專利名稱：抑制白血病干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于抑制白血病干細(xì)胞的方法，特別是用于抑制與急性骨髓性白 血病(AML)以及其它血液癌癥病癥相關(guān)聯(lián)的白血病干細(xì)胞從而作為對抗這些血液癌癥病 癥的有效治療。
背景技術(shù)：
血液癌癥病癥是例如白血病以及惡性淋巴組織增生性病癥類型的癌癥，其影響血 液、骨髓以及淋巴系統(tǒng)。白血病可以分為急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以進(jìn)一步分為急性骨髓 性白血病(AML)和急性淋巴樣白血病((ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)和 慢性淋巴樣白血病(CLL)。其它相關(guān)病癥包括骨髓增生異常綜合癥(MDS，以前被稱作“白血 病前期”)，其是由骨髓樣血細(xì)胞的無效生成(或發(fā)育異常)以及轉(zhuǎn)化為AML的風(fēng)險所組合 的多種血液病癥的集合。白血病干細(xì)胞(LSC)是具有與正常干細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的特征(即，自我更新的特性以 及形成多譜系的能力)的癌細(xì)胞。已經(jīng)提出此類細(xì)胞在血液癌癥(例如AML)中作為不同 的群體始終存在。1急性骨髓性白血病(AML)是一種克隆紊亂，其臨床表現(xiàn)為增加的異質(zhì)增殖以及未 分化的骨髓樣母細(xì)胞。白血病體系是由一小群的LSC維持的，它們具有不同的自我更新的 能力，并且能夠分化成白血病前體(progenitor)1。這些前體生成大量的白血病母細(xì)胞，這 些母細(xì)胞在診斷和復(fù)發(fā)的患者體內(nèi)很容易被檢測到，最終導(dǎo)致死亡2_4。與快速分裂的克隆 生成的前體3’5’6相比較，AML-LSC通常被報告為靜止期的細(xì)胞。LSC的這種特性使得靶向增 殖細(xì)胞的傳統(tǒng)化學(xué)療法的有效性降低，這潛在地解釋了當(dāng)前的經(jīng)驗，即高比例的AML患者 進(jìn)入完全緩解期，但幾乎總是復(fù)發(fā)，其中小于30%的成人存活超過4年7。此外，微小殘留病 (minimal residualdisease)的出現(xiàn)以及欠佳的存活率被歸結(jié)為在AML患者中在診斷時的 高LSC頻率8。所以，對于AML(以及與以上提及的相類似的其它血液癌癥病癥)的長期治 療而言必須發(fā)展新的治療方法以便特異性地消除LSC9_14。AML-LSC和正常的造血干細(xì)胞(HSC)共有緩慢分裂的、自我更新能力、以及表面標(biāo) 記物(例如⑶34+⑶38_表型)這些常見特性。然而，除了已改變的其它細(xì)胞表面標(biāo)記物的 表達(dá)之外，還已被報道LSC具有增強(qiáng)的自我更新活性，這二者為治療開發(fā)提供了目標(biāo)。白細(xì) 胞介素-3(IL-3)通過與細(xì)胞表面受體進(jìn)行相互作用而介導(dǎo)其作用，所述細(xì)胞表面受體由2 個亞基(a亞基(⑶123)以及0共同(0。)鏈(⑶131))組成。a鏈與0鏈的相互作用 形成針對IL-3的高親和力受體，0。鏈介導(dǎo)隨后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)15’16。已經(jīng)廣泛地報道了⑶123 在AML母細(xì)胞、⑶34+白血病前體以及LSC上相對于正常血液細(xì)胞的過量表達(dá)17_23，并且在 一些研究中已經(jīng)提議其作為LSC的標(biāo)記物24’25。⑶131也被報道在AML細(xì)胞上21’25表達(dá)，但 對于它在AML-LSC上的表達(dá)存在著相沖突的報道23’25。⑶123在AML細(xì)胞上的過量表達(dá)賦予了一系列相對于正常血液細(xì)胞的生長優(yōu)勢，其中很大比例的AML母細(xì)胞被報道響應(yīng)于IL-3而在培養(yǎng)物中增殖26_31。此外，⑶123在AML 細(xì)胞上的高水平表達(dá)與以下各項相關(guān)由IL-3刺激的STAT-5激活的水平；循環(huán)細(xì)胞的比 例；更為原始的細(xì)胞的表面表型；以及凋亡抗性。臨床上，CD123在AML中的高表達(dá)與較低 的存活期、較低的完全緩解速率以及在診斷時較高的母細(xì)胞計數(shù)相關(guān)聯(lián)19’21’32。與HSC相比，⑶123在LSC上的增加的表達(dá)為治療性靶向AML-LSC提供了機(jī)會。單 克隆抗體(MAb)7G3(針對⑶123而產(chǎn)生的)之前已顯示抑制IL-3介導(dǎo)的白血病細(xì)胞系以 及初級細(xì)胞的增殖和激活33。然而，還不清楚靶向⑶123是否可以功能性地?fù)p傷AML-LSC， 以及它是否能夠抑制它們的骨髓龕(bonemarrow niche)中的歸巢、沉積以及增殖。而且， 直接抑制IL-3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)相對于抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)在7G3靶 向AML-LSC的能力方面的相對貢獻(xiàn)仍然是未解決的。美國專利號6，177，078 (Lopez)披露了抗-IL-3受體a鏈(IL_3Ra )的單克隆抗 體7G3，以及7G3結(jié)合到IL-3R a的N-端結(jié)構(gòu)域(具體地是IL-3R a的氨基酸殘基19-49) 上的能力。因此，該專利披露了單克隆抗體(例如7G3)或它的抗體片段(具有針對IL-3Ra 的氨基酸殘基19-49的結(jié)合特異性)在治療患者中的由IL-3的過量產(chǎn)生所導(dǎo)致的病癥(包 括骨髓樣白血病、淋巴瘤以及過敏癥)中的用途，這是通過拮抗IL-3的功能來進(jìn)行的。美國專利號6，733，743 (Jordan)披露了一種損傷血液癌祖細(xì)胞的方法，所述祖細(xì) 胞表達(dá)CD123但不顯著表達(dá)CD131，所述方法通過將該細(xì)胞與抗體和細(xì)胞毒劑(選自化學(xué)治 療劑、毒素、或a輻射的放射性同位素)的組合物相接觸來進(jìn)行，由此該組合物以有效引起 細(xì)胞死亡的量選擇性地結(jié)合到⑶123上。血液癌癥可以是白血病或惡性淋巴組織增生性紊 亂例如淋巴瘤。在產(chǎn)生本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人測試了 MAb 7G3在AML-LSC與HSC之間開發(fā) ⑶123表達(dá)和功能方面的明顯差異的能力。MAb 7G3抑制IL-3信號傳導(dǎo)通路以及初級AML 細(xì)胞的增殖。而且，MAb 7G3顯著降低非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(N0D/SCID)異 種移植模型中AML母細(xì)胞的歸巢和移入(engraftment)，并且LSC的功能受到抑制。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供了一種用于抑制表達(dá)IL-3Rci (⑶123)的白血病干細(xì)胞 的方法，該方法包括將所述細(xì)胞與抗原結(jié)合分子相接觸，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或 經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到 IL-3Ra (CD123)上。本發(fā)明還提供了用于治療一位患者中的血液癌癥病癥的方法，該方法包括對該患 者給予有效量的抗原結(jié)合分子，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng) 子功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Ra (⑶123)上。另一方面，本發(fā)明還提供了抗原結(jié)合分子在抑制表達(dá)IL-3Ra (⑶123)的白血病 干細(xì)胞中的用途或在制備用于抑制表達(dá)IL-3Rci (CD123)的白血病干細(xì)胞的藥物中的用 途，所述抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述 抗原結(jié)合分子選擇性結(jié)合到IL-3Rci (⑶123)上。在這個方面，本發(fā)明還提供了抗原結(jié)合分子在治療患者中的血液癌癥病癥或 在制備用于治療患者中的血液癌癥病癥的藥物中的用途，所述抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性結(jié)合到 IL-3Ra (CD123)上。本發(fā)明還提供了用于抑制表達(dá)IL-3Rci (⑶123)的白血病干細(xì)胞的試劑，該試劑 包括抗原結(jié)合分子，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc 區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Ra (⑶123)上。在這個方面，本發(fā)明還提供了用于治療患者中的血液癌癥病癥的試劑，該試劑包 括抗原結(jié)合分子，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc 區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Ra (⑶123)上。


圖1顯示了 MAb 7G3抑制IL-3刺激的⑶131磷酸化以及初級AML細(xì)胞的增殖。 (a)將來自兩位單獨(dú)的患者的初級AMI細(xì)胞用圖中所示濃度的抗體在冰上孵育30分鐘。不 洗滌，用IL-3(lnM，在37°C下持續(xù)10分鐘)刺激細(xì)胞。刺激之后立即將細(xì)胞裂解。對裂解 物進(jìn)行SDS-PAGE，并且用MAb 4G10進(jìn)行免疫印跡，接著剝?nèi)ビ≯E并且將MAb 1C1作為上樣 對照物進(jìn)行再次探測。(b-e)通過將3H-胸腺嘧啶核苷摻入到TCA不溶性材料中來測定初 級AML細(xì)胞的增殖。(b-d)在不存在(A，虛線)或存在細(xì)胞因子的情況下，用滴定的MAb 7G3將從3位單獨(dú)的AML患者中新鮮分離的單核細(xì)胞孵育48小時lng/mL的IL-3 ( ，點 線)或0. Ing/mL的GM-CSF (■，實線)。數(shù)據(jù)點顯示重復(fù)三次的點的平均值士 s.e.m.。(e) 在不存在或存在IL-3 (Ing/mL)的情況下，對來自35位患有AML的患者的解凍細(xì)胞分析MAb 7G3(lug/mL)對增殖的抑制。在所測試的35位患者中有32位顯示了抑制。在這些患者中 有9位的增殖水平降到低于不存在IL-3的情況(組成型增殖)。使用3H-胸腺嘧啶核苷摻 入以及液體閃爍計數(shù)來對增殖進(jìn)行定量。圖2顯示了⑶123中和在N0D/SCID小鼠中抑制初級AML細(xì)胞的歸巢和移入。在 體外暴露于7G3(灰色柱)或IgG2a(黑色柱)(10i!g/mL，2h)之后，來自10位患者的初級 AML細(xì)胞的移入(a)、或來自5位個體的正常骨髓(NBM)或臍帶血(CB)的移入(b)。在將抗 體處理的細(xì)胞移植到亞致命照射的N0D/SCID小鼠中之后，在4-8 (a)或4_11 (b)周進(jìn)行挑 選，并且用流式細(xì)胞術(shù)估計股骨骨髓中人類CD45+細(xì)胞的比例。對于每個樣品，每個處理組 使用3-10只小鼠。AML-8和AML-8-rel對應(yīng)于從同一個患者中分別在診斷和復(fù)發(fā)時收集 到的白血病細(xì)胞。NBM-4和CB-1起源于匯集的樣品。(c)移植了經(jīng)IgG2a(n = 10，實線) 或7G3(n= 10，點線)體外處理的AML-9細(xì)胞的小鼠卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)無事件 (event-free)存活曲線。(d)移植后24小時評估的經(jīng)IgG2a(黑色柱)、7G3(灰色柱)體 外處理的AML-8-rel或AML-9細(xì)胞歸巢到骨髓和脾臟的效率。(e)在靜脈輸注(IV)或股 骨內(nèi)注射(IF)之后，在移植了經(jīng)IgG2a(白色柱)或7G3(黑色柱)體外處理的細(xì)胞的小鼠 中AML-8-rel細(xì)胞的移入水平。對于IF移植的小鼠，顯示了移植AML細(xì)胞的右股骨(RF) 中、以及在未移植的骨(WBM)中的移入水平。對于(d)和(e)，每個處理組使用4-5只小鼠。 在移植后5周處死小鼠。數(shù)值代表平均值士 s.e.m.。對照IgG2a與經(jīng)治療的小鼠之間的 顯著性差異指示如下*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01 ;_，P彡0. 0001。(f)注射了體外7G3 處理的白血病細(xì)胞的N0D/SCID小鼠的BM和脾臟中歸巢的⑶34+38_AML細(xì)胞的絕對數(shù)。對 于AML-8，N =每組2-3只小鼠；而對于AML-9，n =每組5只小鼠。數(shù)值代表平均值士 SEM。
6(g)體外治療后分選的CD34+CD38_AML-9細(xì)胞歸巢到小鼠的BM和脾臟的效率。每個處理組 N = 3只小鼠。圖3顯示了將7G3給予N0D/SCID小鼠減少了 AML的移入。(a)在照射的N0D/SCID 小鼠的股骨骨髓中AML-1細(xì)胞的移入水平，小鼠在移植前6小時接受了單一劑量的IgG2a 對照或7G3(300i!g)。在移植后5周挑選小鼠。(b)在經(jīng)IgG2a(黑色柱)或7G3(灰色柱) 處理的N0D/SCID小鼠中AML-1、2、和3的移入。在移植后24小時開始處理，每劑量300 u g， 每隔一天給藥，共4個劑量。在移植后5周挑選小鼠。(c)CD123在骨髓衍生的細(xì)胞上的表 達(dá)，以及(d)將AML-1細(xì)胞接種到小鼠中，然后在移植后4天開始IgG2a或7G3處理(共12 次注射，每周給藥3次)在外周血和脾臟中的移入水平。在移植后5周挑選小鼠。(e)當(dāng)移 植后28天開始IgG2a (點線)或7G3(實線)處理，并且連續(xù)每周3次直至處死時在骨髓中 AML-2細(xì)胞的移入水平。每個處理組使用3-10只小鼠。數(shù)值代表平均值士s. e. m. (f)在以 4個劑量的7G3或IgG2a對照(300 u g/劑量)從移植后第28天開始一周給藥3次之后， 在N0D/SCID小鼠的BM中人類AML-1細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。每一個單獨(dú)的符號代表從一個單個的 小鼠獲得的數(shù)值。IgG2a對照與7G3處理的小鼠之間的顯著性差異指示如下*，P < 0. 05 ； 氺氺，P < 0. 005。圖4部分I顯示了將7G3和Ara-C給予具有確定的AML疾病的小鼠阻斷了次級受 體小鼠(secondary recipient mice)的 LSC 再生。(a)在經(jīng) Ara_C 聯(lián)合 IgG2a 或 7G3 治療 的初級小鼠的骨髓和脾臟中AML-10細(xì)胞的移入水平，如在示意圖中所示，(b)歸巢到骨髓 和脾臟的效率，(c)移入水平，以及(d)在次級移入物中CD34+38_細(xì)胞的比例，從在(a)中處 理的小鼠的骨髓中收集并移植到次級受體小鼠中的白血病細(xì)胞中的比例。水平柱指示平均 值。IgG2a加Ara-C對照組與7G3加Ara_C處理組之間的顯著性差異指示如下*，P < 0. 05 和 **P < 0. 01。部分II顯示了(A)在7G3或?qū)φ誌gG2a處理10周后BM和脾臟中AML-10細(xì)胞的 移入水平。移植后第28天開始抗體處理，每只小鼠300 u g，每周三次，如在示意性概述中 所示。(B-D)歸巢效率(B)、BM和脾臟中移入的水平(C)、以及在次級受體小鼠的BMW中 CD34+CD38—細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在移植后12周對C和D中的小鼠進(jìn)行分析。每個符號代表一只 單一的小鼠，水平柱代表平均值。*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01在對照IgG2a與7G3組之間。部分III顯示了(A)在7G3或?qū)φ誌gG2a處理10周后BM和脾臟中AML-9細(xì)胞的 移入水平。在移植后第28天開始抗體處理，每只小鼠300 y g，每周三次，如在示意性概述中 所示。(B)次級受體小鼠的BM中移入的水平。在移植后8周對次級小鼠進(jìn)行分析。每個符 號代表一個單以的小鼠，水平柱指示平均值。**，P < 0. 01，在對照IgG2a與7G3組之間。圖5顯示自然殺傷(NK)淋巴細(xì)胞導(dǎo)致7G3-介導(dǎo)的AML移入的抑制。(a)移入的水 平，以及(b)經(jīng)IgG2a(白色柱)或7G3(黑色柱)(10i!g/mL，2h)體外處理并且移植入NOD/ SCID小鼠中、沒有(-)或具有(+)先前⑶122+NK細(xì)胞消耗的AML-8-rel細(xì)胞的歸巢效率。 每個處理組使用4只小鼠。數(shù)值代表平均值士s.e.m.。顯著性差異指示如下P*< 0.05 以及 **P < 0. 01。圖6顯示MAb 7G3 (而非6H6或9F5)在IL-3依賴的細(xì)胞系和AML細(xì)胞中抑制由 IL-3刺激的CD131 ( 3 c)、STAT-5、以及Akt的磷酸化。(a)將TF-1細(xì)胞用不同濃度的7G3、 9F5或6H6在冰上孵育30分鐘。不洗滌，用IL_3 (InM,在37°C下持續(xù)10分鐘)刺激細(xì)胞。刺激后立即將細(xì)胞裂解，并且如在這些方法的說明將⑶131免疫沉淀。用SDS-PAGE將免疫 沉淀物分離，并且用抗體將其免疫印跡到磷酸化的酪氨酸殘基(4G10)、磷酸化的STAT-5或 磷酸化的Akt上。剝?nèi)ビ≯E，并且用針對0。(1C1)的抗體作為上樣對照物將其進(jìn)行再次探 測。(b)通過TF-1和M07e細(xì)胞系、以及初級AML-9細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)FACS染色也證實7G3抑 制由IL-3誘導(dǎo)的STAT-5的激活。