專利名稱：二價(jià)雙特異性抗體的制作方法
二價(jià)雙特異性抗體本發(fā)明涉及新型的二價(jià)雙特異性抗體，其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
改造的蛋白，諸如能夠結(jié)合兩種以上抗原的雙特異性或多特異性抗體是本領(lǐng)域中 已知的。這樣的多特異性結(jié)合蛋白可以利用細(xì)胞融合、化學(xué)綴合、或重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。最近已經(jīng)開發(fā)了廣泛多樣的重組雙特異性抗體形式，例如通過(guò)融合例如IgG抗體 形式和單鏈結(jié)構(gòu)域的四價(jià)雙特異性抗體(參見(jiàn)例如Morrison，S. L.等，Nature Biotech. (自然生物技術(shù))15(1997) 159-163 ；WO 2001077342 ；和Coloma，M. J. ,Nature Biotech.(自 然生物技術(shù))25 (2007) 1233-1234)。此外，開發(fā)了能夠結(jié)合兩種以上抗原的若干其他新型形式，其中抗體核心結(jié) 構(gòu)(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)不再保持諸如雙抗體、三鏈抗體或四鏈抗體，微型抗體 (minibodies)，若干單鏈形式(scFv，雙-scFv) (HoiIiger P,等，Nature Biotech(自 然生物技術(shù))23 (2005) 1126-1136 2005 ；Fischer N.，和 Leger, 0.，Pathobiology (病 理學(xué))74 (2007)3-14 ;Shen J，等，Journal of Immunological Methods (免疫學(xué)方法雜 志)318 (2007) 65-74 ；Wu, C.等，Nature Biotech (自然生物技術(shù))25 (2007) 1290-1297)。所有這樣的形式使用連接體將抗體核心(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)與其他 結(jié)合蛋白(例如scFv)融合或融合例如兩個(gè)Fab片段或scFv(Fischer N. , Leger 0.， Pathobiology (病理學(xué))74 (2007) 3-14)。雖然連接體具有改造雙特異性抗體的優(yōu)勢(shì)是明顯 的，但是它們也可能引起治療設(shè)置中的問(wèn)題。實(shí)際上，這些外源肽可能引起針對(duì)連接體本身 或蛋白質(zhì)和連接體之間連接的免疫應(yīng)答。此外，這些肽的靈活的性質(zhì)使得它們更加傾向于 蛋白水解分裂，這潛在地導(dǎo)致抗體穩(wěn)定性差、聚集和增高的免疫原性。另外，人們可能希望 保持效應(yīng)子功能，諸如例如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，它 們通過(guò)保持與天然存在的抗體的高度相似性而通過(guò)Fc部分來(lái)介導(dǎo)。因此，理想地，人們的目標(biāo)應(yīng)該是開發(fā)通用結(jié)構(gòu)與天然存在的抗體(如IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)非常類似的雙特異性抗體，其與人序列具有最小的偏差。在一種方法中，利用細(xì)胞雜交瘤(quadroma)技術(shù)(見(jiàn)Milstein，C.和 A. C. Cuello, Nature (自然)，305 (1983) 537-40)生成了與天然抗體非常類似的雙特異性 抗體，所述細(xì)胞雜交瘤技術(shù)基于表達(dá)具有所需的雙特異性抗體特異性的鼠單克隆抗體的兩 種不同雜交瘤細(xì)胞系的體細(xì)胞融合。因?yàn)樵诋a(chǎn)生的雜交-雜交瘤(或細(xì)胞雜交瘤)細(xì)胞 系中的兩個(gè)不同抗體重鏈和輕鏈的隨機(jī)配對(duì)，因而生成至多10種不同的抗體種類，其中 只有一種是所需的功能性雙特異性抗體。由于存在錯(cuò)配副產(chǎn)物和顯著降低的產(chǎn)率，其意 味著需要技術(shù)先進(jìn)的純化程序(參見(jiàn)例如Morrison，S. L.，Nature Biotech(自然生物技 術(shù))25 (2007) 1233-1234)。一般地，如果使用重組表達(dá)技術(shù)，則相同的錯(cuò)配副產(chǎn)物問(wèn)題仍存 在。用于避開錯(cuò)配副產(chǎn)物問(wèn)題的方法，稱為“杵-進(jìn)入-臼(knobs-into-holes) ”的目 的在于通過(guò)將突變引入CH3結(jié)構(gòu)域來(lái)改變接觸界面，從而迫使兩個(gè)不同抗體重鏈配對(duì)。在 一條鏈上，大體積氨基酸被具有短側(cè)鏈的氨基酸替換，以形成“白(hole)”。相反地，將具有大側(cè)鏈的氨基酸引入到另一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中，以形成“杵(knob)”。通過(guò)共表達(dá)這兩條重鏈 (和兩條相同的輕鏈，其必須適合于這兩條重鏈)，觀察到與同型二聚體形式(‘臼-臼’或 ‘杵-杵’)相比，異型二聚體形式(‘杵-臼’)的高產(chǎn)率(Ridgway,JB,Presta,LG,Carter, P和WO 1996027011)。異型二聚體的百分比可以通過(guò)利用噬菌體展示法重建兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu) 域的相互作用表面和引入二硫鍵來(lái)穩(wěn)定該異型二聚體而得到進(jìn)一步增加(Merchant A.M.， 等，Nature Biotech (自然生物技術(shù))I6 (I"8) 677_681 ；Atwe 11 S，Ridgway JB, Wells JA, Carter P.，J Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)270 (1997) 26-35)。關(guān)于杵-進(jìn)入-臼技術(shù)的 新方法記述在例如EP 1870459A1中。盡管這種形式似乎非常吸引人，但是目前不存在記載 針對(duì)臨床的進(jìn)展的數(shù)據(jù)。這種策略的一個(gè)重要制約是兩個(gè)母體抗體的輕鏈必須相同，以防 止錯(cuò)配和形成無(wú)活性的分子。因此，該技術(shù)不適合于容易地從針對(duì)第一和第二抗原的兩種 抗體開始開發(fā)針對(duì)兩種抗原的重組、二價(jià)雙特異性抗體，因?yàn)檫@些抗體的重鏈和/或相同 的輕鏈必須被優(yōu)化。Xie, Z.等，J Immunol Methods (免疫學(xué)方法雜志)286 (2005) 95-101 提到一種新 型的雙特異性抗體，其使用scFv并結(jié)合以針對(duì)FC部分的杵-進(jìn)入-臼技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及二價(jià)雙特異性抗體，其包括a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換。