抗；和留類。具體的天然和合成留類的例子包括，例如醛固酮、倍氯米松、倍他米松、 布地奈德、氯潑尼醇、可的松、可的伐唑、脫氧皮質酮、地奈德、去羥米松、地塞米松、二氟可 龍(difluorocortolone)、氟氯縮松、氟米松、氟尼縮松、膚輕松、醋酸氟輕松、氟考丁酯、氟 可的松、氟可龍(fluorocortolone)、氟米龍、氟氫縮松、氟替卡松、氯氟舒松、氫化可的松、 icomethasone、甲潑尼松、甲潑尼龍、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松、替可的松和曲安西龍?？捎帽景l(fā)明的人抗DEC-205抗體治療的其它疾病的實例包括移植排斥和移植物 抗宿主病。移棺排斥近年來，在用于移植組織和器官，如皮膚、腎臟、肝臟、心臟、肺、脾臟和骨髓的手術 技術的效果方面有相當大的進步。還沒有解決的主要問題也許是缺少令人滿意的用于在移 植接受者中誘導對所移植的同種異體移植物或器官的免疫耐受性的藥物。當同種異體細胞 或器官移植到宿主(即供體和受體為同物種的不同個體)時，宿主免疫細胞很可能發(fā)起針 對移植物中的外來抗原的免疫應答(宿主抗移植物病)，導致移植的組織被破壞。CD8+細 胞、CD4+細胞和單核細胞都參與對移植的組織的排斥。本發(fā)明的抗體可用于抑制受體中樹 突細胞介導的、同種抗原誘導的免疫應答，從而防止這些細胞參與對移植的組織或器官的 破壞。移植物抗宿主病本發(fā)明的抗體的一個相關用途是調節(jié)參與“移植物抗宿主病”(GVHD)的免疫應答。 GVHD是一種潛在的致命疾病，在具有免疫能力的細胞被轉移到同種異體接受者時會發(fā)生該 疾病。在這種情況下，供體中具有免疫能力的細胞會攻擊接受者中的組織。皮膚、內臟上皮 和肝臟中的組織是常見的攻擊目標，它們在GVHD發(fā)病過程中會被破壞。當移植免疫組織 時，如骨髓移植時，該疾病會造成特別嚴重的問題；但在其它情況下(包括心臟和肝臟移植 物情況)也報道了較不嚴重的GVHD。本發(fā)明治療劑可用于抑制宿主抗原呈遞細胞如樹突細 胞的活性。本發(fā)明進一步用以下實施例進行說明，這些實施例不能理解為是對本發(fā)明的進一 步限制。在本申請中引用的序列表、附圖和所有引用文獻、專利和出版的專利申請的內容通 過引用專門結合到本文中。實施例實施例1DEC-205特異性人單克隆抗體(HuMab)的 產生通過用可溶性人DEC-205抗原免疫HuMAb 轉基因小鼠("HuMab”是Medarex, Inc.，Princeton, New Jersey 的商標)HC2/KCo7 株產生人抗 DEC-205 單克隆抗體。HC2/ KCo7HuMAb小鼠如美國專利5，770，429和5，545，806所述產生，其全部公開內容通過參考并 入本文?？乖兔庖呖乖前c抗體Fc域融合的DEC-205胞外域(包含全部10個 凝集素結合域)的可溶性融合蛋白。人DEC-205的核酸和氨基酸序列在PCT專利公布WO 96023882 (Steinman)中提供。抗原與完全弗氏佐劑(Sigma)混合用于第一次免疫。之后， 抗原與不完全弗氏佐劑(Sigma)混合。另外的小鼠用RIBI MPL+TDM佐劑系統(Sigma)中 的可溶性DEC-205蛋白免疫。溶于PBS的5_25微克可溶性重組DEC-205抗原或PBS中的 為了表面表達人DEC-205而轉染的5x IO6CHO細胞與佐劑1 1混合。每14天向小鼠的腹 腔注射100微升制備的抗原。融合前3-4天給產生抗DEC-205滴度的動物靜脈注射10微 克可溶性重組DEC-205抗原。取小鼠脾臟，分離的脾細胞用于雜交瘤制備。雜交瘤制備P3x63Ag8.653鼠骨髓瘤細胞系(ATCC CRL 1580)用于融合。含有 10% FBS的RPMI 1640 (Invitrogen)用于培養(yǎng)該骨髓瘤細胞。向雜交瘤生長培養(yǎng)基中添加 另外的培養(yǎng)基補充物，包括3% Origen-雜交瘤克隆因子(Igen)，10% FBS (Sigma)，L-谷 氨酰胺(Gibco)O. 慶大霉素(Gibco)，2-巰基乙醇(Gibco)，HAT (Sigma ； l.Ox IO4M 次黃 嘌呤，4. Ox 10_7M氨基蝶呤，1. 6x 10_5M胸苷)或HT (Sigma ；1. Ox 10_4M次黃嘌呤，1. 6x 10_5M 胸苷)培養(yǎng)基。脾細胞與653骨髓瘤細胞以6 1的比例混合，并離心沉淀。逐滴添加聚乙二醇， 同時小心混合以促進融合。讓雜交瘤生長1-2周，直到形成可見的集落。收集上清液，并利 用人κ鏈特異性捕獲和人Fc特異性檢測通過ELISA用于初始篩選人IgG。然后通過流式 細胞術或使用DEC-205ELISA測定IgG陽性上清液的DEC-205特異性。亞克隆并擴增產生特異性HuMab IgG的雜交瘤。然后按照標準條件通過蛋白A柱 層析純化產生的HuMab，這導致分離出許多特別感興趣的抗體。實施例2通過表面等離子體共振(SPR)測定HuMab的親和力和速率常數使用Biacore 2000SPR 儀器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)，按照廠商指導，通 過Biacore 表面等離子體共振(SPR)分析檢查來自實施例1的各種人抗DEC-205抗體的 結合親和力和結合動力學。使用Biacore提供的胺偶聯試劑盒，按照廠商指導(BIAcoreProduct No.BR-1000-50，包括偶聯試劑N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基_3_ (3-二甲基氨基丙 基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC))，使用標準胺偶聯化學，將純化的重組人DEC-205融合(或對 照)蛋白共價連接到Biacore CM5傳感器芯片上(共價連接到金表面上的羧甲基化的葡 聚糖；Biacore Product No. BR-1000-14)。將低水平的配體固定，以限制分析物的質量轉運 對動力學參數的任何影響，使得觀測的Rmax為200RU等級。通過使抗體以1. 25-200nM的濃度和35 μ 1/分鐘的低流速流經在HBS-NP緩沖液(HBS-N 緩沖液，Biacore Product No. BR-1003-69 :4_ (2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)0. 24%,氯化鈉0. 88%，足量的水，過濾/除氣并且預平衡至室溫，使用1 2000稀 釋的表面活性劑P20)中的傳感器芯片來檢測結合?？乖?抗體締合和解離動力學在每種 情況下進行大約300至600秒。在每種情況下使用無關蛋白質進行相應的對照，用于“背景”減除。以35μ 1/min 單次注射18mM NaOH 17秒用作整個研究中的再生條件。在每種情況下使用Biacore’ s動力學向導從在HBS-NP運行緩沖液中稀釋的分析 物濃度系列得出動力學參數。使用Biacore 動力學向導軟件(Biacore AB)按照廠商指導 將締合和解離曲線與1 ILangmuir結合模型擬合。測定的親和力和動力學參數(背景已 減除)在以下表1中顯示。對于每種抗體，所示的數字是兩個單獨實驗系列的平均值，在每 種情況下使用分別制備的傳感器芯片(其中ka =結合的速率常數，kd =解離的速率常數， Kd =解離平衡常數(親和力的量度)，Ka =結合平衡常數，Rmax =最大SPR響應信號)。表 1 實施例3HuMab與表達人DEC-205的細胞的結合 抗DEC-205HuMab與在其表面上表達人DEC-205的CHO-S細胞上的DEC-205結合 的能力如下所述通過流式細胞術進行研究。 檢測抗體與在其表面上表達人DEC-205的CHO-S細胞的結合。蛋白A純化的 HuMab 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 禾口 3A4-1C10與表達人DEC-205的CHO-S細胞以及CHO-S對照細胞在4°C溫育。所有抗體都以 飽和濃度使用。1小時后，用含有0. BSA和0.05% NaN3(PBA)的PBS洗滌細胞，并通過 細胞與PE標記的山羊抗人IgG Fc特異性探針在4°C溫育來檢測結合的抗體。用PBA從細胞上洗去過量的探針，按照廠商說明通過使用LSR 儀器(BD Biosciences, NJ, USA)的分 析確定細胞結合的熒光。結果示于圖1中。如圖1所示，證明HuMab高水平結合表達人DEC-205的CHO-S細胞。這些數據證 明與對照細胞相比，這些抗體有效地和特異性地結合在活CHO-S細胞上表達的人DEC-205。實施例4 HuMab與人樹突細胞的結合人外周血單個核細胞(PBMC)通過對Leukopak血小板血漿分離制品(platelet apheresis preparation)進行密度梯度離心而獲得。單核細胞通過粘附到組織培養(yǎng)瓶上 2小時分離，然后通過在巨噬細胞無血清培養(yǎng)基(Gibco)中與2ng/ml GM-CSF和lOng/ml IL-4溫育5-7天分化為樹突細胞。抗DEC_205HuMab結合如上制備的人樹突細胞上的DEC-205的能力如下所述通過 流式細胞術進行研究。