模擬處理(Mock treatment)(點線)，單獨(dú)用IL-3 (10ng/ mL 2h，實線)，IL-3 加 7G3 (10ng/mL,虛線)。圖7顯示了⑶123在⑶34+/⑶3K細(xì)胞上的表達(dá)強(qiáng)度與7G3在N0D/SCID小鼠中抑 制移入的能力負(fù)相關(guān)。Y軸代表對于每位患者或供者的樣品而言⑶123在⑶347⑶38_部 分上的表達(dá)的RFI的對數(shù)。X軸繪制了對于每位單獨(dú)的患者或供者的樣品而言以IgG2a對 照作為100%進(jìn)行％標(biāo)準(zhǔn)化的、7G3體外處理組的移入水平的對數(shù)。每個點代表一個單獨(dú)的 實驗，該實驗反映了每個處理組3-10只小鼠的平均值，并且使用不同的AML患者(實心符 號)或正常BM樣品(空心符號)進(jìn)行的每個實驗。在移入后4-6周后分析全部小鼠。每 個移入數(shù)據(jù)點都是基于從3至10只小鼠的測量值，如在圖2a中所示。圖8顯示了以AML細(xì)胞作為靶細(xì)胞，⑶107a在NK細(xì)胞中的表達(dá)。在37 °C以 1 1的比例(A和B)將來自正常健康供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)與初級人類AML細(xì) 胞(RMH003)、或用 IgGl 對照(10 u g/mL) (A 和 C)或用 CSL360 (10 u g/mL) (B 和 D)孵育 3 小 時。為了評估CD107a的非特異性表達(dá)，用抗體和非靶細(xì)胞孵育PBMC(1 0) (C和D)。圖9顯示了從圖8中描繪的實驗中得到的數(shù)據(jù)的直方圖，并且如所示還包括其中 不加入抗體的樣品。圖10顯示了在接種到N0D/SCID小鼠之前經(jīng)10ii g/mL IgG2a、完整7G3、6H6或9F5 抗體以及7G3 (7G3Fab)和6H6 (6H6Fab)的F(ab，)2片段體外處理的AML_8_rel樣品的歸巢 效率。在16小時后測量人類單核細(xì)胞歸巢到骨髓的效率。對于每個樣品，每個處理組使用 3只小鼠。圖11顯示了在體外暴露于10 ii g/mL IgG2a、完整7G3或9F5抗體以及 7G3 (7G3Fab)和9F5 (9F5Fab)的F(ab，)2片段之后，來自兩位患者的初級AML細(xì)胞(AML-9 和AML10)在亞致死照射的N0D/SCID小鼠中的移入。接種后4周評估AML的移入，作為通 過流式細(xì)胞術(shù)所評估的股骨骨髓中人類CD45+細(xì)胞的比例。對于每個樣品，每個處理組使 用5只小鼠。圖12顯示了嵌合的CSL360、人類CSL360、及其Fc變體的ADCC活性的對較。將鈣 黃綠素(calceirOAM標(biāo)記的CTLEN細(xì)胞與不同的抗體以及從正常人類供體中新鮮分離的 PBMC進(jìn)行孵育。PBMC與CTLEN細(xì)胞的比例為100 1。將細(xì)胞在37°C在具有5% C02的培 養(yǎng)箱中孵育4小時。孵育期之后，將細(xì)胞離心并且將100 yL上清液轉(zhuǎn)移到新鮮的板中。使 用Wallac酶標(biāo)儀對上清液中的熒光進(jìn)行測量(激發(fā)濾光片485nm，發(fā)射濾光片535nm)。使 用的抗體是嵌合的CSL360 (空心柱)，人源化的CSL360 (實心柱)，具有兩個氨基酸改變的 人源化CSL360 (對角線)、或具有三個氨基酸改變的人源化CSL360 (點)。將人類IgGl (水 平線)和沒有抗體的孔(垂直線)包括進(jìn)來作為對照。圖13顯示了(a)結(jié)合到FcR上的hCSL360及其三個變體的Biacore分析。在偶聯(lián) 了 CD123 的 BIAcore CM5 芯片上逐個捕獲huCSL 360及其三個變體。huFc y RI、huFc y Rllb/ c以及huFcyRIIIa以0. 4nM至800nM范圍內(nèi)的濃度在對應(yīng)的表面上流動，并且將這些信號用來確定KA。親和力報告為超過hCSL360的增加倍數(shù)，對hCSL360賦予相對值1。(b) KA 值表達(dá)為對于這四種抗體中每一種的huFc y RHIa與huFc y Rllb/c的A/I比例。圖14顯示了在鈣黃綠素釋放測定中將正常的PBMC用作效應(yīng)子細(xì)胞所檢測到的 ADCC介導(dǎo)的Raji-⑶123陽性細(xì)胞的裂解。⑶123分子在Raji-⑶123低和高表達(dá)子上表達(dá) 的大致的數(shù)量分別是4，815和24，432。(a)在E T = 25 1，ADCC介導(dǎo)的Raji_CD123的 裂解低(b)在 E T = 50 1，ADCC 介導(dǎo)的 Raji-CD123 的裂解低(c)在 E T = 25 1， ADCC 介導(dǎo)的 Raji-CD123 的裂解高(d)在 E T = 50 1，ADCC 介導(dǎo)的 Raji_CD123 的裂 解高。實心三角代表hCSL360Fc3、圓圈代表hCSL360kif、實心圓圈代表CSL360、方塊代表 hCSL360、星形代表沒有抗體。圖15顯示了 CSL360及其變體的增強(qiáng)的ADCC活性，其中TF_1細(xì)胞作為靶細(xì)胞。 使用LDH檢驗來測定抗體的ADCC活性。(a)實心三角代表hCSL360Fc3、實心正方代表 hCSL360Fc2、空心圓圈代表hCSL360kif、實心圓圈代表CSL360、而星形代表沒有抗體。(b) 實心三角代表168-26Fc3、實心方塊代表168-26Fc2、實心圓圈代表168-26、而星形代表沒 有抗體。圖16顯示了 CSL360及其變體的增強(qiáng)的ADCC活性，其中初級人類白血病細(xì)胞作為 靶細(xì)胞，(a)RMH003AML, (b) RMH011AML, (c) RMH010AML, (d) RMH008AML, (e)WMH007AML, (f) RMH009B-ALL, (g) RMH007B-ALL。使用 LDH 檢驗來確定 ADCC 的活性。圖17顯示了具有預(yù)先移入的ALL的小鼠對于對照Mab (鼠IgG2a)、7G3、168-26以 及168-26Fc3的體內(nèi)靈敏度，該靈敏度被描述為從白血病移植的當(dāng)天開始對于無事件生存 (EFS)的卡普蘭-邁耶曲線。事件定義為在外周血中25% h⑶45+負(fù)荷。每組中動物的數(shù) 目分別是7，6，6以及7。白血病生長延遲(LGD)定義為基于中位數(shù)EFS的比較，處理組比對 照MAb組多存活的天數(shù)，對于7G3、168-26以及168_26Fc3分別是2. 9 (P = 0. 54)、6. 4 (P = 0. 13)以及 12. 2 (P = 0. 044)天。
具體實施例方式一方面，本發(fā)明提供了用于抑制表達(dá)IL-3Rci (⑶123)的白血病干細(xì)胞的方法，該 方法包括將所述細(xì)胞與抗原結(jié)合分子相接觸，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有 增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Ra (CD123)上。在這個方面，本發(fā)明還提供了用于治療患者中的血液癌癥的方法，該方法包括對 該患者給予有效量的抗原結(jié)合分子，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc 效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Ra (⑶123)上。優(yōu)選地，患者是人類?？乖Y(jié)合分子優(yōu)選地是單克隆抗體或抗體片段，其包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增 強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)?？贵w提供了體液免疫系統(tǒng)與細(xì)胞免疫系統(tǒng)之間的連接，其中IgG是最大量的血清 免疫球蛋白。當(dāng)抗體的Fab區(qū)識別抗原時，該Fc部分結(jié)合到Fc y受體(Fc y R)上，這些受 體由所有免疫輔助細(xì)胞(例如，自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞或樹突細(xì) 胞)差異性表達(dá)。這種結(jié)合在這些細(xì)胞上交叉連接FcR，并且結(jié)果它們被激活。這些細(xì)胞的激活有幾個結(jié)果；例如，NK細(xì)胞殺死癌細(xì)胞，并且還釋放能夠抑制細(xì)胞增殖以及與腫瘤相 關(guān)的血管新生的細(xì)胞因子和趨化因子，并且通過增加的主要組織相容性抗原(MHC)抗原的 細(xì)胞表面表達(dá)來增加腫瘤的免疫原性。一旦受體與多價抗原/抗體復(fù)合物交聯(lián)，效應(yīng)子細(xì) 胞去粒以及編碼細(xì)胞因子的基因的轉(zhuǎn)錄激活被觸發(fā)，然后靶細(xì)胞溶解或吞噬?？贵wFc區(qū)介導(dǎo)的效應(yīng)子功能可以分成兩類(1)在抗體結(jié)合到抗原之后運(yùn)行的效 應(yīng)子功能(這些功能涉及例如，補(bǔ)體級聯(lián)或帶有Fc受體(FcR)的細(xì)胞的參與)；以及(2)獨(dú) 立于抗原結(jié)合而運(yùn)行的效應(yīng)子功能(這些功能賦予例如，在循環(huán)中的持久性以及通過轉(zhuǎn)胞 吞作用被轉(zhuǎn)移通過細(xì)胞屏障的能力)。例如，補(bǔ)體的Cl組分與抗體的結(jié)合激活補(bǔ)體系統(tǒng)。 補(bǔ)體的激活在細(xì)胞病原體的調(diào)理作用和裂解方面是重要的。補(bǔ)體的激活也刺激炎癥應(yīng)答， 并且還可涉及自身免疫超敏反應(yīng)。此外，抗體經(jīng)由Fc區(qū)結(jié)合到細(xì)胞上，其中在該抗體Fc區(qū) 上的Fc受體結(jié)合位點結(jié)合到細(xì)胞上的Fc受體(FcR)上。抗體結(jié)合到細(xì)胞表面的Fc受體 上觸發(fā)了許多重要的并且多樣的生物反應(yīng)，包括抗體包被的顆粒的吞沒和破壞、免疫復(fù)合 物的清除、抗體包被的靶細(xì)胞被殺傷細(xì)胞裂解(稱為抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，或 ADCC)、炎癥調(diào)節(jié)子的釋放、胎盤轉(zhuǎn)移以及免疫球蛋白生產(chǎn)的控制。本發(fā)明人已經(jīng)顯示在抗體結(jié)合分子中Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能 的Fc區(qū)的存在對于表達(dá)CD123的白血病干細(xì)胞的抑制是重要的，并且因此在治療與白血病 干細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的血液癌癥病癥中是重要的。與白血病干細(xì)胞(LSC)相關(guān)聯(lián)的、可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的血液癌癥病癥包括 白血病(例如，急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病，急性淋巴樣白血病，慢性淋巴樣白 血病、以及骨髓增生異常綜合癥)以及惡性淋巴組織增生性病癥，包括淋巴瘤(例如，多發(fā) 性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及小細(xì)胞和大細(xì)胞濾泡淋巴瘤)。本文所使用的術(shù)語“抗原結(jié)合分子”是指完整的免疫球蛋白，包括單克隆抗體(例 如，嵌合的、人源化的或人類的單克隆抗體)、或者是指免疫球蛋白的抗原結(jié)合的和/或包 括可變結(jié)構(gòu)域的片段，其與完整免疫球蛋白競爭特異性結(jié)合到免疫球蛋白的結(jié)合伴侶(例 如，宿主細(xì)胞蛋白)上。不論結(jié)構(gòu)如何，抗原結(jié)合片段與被完整的免疫球蛋白所識別的相 同的抗原相結(jié)合?？乖Y(jié)合片段可以合成產(chǎn)生或通過完整免疫球蛋白的酶促或化學(xué)切割 而產(chǎn)生，或者它們可以通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行遺傳上的工程化處理。生產(chǎn)抗原結(jié)合分子 及其片段的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，并且見以下描述，例如，Antibodies =A Laboratory Manual, Edited by Ε. Harlow andD, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,通過弓|用并入本文。提及白血病干細(xì)胞時，本文所使用的術(shù)語“抑制”包括LSC的功能性或活性(包括 生長或增殖以及存活活性)的任何減少，尤其是LSC存活、增殖和/或分化成白血病或其它 惡性過度增生性血液癌細(xì)胞的前體的能力方面的任何減少或限制。提及結(jié)合分子(例如抗體)及其結(jié)合伴侶(例如抗原)的相互作用時，本文使用 的術(shù)語“選擇性結(jié)合”是指該相互作用依賴于特定結(jié)構(gòu)(例如，在結(jié)合伴侶上的抗原決定簇 或表位)的存在。換言之，抗體優(yōu)先地結(jié)合或識別結(jié)合伴侶，甚至當(dāng)結(jié)合伴侶存在于其它分 子或生物體的混合物中時。術(shù)語“有效量”是指對于治療血液癌癥病癥有效的如本文所定義的結(jié)合分子的數(shù)量。
術(shù)語“治療”是指治療性治療連同預(yù)防性或防止性措施以治愈或停止或至少延緩 病癥的進(jìn)程。需要治療的包括已經(jīng)遭受血液癌癥病癥折磨的連同有待在體內(nèi)防止這種病癥 的。部分地或完全從病癥中恢復(fù)的受試者也可能需要治療。防止涵蓋了抑制或降低與血液 癌癥病癥相關(guān)聯(lián)的一種或多種癥狀中的起始、發(fā)展或進(jìn)程。在本發(fā)明的方法中，對患者給予化學(xué)治療劑可以與給予抗原結(jié)合分子相聯(lián)合，其 中給予化學(xué)治療劑是在給予抗原結(jié)合分子之前、同時、或之后。優(yōu)選地，化學(xué)治療劑是細(xì)胞毒劑，例如選自下列的細(xì)胞毒劑(a)芥子氣衍生物氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、以及異環(huán)磷酰胺(b)乙撐亞胺噻替派以及六甲三聚氰胺(Hexamethylmelamine)(c)烷基磺酸鹽白消安(d)胼類以及三嗪六甲蜜胺(Althretamine)、丙卡巴胼、達(dá)卡巴嗪以及替莫唑胺(e)亞硝基脲類(Nitrosureas)卡莫司汀、洛莫司汀以及鏈佐星(f)金屬鹽卡鉬、順鉬以及奧沙利鉬(g)長春花生物堿長春新堿、長春堿以及長春瑞賓(h)紫杉烷紫杉醇以及多西他賽⑴鬼臼毒素依托泊苷以及替尼泊苷(Tenisopide)(j)喜樹堿(Camptothecan)類似物伊立替康以及托泊替康(k)蒽環(huán)類阿霉素、柔紅霉素、表柔比星、米托蒽醌以及伊達(dá)比星(1)色霉素更生霉素以及普卡霉素(m)各種抗腫瘤抗生素絲裂霉素以及博來霉素(η)葉酸拮抗劑甲氨蝶呤(ο)嘧啶拮抗劑5_氟尿嘧啶、氟尿苷(Foxuridine)、阿糖胞苷、卡培他濱、以及吉 西他濱(ρ)嘌呤拮抗劑類6_巰基嘌呤以及6-硫鳥嘌呤(q)腺苷脫氨酶抑制類克拉屈濱、氟達(dá)拉濱、奈拉濱以及噴司他丁(r)拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑伊立替康(Ironotecan)以及托泊替康(s)拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷以及替尼泊苷(t)核糖核苷酸還原酶抑制劑羥基脲(u)腎上腺皮質(zhì)類固醇抑制劑米托坦(V)酶天門冬酰胺酶以及培門冬酶(w)抗微管劑雌莫司汀(χ)類視黃醇貝沙羅汀、異維甲酸以及維甲酸(ATRA)。化學(xué)治療劑的其它例子包括但不限于阿西維辛；阿柔比星；鹽酸阿考達(dá)唑；阿克 羅寧；阿多來新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨魯米特；阿那曲唑； 蒽環(huán)類；安曲霉素；曲林菌素；阿扎胞苷(Vidaza)；阿扎替派；阿佐霉素；巴馬司他；苯佐替 派；比卡魯胺；鹽酸比生群；甲磺酸雙奈法德；二膦酸鹽類(例如，帕米膦酸鹽(Aredria)、 氯磷酸鈉(sodium clondronate) (Bonefos)、唑來膦酸(Zometa)、阿侖磷酸鹽(Fosamax)、 依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、斯孟膦酸鹽(cimadronate)、利塞膦酸鹽以及替魯膦酸鹽 (tiludromate))；比折來新；布喹那鈉；溴匹立明；放線菌素c ；卡普睪酮；卡醋胺；卡貝替姆；卡莫司汀(carrnustine)；鹽酸卡柔比星；卡折來新；西地芬戈；西羅霉素；甲磺酸克立 那托；地西他濱(Dacogen)；脫甲基試劑；右奧馬鉬；地扎胍寧；甲磺酸地扎胍寧；地吖醌； 屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；達(dá)佐霉素；依達(dá)曲沙；鹽酸依氟鳥氨酸；EphA2 抑制劑；依沙蘆星；恩洛鉬；恩普氨酯；依匹哌啶；厄布洛唑；鹽酸依索比星；依他硝唑；氯 苯乙嘧胺；鹽酸法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；氮尿苷；氟西他濱；磷喹酮；福司曲星鈉；組 蛋白脫乙?；敢种苿?HDAC-I)；伊莫福新；甲磺酸伊馬替尼(Gleevec，Glivec)；異丙 鉬；醋酸蘭瑞肽；來那度胺(Revlimid)；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索鈉； 洛莫司??