本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案是用于一種制備根據(jù)本發(fā)明所述的二價(jià)雙特異性抗 體的方法，其包括下列步驟a)用以下各項(xiàng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可 變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換；b)在容許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案是一種宿主細(xì)胞，其包括-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可 變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換。本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案是一種根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的組合物，優(yōu)選藥物或 診斷組合物。本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案是一種藥物組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明所述的抗體和 至少一種藥用賦形劑。本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案是一種用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于 向所述患者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的抗體。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及二價(jià)雙特異性抗體，其包括a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和
b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換。因此，所述二價(jià)雙特異性抗體包括a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的第二輕鏈和第二重鏈，其中第二輕鏈和第二重鏈 的可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換。因此，對(duì)于所述特異性結(jié)合第二抗原的抗體，以下各項(xiàng)適用在輕鏈中可變輕鏈結(jié)構(gòu)域VL被所述抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域VH替換；且在重鏈中可變重鏈結(jié)構(gòu)域VH被所述抗體的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域VL替換。術(shù)語(yǔ)“抗體”用于本文中時(shí)，指完整的單克隆抗體。所述完整抗體由兩對(duì)“輕 鏈”(LC)和“重鏈”(HC)(所述輕鏈(LC)/重鏈對(duì)在本文中縮寫為L(zhǎng)C/HC)組成。所述抗體的輕 鏈和重鏈?zhǔn)怯扇舾山Y(jié)構(gòu)域組成的多肽。在完整抗體中，每條重鏈包括重鏈可變區(qū)(本文中 縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3(抗體類 型IgA，IgD,和IgG)和任選地，重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH4 (抗體類型IgE和IgM)。每條輕鏈包括輕 鏈可變結(jié)構(gòu)域VL和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域CL。一種天然存在的完整抗體，即IgG抗體的結(jié)構(gòu)顯示 在例如圖1中。可變結(jié)構(gòu)域VH和VL可以進(jìn)一步再細(xì)分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)， 它們之間分布有更加保守的區(qū)域，稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組 成，以下列順序從氨基端向羧基端排列FR1，CDRl，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4( (Janeway CA, Jr 等，(2001) Immunobiology (免疫生物學(xué))，第 5 版，加蘭出版社(Garland Publishing)； 和Woof J，Burton DNat Rev Immunol (自然免疫學(xué)綜述)4 (2004) 89-99)。兩對(duì)重鏈和輕鏈 (HC/LC)能夠特異性結(jié)合相同抗原。因此所述完整抗體是二價(jià)、單特異性抗體。所述“抗體” 包括例如小鼠抗體、人抗體、嵌合抗體、人源化抗體和遺傳改造的抗體(變異或突變抗體)， 條件是保留它們的特有特性。特別優(yōu)選人或人源化抗體，尤其作為重組的人抗體或人源化 抗體。存在5種由希臘字母表示的哺乳動(dòng)物抗體重鏈類型α，δ , ε , Υ，和 μ (Janeway CA，Jr 等，(2001) Immunobiology (免疫生物學(xué))，第 5 版，加蘭出版社(Garland Publishing))。存在的重鏈的類型定義抗體的類型；這些鏈分別存在于IgA，IgD, IgE, IgG, 和 IgM 抗體中(Rhoades RA, Pflanzer RG (2002) · Human Physiology (人體生理學(xué))，第 4 版，湯姆森知識(shí)(ThomsonLearning))。不同的重鏈在尺寸和組成上不同；α和γ含有約 450個(gè)氨基酸，而μ和ε具有約550個(gè)氨基酸。每條重鏈具有兩種區(qū)域，即恒定區(qū)和可變區(qū)。恒定區(qū)在相同同種型的所有抗體中 相同，但在不同同種型的抗體中不同。重鏈Y，α和δ具有由3個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CHI、CH2 和CH3(處于一排中)組成的恒定區(qū)和用于增加柔性的鉸鏈區(qū)(Woof J,Burton D Nat Rev Immunol (自然免疫學(xué)綜述)4 (2004) 89-99)；重鏈μ和ε具有由4個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CHl、CH2、 CH3 和 CH4 組成的恒定區(qū)(Janeway CA, Jr 等，(2001) Immunobiology (免疫生物學(xué))，第 5 版，加蘭出版社(Garland Publishing))。在由不同的B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體中重鏈的可變區(qū)不 同，但對(duì)由單個(gè)B細(xì)胞或B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的所有抗體都是相同的。每條重鏈的可變區(qū)長(zhǎng)約 110個(gè)氨基酸且由單一的抗體結(jié)構(gòu)域組成。