蛋白A 純化的 HuMab 3D6-2F2、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5_2A9、 3C7-3A3.5D12-5G1UG6-1G6和3A4-1C10和同種型對照(人IgG)與人樹突細胞在4°C溫 育。所有抗體都以飽和濃度使用。1小時后，用含有0. 1% BSA和0. 05% NaN3(PBA)的PBS 洗滌細胞，通過細胞與PE標記的山羊抗人IgG Fc特異性探針在4°C溫育來檢測結合的抗 體。用PBA從細胞上洗去過量的探針，按照廠商說明通過使用LSR 儀器(BD Biosciences, NJ, USA)的分析來確定細胞結合的熒光。結果示于圖2，結果表明與同種型對照相比，證明 HuMab與人樹突細胞有高水平結合。實施例5測定HuMAb的DEC-205結合特征的ELISA分析微量滴定板用PBS中的可溶性DEC-205/Fc融合蛋白包被，然后用PBS中的5%牛 血清白蛋白封閉。以飽和濃度添加蛋白A純化的HuMab和同種型對照，并于37°C溫育。用 PBS/Tween洗板，然后于37°C與偶聯有堿性磷酸酶的山羊抗-人IgG Fc特異性多克隆試劑 溫育。洗滌后，平板用PNPP底物(lmg/ml)顯色，并使用微量滴定板讀數器在OD 405-650 處分析。結果示于圖3，結果表明與同種型對照相比，HuMab被證明有高水平的結合。實施例6抗體內化分析每等份5x IO5個人單核細胞衍生的樹突細胞與人IgG(lmg/ml)溫育，以阻斷非 特異性結合。然后細胞與100μ g/ml溶于封閉緩沖液的FITC-偶聯的抗-DeC-205HuMab 3G9-2D2在冰上溫育30分鐘用于結合，隨后轉移到37 °C放置0、10、30、60和120分析用于內 化。使用相同濃度的FITC-偶聯的人IgGl作為對照。然后洗滌細胞，并用低聚甲醛固 定。洗滌固定的細胞，重懸浮于水中，并細胞離心到顯微鏡載玻片上。使用Zeiss LSM 510 Meta共焦顯微鏡獲取圖像。結果示于圖4中，結果顯示與對照相比，FITC-標記的HuMab被 證明有效地內化到樹突細胞內。實施例7抗體測序如以上實施例1所述，來自產生特異性HuMab IgG的雜交瘤的HuMab通過蛋白A柱 層析法進行純化，導致分離出8種特別感興趣的抗體(“HuMab”)。HuMab 3D6_2F4、3D6_4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9 (VH 區(qū))、3C7_3A3、1E6-3D10 (VH 區(qū))和 5C3-2-3F6的 Vh 和 Vl 編碼區(qū)使用來自相應雜交瘤的RNA進行確認。將RNA逆轉錄為cDNA，通過PCR擴增V編碼 區(qū)，將PCR產物測序。以下是HuMab的V1^nt區(qū)的核酸和氨基酸序列(在氨基酸序列中， 互補決定區(qū)(CDR)以下劃線標出)。3D6-2F4VH 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH4) (SEQ ID NO 2)atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcatcttcag tatctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagctcctcactttgactactggggcca gggaaccctggtcaccgtctcctcagctagc3D6-2F4Vh氨基酸序列(SEQ ID NO :3)，包括信號肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSIYGMHWVRQAPGKGLEffVAV IffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYYYCARAPHFDYffGQGTLYTYS S3D6-2F4 Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO :4)，不包括信號肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSIYGMHWVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAPHFDYffGQGTLVTVSS3D6-2F4Vh CDRl(SEQ ID NO 5) :IYGMH3D6-2F4Vh CDR2(SEQ ID NO 6) :YIffYDGSNKYYADSVKG3D6-2F4Vh CDR3(SEQ ID NO 7) APHFDY3D6-2F4 Vl 核酸序列(VK1，基因座 L15 ;JK2) (SEQ ID NO 8)atgggatggagctgtatcatcctgttcctcgtggccacagcaaccggtgtccactccgacatccagatg acccagtctccatcctcactgtctgcatctgttggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattag cagctggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaa gtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaa gattttgcaacttattactgccaacagtataatagttacccgtacacttttggccaggggaccaagctggagatcaa acgtacg3D6-2F4Vl氨基酸序列(SEQ ID NO :9)，包括信號肽MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIK 3D6-2F4Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 10)，不包括信號肽DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSffLAffYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIK3D6-2F4 Vl CDRl (SEQ ID NO: 11) RASQGI SSffLA3D6-2F4 Vl CDR2 (SEQ ID NO: 12) =MSSLQS3D6-2F4 Vl CDR3 (SEQ ID NO: 13) :QQYNSYPYT3D6-4C8VH 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH4) (SEQ ID NO 14)atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcatcttcagtatctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagctcctcactttgactactggggcca gggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac3D6-4C8Vh氨基酸序列(SEQ ID NO : 15)，包括信號肽 MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSIYGMHWVRQAPGKGLEffVAV IffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAPHFDYffGQGTLVTVSS3D6-4C8Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 16)，不包括信號肽 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSIYGMHWVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAPHFDYffGQGTLVTVSS3D6-4C8Vh CDRl (SEQ ID NO: 17) : IYGMH3D6-4C8 Vh CDR2 (SEQ ID NO: 18) :YIffYDGSNKYYADSVKG3D6-4C8 Vh CDR3 (SEQ ID NO: 19) APHFDY3D6-4C8VL 核酸序列(VK1，基因座 L4 ;JK4) (SEQ ID NO 20)atggacatgagggtccccgctcagctcctggggcttctgctgctctggctcccaggtgccagatgtgcc atccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtca gggcattagcagtgctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcctcca gtttggaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctg cagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttaccctctcactttcggcggagggaccaaggt ggagatcaaa3D6-4C8Vl氨基酸序列(SEQ ID NO :21)，包括信號肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLL IYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK3D6-4C8Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 22)，不包括信號肽AIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK3D6-4C8 Vl CDRl(SEQ ID NO 23) RASQGISSALA3D6-4C8 Vl CDR2(SEQ ID NO 24) :DASSLES3D6-4C8 Vl CDR3(SEQ ID NO 25) :QQFNSYPLT3G9-2D2，Vh 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ；D 未確定;JH4) (SEQ ID NO 26)atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag taattatggcatgtactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatctctggggatggtactttgacta ttggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagc3G9-2D2，Vh氨基酸序列(SEQ ID NO 27)，包括信號肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMYffVRQAPGKGL EffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYYYCARDLffGffYFDYffGQGTLYTVSSASTKGPSVFPLA3G9-2D2，Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 28)，不包括信號肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMYffVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLffGffYFDYffGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA3G9-2D2, Vh CDRl(SEQ ID NO 29) NYGMY3G9-2D2, Vh CDR2(SEQ ID NO 30) :YIffYDGSNKYYADSVKG3G9-2D2, Vh CDR3(SEQ ID NO 31) :DLffGffYFDY
3G9-2D2, Vl 核酸序列(VK3，基因座 L6 ;JK4) (SEQ ID NO 32)atgggatggagctgtatcatcctgttcctcgtggccacagcaaccggtgtccactccgaaattgtgttg acacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttag cagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggcca ctggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaa gattttgcagtttattactgtcagcagcgtcgcaactggccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaa acgtacg3G9-2D2，Vl氨基酸序列(SEQ ID NO 33)，包括信號肽MEAPAQLLFLLLLffLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIY DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRNVPLTFGGGTKVEIK3G9-2D2，Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 34)，不包括信號肽EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRNffPLTFGGGTKVEIK3G9-2D2, Vl CDRl(SEQ ID NO 35) :RASQSVSSYLA3G9-2D2, Vl CDR2(SEQ ID NO 36) :DASNRAT3G9-2D2, Vl CDR3(SEQ ID NO 37) QQRRNffPLT5A8-1F1, Vh 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH2) (SEQ ID NO 38)atggagtttgggctgacctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag tacctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggag gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagacttctactggtacttcgatctctg gggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaagg5A8-1F1，Vh氨基酸序列(SEQ ID NO : 39)，包括信號肽MEFGLTffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHffVRQAPGKGLEffVA IIffYDGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDFYffYFDLffGRGTLVTVSSASTKGPSV FPLA5A8-1F1，Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 40)，不包括信號肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEffVAIIffYDGGNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDFYffYFDLffGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLA5A8-1F1, Vh CDRl(SEQ ID NO 41) TYGMH5A8-1F1, Vh CDR2 (SEQ ID NO 42) JIffYDGGNKYYADSVKG
5A8-1F1, Vh CDR3(SEQ ID NO 43) :DFYffYFDL5A8-1F1, Vl 核酸序列(VK3，基因座 L6 JKl) (SEQ ID NO 44)atggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggagaaattgtg ttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgt tagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacaggg ccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct gaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtaggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacga5A8-1F1，Vl氨基酸序列(SEQ ID NO 45)，包括信號肽MEAPAQLLFLLLLffLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIY DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRTFGQGTKVEIK5A8-1F1，Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 46)，不包括信號肽EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRTFGQGTKVEIK5A8-1F1, Vl CDRl(SEQ ID NO 47) :RASQSVSSYLA5A8-1F1, Vl CDR2(SEQ ID NO 48) :DASNRAT5A8-1F1, Vl CDR3(SEQ ID NO 49) QQRRT3C7-3A3, Vh 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH2) (SEQ ID NO 50)atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag tagctataacatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcatttatatggtatgatggaa gtaataaatactatggagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaaaaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaagagctggggatcgggtggtactt cgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac3C7-3A3，Vh氨基酸序列(SEQ ID NO :51)，包括信號肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYNMHffVRQAPGKGLEffVA FIWYDGSNKYY⑶SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREELGIGffYFDLffGRGTLVTVSSASTKG PSVFPLA3C7-3A3，Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 52)，不包括信號肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYNMHWVRQAPGKGLEffVAFIffYDGSNKYYGDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREELGIGffYFDLffGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLA3C7-3A3, Vh CDRl(SEQ ID NO 53) SYNMH3C7-3A3, Vh CDR2(SEQ ID NO 54) :FIWYDGSNKYY⑶SVKG3C7-3A3, Vh CDR3(SEQ ID NO 55) :EELGIGffYFDL3C7-3A3, Vl 核酸序列(VK3，基因座 L6 JKl) (SEQ ID NO 56)atggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggagaaattgtg ttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgt tagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacaggg ccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct gaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtaggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgc3C7-3A3，Vl氨基酸序列(SEQ ID NO 57)，包括信號肽
MEAPAQLLFLLLLffLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIY DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRTFGQGTKVEIK3C7-3A3，Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 58)，不包括信號肽EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRTFGQGTKVEIK3C7-3A3, Vl CDRl(SEQ ID NO 59) :RASQSVSSYLA3C7-3A3, Vl CDR2(SEQ ID NO 60) :DASNRAT3C7-3A3, Vl CDR3(SEQ ID NO 61) QQRRT2D3-1F5-2A9，Vh 核酸序列(VH3，基因座 0rph_C16 ; JH3) (SEQ ID NO 62)atggagtttgtgctgagctgggttctccttgttgctatattaaaaggtgtccagtgtgaggttcagctg gtgcagtctgggggaggcttggtacatcctggggggtccctgagactctcctgtgcaggctctggattcaccttcag taactatgctatgcactgggttcgccaggctccaggaaaaggtctggagtgggtatcaactattggtactggtggtg gcacaccctatgcagactccgtgaagggccgcttcaccatctccagagacaatgccaagaactccttgtatcttcaa atgaacagcctgagagccgaggacatggctgtgtattactgtgcattaagtgcttttgatgtctggggccaagggac aatggtcaccgtctcttcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac2D3-1F5-2A9，Vh 氨基酸序列(SEQ ID NO 63)，包括信號肽MEFVLSffVLLVAILKGVQCEVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLEffVST IGTGGGTPYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCALSAFDVffGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLA2D3-1F5-2A9，Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 64)，不包括信號肽EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLEffVSTIGTGGGTPYADSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCALSAFDVffGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLA2D3-1F5-2A9, Vh CDRl(SEQ ID NO 65) NYAMH2D3-1F5-2A9, Vh CDR2(SEQ ID NO 66) :TIGTGGGTPYADSVKG2D3-1F5-2A9, Vh CDR3(SEQ ID NO 67) SAFDV1E6-3D10Vh 核酸序列(VH3，基因座 0rph_HC16 ;JH4)(SEQ ID NO 68)Atggagtttgtgctgagctgggttttccttgttgctatattaaaaggtgtccagtgtgaggttcagct ggtgcagtctgggggaggcttggtacatcctggggggtccctgagactctcctgtgcaggctctggattcaccttc agtagctatgctatgcactgggttcgccaggctccaggaaaaggtctggagtgggtatcagctattggtactggt ggttacacatactatgtagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaagtccttgtat cttcaaatgaacagcctgagagccgaggacatggctgtgtattactgtgcaagagagccgttttacgatattttg actggttattccccatactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggc ccatcggtcttccccctggcac1E6-3D10Vh氨基酸序列(SEQ ID NO :69)，包括信號肽MEFVLSffVFLVAILKGVQCEVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEffVSA IGTGGYTYYVDSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDMAVYYCAREPFYDILTGYSPYFDYffGQGTLVTVSS1E6-3D10Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 70)，不包括信號肽
EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEffVSAIGTGGYTYYVDSVKGRFTI SRDNAKKSLYLQMNSLRAEDMAVYYCAREPFYDILTGYSPYFDYffGQGTLVTVSS1E6-3D10 Vh CDRl (SEQ ID NO 71) SYAMH1E6-3D10 Vh CDR2(SEQ ID NO 72) :AIGTGGYTYYYDSVKG1E6-3D10 Vh CDR3(SEQ ID NO 73) :EPFYDILTGYSPYFDY5C3-2-3F6VH 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH2) (SEQ ID NO 74)Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag tagctataacatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatggagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaagagctggggatcgggtggtactt cgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac5C3-2-3F6Vh 氨基酸序列(SEQ ID NO :75)，包括信號肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYNMHWVRQAPGKGLEffVAV IWYDGSNKYY⑶SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREELGIGWYFDLWGRGTLVTVSS5C3-2-3F6Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 76)，不包括信號肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYNMHWVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYGDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREELGIGffYFDLffGRGTLVTVSS5C3-2-3F6 Vh CDRl(SEQ ID NO 77) SYNMH5C3-2-3F6 Vh CDR2(SEQ ID NO 78) :VIWYDGSNKYY⑶SVKG5C3-2-3F6 Vh CDR3(SEQ ID NO 79) :EELGIGffYFDL5C3-2-3F6 VK Vl 核酸序列(VK1，基因座 L18 ;JK5) (SEQ IDNO 80)Atggacatgagggtccccgctcagctcctggggcttctgctgctctggctcccaggtgccagatgtgc catccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagt cagggcattagcagtgctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcc tccagtttggaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagc agcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttaccctcacttcggccaagggaca cgactggagattaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct ggaactgcctctgttgtgtgcctgcaagggc5C3-2-3F6VK Vl 氨基酸序列(SEQ ID NO :81)，包括信號肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLL IYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPHFGQGTRLEIK5C3-2-3F6VK Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO :82)，不包括信號肽 AIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPHFGQGTRLEIK5C3-2-3F6 Vl CDRl(SEQ ID NO 83) RASQGISSALA5C3-2-3F6 Vl CDR2(SEQ ID NO 84) :DASSLES5C3-2-3F6 Vl CDR3(SEQ ID NO 85) :QQFNSYPH5D12-5G1 VH 核酸序歹lj (VH3，基因座 3-33 ;JH2) (SEQ ID NO 86)
Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag tagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggcccccctcggtacttcgatctctg gggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac5D12-5G1 VH氨 基酸序列(SEQ ID NO :87)，包括信號肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEffVAV IffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPPRYFDLffGRGTLVTVSS5D12-5G1VH “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO :88)，不包括信號肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPPRYFDLWGRGTLVTVSS5D12-5G1 VH CDRl(SEQ ID NO 89) SYGMH5D12-5G1 VH CDR2(SEQ ID NO 90) :YIffYDGSNKYYADSVKG5D12-5G1 VH CDR3(SEQ ID NO 91) :GPPRYFDL為了參考，提出的相應種系序列(沒有偏見地指定)的氨基酸序列如下種系L6(SEQ ID NO 92)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP種系L4(SEQ ID NO 93)AIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYP種系L15(SEQ ID NO 94)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRARQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYP系νΞ3-33 (SEQ ID NO 95)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR系Orph-C 16 (SEQ ID NO 96)EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSAIGTGGGTYYADSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCAR八和Vh序列相對于提出的相應種系序列的序列比對顯示于圖5中，只是用于說明 的目的。實施例83G9- β hCG APC-靶向疫苗偶聯物DEC-205靶向疫苗偶聯物是通過將β hCG抗原連接到來自上述實施例7的HuMab 3G9-2D2(也確定與獼猴DEC-205交叉反應)上產生的。連接是通過基因融合共價連接抗原 與抗體的重鏈而實現的。產生含有新霉素和二氫葉酸還原酶基因的質粒，其含有與抗體3G9-2D2重鏈的CH3結構域和3G9-2D2輕鏈融合的β hCG編碼序列。使用標準方案(Qiagen Inc, Valencia, CA)，用得到的質粒構建體轉化CHO細胞。在含有抗生素G418的培養(yǎng)基中選擇被轉染的 細胞。選擇后，通過有限稀釋克隆細胞，并用穩(wěn)定的克隆系產生細胞庫用于進一步研究。 為了證實3G9-i3hCG構建體的表達，在還原和非還原條件下在SDS-PAGE上進行蛋白質的 Western印跡分析。觀察到該融合蛋白具有預期的分子量并且正確裝配(即，同時含有重 鏈融合和輕鏈)。具體地，使用變性條件通過SDS-PAGE分析疫苗偶聯物和單獨的抗體，并 且通過Western印跡分析進行檢測。然后使用山羊抗人IgG、使用β hCG C-末端肽特異性 mAb (US Biologicals)分別探查該印跡。結果證實，根據融合產物的適當大小和組成證明， 被轉化的CHO細胞特異性表達3G9- β hCG疫苗偶聯物。實施例9使用3G9_i3 hCG APC-靶向疫苗偶聯物的抗原特異性活性能夠呈遞抗原的細胞是在來源上是人細胞，并且在外周血單個核細胞(PBMC)、單 核細胞(THP-I)、B類淋巴母細胞(C 1R. A2，1518B-LCL)和單核細胞衍生的DC之間不同。 通過流式細胞術評估，所有細胞的細胞表面DEC-205表達都是陽性的。將載體pk :3G9_hCGi3轉染入CHO細胞。使用G418選擇穩(wěn)定的克隆，隨后亞克隆。 在上清液中收集細胞產生的融合蛋白(3G9- β hCG疫苗偶聯物；實施例8)，并在蛋白A柱上 純化。從正常健康供體的Ieukopack獲得T細胞。通過每周2_3次用3G9_hCG β所針對 的和對于⑶8+和⑶4+Τ細胞富集的自體DC刺激，在體外產生抗原特異性T細胞，之后通過 GrB或IFN γ ELISpot分析(MabTech)用多種APC (如上所述)檢測抗原特異性活性。每3-4 天添加細胞因子IL-7和IL-2，以保持效應物的傳遞和活性。在低劑量IL-2的存在下使用 Miltenyi-MACS T細胞擴增試劑盒擴增抗原特異性T細胞10-12天。利用⑶40L(Alexis Biochemicals)誘導DC的成熟。如圖9A所示，在DC和單核細胞(THP-I)以及B類淋巴母 細胞中中獲得CD8+T細胞應答(圖9B)。因此，抗原通過DEC-205受體向B細胞的靶向導致 MHC-I類限制的T細胞的刺激。等同方案本領域技術人員只使用常規(guī)實驗方法，就可確認或能夠確定本文所述的本發(fā)明特 定實施方案的許多等同方案。這樣的等同方案包括在以下權利要求書中。