；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚；美登素；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕酮；美諾立爾；氯 苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；絲裂紅素(mitocromin)；米托潔林；米托馬星；米 托司培；麥考酚酸；諾考達(dá)唑；諾拉霉素；奧馬鉬；奧昔舒侖；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛 霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；鹽酸吡羅蒽醌；普洛美坦；卟吩姆鈉；泊非霉素；撥 尼莫司??；嘌羅霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋林；利波腺苷；羅谷亞胺；沙芬戈；鹽酸沙芬戈 (saflngol hydrochloride)；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸鈉；司帕霉素；鹽酸螺旋 鍺；螺莫司汀；螺鉬；鏈黑霉素；鏈佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加蘭鈉；替加氟；鹽酸替 洛蒽醌；替莫泊芬；替羅昔??；睪內(nèi)脂；硫咪嘌呤；噻唑呋林；替拉扎明；檸檬酸托瑞米芬； 醋酸曲托龍；磷酸曲西立濱；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；鹽酸妥布氯唑； 尿嘧啶氮芥；烏瑞替派；伐普肽；維替泊芬；長春地辛；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定；硫酸 長春甘酯；硫酸長春羅辛；硫酸長春羅定；硫酸長春利定；伏氯唑；折尼鉬；凈司他丁 ；鹽酸 佐柔比星；20-表-1，25 二基羥維生素D3 ；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龍；阿柔比星；?；?文(acylfulvene)；腺環(huán)戊醇；阿多來新；阿地白介素；ALL-TK拮抗劑；六甲蜜胺；氨莫司 ??；偕胺肟；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；阿那格雷；阿那曲唑；穿心蓮內(nèi)酯；血管新 生抑制劑；拮抗劑D ；拮抗劑G ；安雷利克斯；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素藥；抗瘤酮；反 義寡核苷酸；阿非迪霉素甘氨酸鹽(aphidicolin glycinate)；凋亡基因調(diào)整基因；凋亡調(diào) 節(jié)劑；脫嘌呤核酸；阿糖-CDP-D L-PTBA (ara-CDP-D L-PTBA)；安素拉可林(asulacrine)； 阿他美坦；阿莫司?。缓Ｑ蟓h(huán)肽1 (axinastatin 1)；海洋環(huán)肽2 ；海洋環(huán)肽3 ；阿扎司瓊；阿 扎毒素；重氮酪氨酸；漿果赤霉素III衍生物；Balanol ；巴馬司他；BCR/ABL拮抗劑；苯并 二氫卟酚類；苯甲酰星孢素；β內(nèi)酰胺衍生物；β阿愛力新(beta-alethine) ； β克拉霉 素B (beta clamycin B)；樺木酸；bFGF抑制劑；比卡魯胺；比生群；雙吖丙啶基精胺；雙奈 法德；二枸櫞酸環(huán)己噻卓酯A(bistratene Α)；比折來新；布雷菲德(breflate)；溴匹立明； 布度鈦；丁胱亞磺酰亞胺；卡泊三醇；鈣感光蛋白C(calph0Stin C)；喜樹堿衍生物；金絲雀 痘IL-2 ；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3 ；CARN 700 ；軟骨衍生的抑制劑；卡折 來新；酪蛋白激酶抑制劑(ICOS)；澳粟精胺；天蠶素B ；西曲瑞克；二氫卟酚類(chlorlns)； 氯代喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；順卟啉；氯米芬類似物；克霉唑；柯林斯霉菌素A ；柯林斯 霉菌B ；考布他汀A4 ；考布他汀類似物；conagenin ；crambescidin 816 ；克立那托；念珠藻 環(huán)肽8 ；念珠藻環(huán)肽A衍生物；氯化琥珀膽堿A ；環(huán)戊蒽醌；cycloplatam ；cypemycin ；溶細(xì) 胞因子；磷酸己烷雌酚；達(dá)昔單抗；地西他濱；脫氫膜海鞘素B ；地洛瑞林；地塞米松；右異 環(huán)磷酰胺；右雷佐生；右維拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B ；3，4- 二羥筌苯并氧肟酸(didox)； 二乙基去甲精胺(diethylnorspermine) ；二氫_5_氮雜胞嘧啶核苷；二氫紫杉酚，二草霉 素(dioxamycin)；聯(lián)苯螺莫司??；二十二烷醇；多拉司瓊；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡比星SAWuocarmycin SA)；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依決洛單抗；依氟鳥 氨酸；欖香烯；乙嘧替氟；依立雄胺；雌莫司汀類似物；雌激素激動劑；雌激素拮抗劑；依 他硝唑；依西美坦；法倔唑；法扎拉濱；芬維a胺；非格司亭；非那雄胺；黃酮吡多；氟卓斯 tT ；氣海星Sl (fluasterone)；鹽酸氣柔紅比星(fluorodaunorunicin hydrochloride)； 福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司?。会徧嫔沉?；硝酸鎵；加洛他濱；加尼瑞克；明膠酶 抑制劑；谷胱甘肽抑制劑；HMG輔酶A還原酶抑制劑(例如，阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐 他汀、來適可、lupitor、洛伐他汀、羅蘇伐他汀、以及辛伐他汀)；h印sulfam^eregulin ； 六甲撐二乙酰胺；金絲桃素；伊班膦酸；艾多昔芬；伊決孟酮；伊莫福新；伊洛馬司他；咪 唑并吖啶酮類；咪喹莫特；胰島素樣生長激素-1受體抑制劑；干擾素激動劑；干擾素類； 白細(xì)胞介素類；碘芐胍；碘阿霉素；甘薯醇，4-伊羅普拉；伊索拉定；isobengazole ；異高 軟海綿B ；伊他司瓊；jasplakinolide ；海蛞蝓提取物F ；三乙酸層狀素-Ndamellarin-N triacetate)；蘭瑞肽；Ieinamycin ；來格司亭；硫酸香菇多糖；1印tolstatin ；來曲唑；亮 丙立德和雌激素、以及黃體酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；LFA-3TIP(Bi0gen，Cambridge, MA ；國 際申請?zhí)朩O 93/0686和美國專利號6，162，432)；利阿唑；線性聚胺類似物；親脂性二糖 肽；親脂性鉬化合物；lissoclinamide 7 ；洛鉬；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼達(dá)明；洛索蒽 醌；洛伐他?。宦逅髁①e；勒托替康；替沙林镥；利索茶堿(lysofylline)；裂解肽；美坦新； 甘露糖他汀AOiiarmostatin A)；馬立馬司他；馬索羅酚；基質(zhì)溶解因子抑制劑；基質(zhì)金屬蛋 白酶抑制劑；美諾立爾；美巴龍；美替瑞林；甲氧氯普胺；MIF抑制劑；米非司酮；米替福新； 米立司亭；錯配的雙鏈RNA ；丙米腙；二溴衛(wèi)矛醇；米托萘胺；促分裂原毒素成纖維細(xì)胞生 長因子-皂草毒蛋白；莫法羅?。荒就?；單磷酰脂質(zhì)A+分支桿菌(myobacterium)細(xì)胞 壁sk ；莫哌達(dá)醇；多重抗藥性基因抑制劑；基于多重腫瘤抑制基因1的治療；芥子抗癌劑； 印度海綿BOnycaperoxideB)；分支桿菌細(xì)胞壁提取物；myriaporone ；N-乙?；啬橇郑?N-取代的苯酰胺類；那法瑞林；那瑞替噴；納洛酮+噴他佐辛；萘脲烷亞胺(napavin)；萘 萜二醇(naphterpin)；那托司亭；奈達(dá)鉬；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼魯米特；碘代琥珀酰 亞胺阿霉素(nisamycin)；氧化亞氮調(diào)控劑；氮氧自由基抗氧化劑；nitrullyn ；06-芐基鳥 嘌呤；奧曲肽；okicenone ；寡核苷酸；奧那司酮；oracin ； 口服的細(xì)胞因子誘導(dǎo)物；奧馬鉬； 奧沙特??；oxaunomycin ；紫杉醇；紫杉醇類似物；紫杉醇衍生物；鈀胺(palauamine)；棕櫚 酰根霉素；帕米膦酸；人參炔三醇；帕諾米芬；副菌鐵素(parabactin)；帕折普??；培得星； 戊聚硫鈉；pentrozole ；全氟溴烷；培磷酰胺；紫蘇醇(perillyl alcohol)；苯阿齊諾霉素 (phenazinomycin)；乙酸苯酯；磷酸酶抑制劑；溶血鏈球菌素；pilocaine hydrochloride ； 吡柔比星；卩比曲克辛；placetinA ；placetin B ；鉬絡(luò)合物；鉬化合物；鉬-三胺絡(luò)合物； porfimer sodium ；泊非霉素；潑尼松；丙基雙吖啶酮；前列腺素J2 ；蛋白酶體抑制劑；基于 蛋白質(zhì)A的免疫調(diào)節(jié)物；蛋白激酶C抑制劑，微藻的；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑；嘌呤核苷 磷酸化酶抑制劑；紫紅素；吡唑啉吖啶；吡醇羥乙酯化的血紅蛋白聚氧乙烯偶聯(lián)物；raf拮 抗劑；雷替曲塞；雷莫司瓊；ras法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；ras抑制劑；ras-GAP抑制劑；去 甲基化的瑞替普??；依替膦酸錸Re 186 (rhenium Re 186 etidronate)；根霉素；RII維胺 酯(RII retinamide)；羅谷亞胺；羅希吐堿(rohitukine)；羅莫肽；羅喹美克；rubiginone Bl ；ruboxyl ；沙芬戈；saintopin ；SarCNU ；肌肉葉綠醇 A(sarcophytol A)；沙格司亭；Sdi 1模擬物；司莫司?。凰ダ涎苌种苿? ；正義寡核苷酸；信號傳導(dǎo)抑制劑；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控
13劑；Y分泌酶抑制劑，西佐喃；索布佐生；硼卡鈉；苯乙酸鈉；solverol ；索納明；膦門冬酸； spicamycin D ；螺莫司??；脾臟五肽(splenopentin)；海綿素1 ；角鯊胺；干細(xì)胞抑制劑；干 細(xì)胞分裂抑制劑；stipiamide ；間充質(zhì)溶解素抑制劑；sulfinosine ；強(qiáng)效血管活性腸肽拮 抗劑；suradista ；蘇拉滅；苦馬豆素；合成的葡萄糖胺聚糖；他莫司汀；亞葉酸；他莫昔芬 甲碘化物；?；悄就?；他扎羅??；替可加蘭鈉；替加氟；tellurapyrylium ；端粒末端轉(zhuǎn)移 酶抑制劑；替莫泊芬；tetrachlorodecaoxide ；tetrazomine ；菌體胚素；噻可拉林；血小板 生成素；血小板生成素模擬物；胸腺法新；胸腺生成素受體激動劑；胸腺曲南；乙基錫初紫 紅素；替拉扎明；二茂鈦二氯化物；topsentin ；托瑞米芬；全能干細(xì)胞因子；翻譯抑制劑； 三乙酰尿苷；曲西立濱；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司瓊；妥羅雄脲；酪氨酸激酶抑制劑； tyrphostins ；UBC抑制劑；烏苯美司；尿激酶受體拮抗劑；伐普肽^ariolin B ；載體系統(tǒng)， 紅細(xì)胞基因治療；沙利度胺；維拉雷瑣；藜蘆胺；verdins ；維替泊芬；vinxaltine ；伏氯唑； 扎諾特?。徽勰徙f；亞芐維C(2H)；以及凈司他丁斯酯。根據(jù)本發(fā)明，抗原結(jié)合分子(包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的 Fc區(qū))優(yōu)選通過非腸道給藥途徑施給予患者。非腸道給藥包括不通過消化道(即，不是腸 道)的任何給藥途徑，包括通過注射、輸注以及類似方式進(jìn)行給藥。通過注射給藥包括，例 如通過進(jìn)入到靜脈(靜脈內(nèi))、動脈(動脈內(nèi))、肌肉(肌內(nèi))以及皮膚以下(皮下)的方 式?？乖Y(jié)合分子還可以作為儲庫或緩慢釋放的制劑進(jìn)行給藥，以足以獲得所希望的藥理 學(xué)效果的劑量通過例如皮下、皮內(nèi)、或肌內(nèi)進(jìn)行給藥。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，抗原結(jié)合分子包括經(jīng)修飾的Fc區(qū)，更特別地是 Fc區(qū)，該Fc區(qū)已經(jīng)被修飾為提供增強(qiáng)的效應(yīng)子功能，例如對Fc受體的增強(qiáng)的親和力、抗體 依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)以及補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)。對于IgG類的抗體，這些效應(yīng)子 功能由Fc區(qū)與被稱為Fc γ受體(Fe y R)(在多種免疫細(xì)胞上表達(dá))的受體家族的接合進(jìn) 行控制。Fc/Fc γ R復(fù)合物的形成將這些細(xì)胞招募到結(jié)合的抗原的位置上，通常產(chǎn)生信號傳 導(dǎo)以及隨后的免疫應(yīng)答。用于優(yōu)化這些Fc γ R對該抗體Fc區(qū)的親和力以增強(qiáng)效應(yīng)子功能 (特別是改變相對于“母體”Fc區(qū)的ADCC和/或CDC活性)的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而 言是熟知的。僅作為例子，用于優(yōu)化Fc區(qū)的結(jié)合親和力的程序由Niwa等人34、Lazar等人 35、Shields等人36以及Desjarlais等人37描述。這些方法可以包括抗體Fc區(qū)的修飾以增 強(qiáng)它與相關(guān)的Fc受體的相互作用并且增加它促進(jìn)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC) 以及抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)34的潛力。也已經(jīng)描述了在共價結(jié)合到Fc區(qū) 中的保守Asn297上的IgGl抗體上的寡聚糖修飾之后ADCC活性的增強(qiáng)35’36。其它方法包括使 用固有地產(chǎn)生具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的抗體的細(xì)胞系(例如，鴨胚胎衍生的干細(xì)胞用于 產(chǎn)生病毒疫苗，W0/2008/129058 ；在禽的EBX 細(xì)胞中產(chǎn)生的重組蛋白，W0/2008/142124)。 用于增強(qiáng)CDC活性的方法可以包括同種型嵌合現(xiàn)象，其中IgG3亞類的一部分被引入到IgGl 亞類的相應(yīng)的區(qū)中(例如，重組抗體組合物，US2007148165)。另一方面，本發(fā)明還提供了抗原結(jié)合分子在抑制表達(dá)IL-3RCI (⑶123)的白血病 干細(xì)胞中的用途或在制備用于抑制表達(dá)IL-3Rci (CD123)的白血病干細(xì)胞的藥物中的用 途，所述抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述 抗原結(jié)合分子選擇性結(jié)合到IL-3Rci (⑶123)上。在這個方面，本發(fā)明還提供了抗原結(jié)合分子在治療患者中的血液癌癥病癥或在制備用于治療患者中的血液癌癥病癥的藥物中的用途，所述抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū) 或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性結(jié)合到 IL-3Ra (CD123)上。另一方面，本發(fā)明還提供了用于抑制表達(dá)IL-3Rci (⑶123)的白血病干細(xì)胞的試 劑，該試劑包括抗原結(jié)合分子，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子 功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Ra (⑶123)上。在這個方面，本發(fā)明還提供了用于治療患者中的血液癌癥病癥的試劑，該試劑包 括抗原結(jié)合分子，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc 區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Ra (⑶123)上。本發(fā)明的這個方面的試劑可以是藥物組合物，其包含抗原結(jié)合分子連同一種或多 種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或稀釋劑。適合非腸道給藥的組合物方便地包括活性組分的無菌水性制劑，優(yōu)選地與接受者 的血液等滲。這種水性制劑可根據(jù)已知的方法使用適宜的分散劑或潤濕劑以及助懸劑進(jìn)行 配制。這種無菌可注射的制劑也可以是處于無毒的非腸道可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌 可注射的溶液或混懸液，例如作為處于聚乙二醇和乳酸中的溶液。可被采用的可接受的運(yùn) 載體(vehicle)和溶劑有水、林格氏溶液、適宜的碳水化合物(例如，蔗糖、麥芽糖、海藻 糖、葡萄糖)、以及等滲的氯化鈉溶液。此外，方便地采用無菌的、非揮發(fā)油類作為溶劑或懸 浮介質(zhì)。出于這一目的，可采用任何溫和的非揮發(fā)油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此 外，脂肪酸(如油酸)可用于制備可注射物。此類治療組合物的制劑對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知的。適宜的藥學(xué)上可 接受的載體和/或稀釋劑包括任何以及所有的常規(guī)溶劑、分散介質(zhì)、填充劑，固體載體，水 性溶液、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、以及類似物。此類介質(zhì)和試劑針 對藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，并且在例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA 中進(jìn)行了描述。 除了其中與該活性成分不相容的任何常規(guī)的介質(zhì)或試劑之外，還考慮了它在本發(fā)明的藥物 組合物中的使用。還可以將補(bǔ)充的活性成分加入組合物中。貫穿本說明書及其隨附的權(quán)利要求書，除非上下文另有要求，否則詞語“包括”和 或變化(如“包括(comprise) ”和“包括(comprising) ”應(yīng)當(dāng)被理解成包含提及的整體或 步驟或者整體或步驟的組，但不排除任何其它整體或步驟或者整體或步驟的組。本說明書中提及任何在先公開文件(或從其中所獲得的信息)、或者提及任何已 知事物，不是并且不應(yīng)該被當(dāng)成是承認(rèn)或準(zhǔn)許或任何形式的建議，即該在先公開文件(或 從其中獲得的信息)或已知的事物形成本說明書所涉及的研究領(lǐng)域內(nèi)公知的一般知識的 一部分。本發(fā)明通過下面非限制性的實施例進(jìn)一步說明實施例1該實例證實了 MAb 7G3在在AML-LSC與HSC之間區(qū)分⑶123表達(dá)和功能方面的明 顯差異的能力。MAb 7G3抑制IL-3信號傳導(dǎo)通路以及初級AML細(xì)胞的增殖。此外，MAb 7G3 明顯降低N0D/SCID異種移植模型中AML母細(xì)胞的歸巢和移入，并且LSC功能受到了抑制。方法