在哺乳動(dòng)物中，僅存在兩類輕鏈，其稱為λ和K。輕鏈具有兩種連續(xù)的結(jié)構(gòu)域1 個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CL和1個(gè)可變結(jié)構(gòu)域VL。輕鏈的近似長(zhǎng)度是211-217個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，輕 鏈?zhǔn)铅瘦p鏈，且恒定結(jié)構(gòu)域CL優(yōu)選來(lái)源于kappa(K)輕鏈(恒定結(jié)構(gòu)域Ck)。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時(shí)，指單一的氨基酸組合 物組成的抗體分子的制劑。根據(jù)本發(fā)明的“抗體”可以是任意類型(例如IgA，IgD, IgE, IgGjP IgM，優(yōu)選IgG 或IgE)，或亞型(例如IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgAl和IgA2，優(yōu)選IgGl)，其中根據(jù)本發(fā)明 的二價(jià)雙特異性抗體所源自的兩種抗體具有相同亞型(例如IgGl，IgG4等，優(yōu)選IgGl)的 Fc部分，優(yōu)選相同同種異型(例如高加索人)的Fc部分?！翱贵w的Fc部分”是熟練的技術(shù)人員公知的術(shù)語(yǔ)并基于抗體的木瓜蛋白酶裂解而 定義。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體包含F(xiàn)c部分，優(yōu)選源自人來(lái)源的Fc部分和優(yōu)選人恒定區(qū)的 全部其他部分?？贵w的Fc部分直接參與補(bǔ)體活化，Clq結(jié)合，C3活化和Fc受體結(jié)合。雖 然抗體對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的影響取決于某些條件，但是與Clq的結(jié)合由Fc部分中確定的結(jié)合位 點(diǎn)引起。所述結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的且記載在例如Lukas，T.J.，等，J. Immunol. (免疫學(xué)雜志)127(1981)2555-2560 ；Brunhouse, R.，禾口 Cebra，J. J.，Mol. Immunol. (分子免疫學(xué))16 (1979) 907-917 ；Burton, D. R.，等，Nature (自然)288 (1980) 338-344 ； Thommesen, J. E.，等，Mol. Immunol.(分子免疫學(xué))37 (2000) 995-1004 ；Idusogie, Ε. E.， 等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)164 (2000) 4178-4184 ；Hezareh, M.，等，J. Virol.(病毒學(xué)雜 志)75 (2001) 12161-12168 ；Morgan, A.，等·，Immunology (免疫學(xué))86 (1995) 319-324 ；和 EP 0 307 434 中。所述結(jié)合位點(diǎn)是例如 L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331 和 P329 (按照Kabat的EU目錄編號(hào)，見(jiàn)下)。亞型IgGl，IgG2和IgG3的抗體通常顯示補(bǔ)體活 化，Clq結(jié)合和C3活化，而IgG4不活化補(bǔ)體系統(tǒng)，不結(jié)合Clq且不活化C3。優(yōu)選地，F(xiàn)c部 分是人Fc部分。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指一種抗體，其包括來(lái)自一種來(lái)源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)， 以及源自不同來(lái)源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，其通常通過(guò)重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。優(yōu) 選包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優(yōu)選形式是這 樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)被從原始抗體的恒定區(qū)修飾或改變以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的特 性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合。也將這種“嵌合”抗體稱作“類別轉(zhuǎn) 換抗體”。嵌合抗體是包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的 DNA區(qū)段的被表達(dá)的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物。制備嵌合抗體的方法包括目前在本領(lǐng)域眾所 周知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。見(jiàn)，例如，Morrison，S. L.，等，Proc. Natl. Acad Sci. USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))81 (1984)6851-6855 ；美國(guó)專利號(hào)5，202，238和5，204，244。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指這樣的抗體，其中的構(gòu)架或“互補(bǔ)性決定區(qū)”(OTR)已 經(jīng)被修飾為包括與親本免疫球蛋白相比特異性不同的免疫球蛋白的CDR。在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中，將鼠CDR移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)以制備“人源化抗體”。見(jiàn)，例如， Riechmann, L.，等，Nature (自然)332 (1988) 323-327 ；禾口 Neuberger, M. S.，等，Nature (自 然)314 (1985) 268-270。特別優(yōu)選的CDRs對(duì)應(yīng)于識(shí)別以上指出的關(guān)于嵌合抗體的抗原的那 些代表性序列。本發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其它形式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)另 外地從原始抗體的恒定區(qū)被修飾或改變以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“人抗體”意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū) 和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel, J. G., Curr. Opin. in Chemical Biology (當(dāng)前化學(xué)生物學(xué)觀點(diǎn))5 (2001) 368-374)。