權利要求
一種分離的人單克隆抗體，其中該抗體結合人樹突和上皮細胞205受體(DEC-205)并且顯示至少一種以下性質(a)根據表面等離子體共振測定，以至少108M-1的親和常數結合人DEC-205；(b)在結合表達DEC-205的人樹突細胞后內化；(c)產生或增強對抗原的人CD4+T細胞應答；(d)產生或增強對抗原的人CTL或NKT應答；(e)定位于樹突細胞的抗原加工區(qū)室；或(f)誘導周圍CD8+T細胞耐受性。
2.權利要求1的抗體，其中，所述人T細胞應答由MHCI類或II類途徑之一或兩者介導。
3.一種分離的人單克隆抗體，其結合位于人DEC-205胞外域上的表位。
4.一種分離的單克隆抗體，其中該抗體結合人DEC-205并且包含重鏈可變區(qū)，該重鏈 可變區(qū)(a)利用人種系Vh 3-33基因，并且(b)包含SEQ ID NO :28、4、16、40、52、76和88的 任一個中相比SEQID NO 95的至少一個氨基酸置換。
5.一種分離的單克隆抗體，其中該抗體結合人DEC-205并且包含重鏈可變區(qū)，該重鏈 可變區(qū)(a)利用人種系0rph-C16基因，并且(b)包含SEQ ID NO :64和70的任一個中相比 SEQ ID NO 96的至少一個氨基酸置換。
6.權利要求4或5的抗體，其中該抗體進一步包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)選自以下 區(qū)域，該區(qū)域(a)利用人種系VK3-L6基因并且包含SEQ ID NO :34、46、58的任一個中相對 于SEQ ID NO :92的至少一個氨基酸置換；(b)利用人種系VK1-L4基因并且包含SEQ IDNO 22或82中相對于SEQ ID NO 93的至少一個氨基酸置換；和(c)利用人種系VK1-L15基因 并且包含SEQ ID NO 10中相比SEQ IDNO 94的至少一個氨基酸置換。
7.一種分離的單克隆抗體，其中該抗體結合人DEC-205并且包含重鏈可變區(qū)，該重鏈 可變區(qū)⑴利用人種系Vh 3-33基因，并且包含SEQ ID NO :28、4、16、40、52、76和88的任一個 中相比SEQ ID NO 95的至少一個氨基酸置換；或(ii)利用人種系Orph-C 16基因，并且包含SEQ ID NO 64和70的任一個中相比SEQ ID NO 96的至少一個氨基酸置換；并且其中所述抗體進一步包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)(a)利用人種系VK3-L6基因并且包含SEQID NO :34、46、58的任一個中相比SEQ ID NO 92的至少一個氨基酸置換；(b)利用人種系VK1-L4基因并且包含SEQID NO 22或82中相比SEQ ID NO 93的至 少一個氨基酸置換；或(c)利用人種系VK1-L15基因并且包含SEQID NO: 10中相比SEQ ID NO :94的至少一 個氨基酸置換。
8.一種分離的單克隆抗體，其中所述抗體結合人DEC-205并且包含選自SEQ ID NO 28、4、16、40、52、64、70、76或88及其保守序列修飾的重鏈可變區(qū)；和選自SEQ ID NO :34、 10、22、46、58或82及其保守序列修飾的輕鏈可變區(qū)。
9.一種結合人DEC-205的分離的單克隆抗體，其中該抗體包含包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)；和 包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO :31、7、19、43、55、67、73、79、91及其保守序 列修飾的氨基酸序列。
10.權利要求9的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)⑶R3序列包含選自SEQID N0:37、13、 25、49、61、85及其保守序列修飾的氨基酸序列。
11.權利要求10的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)⑶R2序列包含選自SEQID NO :30、6、 18、42、54、66、72、78、90及其保守序列修飾的氨基酸序列；且所述輕鏈可變區(qū)CDR2序列包 含選自SEQ IDNO :36、12、24、48、60、84及其保守序列修飾的氨基酸序列。
12.權利要求11的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQID NO :29、5、 17、41、53、65、71、77、89及其保守序列修飾的氨基酸序列；且所述輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列選 自SEQ ID NO :35、11、23、47、59、83及其保守序列修飾。
13.權利要求9-12中任一項的抗體，其中所述保守序列修飾是保守氨基酸置換。
14.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含選自下組的重鏈和輕鏈可變 區(qū) CDR1、CDR2 和 CDR3 序列(i)包含SEQID NO 29的重鏈可變區(qū)CDRl ； 包含SEQ ID NO 30的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 31的重鏈可變區(qū)⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 35的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 36的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 37的輕鏈可變區(qū)⑶R3 ； 或其保守序列修飾；(ii)包含SEQID NO 17的重鏈可變區(qū)CDRl ； 包含SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 23的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 24的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 25的輕鏈可變區(qū)⑶R3 ； 或其保守序列修飾；(iii)包含SEQID NO 5的重鏈可變區(qū)CDRl ； 包含SEQ ID NO 6的重鏈可變區(qū)CDR2 ； 包含SEQ ID NO 7的重鏈可變區(qū)CDR3 ； 包含SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)⑶R3 ；其保守序列修飾；(iv)包含SEQID NO 41的重鏈可變區(qū)CDRl ； 包含SEQ ID NO 42的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 43的重鏈可變區(qū)⑶R3 ；3包含SEQ ID NO 47的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 48的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 49的輕鏈可變區(qū)⑶R3 ； 或其保守序列修飾；(ν)包含SEQ ID NO 53的重鏈可變區(qū)CDRl ； 包含SEQ ID NO 54的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 55的重鏈可變區(qū)⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 59的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 60的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 61的輕鏈可變區(qū)⑶R3 ； 或其保守序列修飾；和(viii)包含SEQ ID NO 77的重鏈可變區(qū)CDRl ； 包含SEQ ID NO 78的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 79的重鏈可變區(qū)⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 83的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 84的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 85的輕鏈可變區(qū)⑶R3 ； 或其保守序列修飾。