AML患者的樣品、正常的造血細(xì)胞、以及細(xì)胞系單采血液成分術(shù)(apheresis)的產(chǎn)品、骨髓或外周血樣品獲自新診斷的以及復(fù)發(fā) 的患有AML的患者。根據(jù)公共機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)方針在知情同意之后收集患者的樣品，并且由 Royal Adelaide Hospital Human Ethics Committee、Melbourne HealthHuman Research Ethics Committee、Research Ethics Board of the University HealthNetwork、以及 the South Eastern Sydney & Illawarra Area Health Service HumanResearch Ethics Committee批準(zhǔn)進(jìn)行研究。使用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、白細(xì)胞抗原表達(dá)進(jìn)行診斷，并且 根據(jù)法美英分類法(French-American-British (FAB) classification)進(jìn)行評估。通過淋 巴細(xì)胞分離劑(Lymphopr印)或菲可(Ficoll)密度梯度分離來富集單核細(xì)胞并將其冷凍 于液氮中。人類臍帶血和BM細(xì)胞分別獲自足月分娩或接受髖置換手術(shù)的知情患者或從 Cambrex(US)商購得到，并且如之前所說明38進(jìn)行處理。增殖檢驗如之前所說明39，使用[3H]-胸腺嘧啶核苷檢驗來測量AML細(xì)胞對IL_3或GM-CSF 的生長應(yīng)答。簡言之，在37°C在5% CO2中，在200μ1 IMDM+10 %熱滅活的胎牛血清 (HI-FCS) (Hyclone, Utah)中，在 0. OOl-IOnM 7G3 或同種型匹配的對照 BM4(IgG2a)存在 的情況下，用IL-3 (InM)或GM-CSF(0. InM)將96孔板中的2xl04個單核細(xì)胞/孔刺激48 小時，其中在培養(yǎng)的最后6小時加入0.5 μ Ci的3H-胸腺嘧啶核苷(MP Biomedicals, NSW， Australia) ο 使用 Packard Filtermate 細(xì)胞收集器(Perkin Elmer, Victoria, Australia) 將細(xì)胞沉淀在玻璃纖維紙上，并使用Top Count (Perkin Elmer)進(jìn)行計數(shù)。所有的細(xì)胞因 子和抗體是可商購獲得的(R&D Systems, Minneapolis, MN)或由 CSL Limited (Melbourne, Australia)提供。細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)通過免疫沉淀和免疫印跡來檢測信號傳導(dǎo)蛋白的磷酸化。對TF-I細(xì)胞和AMLMNC 細(xì)胞進(jìn)行洗滌，并且使其在缺失生長因子、含有0.5% HI-FCS (Hyclone，Utah)或0.5%人類 白蛋白(CSL，Melbourne，Australia)的IMDM培養(yǎng)基中靜止達(dá)到18小時。將一億個細(xì)胞用 IgG2a (IOOnM)、9F5、6H6 (非封閉抗 CD123 抗體)、或 7G3(0. OOOl-lOOnM)在冰上孵育 30 分 鐘，接著在37°C用50ng/mL IL-3刺激15分鐘。將細(xì)胞在NP-40裂解緩沖液4°中裂解，并且 使用偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠珠上的ICl和8E4抗體將人類i3。(CD131)免疫沉淀。將免疫沉淀物 進(jìn)行SDS-PAGE以及免疫印跡，如之前所描述41。用于探測免疫印跡的抗體是4G10，抗磷酸 酪氨酸MAb (Upstate Biotech, Lake Placid, NY)；抗-磷酸-Akt Ser473(Cell Signaling, Beverly,MA)；以及抗磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子5的激活子(STAT_5)MAb (Zymed，San Francisco,CA)。所有抗體根據(jù)制造商的說明書使用。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL ；Amersham Pharmacia或West Dura來自Pierce)對信號進(jìn)行顯影。還通過細(xì)胞內(nèi)FACS在白血病細(xì)胞系M07e和TF1、以及初級AML細(xì)胞上檢測 STAT-5 的激活。將細(xì)胞在 MEDM 力口 10 % FCS 以及 10ng/mL huIL-3 (CSL, Melbourne, Australia)中孵育60分鐘，并且用BD Cytofix 緩沖液(Becton-Dickinson)固定，之 后以甲醇滲透。然后，用抗磷酸STAT-5(Becton-Dickinson)對細(xì)胞進(jìn)行染色，并且使用 FACSCalibur(Becton-Dickinson)設(shè)備對其進(jìn)行分析。體外的抗體處理
在37°C將解凍的AML或正常的造血細(xì)胞用對照IgG2a或7G3(10l·! g/mL)在補(bǔ)充 7 15-20 % BIT(StemCell Technologies, Vancouver, BC Canada)的 X-VIVOlO(Cambrex Bioscience)中孵育2小時，之后靜脈移植進(jìn)入亞致死照照射的N0D/SCID小鼠中用于再生 測定(見下)。在4-10周在2個不同的時間點檢測移入。
AML的體內(nèi)抗體處理對于體內(nèi)測試，按照每幅圖的圖例中所說明的方案將對照IgG2a或 7G3 (300-500 μ g/注射)通過腹膜內(nèi)(i. p.)注射到小鼠中，每周3次。為了研究7G3與阿 糖胞苷(Ara-C)可能的協(xié)同效應(yīng)，在移植后35天，每天注射一次500 μ g抗體，持續(xù)連續(xù)的 3天；之后以40mg/kg/d腹膜內(nèi)注射Ara-C，持續(xù)連續(xù)的5天。以500 μ g/注射每周3次重 新進(jìn)行抗體處理，再進(jìn)行4周；在這之后在最后注射抗體的最后3天對移入進(jìn)行測定。人類細(xì)胞異種移植到N0D/SCID小鼠中根 據(jù) University Health Network/Princess Margaret Hospital Animal CareCommittee 或 the Animal Care and Ethics Committee of the University of New SouthWales批準(zhǔn)的公共機(jī)構(gòu)指導(dǎo)方針進(jìn)行動物研究。如之前所說明38，將人類細(xì)胞移植到 N0D/SCID小鼠中。簡言之，所有小鼠接受亞致死照射(250-350cGy)24小時，之后每只小鼠 用5，000，000-10，000，000個人類細(xì)胞進(jìn)行靜脈內(nèi)(i. v.)或股骨內(nèi)移植。從雜交瘤細(xì)胞 系 ΤΜ-β 1 (由 Prof. Τ. Tanaka, Hyogo University of HealthSciences 惠贈)42 純化出抗 CD122抗體，并且在小鼠照射后立即將200 μ g通過腹膜內(nèi)注射到小鼠中用于自然殺傷細(xì)胞 的清除，如之前所說明43。類似地，每只小鼠通過靜脈內(nèi)移植8，000, 000個正常的骨髓細(xì)胞、 或1，000，000個分選的⑶34+正常骨髓細(xì)胞、或3xl05個譜系清除的⑶34+正常臍帶血的細(xì) 胞。通過流式細(xì)胞術(shù)基于hCD45+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)來評估人類AML以及自然造血細(xì)胞在鼠骨 髓、外周血、肝臟和脾臟中的移入水平。為了測量7G3對LSC活性的效應(yīng)，還通過在IgG2a 或7G3處理組中通過靜脈移植相同數(shù)目的從之前經(jīng)過移入的小鼠的骨髓中分離的人類細(xì) 胞(9，000, 000個細(xì)胞/小鼠)進(jìn)行了二次移植，。歸巢檢驗將來自初級的患者樣品的或從經(jīng)過移入的小鼠中收集的相同數(shù)目的人類細(xì)胞通 過靜脈注射到亞致死照射的N0D/SCID小鼠中。注射后16-20-4小時，使用5xl04-lxl05個 收集的事件(event)通過流式細(xì)胞術(shù)針對人類細(xì)胞分析來自受體小鼠的骨髓、脾臟、以及 外周血的單核細(xì)胞。人類細(xì)胞歸巢到小鼠組織的效率通過測量特定的器官中所發(fā)現(xiàn)的所注 射細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)來測定，通過以下式子計算在該組織中檢測的hu⑶45+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)X 在特定組織中細(xì)胞的總數(shù)/所注射的人類細(xì)胞的總數(shù)X 10 044—46。細(xì)胞染色和流式細(xì)胞術(shù)用異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗鼠抗體以及藻紅蛋白-花青苷5(PC5， Beckman-CouIter)或異藻藍(lán)蛋白(APC, BioLegend and Becton-Dickinson)偶聯(lián)的抗人類 抗體對來自經(jīng)處理的小鼠的骨髓、脾臟、肝臟和外周血的細(xì)胞進(jìn)行染色，如之前所說明2。用 藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗人類⑶123抗體(克隆9F5)測量⑶123的表達(dá)。通過使用9F5-PE 或7G3-PE對一式兩份樣品進(jìn)行染色以測量從經(jīng)7G3處理的小鼠中回收的、結(jié)合到人類細(xì) 胞上的7G3，這是因為兩個克隆結(jié)合到完全分開的表位上并且在未經(jīng)處理的初級細(xì)胞上產(chǎn) 生類似水平的熒光(數(shù)據(jù)未顯示)。通過以下式子計算7G3的結(jié)合水平[(9F5-PE檢測的CD123 的 RFI)-(7G3-PE 檢測的 CD123 的 RFI)] + (9F5-PE 檢測的 CD123 的 RFI)xl00。使 用一列抗人類抗體來識別免疫表型以及干細(xì)胞群體抗-⑶15-FITC、偶聯(lián)PE的抗-⑶14、 抗-CD19-PE、抗-CD33-PE、抗-CD34-FITC 或抗-CD34-PC5、以及抗-CD38-PE 或 PE-菁藍(lán) 7 (所有抗體都來自Becton-Dickinson，除非另有指明)。同種型對照抗體用于排除99. 9% 的陰性細(xì)胞，并且使用FACScan或FACS Calibur流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)對細(xì)胞 進(jìn)行分析。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為平均值士s. e.m.。各組之間差異的顯著性通過使用Student's t_檢 驗來確定。結(jié)果單克隆抗體7G3在IL-3依賴的細(xì)胞系和初級AML細(xì)胞中阻斷IL_3介導(dǎo)的信號傳 導(dǎo)之前已經(jīng)顯示單克隆抗體7G3(針對IL-3受體α亞基(IL_3Ra，CD123)產(chǎn)生) 抑制IL-3結(jié)合到⑶123上以及IL-3介導(dǎo)的體內(nèi)效應(yīng)，包括白血病細(xì)胞系(TF-I)的增殖、組 胺從人類嗜堿粒細(xì)胞中的釋放、以及內(nèi)皮細(xì)胞的激活33。與這些發(fā)現(xiàn)一致，目前已發(fā)現(xiàn)MAb 7G3在TF-I細(xì)胞以及初級人類AML細(xì)胞中抑制細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。用IL-3(lnM)刺激剝奪生 長因子的TF-I細(xì)胞導(dǎo)致受體β亞基(CD131)的酪氨酸磷酸化以及STAT-5和Akt下游信 號傳導(dǎo)分子的激活，這些分子在細(xì)胞的增殖和存活方面發(fā)揮作用(圖6a)。CD131酪氨酸磷 酸化以及STAT-5和Akt的激活通過使用InM的7G3孵育細(xì)胞而受到抑制，在IOnM被進(jìn)一 步降低，并且在IOOnM濃度下被完全阻斷，這與所報道33的7G3的900pM的Kd相一致。兩 種不阻斷IL-3結(jié)合、中和⑶123欠佳的抗體9F5和6H6在抑制IL-3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)上是 無效的(圖6a)。還通過流式細(xì)胞測定證實了 IL-3依賴的白血病細(xì)胞系TF-I和M07e中 7G3對IL-3刺激的STAT-5磷酸化的抑制(圖6b)。重要地，MAb 7G3在初級AML細(xì)胞中以 濃度依賴的方式選擇性地抑制IL-3依賴的CD131酪氨酸577的磷酸化(涉及促進(jìn)細(xì)胞存 活的信號4°)(圖6a)。類似地，7G3在初級AML細(xì)胞中還降低了 IL-3刺激的STAT-5的磷酸 化，如通過流式細(xì)胞術(shù)所測量(圖6b)。MAb 7G3對IL-3信號傳導(dǎo)的這種選擇性抑制與它 能夠阻斷IL-3結(jié)合的能力相一致，并且提出了以下重要問題，即以前報道不表達(dá)⑶131 ( β 鏈)25的白血病干細(xì)胞是否可以專有性地通過⑶123(α鏈)進(jìn)行信號傳導(dǎo)。⑶123(IL_3受體α鏈)與⑶131 (受體β鏈)在AML白血病干細(xì)胞上共表達(dá)⑶123在來自AML患者的⑶34+/⑶38_細(xì)胞上的過量表達(dá)已被廣泛報道17_21，并且 在一些研究24’25中提出作為白血?、?47⑶38_干細(xì)胞(LSC)的標(biāo)記物。在目前的研究 中，在2個不同的實驗室對⑶123在多個AML樣品上的表達(dá)進(jìn)行獨(dú)立地測量。⑶123在AML CD34+/CD38-細(xì)胞上的表達(dá)(RFI 67. 7士24. 2，η = 9)顯著高于在正常的造血CD34+/CD38-細(xì) 胞上的表達(dá)(RFI 17. 1 士8. 6，η = 4，Ρ = 0. 21)，(數(shù)據(jù)匯總于以下表1中)，這與其它報道 17_21’24’25—致。這種過量表達(dá)表現(xiàn)為選擇性的，因為在AMl樣品中在等效的群體中GM-CSF受 體α鏈(⑶116)沒有表達(dá)，如通過流式細(xì)胞術(shù)所測量。相反，GM-CSF受體α鏈在⑶34—母 細(xì)胞上大量表達(dá)(數(shù)據(jù)沒有顯示)。而且，流式細(xì)胞術(shù)和PCR分析證實了表達(dá)⑶123的⑶34+ 細(xì)胞也表達(dá)⑶131 (數(shù)據(jù)沒有顯示)，這提示通過經(jīng)典的雜二聚體IL-3受體但不單獨(dú)通過 CD123來發(fā)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這也是CD131磷酸化數(shù)據(jù)所支持的(圖la)。此外，在正常的以及惡性的⑶34+/⑶38_母細(xì)胞之間⑶123表達(dá)水平方面的差異為7G3選擇性地靶向LSC而非 正常造血干細(xì)胞提供了基礎(chǔ)。7G3在體外抑制初級AML樣品的自發(fā)的以及IL_3誘導(dǎo)的增殖使用38個初級AML的患者樣品來研究7G3抑制由IL_3誘導(dǎo)的增殖的能力。對于 3個初級樣品的代表性圖顯示于圖lb-d。在35份樣品中的32份中，7G3抑制IL-3誘導(dǎo)的 增殖(圖Ie)，但不抑制GM-CSF刺激的生長(圖lb_d)。在缺失外源加入的生長因子時， 7G3還抑制一些AML樣品中的細(xì)胞的生長。在所測試的9個初級樣品中，7G3和IL-3的存 在將增殖降低到內(nèi)源水平的大約60%，其范圍是50-75% (圖Ie)，這提示了自分泌通路。 這種阻斷6H6欠佳的抗體不抑制IL-3誘導(dǎo)的增殖(數(shù)據(jù)沒有顯示)。7G3抗體的Kd(大約 900pM)33與抑制增殖所要求的濃度很好地擬合(圖lb-d)。