人抗體還 可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在免疫時(shí)能夠在缺乏內(nèi)源免疫 球蛋白生成的條件下產(chǎn)生全部的或選擇的人抗體成員。在所述種系突變小鼠中人種系 免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移將導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體(見(jiàn)，例如Jakobovits，Α.， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, A.，等，Nature (自然)362 (1993) 255-258 ；Bruggemann, M.，等，Year Immunol.(免疫學(xué) 年報(bào))7 (1993) 33-40)。人抗體還可以在噬菌體展示文庫(kù)中產(chǎn)生(Hoogenboom, H. R.，和 Winter, G.，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)222(1991)581-597)。Cole等和Boerner等的技術(shù)也可以用于 制備人單克隆抗體(Cole 等，Monoclonal antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體 和癌癥治療)，Alan R. Liss，第 77 頁(yè)(1985)；和 Boerner，P.，等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜 志)147(1991)86-95)。如已經(jīng)對(duì)根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合和人源化抗體所提及地，術(shù)語(yǔ)“人 抗體”用于本文中時(shí)還包括這樣的抗體，其在恒定區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的 特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合，例如通過(guò)“類別轉(zhuǎn)換”即Fc部分的改變或突變 (例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突變。)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”意欲包括通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的 所有人抗體，諸如分離自宿主細(xì)胞，諸如NSO或CHO細(xì)胞的抗體或分離自人免疫球蛋白基因 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)的抗體，或利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。 這種重組人抗體具有處于重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。根據(jù)本發(fā)明所述的重組人抗體已經(jīng) 經(jīng)歷了體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列是這樣的序列，其盡 管源自并涉及人種系VH和VL序列，但在體內(nèi)可能天然不存在于所有人抗體種系組成成員 中。“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(VL)，重鏈的可變區(qū)(VH))用于本文中時(shí)，表示 直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈中的任一個(gè)。可變?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有 相同的通用結(jié)構(gòu)且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列普遍保守，其通過(guò) 3個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)性決定區(qū)，⑶Rs)相連接。構(gòu)架區(qū)采用β-折疊構(gòu)象且⑶R可以形 成連接折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過(guò)構(gòu)架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)并與來(lái)自另一條鏈 的CDR —起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的結(jié)合 特異性/親和性方面具有特別重要的作用，并因此提供本發(fā)明的另一個(gè)目的。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的 氨基酸殘基。高變區(qū)包括來(lái)自“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“⑶Rs”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR” 區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從 N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FRl，⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。各條鏈上的⑶R通過(guò)所述 構(gòu)架氨基酸分隔。特別地，重鏈的⑶R3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。按照Kabat E.A.等， Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫目的的蛋白質(zhì)序列)，第 5 版， Public Health Service (公眾健康服務(wù))，National Institutes of Health (全國(guó)衛(wèi)生研究所)，Bethesda, MD. (1991))的標(biāo)準(zhǔn)定義來(lái)確定CDR和FR區(qū)域。重鏈和輕鏈的“恒定結(jié)構(gòu)域”不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出多種效應(yīng) 子功能。