15.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含 包含SEQ ID NO 29的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；包含SEQ ID NO 30的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 31的重鏈可變區(qū)⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 35的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 36的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；和 包含SEQ ID NO 37的輕鏈可變區(qū)⑶R3。
16.一種結合人DEC-205的分離的單克隆抗體，其中該抗體包含 包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)；和包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自共有序列(A，G，Y，S，P，-) (P，W，S，R) (Y，A，H) F D (Y， L，V) (SEQ ID NO 99)的氨基酸序列，其中“_”表示在該共有位點不存在氨基酸殘基的選項。
17.權利要求16的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)⑶R3序列包含選自共有序列QQ(R，Y， F) (R，N) (Τ, S, N) (Y, W,-) (P,-) (Y，L，H，_) (Τ,-) (SEQ ID NO 102)的氨基酸序列，其中 “_” 表示在該共有位點不存在氨基酸殘基的選項。
18.權利要求17的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)⑶R2序列包含選自共有序列(V，I，F，T， A) I (W, G) (Y, Τ) (D, G)G(S, G, Y) (N, Τ) (K, P) Y(Y, A, V) (A, G, -)D S V K G(SEQ ID NO 98) 的氨基酸序列，其中“_”表示在該共有位點不存在氨基酸殘基的選項，并且所述輕鏈可變區(qū) CDR2 序列包含選自共有序列(D,A)A S (N，S) (R，L) (A，Q，Ε) (T，S) (SEQ ID NO 101)的氨基 酸序列。
19.權利要求18的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自共有序列(I，N,T，S) Y (G, N, A) M (H, Y) (SEQ ID NO 97)的氨基酸序列；并且所述輕鏈可變區(qū)CDRl序列包含選 自共有序列 R A S Q (S, G) (I,V)S S(Y，W，A)L A (SEQ ID NO: 100)的氨基酸序列。
20.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含選自下組的重鏈和輕鏈可變 區(qū) CDR1、CDR2 和 CDR3 序列⑴包含選自共有序列(I，N，T，S)Y(G，N，A)M(H，Y) (SEQ IDNO 97)的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)CDRl ；(ii)包含選自共有序列(V,I，F，T，A) I (W, G) (Y，T) (D，G)G(S，G，Y) (N，Τ) (K，P) Y(Y， A, V) (A, G, -)D S V K G(SEQ ID NO 98)的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(iii)包含選自共有序列(A，G，Y，S，P，_)(P, W, S, R) (Y, A, H) FD (Y, L, V) (SEQ ID NO: 99)的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(iν)包含選自共有序列 RA S Q (S，G) (I，V) S S (Y，W, A) LA (SEQ ID NO 100)的氨基 酸序列的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(ν)包含選自共有序列(D，A)A S (N，S) (R，L) (A, Q，Ε) (Τ, S) (SEQ ID NO 101)的氨基 酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；(vi)包含選自共有序列 Q Q(R，Y，F) (R，N) (Τ, S，N) (Y，W, -) (P，-) (Y，L，H，-) (Τ,-) (SEQ ID NO 102)的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；其中“-”表示在該共有位點不存在氨 基酸殘基的選項。
21.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含含有選自SEQ ID NO :28、4、 16、40、52、64、70、76、88及其保守序列修飾的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
22.權利要求21的抗體，其進一步包含含有選自SEQID NO :34、10、22、46、58、82及其 保守序列修飾的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
23.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含含有選自下組的氨基酸序列 的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(a)分別為SEQID NO 28和34，及其保守序列修飾；(b)分別為SEQID NO 16和22，及其保守序列修飾；(c)分別為SEQID NO :4和10，及其保守序列修飾；(d)分別為SEQID NO 40和46，及其保守序列修飾；(e)分別為SEQID NO 52和58，及其保守序列修飾；(d)分別為SEQ ID NO 76和82，及其保守序列修飾。
24.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含含有氨基酸序列SEQ ID N0 28的重鏈可變區(qū)和含有氨基酸序列SEQ ID NO 34的輕鏈可變區(qū)。
25.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包 含與選自SEQ ID NO :28、4、16、40、52、64、70、76和88的氨基酸序列至少90%相同的氨基 酸序列。
26.權利要求25的抗體，其進一步包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQID NO :34、10、22、46、58和82的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。
27.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，該 重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)包含與選自下組的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列(a)分別為 SEQ ID NO 28 和 34 ；(b)分別為SEQ ID NO 16 和 22 ；(c)分別為SEQ ID NO :4 和 10 ；(d)分別為SEQ ID NO 40 和 46 ；(e)分別為SEQ ID NO 52 和 58 ；禾口(f)分別為SEQ ID NO 76 和 82。
28.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，該 重鏈可變區(qū)包含與氨基酸序列SEQ ID NO :28至少90%相同的氨基酸序列，該輕鏈可變區(qū) 包含與氨基酸序列SEQID NO 34至少90%相同的氨基酸序列。