總而言之，在大多數(shù)初始AML樣 品中7G3有效地抑制IL-3介導(dǎo)的生長連同自發(fā)生長(未添加IL-3)，這提示一些AML細(xì)胞 組成型地生產(chǎn)IL-3或者7G3在這些細(xì)胞中觸發(fā)了負(fù)信號。用7G3預(yù)處理抑制N0D/SCID小鼠中AML的移入但不抑制正常造血細(xì)胞的移入為了評估7G3對于正常的以及惡性細(xì)胞在免疫缺陷小鼠中再生能力的效應(yīng)，用 7G3或不相關(guān)的IgG2a(10y g/mL，2h)對初級AML以及正常骨髓(NBM)或臍帶血(CB)細(xì)胞 進(jìn)行體外孵育，并且將其移植到亞致死照射的N0D/SCID小鼠中。體外7G3孵育明顯地減少 了(10份中有9份)初級AML樣品的移入，它的對照物顯示了在接種后4-8周骨髓移入的 證據(jù)(平均值89. 7士 1.9%，相對于對照物的減少，P = 0. 013，圖2a和表1)。當(dāng)在接種后 8-12周之間評估時，在7份樣品中有6份持續(xù)了移入的減少。相比之下，在接種后4-11周， 7G3對5份正常樣品中的3份的移入沒有顯著的抑制作用，并且當(dāng)對抗兩個NBM的小效應(yīng)達(dá) 到統(tǒng)計顯著性時，與AML細(xì)胞相比這種抑制的明顯程度低得多(圖2b和表1)。體外7G3處 理相對于IgG2a對照將正常造血細(xì)胞的移入平均降低了值23. 5士8. 9% (P = 0. 078)。通 過監(jiān)測⑶33、⑶19以及⑶3表達(dá)，對這些NBM中的3個的多譜系移入進(jìn)行測量，在IgG2a與 7G3處理組之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異(數(shù)據(jù)沒有顯示)。體外7G3處理將診斷和復(fù)發(fā)時所收集的AML-8的移入抑制到相似的程度，這表明 診斷和復(fù)發(fā)的樣品可以具有可以針對7G3處理的可相比的敏感性。AML-5是僅有的其中 體外7G3處理不會降低移入的AML樣品，這也許是歸因于該樣品顯示高比例的LSC(⑶347 ⑶38_)以及所評估的全部AML樣品中最低的⑶123表達(dá)(表1)。總而言之，這些結(jié)果證實 了與AMLLSC相比正常造血干細(xì)胞對7G3處理的降低的敏感性。由體外7G3處理所引起的AML移入的減少也與改進(jìn)的生存率相關(guān)聯(lián)。移植了經(jīng) IgG2a或7G3處理的AML-9細(xì)胞的小鼠分別顯示11. 5和24周的中位值存活期(P = 0. 0188， 對于每組η = 10，，圖2c)，其中7G3組中有40%存活超過實驗結(jié)束時(25周)，相比之下在 對照組中沒有小鼠存活超過20周。體外7G3處理對AML或正常造血細(xì)胞移入的抑制效應(yīng)是與⑶123在該⑶34+/ ⑶38—群體上的表達(dá)強(qiáng)度負(fù)關(guān)聯(lián)的，具有顯著的關(guān)系(圖7洱=-0.68，？ = 0.0051)。二元 模式是明顯的，這證實了對于其中移入被7G3嚴(yán)重抑制的那些AML樣品而言⑶123表達(dá)通 常是高的。相反地，這種單一的AML樣品(AML-5)、連同正常的造血細(xì)胞樣品(對于這些樣 品，移入沒有受到7G3的明顯影響)通常表達(dá)較低水平的⑶123。7G3在N0D/SCID小鼠中抑制AML歸巢的能力
為了確定7G3對經(jīng)靜脈接種AML細(xì)胞歸巢到骨髓和脾臟的能力的效應(yīng)，移植了體 外處理的AML-8-rel和AML-9細(xì)胞，并且將小鼠進(jìn)行安樂死并且24小時后進(jìn)行檢查。與同 種型處理的對照物相比(P < 0. 05)，7G3將歸巢到骨髓顯著地降低到46-93%，同時將歸巢 到脾臟減少到對照物的35%至90%，但是該差異不是統(tǒng)計學(xué)顯著的(P > 0. 05)(圖2d)。 接種后24小時停留在骨髓和脾臟中的白血病細(xì)胞基本上是CD34+原始細(xì)胞，并且當(dāng)7G3減 少骨髓中細(xì)胞的數(shù)目時，它沒有改變停留的細(xì)胞的細(xì)胞表面表型(數(shù)據(jù)沒有顯示)。為了進(jìn)一步表征7G3對AML歸巢到骨髓的效應(yīng)，將AML-8_rel細(xì)胞暴露于7G3或 同種型對照抗體，隨后經(jīng)由尾靜脈(IV)進(jìn)行移植或直接進(jìn)入右股骨(RF)，并且在5周之 后將這些動物安樂死。圖2e顯示了與靜脈接種相比股骨內(nèi)接種緩解了 7G3對移入的抑制 效應(yīng)，盡管7G3在經(jīng)注射的股骨和未注射的股骨中顯著地降低移入方面仍然有效。為了更 直接地證實7G3對AML-LSC的抑制，我們研究了 7G3處理對⑶34+CD38_細(xì)胞的影響，因為 AML-LSC(按照它們在N0D/SCID小鼠中重現(xiàn)人類疾病的能力來定義)在該部分中顯著地富 集2’3。來自歸巢到BM中的AML-8-rel和AML-9的⑶34+CD38-細(xì)胞的數(shù)目被體外7G3處理 分別減少到對照物的8. 4士0. 018%和12. 0士4. 3% (P = 0. 16和0. 013，圖2f)。類似地， 歸巢到脾臟的AML-9CD34+CD38—細(xì)胞的數(shù)目被減少到對照物的3. 8士 1. 5% (P = 0. 019)。 為了進(jìn)一步確認(rèn)該發(fā)現(xiàn)，使用從AML-9中分選的CD34+CD38—細(xì)胞對該歸巢實驗進(jìn)行重復(fù)， 并接著用IgG2a或7G3進(jìn)行體外處理，之后注射到N0D/SCID小鼠中。在7G3處理組中人 類細(xì)胞的歸巢效率在BM中被降低到IgG2a對照的7. 8士 1. 7% (P = 0. 0019)，而在脾臟中 (P = O. 09)為11. 2士0.84% (圖2g)。所以，CD123似乎在AML N0D/SCID白血病起始細(xì)胞 (SL-IC)歸巢到它們的支持性微環(huán)境、連同該疾病在N0D/SCID小鼠中的確立和傳播方面發(fā) 揮重要的作用。在N0D/SCID小鼠早期給予7G3降低了 AML移入為了確定N0D/SCID小鼠的7G3處理是否影響AML細(xì)胞移入，對小鼠給予單一的 腹膜內(nèi)注射7G3或同種型對照抗體(300 μ g)，然后在6小時后進(jìn)行AML-I細(xì)胞的靜脈內(nèi)移 植。在移植后5周，7G3處理幾乎完全去除了骨髓中的移入，達(dá)到對照物的1.3士0.9% (P =0. 0006，η = 5，圖 3a)。還通過在移植后24小時或4天開始處理來檢查7G3在N0D/SCID小鼠中控制AML 進(jìn)展方面的療效，假定處理開始之前允許SL-IC歸巢到骨髓微環(huán)境中44_46。當(dāng)在移植后24 小時開始處理時，在3份AML樣品中有2份的移入被降低。使用這種每隔一天給予4個劑 量的處理方案時，AML-2和-3的移入分別被減少到對照物的41. 1 士27. 1% (P = 0. 096)和 39. 6 士 10. 0% (P = O. 026)，而AML-I的移入沒有受到影響(圖3b)。盡管7G3在兩個移植后處理方案中的效應(yīng)相對溫和，但是包被在AML細(xì)胞(從小 鼠骨髓中收集)上的7G3是清楚地明顯的(數(shù)據(jù)沒有顯示)。此外，在所測試的任何處理方 案中，7G3處理減少了⑶123在AML-I細(xì)胞上的表達(dá)。為了展示，從移植后4天開始的7G3處 理將從BM中收集的AML-I的⑶123表達(dá)降低到對照物的51. 3士4. 0% (圖3c，P<0. 0001)， 正如使用9F5抗體所評估。在同一實驗中，7G3還將AML-I向小鼠外周血和脾臟的傳播分別 降低到對照物的 27. 8 士 7. 5% (P = 0. 0029)和 23. 5 士 5. 3% (P = 0. 0009)(圖 3d)。7G3能夠降低N0D/SCID小鼠中確立的AML疾病的負(fù)荷盡管本發(fā)明的主要目標(biāo)是測試靶向⑶123對于AML干細(xì)胞的效應(yīng)，7G3對確立的白血病顯示任何單一試劑處理活性的能力(高于并且超過它對白血病干細(xì)胞移入的效應(yīng)) 是在確立的疾病模型中通過在移植后28天開始進(jìn)行連續(xù)的7G3或?qū)φ誌gG2a處理來進(jìn)行 評估的，并且連續(xù)處理直到處死時。在該模型中在多個患者樣品之間對7G3處理的應(yīng)答存 在著差異，這類似于臨床見到的AML的異質(zhì)性反射。在該模型中兩個患者樣品之間應(yīng)答7G3 處理存在差異，這類似于臨床可見的AML的異質(zhì)性反射。在5份樣品中的2份中看到AML 的BM負(fù)荷的顯著降低(顯示于圖3e和f)。AML-2響應(yīng)于7G3，其中在移植后9周和14周 BM的移入顯著降低(圖3e)，而在8天內(nèi)僅用4個劑量的7G3對小鼠進(jìn)行處理將AML-I的 移入顯著地減低到IgG2a對照的18. 9士4. 1% (P = O. 001，圖3f)。此外，移植后4天或28 天開始7G3處理時，多個AML樣品不具有BM中自血病負(fù)荷的顯著降低，通常觀察到外周造 血器官(脾臟、外周血、以及肝臟)中白血病負(fù)荷低于7G3處理組(圖3d，數(shù)據(jù)沒有顯示)。 總之，這些數(shù)據(jù)提示7G3在體內(nèi)是具有生物學(xué)活性的，并且在用作單一試劑時可以在NOD/ SCID模型中抑制AML的生長。7G3靶向SL-IC自我更新能力這些系列性的移植實驗解答對于所有的癌癥干細(xì)胞(CSC)指引的治療中一個重 要問題，并且提供了 CSC實際上是受到體內(nèi)靶向的這一證據(jù)。在AML的情況下，已知當(dāng) AML-LSC再生初級N0D/SCID小鼠時，它們必須自我更新3 ；自我更新是所有干細(xì)胞的關(guān)鍵特 性，并且最好通過二次移植進(jìn)行評估。為了檢查7G3是否也能夠作為常規(guī)處理的佐劑用于靶向具有自我更新能力的 LSC(它靶向更快增殖的AML母細(xì)胞)，將7G3或IgG2a與阿糖胞苷(Ara-C)相結(jié)合，并且 確定了它們對SL-IC和白血病負(fù)荷的效應(yīng)。在用AML-10細(xì)胞移植后35天，每天用7G3或 IgG2a對照(500 μ g/d)對小鼠進(jìn)行處理，持續(xù)3天，之后是Ara-C (40mg/kg/d)，持續(xù)連續(xù)的 5天。在Ara-C處理之后，再給予7G3持續(xù)另外4周。與經(jīng)IgG2a和Ara-C處理的小鼠相 比，在經(jīng)7G3和Ara-C處理的小鼠的骨髓和脾臟中白血病移入沒有減少(圖4部分Ia)。然 而，當(dāng)從經(jīng)處理的小鼠的骨髓中收集細(xì)胞并且將相同數(shù)目的人類細(xì)胞移植到次級受體小鼠 中時，從7G3/Ara-C處理的供體小鼠中收集的細(xì)胞歸巢到骨髓和脾臟分別被抑制到IgG2A/ Ara-C 處理的對照物的 33. 6士5. 0% (P = 0. 014)和 10. 9士4. 6% (P = 0. 15)(圖 4 部分 Ib)。此外，次級受體小鼠的骨髓和脾臟的再生還被7G3/Ara-C分別降低到IgG2a/Ara-C處 理的對照物的 21. 0士 15. 2% (P = O. 024)和 35. 8士31. 8% (P = O. 31)(圖 4 部分 Ic)。盡 管在供體小鼠的骨髓中出現(xiàn)的⑶347⑶38—LSC的比例相對于IgG2a/Ara-C處理沒有被7G3/ Ara-C減少(數(shù)據(jù)沒有顯示)，圖4部分Id顯示了與使用IgG2a/Ara-C進(jìn)行處理的供體相 比來自7G3/Ara-C供體的次級受體小鼠的骨髓和脾臟中該細(xì)胞群體的顯著減少。這些數(shù)據(jù) 證實在N0D/SCID小鼠中體內(nèi)7G3給藥特異性地靶向AML-LSC，導(dǎo)致在次級受體小鼠中歸巢 和移入的減少。為了確定7G3是否可以作為單一的試劑，在Ara-C缺失的情況下進(jìn)行體內(nèi)7G3處 理之后進(jìn)行系列性移植。如圖4部分IIA中所示，盡管7G3處理10周在初級移入小鼠的BM 或脾臟中沒有明顯地減少AML-10的移入，與IgG2a處理的對照物相比，從7G3處理的小鼠 中收集的AML細(xì)胞顯著地破壞了歸巢到次級受體小鼠的BM(28. 2士2. 9%，P = 0. 0083)和 脾臟(18·3±4·8%，Ρ = 0·0021)的能力(圖4部分II B)。再生能力也受到顯著破壞盡 管9只移植了未經(jīng)處理的對照細(xì)胞的次級受體小鼠中有8只被移入，在8只接種了來自7G3
21處理小鼠的細(xì)胞的小鼠中僅有3只顯示移入的證據(jù)(圖4部分II C)。與IgG2a處理的對照 物相比，在7G3處理的小鼠中平均移入水平被顯著減少(BM，34. 6士 18. 6%，P = 0. 039 ；脾 臟，33. 7 士 20.4%，P = 0. 19)(圖4部分II C)。這個患者樣品具有高水平的⑶34+⑶38_原 始細(xì)胞，其在7G3處理的初級小鼠中沒有減少。然而，與IgG2a處理的供體相比，在從7G3 處理的供體中移植的次級受體小鼠的BM中該原始細(xì)胞群體存在著顯著的減少(對照物的 56.6 士 15.0%，P = 0.031)(圖4部分II D)。在以AML-9細(xì)胞進(jìn)行的獨(dú)立實驗中獲得了 類似的結(jié)果，顯示7G3引起移入平均水平的降低達(dá)到對照物的19. 3% 士9. 8% (圖4部分 III)?？傊?，將在圖4中所描述的來自全部3個獨(dú)立實驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，在27只次級 小鼠中僅有1只(3. 7% )沒有移入從IgG2a或IgG2a加Ara-C處理的對照小鼠中收集的細(xì) 胞。相比之下，在23只次級小鼠中有11只(48% )不能移入從7G3或7G3加Ara-C處理的 小鼠中收集的細(xì)胞。這些結(jié)果證實在N0D/SCID小鼠體內(nèi)7G3給藥特異性地靶向AML-LSC， 導(dǎo)致次級受體中歸巢和移入的減少。⑶122+NK細(xì)胞對于N0D/SCID小鼠中7G3介導(dǎo)的AML再生的抑制發(fā)揮作用NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和樹突細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)子細(xì)胞，它們有助 于Fc依賴的、抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。通過以下方法進(jìn)行評價它們對7G3抑制AML 移入的能力的貢獻(xiàn)在進(jìn)行體外7G3處理的AML細(xì)胞的白血病細(xì)胞移植之前，將針對鼠 IL-2Ri3 -鏈(IL-2Ri3)的單克隆抗體(也稱作⑶122)注射到經(jīng)照射的N0D/SCID小鼠中。 IL-2R^廣泛地表達(dá)于NK細(xì)胞、T細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞上，通過mAb阻斷IL-2R0可以在NOD/ SCID異種移植系統(tǒng)中改進(jìn)人類造血細(xì)胞的移入。在移植后4周，在NK細(xì)胞清除的、移植了經(jīng)IgG2a對照體外處理的AML-8_rel細(xì) 胞的小鼠中白血病移入被增加到未清除的小鼠的113. 3士2. 8% (P = 0. 023)(圖5a)，這提 示⑶122+NK細(xì)胞在N0D/SCID小鼠中溫和地減少了 AML的移入。⑶122+細(xì)胞的消除也部分 地但卻顯著地緩解7G3降低AML細(xì)胞移入的能力，這提示⑶122陽性細(xì)胞部分地介導(dǎo)7G3 的抑制作用(圖5a)。與對N0D/SCID再生的效應(yīng)相反，在抗CD122處理的小鼠中7G3還將 白血病細(xì)胞的歸巢有力地抑制達(dá)到超過IgG對照的85% (圖5b)。這些結(jié)果表明在NOD/ SCID小鼠中7G3抑制AML細(xì)胞的移入和歸巢的能力是由至少2種合作的通路所介導(dǎo)的NK 和/或其它CD122依賴的細(xì)胞引起的ADCC ；以及，7G3阻斷IL-3/CD123信號通路的特異性
抑制效應(yīng)。