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體或免疫球蛋白被分為以下類型術(shù)語(yǔ)“二價(jià)雙特異性抗體”用于本文中時(shí)，指如上所述的抗體，其中兩對(duì)重鏈和輕 鏈(HC/LC)中的每對(duì)特異性結(jié)合不同的抗原，即第一重鏈和第一輕鏈(源自針對(duì)第一抗原 的抗體)特異性共同結(jié)合第一抗原，且第二重鏈和第二輕鏈(源自針對(duì)第二抗原的抗體) 特異性共同結(jié)合第二抗原(如圖2中所示)；所述二價(jià)雙特異性抗體能夠同時(shí)特異性結(jié)合 兩種不同的抗原，且不超過(guò)兩種抗原，與其相反的是，一方面僅能夠結(jié)合一種抗原的單特異 性抗體，和另一方面例如能夠同時(shí)結(jié)合四種抗原分子的四價(jià)、四特異性抗體。根據(jù)本發(fā)明，所需二價(jià)雙特異性抗體與不需要的副產(chǎn)物的比值可以通過(guò)替換僅一 對(duì)重鏈和輕鏈(HC/LC)中的某些結(jié)構(gòu)域來(lái)提高。盡管兩對(duì)HC/LC對(duì)的第一對(duì)源自特異性結(jié) 合第一抗原的抗體且保持基本不變，而兩對(duì)HC/LC對(duì)的第二對(duì)源自特異性結(jié)合第二抗原的 抗體并通過(guò)以下替換來(lái)改變-輕鏈將可奪輕鏈結(jié)構(gòu)域VL替換為所述特異性結(jié)合第二抗原的抗體的可變重鏈 結(jié)構(gòu)域VHJP-重鏈將可奪重鏈結(jié)構(gòu)域VH替換為所述特異性結(jié)合第二抗原的抗體的可變輕鏈 結(jié)構(gòu)域VL。因此由此生成的二價(jià)雙特異性抗體是人造抗體，其包括a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈；其中所述(特異性結(jié)合第二抗原的抗體的)輕鏈包括可變結(jié)構(gòu)域VH而非VL，且其中所述(特異性結(jié)合第二抗原的抗體的)重鏈包括可變結(jié)構(gòu)域VL而非VH。在本發(fā)明的另一方面，這樣提高的所需二價(jià)雙特異性抗體與不需要的副產(chǎn)物的比 值可以通過(guò)以下兩種備選方案之一而進(jìn)一步提高A)第一備選方案(見(jiàn)圖3)所述根據(jù)本發(fā)明的二價(jià)雙特異性抗體的CH3結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)“杵-進(jìn)入_臼” 技術(shù)改變，該技術(shù)詳細(xì)地記載在例如WO 96/027011, Ridgway JB，等，Protein Eng(蛋 白質(zhì)工程)9 (1996) 617-621 ；和 Merchant A.M.，等，NatBiotechnol (自然生物技 術(shù))16 (1998) 677-681中的若干實(shí)施例中。在該方法中，改變兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表 面，以增加包含這兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的兩條重鏈的異型二聚化。(兩條重鏈的)兩個(gè)CH3結(jié) 構(gòu)域之一可以是“杵”，而另一個(gè)是“白”。二硫鍵的引入穩(wěn)定該異型二聚體(Merchant Α. Μ, 等，Nature Biotech (自然生物技術(shù))I6 (I"8) 677_681 ；Atwell S, RidgwayJB, Wells JA, Carter, P.，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)270 (1997) 26-35)，并增加產(chǎn)率。因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，二價(jià)雙特異性抗體的CH3結(jié)構(gòu)域通過(guò)“杵-進(jìn)入_臼” 技術(shù)改變，在所述二價(jià)雙特異性抗體中第一 CH3結(jié)構(gòu)域和第二 CH3結(jié)構(gòu)域各自在包括抗 體CH3結(jié)構(gòu)域之間的初始界面的界面處相接觸，所述“杵-進(jìn)入-臼”技術(shù)包括通過(guò)將二 硫鍵引入CH3結(jié)構(gòu)域而進(jìn)一步穩(wěn)定化(記載在WO 96/027011, Ridgway JB，等，Protein Eng(蛋白質(zhì)工程)9 (1996)617-621 ;Merchant Α. Μ.，等，Nature Biotech(自然生物技 術(shù))16 (1998) 677-681 JPAtwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter, P. , J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)270 (1997) 26-35中)以促進(jìn)二價(jià)雙特異性抗體的形成。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述二價(jià)雙特異性抗體的特征在于一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各自在包括抗體CH3結(jié)構(gòu)域之 間的初始界面的界面處相接觸；其中改變所述界面以促進(jìn)二價(jià)雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與二價(jià)雙特異性抗體內(nèi)的另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接觸的 一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結(jié) 構(gòu)域的界面內(nèi)生成凸起，該凸起可以定位在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凹洞中且b)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與二價(jià)雙特異性抗體內(nèi)的第一 CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接觸的第二 CH3 結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的 界面內(nèi)生成凹洞，在該凹洞中可以定位第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凸起。優(yōu)選地，所述具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)， 酪氨酸(Y)，色氨酸(W)組成的組。優(yōu)選地，所述具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇 氨酸(T)，纈氨酸(V)組成的組。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，進(jìn)一步改變這兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，引入半胱氨酸(C)作為每 個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域相應(yīng)位置處的氨基酸，從而使得兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間可以形成二硫鍵。