29.一種分離的單克隆抗體，其結合人DEC-205并且包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包 含選自SEQ ID N0:28、4、16、40、52、64、70、76和88的氨基酸序列，或其中重鏈可變區(qū)構架 區(qū)中的至少一個氨基酸殘基被相應的種系殘基置換的序列。
30.權利要求29的抗體，其進一步包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含選自SEQID NO :34、10、22、46、58和82的氨基酸序列，或其中輕鏈可變區(qū)構架區(qū)中的至少一個氨基酸殘 基被相應的種系殘基置換的序列。
31.權利要求29或30的抗體，其中所述至少一個置換的氨基酸殘基選自直接非共價 結合抗原的殘基；與CDR相鄰的殘基、CDR-相互作用殘基、參與VL-VH界面的殘基、規(guī)范殘 基、游標區(qū)殘基和鏈間堆積殘基。
32.前述權利要求中任一項的抗體，其中所述抗體選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、 IgAl、IgA2、IgAsec、IgD 和 IgE 抗體。
33.一種分離的抗體，其與權利要求1-2或4-31中任一項的抗體競爭結合。
34.一種結合人DEC-205的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含由選自下組的核酸 序列編碼的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(a)分別為SEQ ID NO 26 和 32 ；(b)分別為SEQ ID NO 14 和 20 ；(c)分別為SEQ ID NO 2 禾口 8 ；(d)分別為SEQ ID NO 38 和 44 ；(e)分別為SEQ ID NO 50 和 56 ；禾口(f)分別為SEQ ID NO 74 和 80 ；或與(a)-(f)的核酸序列具有至少90%同一性的核酸序列。
35.前述權利要求中任一項的抗體，其中所述抗體是人抗體。
36.一種表達載體，其包含編碼結合人DEC-205的抗體的輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈可變 區(qū)的核苷酸序列。
37.一種表達載體，其包含編碼如權利要求1-34中任一項所述的結合人DEC-205的抗 體的輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
38.用權利要求36或權利要求37的表達載體轉化的細胞。
39.包含與抗原連接的權利要求1-34中任一項的抗體的分子偶聯物。
40.權利要求39的分子偶聯物，其中所述抗原包括病原體的成分。
41.權利要求39的分子偶聯物，其中所述抗原包括腫瘤抗原、變應原或自身抗原。
42.權利要求39的分子偶聯物，其中所述抗原包括腫瘤抗原。
43.權利要求42的分子偶聯物，其中所述腫瘤抗原選自i3hCG、gpl00或Pmell7、HER2/ neu、WT1、間皮蛋白、CEA、gp 100、MART 1、TRP-2、NY-BR-I、NY-C0-58、MN (gp250)、獨特型、酪 氨酸酶、端粒酶、SSX2、MUC-I、MARTl、me lan-A, NY-ESO-1、MAGE-I、MAGE-3、MAGE-A3 和高分 子量_黑素瘤相關抗原(HMW-MAA)。
44.權利要求43的分子偶聯物，其中所述腫瘤抗原是來自βhCG、NY-ES0-1、間皮蛋白 或HER2/neu的序列。
45.權利要求40的分子偶聯物，其中所述抗原來自HIV、HPV、HBV或HCV。
46.權利要求40-45中任一項的分子偶聯物，進一步包含治療劑。
47.權利要求46的分子偶聯物，其中所述治療劑選自細胞毒性劑、免疫抑制劑和化療劑。
48.一種雙特異性分子，其包含與具有不同于所述抗體的結合特異性的分子連接的權 利要求1-34中任一項的抗體。
49.一種組合物，其包含權利要求1-34中任一項的抗體，權利要求39-47中任一項的分 子偶聯物，或權利要求48的雙特異性分子，和藥學有效的載體。
50.權利要求49的組合物，進一步包含治療劑。
51.權利要求50的組合物，其中所述治療劑是免疫抑制劑。
52.權利要求50的組合物，其中所述治療劑是抗體。
53.權利要求49的組合物，其包含選自TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、LTR8或TLR9激 動劑的免疫刺激劑。
54.一種將抗原靶向至受試者中的DEC-205的方法，包括向該受試者施用權利要求49 的組合物。
55.一種在受試者中誘導或增強針對抗原的免疫應答的方法，包括向該受試者施用權 利要求49的組合物。
56.權利要求55的方法，其中所述免疫應答包括作為MHC-I和/或MHC-II偶聯物的組 分呈遞抗原。
57.一種在受試者中誘導或增強針對抗原的T細胞介導的免疫應答的方法，包括給受 試者施用權利要求49的組合物，使得所述抗原被加工并且呈遞給T細胞，從而誘導或增強 針對該抗原的T細胞介導的應答。
58.權利要求57的方法，其中所述T細胞應答由⑶4+和⑶8+T細胞兩者介導。
59.權利要求57的方法，其中所述T細胞應答由細胞毒性T細胞或輔助T細胞介導。
60.一種免疫受試者的方法，包括給受試者施用權利要求49的組合物。
61.權利要求60的方法，其中所述組合物以足以誘導樹突細胞釋放細胞因子的量施用。
62.一種治療受試者的疾病的方法，包括給受試者施用有效量的權利要求48的組合物。
63.權利要求62的方法，其中所述疾病選自結腸癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、腦癌、腎 癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、肥大 細胞瘤、乳房腺癌、白血病和類風濕性成纖維細胞瘤。
64.權利要求62的方法，其中所述疾病選自細菌、真菌、病毒和寄生蟲傳染病。
65.權利要求62的方法，其中所述疾病選自變態(tài)反應、移植排斥和自身免疫病。
66.權利要求62的方法，其中所述疾病選自包括類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、1型糖 尿病、重癥肌無力、惡性貧血、阿狄森病、干燥綜合征、銀屑病、紅斑狼瘡、克羅恩氏病、潰瘍 性結腸炎、硬皮病、雷諾綜合征、萊特爾綜合征、橋本甲狀腺炎或格雷夫斯病的自身免疫病。
67.一種檢測生物樣品中是否存在DEC-205的方法，包括(a)使生物樣品接觸權利要求1-34中任一項的抗體，其中所述抗體用可檢測物質標 記；和(b)檢測與DEC-205結合的所述抗體，從而檢測生物樣品中是否存在DEC-205。
68.一種將抗原靶向至受試者中的B細胞的方法，包括給受試者施用包含與該抗原連 接的結合B細胞表面上受體的分子的分子偶聯物，使得該B細胞刺激MHC I類限制的T細 胞。
69.一種在受試者中誘導或增強針對抗原的免疫應答的方法，包括給受試者施用包含 與該抗原連接的結合B細胞表面上受體的分子的分子偶聯物，使得該B細胞刺激MHC I類 限制的T細胞。
70.一種針對抗原免疫受試者的方法，包括給受試者施用包含與該抗原連接的結合B 細胞表面上受體的分子的分子偶聯物，使得該B細胞刺激MHC I類限制的T細胞。
71.權利要求68-70中任一項的方法，其中所述受體是C-型凝集素受體。
72.權利要求68-71中任一項的方法，其中所述受體是DEC-205。
73.權利要求68-72中任一項的方法，其中所述結合受體的分子是一種抗體。
74.權利要求73的方法，其中所述抗體是抗DEC-205抗體。
75.權利要求68-74中任一項的方法，其中所述B細胞通過共刺激途徑激活。
76.權利要求68-75中任一項的方法，其中所述抗原被B細胞在MHCI類分子上呈遞。
77.權利要求68-76中任一項的方法，其中所述抗原在HLA-A2.1分子上呈遞。
78.權利要求68-77中任一項的方法，其中所述抗原是腫瘤抗原。
79.權利要求78的方法，其中所述腫瘤抗原是i3hCG。
80.權利要求68-77中任一項的方法，其中所述抗原是病原體。
81.用于治療受試者的疾病的權利要求78的方法，其中所述疾病選自結腸癌、胃癌、乳 癌、肺癌、卵巢癌、腦癌、腎癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纖 維肉瘤、橫紋肌肉瘤、肥大細胞瘤、乳房腺癌、白血病和類風濕性成纖維細胞瘤。
82.用于治療受試者的疾病的權利要求80的方法，其中所述疾病選自細菌、真菌、病毒 和寄生蟲傳染病。
83.一種分離的人抗體或人源化抗體，其結合被權利要求1-3中任一項的抗體結合的表位。
84.一種分離的抗體，其結合被權利要求4-31中任一項的抗體結合的表位。
全文摘要
本申請公開了結合人DEC-205的分離的單克隆抗體和基于相關抗體的組合物和分子。也公開了包含所述抗體的藥物組合物，以及使用所述抗體的治療和診斷方法。
文檔編號C07K16/28GK101888856SQ200880119337
公開日2010年11月17日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權日2007年11月7日
發(fā)明者L·A·維塔勒, L·何, T·科勒, V·雷瑪克里斯納 申請人:塞爾德克斯醫(yī)療公司