AML樣品的增殖。此外，7G3處理明顯地降低了 AML-LSC移入并且改進(jìn)了小鼠的存活率?；?有預(yù)先確立的疾病的小鼠顯示了 BM和外周中降低的AML負(fù)荷、以及在治療時受損的二次移 植，從而確立了在經(jīng)處理的小鼠中AML-LSC被直接靶向。這些結(jié)果為治療性抗⑶123單克 隆抗體對AML-LSC的靶向、以及將體內(nèi)臨床前的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化成潛在的臨床應(yīng)用提供了清 楚的確證。實施例2CSL360是一種嵌合抗體，通過將小鼠單克隆抗體7G3的輕可變區(qū)和重可變區(qū)嫁接 到人類IgGl恒定區(qū)而獲得。與7G3相同，CSL360以高親和力結(jié)合到CD123 (人類IL-3R α ) 上，與IL-3競爭結(jié)合到受體上并阻斷它的生物學(xué)活性33。大部分的人類嵌合抗體CSL360還 由此可以潛在地用于靶向并且消除AML LSC細(xì)胞。CSL360憑借它的人類IgGlFc區(qū)(它可能 在人類環(huán)境中引起效應(yīng)物活性)還具有作為人類治療劑的潛在使用優(yōu)勢。而且，可能的是 在人類中相對于小鼠7G3等效物它會顯示降低的清除并且不太可能是免疫原性的。CSL360 在處理表達(dá)白血病的⑶123中的作用機(jī)制可能涉及1)通過阻斷IL-3結(jié)合到它的受體上而 抑制IL-3信號傳導(dǎo)，2)在抗體已經(jīng)結(jié)合到靶細(xì)胞之后招募補(bǔ)體并且引起補(bǔ)體依賴的細(xì)胞 毒性(CDC)，或3)在抗體結(jié)合到靶細(xì)胞之后招募效應(yīng)子細(xì)胞并且引起抗體依賴的細(xì)胞毒性 (ADCC)。以下說明所開發(fā)的研究抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)的方法，并且可以將其歸類 為以下方法，這些方法分析該檢驗中(1)靶細(xì)胞群體或(2)效應(yīng)子細(xì)胞群體。分析靶細(xì)胞 所涉及的方法測量由ADCC產(chǎn)生的靶細(xì)胞的裂解或靶細(xì)胞的早期凋亡。檢查效應(yīng)群體的方 法測量效應(yīng)子細(xì)胞(例如NK細(xì)胞)上膜顆粒的誘導(dǎo)，以此作為NK細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解的 標(biāo)記物。方法使用51鉻釋放檢驗測量ADCC在37°C將經(jīng)工程化處理以表達(dá)⑶123的鼠淋巴樣細(xì)胞系CTL-EN(如Jenkins等人 5°所描述)或新鮮解凍的白血病細(xì)胞(5xl06)用250 μ Ci的51Cr-鉻酸鈉孵育1小時。用 RPMI-10% FCS培養(yǎng)液將細(xì)胞洗滌3次以去除任何游離的51Cr鉻酸鈉。將鉻標(biāo)記的靶細(xì)胞 以10，000個細(xì)胞/孔分配到圓底的96孔板中。加入10 μ g/mL的CSL360或同種型對照抗 體(MonoRho，重組抗恒河猴D人類免疫球蛋白Gl)。以不同的比例加入新鮮分離的PBMC作為效應(yīng)子細(xì)胞，一式三份，并且在37 °C在 5% CO2培養(yǎng)箱中將其孵育4小時?？倶悠返捏w積是200 μ L/孔。在孵育期之后，將孔板以 600xg離心5分鐘，除去100 μ L上清液并且在Wallace γ -計數(shù)器中測量釋放的51Cr。使用以下式子來確定特異性裂解裂解百分?jǐn)?shù)=IOOx[(具有抗體的平均cpm-平 均自發(fā)cpm) / (平均最大cpm-平均自發(fā)cpm)]。從多個樣品獲得自發(fā)的釋放，這些樣品具有 靶細(xì)胞而沒有抗體并且沒有效應(yīng)子細(xì)胞。從使用(v/v) Triton X-IOO處理的靶細(xì)胞中 確定最大釋放。 使用鈣黃綠素AM標(biāo)記的靶細(xì)胞檢驗測量ADCC 通過Neri等人52描述的方法測量由CSL360誘導(dǎo)的ADCC。該方法涉及用鈣黃綠 素AM代替51鉻來標(biāo)記靶細(xì)胞。將靶細(xì)胞在37°C在5% CO2培養(yǎng)箱中用ΙΟμΜ鈣黃綠蛋白 AM(Invitrogen, cat. no. C3099)孵育30分鐘。對標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行洗滌以去除任何游離的鈣黃綠蛋白AM，并接著將其以5000細(xì)胞/孔分配到圓底平板中。以不同比例加入效應(yīng)子細(xì) 胞。加入有關(guān)抗體達(dá)到終濃度為lOyg/mL，無抗體的細(xì)胞充當(dāng)陰性對照物。將平板在37°C 在5% C02培養(yǎng)箱中孵育4小時。孵育期后，將平板以600xg離心5分鐘。除去100 μ L上 清，并且在Envision酶標(biāo)儀(激發(fā)濾光片485nm，發(fā)射濾光片535nm)中測量熒光。通過使 用以下式子來計算特異的裂解裂解百分?jǐn)?shù)=IOOx [(具有抗體的平均熒光_平均自發(fā)熒 光)/ (平均最大熒光_平均自發(fā)熒光)]。通過用3 % Extran裂解細(xì)胞來確定最大熒光，自 發(fā)裂解是使用沒有任何抗體或效應(yīng)子細(xì)胞的靶細(xì)胞所獲得的熒光。測量ADCC作為膜顆粒蛋白CD107a的效應(yīng)子細(xì)胞表達(dá)而作為細(xì)胞裂解的替代標(biāo)記 物Fischer等人51證實了 NK細(xì)胞的⑶107a(—種膜相關(guān)聯(lián)的裂解顆粒蛋白)的表達(dá) 水平與靶細(xì)胞毒性相關(guān)。該方法用于評估CSL360的ADCC活性。該方法涉及孵育從覆蓋靶 細(xì)胞的棕黃層中新鮮分離的人類PBMC。所使用的靶細(xì)胞是表達(dá)CD123的細(xì)胞系或初級人類 AML細(xì)胞。靶細(xì)胞在抗體存在或不存在的情況下以1 1的比例加到人類PBMC中。⑶107a 的非特異性或自發(fā)的表達(dá)使用不含所添加的任何抗體或靶細(xì)胞的人類PBMC進(jìn)行評估。將 PE-Cy5偶聯(lián)的CD107a單克隆抗體(BD Pharmingen, cat. no. 555802)加到所有樣品中，并 且在37°C在5% CO2培養(yǎng)箱中將細(xì)胞孵育3小時。在孵育的第一個小時之后，加入布雷菲 德菌素A(BFA)。在孵育結(jié)束時，對細(xì)胞進(jìn)行洗滌，并且用抗-CD56-PE(BD Pharmingen, cat. no. 347747)以及抗-CD16-FITC (BD Pharmingen, cat. no. 555406)單克隆抗體對其進(jìn)行染 色。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)使用FACS Calibur (Flow Jo Software TreeStar, Inc.)分析細(xì) 胞并且分析⑶56dimCD16+⑶107a細(xì)胞，這些細(xì)胞代表了表達(dá)FcR y IIIA受體的NK細(xì)胞，它 們表達(dá)膜相關(guān)的裂解顆粒蛋白。結(jié)果當(dāng)通過51鉻釋放檢驗進(jìn)行評估時CSL360在AML樣品和表達(dá)⑶123的細(xì)胞系中誘 導(dǎo) ADCCCTLEN細(xì)胞總攝取的51鉻在2000cpm與1500cpm之間，作為對比AML細(xì)胞僅有大約 400-200cpm，如通過用洗滌劑裂解的最大鉻釋放所確定。使用CSL360以效應(yīng)物比靶細(xì)胞為 100 1的比例觀察到AML(SL)細(xì)胞的15%裂解，相比之下用陰性對照抗體MonoRho具有 1. 9%的裂解。使用CSL360以效應(yīng)物比靶細(xì)胞為100 1的比例觀察到CTLEN細(xì)胞的51% 裂解，相比之下用陰性對照抗體MonoRho具有5%的裂解(表2)。這些結(jié)果提示與AML細(xì) 胞相比，CTLEN細(xì)胞對CSL360-介導(dǎo)的ADCC裂解更加敏感，盡管AML細(xì)胞具有更高水平的 ⑶123的表面表達(dá)。當(dāng)用⑶107a在效應(yīng)NK細(xì)胞上的表達(dá)進(jìn)行評估時CSL360在AML樣品和表達(dá)⑶123 的細(xì)胞系中誘導(dǎo)ADCC圖8顯示了流式細(xì)胞術(shù)分析，這些分析證實在CSL360或同型對照抗體的存在 下膜裂解顆粒⑶107a在衍生自混合的PBMC(來自以AML患者樣品RMH003孵育的正常 供體)NK細(xì)胞上的誘導(dǎo)。在該混合的群體中NK細(xì)胞是對于表達(dá)⑶56(NK標(biāo)記物)和 OTie(FcRYlIIA)的淋巴細(xì)胞群設(shè)門(gated)而獲取。這些數(shù)據(jù)顯示與來自相同供體以及 用同種型對照抗體孵育的患者樣品的NK相比( 3% CD107a陽性細(xì)胞，在圖8A中)，暴露 于包被著CSL360的AML細(xì)胞的NK證實顯著地提高⑶107a ( 39%⑶107a陽性細(xì)胞，在圖8B中)。供體NK細(xì)胞上的CD107a誘導(dǎo)是靶細(xì)胞依賴的，因為如果在靶AML患者細(xì)胞的缺 失下將CSL360加到效應(yīng)子細(xì)胞中就沒有檢測出CD107a(圖8D)。圖9顯示了來自相同實驗 的、被繪成直方圖的數(shù)據(jù)。表3中包含了按照與以上相似的方式產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來自多個經(jīng)工程化處 理以表達(dá)人類⑶123(CTLEN，EL4)的細(xì)胞系或表達(dá)內(nèi)源性⑶123 (TF-I)的人類白血病細(xì)胞 系、以及來自白血病患者的作為靶細(xì)胞(以衍生自達(dá)3種不同供體的效應(yīng)子細(xì)胞進(jìn)行孵育) 的初級樣品。這些數(shù)據(jù)表達(dá)為表達(dá)了 CD 107a、以不同樣品進(jìn)行孵育(在存在CSL360或 不加入抗體的情況下)的NK細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。兩個表達(dá)人類⑶123的小鼠細(xì)胞系在CSL360 的存在下在NK細(xì)胞中誘導(dǎo)了⑶107a的表達(dá)。8份初級白血病樣品中有4份證實在NK細(xì) 胞上CSL360-介導(dǎo)的⑶107a的表達(dá)。RMH007甚至在CSL360的缺失下還在NK細(xì)胞中誘導(dǎo) CD107a的表達(dá)。RBH013給出了與來自供體的PBMC相類似的結(jié)果，然而，使用不同的供體， ⑶107a的表達(dá)是特異性地針對CSL360的，這表明了在這個情況下供體特異性對CSL360誘 導(dǎo)的NK-介導(dǎo)的ADCC的敏感性。對8份初級白血病樣品中的6份檢查了 ADDC效應(yīng)，其中不同的供體作為效應(yīng)子細(xì) 胞的來源。一個重要的觀察是對ADCC敏感的樣品通常在效應(yīng)子細(xì)胞中誘導(dǎo)CD107a，不論供 體如何。類似地，對ADCC具有抗性的樣品也通常保持著陰性，不論供體細(xì)胞如何。CSL360在AML樣品中誘導(dǎo)ADCC，如通過鈣黃綠素-AM釋放檢驗所評估在培養(yǎng)基中裂解的細(xì)胞釋放的鈣黃綠素是ADCC-介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的指示物。在該 檢驗中患者RMH003和RMH008顯示對ADCC的敏感性，而RMH009、RMH010和RBH013表現(xiàn)出 對裂解的抗性(表4)。在NK細(xì)胞CD107a表達(dá)檢驗中，用與本檢驗所使用的相同的效應(yīng)子 細(xì)胞測試了所有這五位患者對CSL360-介導(dǎo)的ADCC的敏感性，并且將比較結(jié)果顯示于表5。 6個患者樣品中有3個樣品的ADCC的狀態(tài)與兩個不同的測檢驗相一致。表2在51鉻釋放檢驗中ADCC介導(dǎo)的裂解 表3CD107a的表面表達(dá)作為ADCC活性的量度 ““表明用不同供體作為效應(yīng)子細(xì)胞的來源來測試樣品的ADCC表4鈣黃綠素釋放檢驗中ADCC的評估。 *使用樣品RMH009重復(fù)測定，使用另一個來源的PBMC作為效應(yīng)子細(xì)胞表5.基于流式細(xì)胞術(shù)的檢驗與裂解檢驗的比較 a使用⑶107和鈣黃綠素釋放檢驗對這些樣品測試ADCC，對于這兩個測定使用相 同的效應(yīng)子細(xì)胞* 未做
討論通過使用幾種被公認(rèn)的測量ADCC活性的檢驗(盡管具有變化的靈敏度)，可以看 到CSL360可以在保持于培養(yǎng)物中的、表達(dá)異位的人類CD123的小鼠細(xì)胞系中誘導(dǎo)ADCC應(yīng) 答。重要的是，CSL360在來自正常供體的功能性效應(yīng)子細(xì)胞存在下也能夠誘導(dǎo)針對初級人 類AML患者樣品的ADCC應(yīng)答。這一數(shù)據(jù)提示了一些白血病患者(它們的白血病細(xì)胞包括 LSC)表達(dá)充足水平的⑶123，治療性地給予CSL360也許能夠誘導(dǎo)ADCC指導(dǎo)的白血病細(xì)胞 的消除，特別是如果患者在他們的循環(huán)中還保留著一些功能性效應(yīng)子細(xì)胞，例如像，處于緩 解期的患者或具有微小殘留病的患者。實施例3⑶123在AML細(xì)胞(包括LSC)上的普遍表達(dá)以及表明IL_3在AML的病因?qū)W中具 有重要作用的證據(jù)提示阻斷IL-3Ra功能的能力對于靶向IL-3Ra的抗體(例如7G3)的 任何治療活性而言是至關(guān)重要的。在這個實施例中，一定程度上出乎意料地證實了 7G3抑 制由AML患者樣品產(chǎn)生的N0D/SCID小鼠的移入或再生的能力至少部分地依賴于由7G3的 Fc區(qū)引起的效應(yīng)子作用應(yīng)答。而且，不顯著抑制IL-3Ra功能的其它IL-3Ra抗體也阻斷 了移入，因此證實在AML的N0D/SCID小鼠模型中的治療活性。方法F (ab)，2片段的制備在37 °C使用固定的胃蛋白酶-瓊脂糖(每mg抗體具有22. 5U胃蛋白酶瓊脂糖) 與抗體孵育2小時，通過胃蛋白酶切割得到針對6H6、9F5以及7G3的F(ab)，2片段。使用 3M Tris將pH調(diào)節(jié)到6. 5來淬滅酶解。通過離心將固定的珠子從得到的F (ab) ’ 2中分離。使用串聯(lián)的色譜操作從殘余的免疫球蛋白以及其它污染物中純化出7G3的 F(ab)，2 嗜硫吸附色譜(20-0%硫酸銨梯度，在40mM HEPES中，超過15個柱體積)以 及陰離子交換色譜。通過離子交換色譜、之后進(jìn)行親和層析而純化出9F5F(ab)’ 2和 6H6F(ab)，2。通過LAL生色檢驗對內(nèi)毒素水平進(jìn)行定量。其中內(nèi)毒素水平大于10EU/mL， Detoxigel用于降低內(nèi)毒素水平。如所預(yù)期的，7G3F (ab) ’ 2保留了 CD123中和活性，如通過 IL-3依賴的TF-I增殖檢驗所評估(數(shù)據(jù)沒有顯示)。AML患者樣品在知情同意之后從3位新診斷的患者中收集外周血細(xì)胞。對AML患者進(jìn)行診斷， 并且根據(jù)法美英(French-American-British) (FAB)指標(biāo)對其進(jìn)行分類。AML_8_rel最初在 第一次診斷時被分類為M4，AML-9被分類為M5a，而未對AML-10進(jìn)行分類。通過菲可密度 梯度離心將AML母細(xì)胞分離，并且將等份冷凍于液氮中。體外抗體處理使用針對IL-3受體α鏈(CD123)、7G3、9F5、6H6及其F(ab)，2片段的單克隆抗 體處理從AML患者中收集的細(xì)胞。IgG2a平行使用作為對照物。將解凍的AML細(xì)胞接種于 XVIV010加15% BIT中，并且用10 μ g/mL濃度的抗體對其進(jìn)行獨(dú)立孵育。在37°C孵育2小 時之后，將收集的白血病細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到亞致死照射的N0D/SCID小鼠中用于再生檢測。將人類細(xì)胞異種移植到N0D/SCID小鼠中進(jìn)行異種移植，基本上如實施例1中所述進(jìn)行。N0D/SCID小鼠在 UniversityHealth Network/Princess Margaret Hospital 白勺云力胃巾口畏住于此。根據(jù) University Health Network/Princess Margaret Hospital Animal Care Committee批準(zhǔn)的公共機(jī)構(gòu)指導(dǎo)方針進(jìn)行動物研究。如之前所說3，將白血病細(xì)胞移植到 N0D/SCID小鼠中。簡言之，在相同的實驗中所有小鼠在相同的時間以300cGy的劑量進(jìn)行 照射，之后注射等數(shù)目的人類細(xì)胞。對于靜脈移植，每一組使用5只小鼠，其中每只小鼠注 射5，000, 000-10, 000, 000個白血病細(xì)胞。基于通過鼠骨髓的流式細(xì)胞術(shù)得到的⑶45+細(xì) 胞的百分?jǐn)?shù)來評估人類AML的移入水平。細(xì)胞染色和流式細(xì)胞術(shù)將來自經(jīng)治療小鼠的骨髓的細(xì)胞用偶聯(lián)到APC上的對人類CD45特異的小鼠抗 體(抗-CD45) (Beckman-Coulter)、偶聯(lián)到異硫氰酸熒光素(FITC)上的抗-CD34、以及 抗-CD38-PC5(Becton-Dickinson)進(jìn)行染色。使用同種型對照以避免假陽性的細(xì)胞。使用 抗-CD123-PE (克隆9F5和7G3, Becton-Dickinson)測試IL-3受體α鏈在AML細(xì)胞上的 表達(dá)。使用Caliber(Becton-Dickinson)分析染色的細(xì)胞。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為平均值士 s. e. m。處理組之間差異的顯著性是用Student’ s t_檢驗 通過P值來確定的。在P < 0. 05時認(rèn)為結(jié)果被統(tǒng)計上顯著的。結(jié)果抗-IL-3RCI抗體Fc區(qū)顯著地促進(jìn)了對AML歸巢能力的抑制實施例1中的數(shù)據(jù)、圖5a和b表明由NK和/或其它⑶122依賴的細(xì)胞所引起的 ADCC促進(jìn)7G3抑制AML細(xì)胞進(jìn)入N0D/SCID小鼠的骨髓的歸巢和再生的能力，并且額外地 影響了 7G3阻斷IL-3/⑶123信號通路的效應(yīng)。為了對此直接進(jìn)行檢查，檢查了其它中和 抗-IL-3R α抗體欠佳的6Η6和9F5對體外處理的AML樣品歸巢的效應(yīng)。6Η6和9F5均特異 地結(jié)合⑶123，然而與7G3不同，它們不阻斷IL-3Ra的功能33。在圖6a中這也是顯然的， 該圖顯示與7G3不同，9F5和6H6甚至在所測試的最高劑量下也不能抑制IL-3誘導(dǎo)的信號 傳導(dǎo)，包括⑶131 (β c)酪氨酸的磷酸化、STAT-5磷酸化和Akt磷酸化。圖10顯示盡管如 此，6Η6和9F5有效地抑制AML細(xì)胞歸巢到ΒΜ，至少與本實驗中的7G3 —樣。Fc結(jié)構(gòu)域?qū)?G3抑制歸巢的效應(yīng)的貢獻(xiàn)是通過測試7G3和6Η6的F(ab)，2片段 來進(jìn)行評估的?？贵wF(ab)，2片段缺少Fc效應(yīng)物免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，并且不能引起ADCC 或⑶C應(yīng)答。圖10還顯示在該實驗中7G3和6H6的F (ab)，2片段沒有抑制AML細(xì)胞歸巢， 并且表明這兩個抗體的Fc結(jié)構(gòu)域?qū)σ种艫ML細(xì)胞歸巢到骨髓是重要的?？?IL-3RCI抗體Fc結(jié)構(gòu)域顯著地促進(jìn)對AML細(xì)胞的骨髓移入和再生能力的抑制然后，本實驗延伸到評估IL-3Ra中和以及效應(yīng)物活性對于抑制AML細(xì)胞移入受 體小鼠骨髓中的貢獻(xiàn)。在37°C用10 μ g/mL濃度的不同的完整的抗體和抗體片段將兩個AML 患者樣品體外處理2小時。孵育后，將細(xì)胞離心以去除未結(jié)合的抗體，并且將其移植到亞致 死照射的N0D/SCID小鼠中。移植后4周通過評估hu⑶45陽性細(xì)胞在小鼠骨髓中的百分?jǐn)?shù) 來分析人類AML的移入水平。如圖Ila和b中所示，如所預(yù)期的，7G3顯著地抑制這兩個AML 患者樣品移入N0D/SCID小鼠中。與對歸巢的效應(yīng)一致，9F5也有效地抑制這兩個患者樣品 的AML細(xì)胞移入。有趣地是，圖Ila顯示對于患者樣品AML-9，7G3和9F5的F(ab) ’ 2片段 被證實顯著地降低抑制能力，但沒有完全允許移移入恢復(fù)到使用對照抗體時的水平。相比 之下，對于樣品AML-10，不存在這兩個F(ab)，2片段的抑制效應(yīng)。