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)使用用于杵殘基的殘基R409D; K370E (K409D)和用于臼殘基的D399K ；E357K來(lái)改變兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，其記載在例如EP 1870459A1 中?；駼)第二備選方案(見(jiàn)圖4)通過(guò)將一個(gè)恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CH3替換為恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CHl ；并且將另一個(gè)恒定 重鏈結(jié)構(gòu)域CH3替換為恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL。替換重鏈結(jié)構(gòu)域CH3的恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CHl可以是任何Ig類型(例如IgA，IgD, IgE, IgG，和 IgM)，或亞型(例如，IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgAl 和 IgA2)。替換重鏈結(jié)構(gòu)域CH3的恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL可以是lambda ( λ )或kappa ( κ)型， 優(yōu)選κ型。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是二價(jià)雙特異性抗體，其包括a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換，且其中任選地，c) 一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各自在包括抗體CH3結(jié)構(gòu)域 之間的初始界面的界面處相接觸；
其中改變所述界面以促進(jìn)二價(jià)雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于ca)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與二價(jià)雙特異性抗體內(nèi)的另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接觸的 一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結(jié) 構(gòu)域的界面內(nèi)生成凸起，該凸起可以定位在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凹洞中且cb)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與二價(jià)雙特異性抗體內(nèi)的第一 CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接觸的第二 CH3 結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的 界面內(nèi)生成凹洞，在該凹洞中可以定位第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凸起；或d)一個(gè)恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CH3被恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CHl替換；且另一個(gè)恒定重鏈結(jié)構(gòu)域 CH3被恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL替換。術(shù)語(yǔ)“抗原”或“抗原分子”用于本文中時(shí)，可交替使用并指能夠被抗體特異性結(jié)合 的所有分子。二價(jià)雙特異性抗體特異性結(jié)合第一抗原和第二不同抗原。術(shù)語(yǔ)“抗原”用于 本文中時(shí)，包括例如蛋白、蛋白上的不同表位(在本發(fā)明含義內(nèi)作為不同抗原)和多糖。這 主要包括細(xì)菌、病毒和其他微生物的部分(外殼、被膜、細(xì)胞壁、鞭毛、菌毛(fimbrae)和毒 素)。脂質(zhì)和核酸僅在與蛋白和多糖組合時(shí)具有抗原性。非微生物外源(非自身)抗原可 以包括花粉、蛋清和來(lái)自被移植組織和器官的蛋白或在被輸注的血細(xì)胞表面上的蛋白。優(yōu) 選地，抗原選自由細(xì)胞因子、細(xì)胞表面蛋白、酶和受體細(xì)胞因子、細(xì)胞表面蛋白、酶和受體組 成的組。腫瘤抗原是由腫瘤細(xì)胞表面上的MHC I或MHC II分子呈遞的那些抗原。這些抗 原有時(shí)可以由腫瘤細(xì)胞來(lái)呈遞，且從來(lái)不由正常細(xì)胞來(lái)呈遞。在此情況下，它們稱為腫瘤特 異性抗原(TSAs)且典型地由腫瘤特異性突變產(chǎn)生。更常見(jiàn)的是由腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞呈 遞的抗原，且它們稱為腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)。識(shí)別這些抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可能能 夠在腫瘤細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)移前破壞它們。腫瘤抗原還可以采用例如突變受體的形式存在于腫 瘤表面上，在這種情形中它們應(yīng)該被B細(xì)胞識(shí)別。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，二價(jià)雙特異性抗 特異性結(jié)合的兩種不同抗原(第一 和第二抗原)中的至少一種是腫瘤抗原。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，二價(jià)雙特異性抗體特異性結(jié)合的兩種不同抗原(第 一和第二抗原)均是腫瘤抗原；在該情形中，所述第一和第二抗原還可以是相同腫瘤特異 性蛋白上的兩種不同表位。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，二價(jià)雙特異性抗體特異性結(jié)合的兩種不同抗原(第 一和第二抗原)之一是腫瘤抗原且另一種是效應(yīng)細(xì)胞抗原，如，例如，T細(xì)胞受體，⑶3，⑶16寸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，二價(jià)雙特異性抗體特異性結(jié)合的兩種不同抗原(第 一和第二抗原)之一是腫瘤抗原且另一種是抗癌物質(zhì)諸如毒素或激酶抑制劑。