討論總而言之，這些結(jié)果表明除了 7G3中和IL-3Rci功能的能力之外，7G3的Fc結(jié)構(gòu)域 對于抑制AML細(xì)胞的歸巢和移入的能力也是重要的。沒有這個Fc結(jié)構(gòu)域，針對⑶123的抗 體在N0D/SCID小鼠中就顯著地喪失了它們抑制AML-LSC的歸巢、沉淀、以及再生的能力。實施例4已經(jīng)描述了用于增加抗體的效應(yīng)子功能活性的一些方法。這些方法可以包括抗體 的Fc區(qū)的氨基酸修飾以增強(qiáng)它與相關(guān)Fc受體的相互作用并且增加它促進(jìn)抗體依賴的細(xì)胞 介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)以及抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)的潛力34’35。還描 述了在寡聚糖共價結(jié)合到Fc區(qū)中的保守Asn297上的IgGl抗體上的修飾之后ADCC活性的 增強(qiáng)34。在進(jìn)一步的研究中36，Lecl3細(xì)胞中(變體的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系，它缺少將巖藻 糖加到其它的正常寡聚糖上的能力)人類IgGl抗體的表達(dá)導(dǎo)致了巖藻糖缺陷抗體，該抗體 具有高達(dá)50倍改進(jìn)的與人類Fc YRIIIA的結(jié)合以及改進(jìn)的ADCC活性。通過在某些糖苷酶抑制劑53的存在下培養(yǎng)表達(dá)抗體的細(xì)胞也說明了產(chǎn)生去巖藻 糖化抗體的可替代的方法。在本研究中，在kifimensine (—種有效的α -甘露糖苷酶I抑 制劑)的存在下培養(yǎng)表達(dá)感興趣的抗體的CHO細(xì)胞，其導(dǎo)致分泌不含有巖藻糖的寡聚甘露 糖類型聚糖的IgG。這些抗體展顯示出對FcR的增強(qiáng)的親和力以及增強(qiáng)的ADCC活性。在本實施例中描述了通過Fc工程化處理或去巖藻糖化而具有增強(qiáng)的ADCC活性的 CSL360變體的產(chǎn)生和測試。方法用于瞬時表達(dá)CSL360和Fc優(yōu)化的CSL360的哺乳動物表達(dá)載體的構(gòu)建使用NucleoSpin RNA II試劑盒(BD Bioscience)根據(jù)制造商的說明書從 總7G3. 1B8雜交瘤RNA中克隆鼠抗-⑶123抗體7G3的輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因。使用 SMART RACE擴(kuò)增試劑盒(Clontech)合成第一鏈cDNA，并且通過RACE-PCR使用校對DNA 聚合酶Plantinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增可變區(qū)。用于可變重區(qū)的引物是 UPM(Universal Primer Amiχ， DB Bioscience)和 MH2a(5’ AATAACCCTTGACCAGGCATCCTA3 ，)。類似地，使用UPM和MK (5，CTGAGGCACCTCCAGATGTTAACT3’ )擴(kuò)增可變輕區(qū)。使用標(biāo)準(zhǔn) 的分子生物學(xué)技術(shù)，將該重鏈可變區(qū)克隆到a)哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3. l(+)-hIgGl， 它基于pcDNA3. 1 (+)表達(dá)載體(Invitrogen)被修飾為包括人類IgGl恒定區(qū)，或b) pcDNA3. l(+)-hIgGlS239D/A3鳳/I332E，或 c)pcDNA3· l(+)-hIgGlS239D/I332E。b)和 c)中使用的載體 編碼摻入氨基酸突變的蛋白，這些氨基酸突變被報道導(dǎo)致具有顯著地增改進(jìn)的ADCC活性 的抗體35。使用QuikChange誘變技術(shù)(Stratagene)引入這些突變。將該輕鏈可變區(qū)克隆 到表達(dá)載體pcDNA3. l(+)-hK中，它基于pcDNA3. 1(+)表達(dá)載體被修飾為包括人類κ恒定 區(qū)。細(xì)胞培養(yǎng)FreeStyle 293-F細(xì)胞獲自Invitrogen。將細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充有青霉素/鏈霉素 / 兩性霉素 B i式齊[J (Invitrogen)的 FreeStyle Expression Medium (Invitrogen)中。在 轉(zhuǎn)染之前將細(xì)胞在37°C在8% CO2的大氣壓進(jìn)行培養(yǎng)。瞬時轉(zhuǎn)染使用293feCtin轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明書使用
31FreeStyleTM293-F細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染。將輕和重鏈表達(dá)載體組合，并且在 Freestyle 293-F細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染。細(xì)胞(1000ml)以最終濃度IxlO6個活細(xì)胞/mL進(jìn)行 轉(zhuǎn)染，在 Cellbag 2L (Wave Biotech/GE Healthcare)中在 37 °C 在 8 % CO2 的大氣壓在 2/10ffave Bioreactor 系統(tǒng) 2/10 或 20/50 (Wave Biotech/GE Healthcare)上孵育 5 天。轉(zhuǎn) 染后4小時加入Pluronic F-68 (Invitrogen)至終濃度0. 1% ν/ν。轉(zhuǎn)染后24小時向細(xì)胞 培養(yǎng)液補(bǔ)充胰蛋白胨NKOrganotechnie，F(xiàn)rance)至終濃度0.5% ν/ν。然后，在純化前通 過Millistak+POD過濾器(Millipore)過濾來收集細(xì)胞培養(yǎng)液的上清。Kifunensine 處理為了產(chǎn)生去巖藻糖化的抗體，按照描述53，將提及的 kifunensine (TorontoResearch Chemicals)加到瞬時轉(zhuǎn)染的 FreeStyle 293-F 細(xì)胞(轉(zhuǎn) 染后24小時)的培養(yǎng)基中至如終濃度0. 5 μ g/mL。蛋白表達(dá)的分析5天后，將20 μ 1的培養(yǎng)液上清在4-20% Tris-Glycine SDS聚丙烯酰胺凝膠上電 泳，并且通過用考馬斯蘭試劑染色而顯示抗體?？贵w純化除了實施例2中所描述的嵌合體CSL360，在本實施例中還描述了 CSL360的人源化 變體(hCSL360)的用途。通過標(biāo)準(zhǔn)的⑶R移入技術(shù)制備該抗體，其中來自7G3的鼠⑶R區(qū) 被移入到適宜的人類可變結(jié)構(gòu)區(qū)上54。得到的人源化抗體含有完整的人類框架序列。作為 人源化處理的結(jié)果，MAb對⑶123的親和力被適度地減小(表示為對于CSL360和hCSL360 的KD分別是1. 06nM和12. 8nM)。然而，結(jié)合特異性保持不變，并且hCSL360保留了有效的 ⑶113中和活性，正如通過IL-3-依賴的TF-I細(xì)胞增殖測試所測量(表示為對于CSL360 和hCSL360的IC5tl分別是5nM和19nM)。使用標(biāo)準(zhǔn)的基于核糖體展示的誘變55進(jìn)行親和力 優(yōu)化，以便將hCSL360的親和力恢復(fù)到至少等效于親本小鼠Mab的7G3以及嵌合體CSL360 的水平。產(chǎn)生了親和力優(yōu)化的MAb克隆(168-26)，它展顯示與⑶123可比的親和力以及 ⑶123對親本Mab的中和的活性(表示為對于與⑶123的結(jié)合KD為0. 6nM，并且IL-3中和 IC50為6nM)。還產(chǎn)生了該克隆的Fc工程化處理衍生物，這些衍生物含有具有三個氨基酸 取代 S239D/A330L/I332E (168_26Fc3)或具有兩個氨基酸取代 S239D/I332E (168_26Fc2)的 IgGlFc區(qū)，如以上針對hCSL360所說明。未修飾的嵌合CSL360、人源化變體(hCSL360)以及ADCC優(yōu)化的和人源化的 CSL360s239d/i332e (hCSL360Fc2)以及 CSL360S239D/A330L/I332E (hCSL360Fc3)以及從 kifunensine 處 理的細(xì)胞所衍生的物質(zhì)是在4°C使用蛋白A進(jìn)行親和層析(其中將MabSelect樹脂(5ml， GE Healthcare, UK)填充到 30mL Poly-Prep 空柱(Bio-Rad，CA)中)進(jìn)行純化。首先將 樹脂用10個柱體積的無熱源的GIBCO蒸餾水(Invitrogen，CA)進(jìn)行洗滌以去除儲存的乙 醇，并接著用5個柱體積的無熱源的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) (GIBC0 PBS, Invitrogen, CA)進(jìn) 行平衡。然后，將經(jīng)過濾的條件細(xì)胞培養(yǎng)基(IL)通過重力自流進(jìn)料(gravity feed)上樣 到該樹脂上。然后，用5個柱體積的無熱源PBS對樹脂進(jìn)行洗滌以去除非特異性蛋白。結(jié) 合的抗體用2個柱體積的0. IM甘氨酸pH 2. 8 (Sigma, M0)洗脫到餾分中，該餾分含有0. 2 個柱體積的2M Tris-HCl pH 8. O (Sigma, M0)以中和低pH。洗脫的抗體在4°C在12ml的 Slide-A-Lyzer盒(攔截分子量為3. 5kD) (Pierce, IL)中以5L PBS透析18小時。通過使用Ultraspec 3000 (GE Healthcare, UK)分光光度計在280nm處測量吸光度來測量抗體濃 度。通過SDS-PAGE來分析抗體的純度，其中將處于還原性樣品緩沖液(Invitrogen，CA) 中的 2μ g 蛋白上樣到 Novex 10-20% Tris Glycine Gel (Invitrogen,CA)上，并且在含有 Tris Glycine SDS 電泳緩沖液的 XCell SureLock Mini-Cell (Invitrogen, CA)中使用恒 壓150V持續(xù)90分鐘，之后用考馬斯蘭染色進(jìn)行顯像，這些是按照制造商的說明書進(jìn)行的。
結(jié)果 野生型CSL360和Fc工程化處理的CSL360變體的ADCC測試為了測試不同的變體抗體的效應(yīng)子活性，使用表達(dá)CD123的CTLEN細(xì)胞系作為靶 細(xì)胞系，并且如實施例2中所概括在正常的PBMC作為效應(yīng)子細(xì)胞來源的情況下使用鈣黃綠 素AM釋放檢驗來評價ADCC活性。圖12顯示了嵌合體CSL360與人源化變體(hCSL360)抗 體、以及經(jīng)Fc修飾的變體hCSL360Fc2以及hCSL360Fc3在它們誘導(dǎo)ADCC指導(dǎo)的CTLEN靶 細(xì)胞系的裂解的能力方面的比較。這些數(shù)據(jù)表明嵌合體CSL360以及具有未修飾的Fc結(jié)構(gòu) 域的人源化變體具有可檢測的、但卻適度的誘導(dǎo)針對CTLEN細(xì)胞系(5-10%的靶細(xì)胞裂解) 的ADCC的能力，并且與在實施例2中所概括的發(fā)現(xiàn)相一致。兩個具有經(jīng)修飾的Fc結(jié)構(gòu)域 的變體(hCSL360Fc2和hCSL360Fc3)證實了顯著地增強(qiáng)引起ADCC指導(dǎo)的CTLEN靶細(xì)胞裂 解的能力，其中當(dāng)用與Fc未修飾抗體相同的濃度測試時觀察到50-60%靶細(xì)胞裂解。測試CSL360、Fc_工程化處理的CSL360變體以及去巖藻糖化的CSL360對Fc受體 的結(jié)合如已提及，通過結(jié)合到先天免疫系統(tǒng)的不同效應(yīng)子細(xì)胞上表達(dá)的Fc Y受體 (FcyR)介導(dǎo)了抗體Fc效應(yīng)子作用37。為了增強(qiáng)對Fc γ R的結(jié)合而進(jìn)行的抗體優(yōu)化導(dǎo)致更 大的效應(yīng)子細(xì)胞激活以及對抗體包被的腫瘤細(xì)胞的更大的殺傷。用BIAcore AlOO生物傳感器測量了不同的人類Fc γ R對于hCSL360、Fc工程化處 理的變體hCSL360Fc2和hCSL360Fc3、以及通過kifunensine處理所產(chǎn)生的去巖藻糖化的 hCSL360(hCSL360kif)的相對親和力。在與CD123偶聯(lián)的CM5BIAcore芯片上逐個捕獲不 同抗體?？扇艿?？(；丫1 011^(；丫1 1、111^(；丫1 11匕/(；禾口111^(；丫1 111&(獲自1 &0 Systems))以 0. 3nM-800nM的濃度范圍流過對應(yīng)的表面，通過將數(shù)據(jù)擬合為動力學(xué)和/或穩(wěn)定狀態(tài)的模 型來確定親和力測量值。圖 13A 比較了 hCSL360Fc2、hCSL360Fc3 和 hCSL360kif 相對于 hCSL360 的與 huFcYRI、huFcYRIIb/c和huFcYRIIIa相結(jié)合的親和力(KA)。這些結(jié)果廣泛地類似于 hCSL360Fc2 和 hCSL360Fc3，其中相對于 hCSL360 與 huFc y RI 和 huFc y RIIb/c 的結(jié)合 KA 具有大約15-35倍的增加。對于huFcYRIIIa，看到了結(jié)合最顯著的增加，其中親和力增加 了 100倍。盡管hCSL360kif親和力在倍數(shù)上的絕對增加低于Fc工程化處理的變體，使 用huFc YRIIIa再次觀察到一種類似的模式，展示了與huFc y RI (0. 75倍)和huFc y RIIb/ c (2. 6倍)相比的最大倍數(shù)增加( 5倍)。近來的研究已經(jīng)顯示不是絕對親和力，而是IgG親和力中高激活/抑制(Α/Ι) (FcyRIII huFcyRIIb)的比例對于最大化的抗體介導(dǎo)的效應(yīng)物活性是重要的56。圖13B 顯示了表達(dá)為對于Fc γ RIII huFcYRII的hCSL360變體親和力比例的數(shù)據(jù)。所有變體 證明相對于hCSL360A/I比例均增加，hCSL360kif、hCSL360Fc2和hCSL360Fc3分別具有 2倍、 4倍以及 3倍的A/I比例增加。
這些數(shù)據(jù)證實，正如所預(yù)期的，不同的hCSL360Fc增強(qiáng)的變體對于Fc γ R顯示出增 加的親和力，其中對于激活對比抑制Fc γ R具有更大的效果。討論本文中顯示了 Fc工程化處理的以及去巖藻糖化的CSL360變體證明顯著地增加針 對FcR γ的親和力和A/I結(jié)合比率，以及改進(jìn)的體外ADCC效應(yīng)物活性。該結(jié)果與在實施例 1和3中所提供的數(shù)據(jù)一起證明了效應(yīng)子功能活性在AML的小鼠模型中對于抗CD123抗體 的治療效果的重要作用，有力地提示效應(yīng)子功能增強(qiáng)的變體抗-CD123抗體治療很可能會 證明用于在人類患者中治療AML和其它CD123-陽性白血病的改進(jìn)的治療活性。實施例5在本實施例中，測試不同的Fc增強(qiáng)的抗體針對經(jīng)工程化處理以表達(dá)⑶123的細(xì)胞 系、連同表達(dá)天然⑶123的的人類白血病細(xì)胞系的增強(qiáng)的ADCC活性。還使用體外ADCC測 試Fc增強(qiáng)的MAb來對抗一系列來自AML和ALL患者的初級白血病樣品。方法使用乳酸脫氫酶釋放檢驗測量ADCC使用乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢驗來測量ADCC，如所說明35。LDH是穩(wěn)定的胞質(zhì)酶， 一旦細(xì)胞裂解就將其釋放出。使用比色檢驗法測定釋放到培養(yǎng)基中的LDH，其中LDH將特 異性底物轉(zhuǎn)化成紅顏色的產(chǎn)物。裂解被測量為釋放的LDH，并且直接與形成的顏色成比例。 將表達(dá)CD123的靶細(xì)胞與不同數(shù)量的抗CD123抗體在用作針對ADCC的效應(yīng)子細(xì)胞的NK細(xì) 胞的存在下進(jìn)行孵育。使用MiltenyiBiotec，s NK分離試劑盒(Cat#130_092_657)從正常 的棕黃包塊中純化NK細(xì)胞。細(xì)胞在37°C在5% CO2的存在下孵育4小時。使用無抗體或 NK細(xì)胞的靶細(xì)胞作為自發(fā)的LDH釋放(背景)對照物，并且使用經(jīng)裂解緩沖液裂解的靶細(xì) 胞作為最大裂解對照物。根據(jù)制造商的說明書(Cat#G1780)使用Promega's CytoTox 96 非放射性細(xì)胞毒性測定試劑盒測量釋放進(jìn)入到培養(yǎng)基中的LDH。所有其它方法見以上的實施例的描述。結(jié)果圖14檢查了不同的CSL360衍生抗體對于針對經(jīng)工程化處理以表達(dá)⑶123的人類 成淋巴細(xì)胞樣Raji細(xì)胞的ADCC活性的效應(yīng)。表達(dá)低水平⑶123 (大約4，800個受體/細(xì) 胞)(Raji-⑶123低)(圖14a和b)的穩(wěn)定克隆或表達(dá)高水平CD123 (大約24，400受體/ 細(xì)胞)(Raji-⑶123高)(圖14c和d)的獨(dú)立克隆用于這些實驗中。使用25 1和50 1 的效應(yīng)物對靶細(xì)胞的比例。一致地，hCSL360Fc3和CSL360kif證明了與親本hCSL360抗 體相比顯著增強(qiáng)的針對Raji-⑶123低和Raji-⑶123高的ADCC活性。在50 1的E T 比例，hCSL360Fc3和hCSL360kif都實現(xiàn)了以低濃度( Ing/mL)的抗體幾乎完全裂解 Raji-⑶123高靶細(xì)胞。在Raji-⑶123低細(xì)胞中達(dá)到相同的效果大約需要超過一個數(shù)量級 幅度的抗體。有趣的是，嵌合體CSL360誘導(dǎo)的ADCC稍微強(qiáng)于hCSL360 (盡管在比Fc增強(qiáng) 的變體更低的水平)。這可能是由于與嵌合MAb相比，對于人源化變體與CD123結(jié)合的親和 性大約減少10倍，如之前所討論的人源化處理產(chǎn)生的結(jié)果。圖15a顯示了上述實驗的重復(fù)，使用了 TF-I人白血病細(xì)胞，該細(xì)胞自然地表達(dá) ⑶123以作為靶細(xì)胞。與Fc未優(yōu)化的hCSL360相比，hCSL360Fc3變體再一次地顯示了具有 hCSL360Fc2和hCSL360kif的顯著改進(jìn)的ADCC(盡管有效性欠佳)，還證明了增加的活性。
圖15b比較了 TF-I細(xì)胞中人源化的以及親和力優(yōu)化的抗-⑶123抗體變體168-26 與它的Fc增強(qiáng)的衍生物168-26Fc3和168_26Fc2的活性。圖中的數(shù)據(jù)證明Fc工程化改進(jìn) 的人源化的和親和力優(yōu)化的168-26變體的ADCC活性，它類似于只用人源化變體(hCSL360) 所看到的。然后，將不同的Fc增強(qiáng)的hCSL360變體的活性與來自5個AML患者(圖16a_e) 和2個ALL患者(圖16f-g)的一列初級白血病細(xì)胞樣品進(jìn)行比較。在這些初級患者樣 品中結(jié)果類似于使用具有針對ADCC活性效力的以下數(shù)量級排列的細(xì)胞系獲得的那些 hCSL360Fc3 彡 168_26Fc3 > hCSL360Fc2 彡 hCSL360kif > > CSL360 彡 168-26 彡 hCSL360。 重要地，F(xiàn)c優(yōu)化變體在測試的所有初級患者樣品中始終誘導(dǎo)ADCC。所有5個AML和2個 ALL樣品證明通過Fc優(yōu)化變體ADCC顯著更高的水平，而對于無Fc優(yōu)化的變體AML樣品中 只有3個證明了微弱的應(yīng)答。兩個ALL都證實對于無Fc優(yōu)化的變體MAbs沒有任何顯著的 ADCC應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)與實施例2中描述的結(jié)果一致，其中CSL360治療在6個AML樣品中的4 個和2個ALL樣品中的0個誘導(dǎo)了適度的ADCC活性(通過不同的ADCC方法評估)。討論實施例5中的數(shù)據(jù)證明CD123MAb的Fc優(yōu)化導(dǎo)致針對體外檢驗中測試的所有初級 白血病樣品的顯著效應(yīng)子作用應(yīng)答，并且與Fc未優(yōu)化的抗-⑶123Mab相比表現(xiàn)為顯著改進(jìn)。具有表達(dá)⑶123的ALL腫瘤的這些發(fā)現(xiàn)與以下觀點一致，即除了 AML之外其它表 達(dá)⑶123的惡性腫瘤也可能對于具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的抗⑶123MAb治療敏感57—61。實施例6實施例4和5中描述的結(jié)果表明具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的CSL360變體顯示了 體外的針對一系列經(jīng)工程化處理以表達(dá)⑶123的細(xì)胞系和自然表達(dá)⑶123的人白血病細(xì)胞 系的增加的ADCC活性，并且重要的是同樣在體外測定(使用從患有AML或ALL的患者中得 到的初級白血病樣品)中的增加的ADCC活性。針對AML和ALL患者初級樣品的體外ADCC 數(shù)據(jù)是特別重要的，因為以這種體外設(shè)置進(jìn)行測試允許在人類疾病的條件下對療效的潛力 進(jìn)行估計。在這個實施例中，這些實驗被延伸到測試CSL360的工程化處理的Fc變體 (168-26Fc3)在人類ALL的N0D/SCID小鼠異種移植模型中的治療效果。這是一種臨床前 模型，它已被證明精確地反應(yīng)ALL臨床疾病并且與患者的結(jié)果顯著相關(guān)62。該模型的臨 ^ffi^ti Β ^^τΛ^ , ^ National Cancer Instituteinitiative :the Pediatric Preclinical Testing Program63 的完整的部分。方法從小兒ALL患者中衍生的人ALL白血病細(xì)胞(ALL-2)通過如前所述62在雌性非肥 胖糖尿病(NOD)/scid-/-小鼠中通過靜脈內(nèi)接種進(jìn)行增殖。從使用常見的CDlO+B細(xì)胞前體 ALL所診斷的65月齡的雌性鼠的第三次復(fù)發(fā)中得到該異種移入物。該患者從那以后死于她 的疾病并且該異種移植對于常規(guī)的化療具有抗性62。將小鼠隨機(jī)分成每組6-7只小鼠的處 理組和對照組，從而在治療開始時在所有的組中給出大約相等的中位值的白血病負(fù)荷。將 所有小鼠維持在阻隔條件下，并且使用經(jīng)新南威爾士大學(xué)的委員會和動物管理和倫理委員會批準(zhǔn)的程序和條件進(jìn)行實驗。如前所述62測定人類CD45-陽性(hCD45+)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。確切的log排列檢測(使用GraphPad Prism 4. Oa進(jìn)行)用于比較處理組和對照 組之間的無事件存活率分布。P值是兩側(cè)的并且不針對多個比較進(jìn)行調(diào)整，從而給出本研究 的探測性本質(zhì)。移植后34天開始處理，小鼠接受300 μ g/100 μ L的溶于磷酸鹽緩沖鹽水中的抗體 的處理。通過腹腔內(nèi)注射給予抗體，每周3次(每2-3天一次)。通過小鼠每周尾靜脈采血 來監(jiān)測白血病負(fù)荷。繼續(xù)治療直到事件達(dá)成并且定義為在外周血中25% h⑶45+負(fù)荷。結(jié)果圖17檢查了不同的抗體(包括不相關(guān)的MAb對照(鼠IgG2a)、鼠MAb 7G3、人源 化的和親和性優(yōu)化的變體168-26以及后者的Fc工程化處理變體168-26Fc3)對于ALL移 入的小鼠的效應(yīng)。附圖描述了對于每個處理組無事件生存期(EFS)的卡普蘭-邁耶曲線， 其中每條垂直線表示一個事件。以對照MAb治療的小鼠具有53. 5天的中位值
下對于7G3、168-26和168_26Fc3分別是56. 3,59. 9和65. 7天。結(jié)果表明7G3和168-26 盡管分別地將白血病的生長延遲了 2. 9和6. 4天，但與對照MAb相比沒有統(tǒng)計上的顯著效 果(P > 0. 05)。168-26Fc3在ALL的生長上具有最顯著地效果，與對照治療的動物相比具 有統(tǒng)計顯著延遲的12. 2天的白血病生長(P = 0. 044)。重要地，F(xiàn)c工程化變體168_26Fc3 對比168-26 (無Fc修飾的同樣的MAb)增加的EFS效果是統(tǒng)計顯著的(P = O. 037)，其中白 血病生長延遲5. 9天。這證明具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的抗⑶123抗體在體內(nèi)具有增強(qiáng) 的治療效果。結(jié)論這些數(shù)據(jù)顯著地擴(kuò)展了前面實施例中提出的那些數(shù)據(jù)，因為它們證明具有增強(qiáng)的 Fc效應(yīng)子功能的抗CD123MAb在患有預(yù)先確定的白血病的小鼠中比Fc未修飾的MAbs具有 增強(qiáng)的治療效果。重要地，使用了臨床證實的ALL模型，該模型已被證實可預(yù)測人類疾病過 程62，這有力地支持了這樣的Fc優(yōu)化的抗CD123MAb在白血病患者中也可以具有增強(qiáng)的臨 床療效。參考文獻(xiàn)1. Wang, J. C. &Dick, J.Ε. Cancer stem cells :lessons from leukemia. Trends CellBiol(2005).2. Bonnet, D. &Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as ahierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med,3, 730-737(1997).3. Hope, K. J. , Jin, L. &Dick, J. E. Acute myeloid leukemia originates from ahierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity. Nat Immunol. 5，738-743(2004).4.Lapidot, Τ. , et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia aftertransplantation into SCID mice. Nature 367,645-648(1994).5. Guan, Y.&Hogge, D. E. Proliferative status of primitive hematopoieticprogenitors from patients with acute myelogenous leukemia (AML). Leukemia 14,2135-2141(2000).
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權(quán)利要求
一種用于抑制表達(dá)IL 3Rα(CD123)的白血病干細(xì)胞的方法，該方法包括將所述細(xì)胞與抗原結(jié)合分子相接觸，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL 3Rα(CD123)上。
2.一種治療患者中的血液癌癥病癥的方法，該方法包括對該患者給予有效量的抗原結(jié) 合分子，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所 述抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Rci (⑶123)上。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中患者是人。
4.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中抗原結(jié)合分子是包含F(xiàn)c區(qū)的單克隆抗 體或抗體片段。
5.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中抗原結(jié)合分子是包含經(jīng)修飾的具有增 強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)的單克隆抗體或抗體片段。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中抗體或抗體片段的Fc區(qū)中的修飾包括在Fc區(qū)中取 代至少一個氨基酸、優(yōu)選2或3個氨基酸，以增強(qiáng)Fc區(qū)與相關(guān)的Fc受體和補(bǔ)體的相互作用。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中包括經(jīng)修飾的Fc區(qū)的抗體或抗體片段是去巖藻糖化 的抗體或抗體片段。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中抗體或抗體片段的Fc區(qū)中的修飾包括結(jié)合在Fc區(qū) 中的保守Asn297上的寡糖的修飾。
9.如權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的方法，其中抗原結(jié)合分子是嵌合的、人源化的或人 類的單克隆抗體或抗體片段。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中抗原結(jié)合分子是嵌合抗體或抗體片段，該嵌合抗體 或抗體片段包括接到人類恒定區(qū)上的小鼠抗-CD123單克隆抗體的輕可變區(qū)和重可變區(qū)。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中抗原結(jié)合分子是一種人源化的抗體或抗體片段，該 人源化的抗體或抗體片段包括接到人類構(gòu)架區(qū)上的小鼠抗CD-123單克隆抗體的互補(bǔ)決定 區(qū)(CDR)。
12.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述血液癌癥病癥是白血病或惡性淋巴增生性紊亂。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述白血病選自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性 白血病、急性淋巴樣白血病、慢性淋巴樣白血病或骨髓增生異常綜合癥。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述惡性淋巴增生性紊亂是淋巴瘤。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述淋巴瘤選自多發(fā)性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴 瘤、伯基特淋巴瘤、或小細(xì)胞和大細(xì)胞濾泡淋巴瘤。
16.如權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括對所述患者給予化學(xué)治療劑。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中給予化學(xué)治療劑是在給予抗原結(jié)合分子之前、同 時、或之后。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述化學(xué)治療劑是細(xì)胞毒劑，該細(xì)胞毒劑選自(a)芥子氣衍生物氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、以及異環(huán)磷酰胺(b)乙撐亞胺噻替派以及六甲三聚氰胺(c)烷基磺酸鹽白消安(d)胼類以及三嗪六甲蜜胺、丙卡巴胼、達(dá)卡巴嗪以及替莫唑胺(e)亞硝基脲卡莫司汀、洛莫司汀以及鏈佐星(f)金屬鹽卡鉬、順鉬以及奧沙利鉬(g)長春花生物堿長春新堿、長春堿以及長春瑞賓(h)紫杉烷紫杉醇以及多西他賽(i)鬼臼毒素依托泊苷以及替尼泊苷(j)喜樹堿類似物伊立替康以及托泊替康(k)蒽環(huán)阿霉素、柔紅霉素、表柔比星、米托蒽醌以及伊達(dá)比星(1)色霉素更生霉素以及普卡霉素(m)其它的抗腫瘤抗生素絲裂霉素以及博來霉素(n)葉酸拮抗劑甲氨蝶呤(o)嘧啶拮抗劑5_氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他濱、以及吉西他濱(P)嘌呤拮抗劑6_巰基嘌呤以及6-硫鳥嘌呤(q)腺苷脫氨酶抑制劑克拉屈濱、氟達(dá)拉濱、奈拉濱以及噴司他丁(r)拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑伊立替康以及托泊替康(s)拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷以及替尼泊苷(t)核糖核苷酸還原酶抑制劑羥基脲(u)腎上腺皮質(zhì)類固醇抑制劑米托坦(v)酶天門冬酰胺酶以及培門冬酶(w)抗微管劑雌莫司汀(x)類視黃醇貝沙羅汀、異維甲酸以及維甲酸(ATRA)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)胞毒劑是阿糖胞苷。
20.抗原結(jié)合分子在抑制表達(dá)IL-3Rci(⑶123)的白血病干細(xì)胞中的用途或在制備用 于抑制表達(dá)IL-3Rci (⑶123)的白血病干細(xì)胞的藥物中的用途，所述抗原結(jié)合分子包括Fc 區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性結(jié)合到 IL-3Ra (CD123)上。
21.抗原結(jié)合分子在治療患者中的血液癌癥病癥或在制備用于治療患者中的血液癌癥 病癥的藥物中的用途，所述抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能 的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性結(jié)合到IL-3Ra (⑶123)上。
22.用于抑制表達(dá)IL-3Rci(⑶123)的白血病干細(xì)胞的試劑，該試劑包括抗原結(jié)合分 子，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述抗 原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Rci (⑶123)上。
23.用于治療患者中的血液癌癥病癥的試劑，該試劑包括抗原結(jié)合分子，該抗原結(jié)合分 子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中所述抗原結(jié)合分子選擇性 地結(jié)合到IL_3Ra (CD123)上。
全文摘要
一種用于對表達(dá)IL-3Rα(CD123)的白血病干細(xì)胞進(jìn)行抑制的方法，包括將這些細(xì)胞與抗原結(jié)合分子相接觸，該抗原結(jié)合分子包括Fc區(qū)或經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的Fc效應(yīng)子功能的Fc區(qū)，其中該抗原結(jié)合分子選擇性地結(jié)合到IL-3Rα(CD123)上。本發(fā)明包括通過對患者給予有效量的該抗原結(jié)合分子而治療該患者中的血液癌癥病癥。
文檔編號C07K16/30GK101896200SQ200880119712
公開日2010年11月24日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月6日
發(fā)明者D·P·吉爾英, G·L·瓦伊羅, J·E·迪克, L·秦, S·J·布斯費(fèi)德 申請人:Csl有限公司;大學(xué)健康網(wǎng)