用于本文中時(shí)，“特異性結(jié)合”或“與……特異性結(jié)合”指特異性結(jié)合抗原的抗體。 優(yōu)選地，特異性結(jié)合該抗原的抗體的親和力為10_9mol/l以下(例如ΙΟ,πιοΙ/Ι)的KD-值， 優(yōu)選ΙΟ,πιοΙ/Ι以下(例如10_12mOl/l)的KD-值。結(jié)合親和力使用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定法，諸如 表面等離振子共振技術(shù)(Biacore )來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)“表位”包括能夠特異性結(jié)合抗體的任何多肽決定子。在某些實(shí)施方案中，表 位決定子包括分子的化學(xué)活性表面分組，諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，并且在某 些實(shí)施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，且或特定的帶電特性。表位是抗原的被抗體 結(jié)合的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)抗體在蛋白和/或大分子的復(fù)雜混合物中優(yōu)選識(shí)別其 靶抗原時(shí)，將該抗體稱為與抗原特異性結(jié)合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于制備根據(jù)本發(fā)明的二價(jià)雙特異性抗體的方法，其 包括a)用以下各項(xiàng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可 變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換；b)在容許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。一般地，存在兩種編碼所述特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的載體，和 另外兩種編碼所述特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的載體。兩種載體之一編碼各 種輕鏈且兩種載體中的另一種編碼各種重鏈。然而，在用于制備根據(jù)本發(fā)明的二價(jià)雙特異 性抗體的備選方法中，可使用僅一種編碼特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的第一 載體和僅一種編碼特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的第二載體來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。本發(fā)明包括用于制備所述抗體的方法，其包括在容許合成所述抗體分子的條件下 培養(yǎng)相應(yīng)的宿主細(xì)胞和從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體，其例如通過(guò)表達(dá)以下各項(xiàng)來(lái)實(shí)現(xiàn)-第一核酸序列，其編碼特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈，-第二核酸序列，其編碼所述特異性結(jié)合第一抗原的抗體的重鏈，-第三核酸序列，其編碼特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈，其中可變輕鏈結(jié)構(gòu)域 VL被替換為可變重鏈結(jié)構(gòu)域VH，和-第四核酸序列，其編碼所述特異性結(jié)合第二抗原的抗體的重鏈，其中可變重鏈結(jié) 構(gòu)域VH被替換為可變輕鏈結(jié)構(gòu)域VL。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種宿主細(xì)胞，其包括-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可 變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種宿主細(xì)胞，其包括a)包括編碼特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈的核酸分子的載體和包括編碼特 異性結(jié)合第一抗原的抗體的重鏈的核酸分子的載體，b)包括編碼特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈的核酸分子的載體和包括編碼特 異性結(jié)合第二抗原的抗體的重鏈的核酸分子的載體，其中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種根據(jù)本發(fā)明所述的二價(jià)雙特異性抗體的組合物， 優(yōu)選藥物或診斷組合物。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種藥物組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明所述的二價(jià)雙特 異性抗體和至少一種藥用賦形劑。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于向 所述患者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的二價(jià)雙特異性抗體。術(shù)語(yǔ)“核酸或核酸分子”，用于本文中時(shí)，意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子 可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。用于本文中時(shí)，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可交替使用，且全部這些 名稱都包括子代。因此，詞語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞和由其來(lái)源的培 養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還理解所有的子代的DNA含量可能不精確一致，這歸因于有意 或無(wú)意的突變。包括在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的變異子代。 在意指不同名稱時(shí)，通過(guò)上下文其將是清楚的。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”用于本文中時(shí)，指將載體/核酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的過(guò)程。如果將 無(wú)難以克服的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞用作宿主細(xì)胞，則轉(zhuǎn)染例如通過(guò)如Graham和van der Eh, Virology (病毒學(xué))52 (1978) 546ff所述的磷酸鈣沉淀法來(lái)進(jìn)行。然而，還可以使用其他將 DNA引入細(xì)胞的方法，諸如通過(guò)核注射或通過(guò)原生質(zhì)體融合。如果使用原核細(xì)胞或包含實(shí)質(zhì) 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，例如一種轉(zhuǎn)染方法是利用氯化鈣的鈣處理，如Cohen，F(xiàn). N，等，PNAS (美 國(guó)科學(xué)院院報(bào))· 69 (1972) 7110ff所述。利用轉(zhuǎn)化重組生成抗體在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的且記載在，例如，綜述文章 Makrides, S. C.，Protein Expr. Purif.(蛋白表達(dá)和純化)17 (1999) 183-202 ；Geisse, S·，等，Protein Expr. Purif.(蛋白表達(dá)和純化)8 (1996) 271-282 ;Kaufman，R. J. , Mol. Biotechnol.(分子生物技術(shù))16 (2000) 151-161 ；Werner, R. G，等，Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880 中以及 US 6，331，415 和 US 4，816，567 中。用于本文中時(shí)，“表達(dá)”指將核酸轉(zhuǎn)錄為mRNA的過(guò)程和/或?qū)⑥D(zhuǎn)錄的mRNA(也稱為 轉(zhuǎn)錄物)隨后翻譯為肽、多肽或蛋白質(zhì)的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄物和被編碼的多肽共同稱為基因產(chǎn)物。 如果多核苷酸源自基因組DNA，則在真核細(xì)胞中的表達(dá)可以包括mRNA的剪接?！拜d體”是核酸分子，特別是自體復(fù)制的，其將插入的核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞之 中和/或之間。該術(shù)語(yǔ)包括主要功能為將DNA或RNA插入細(xì)胞(例如，染色體整合)的載 體，主要功能是復(fù)制DNA或RNA的復(fù)制載體，和功能是轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA的表達(dá)載 體。還包括提供多于一種上述功能的載體。“表達(dá)載體”是多核苷酸，其在引入到合適的宿主細(xì)胞中時(shí)能夠被轉(zhuǎn)錄和翻譯為多 肽?！氨磉_(dá)系統(tǒng)”通常指包括表達(dá)載體的適當(dāng)宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體可以起作用產(chǎn)生所需 的表達(dá)產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明所述的二價(jià)雙特異性抗體優(yōu)選通過(guò)重組手段生成。所述方法是本領(lǐng) 域中普遍已知的，且包括在原核和真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)及隨后分離抗體多肽和通常純 化到藥用純度。為了蛋白質(zhì)表達(dá)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼輕鏈和重鏈或其片段的核酸插入表 達(dá)載體中。表達(dá)在合適的原核或真核宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293 細(xì)胞、COS細(xì)胞、酵母或大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞中進(jìn)行，且從所述細(xì)胞(溶胞后的上清或細(xì)胞)中回收抗體。二價(jià)雙特異性抗體可以存在于完整細(xì)胞中、存在于細(xì)胞溶解產(chǎn)物中或以 部分純化或基本純形式存在。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/SDS處理，柱層析法和本領(lǐng)域中的其 他公知技術(shù)進(jìn)行純化，從而消除其他細(xì)胞成分或其他污染物，例如其他細(xì)胞核酸或蛋白。參 見(jiàn) Ausubel，F(xiàn).，等編輯，Current Protocols in Molecular Biology (當(dāng)前分子生物學(xué)方 案)，Greene Publishing and Wiley Interscience, (1987)。在NSO細(xì)胞中的表達(dá)記載在，例如，Barnes, L. Μ.，等，Cytotechnology (細(xì)胞 技術(shù)學(xué))32 (2000) 109-123 ；和 Barnes, L. Μ.，等，Biotech. Bioeng.(生物技術(shù)和生物工 程)73 (2001) 261-270 中。瞬時(shí)表達(dá)記載在，例如，Durocher, Y.，等，Nucl. Acids. Res.(核 酸研究)30 (2002)E9中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的克隆記載在Orlandi，R，等.，Proc. Natl. Acad. Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))86(1989)3833-3837 ；Carter, P.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))89(1992)4285-4289 ；禾口 Norderhaug，L.，等，J. Immunol. Methods (免疫學(xué)方法雜志)204 (1997) 77-87中。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(HEK 293)記載在 Schlaeger, E. -J.，和 Christensen, K.，在 Cytotechnology (細(xì)胞技術(shù)學(xué))30 (1999) 71-83 中和 Schlaeger，Ε. -J.，在 J. Immunol. Methods (免疫學(xué)方法雜志)194 (1996) 191-199 中。適合于原核生物的控制序列，例如，包括啟動(dòng)子，任選操縱子序列，和核糖體結(jié)合 位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和加A信號(hào)。當(dāng)核酸被置于與另一個(gè)核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，其是“可操作地連接的”。例如， 前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與多肽的DNA可操作地連接，條件是其表達(dá)為參與多肽分泌 的前蛋白；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作地連接，條件是其影響所述序列的轉(zhuǎn)錄；或 核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列可操作地連接，條件是其被定位為促進(jìn)翻譯。一般地，“可操作 地連接的”意指被連接的DNA序列是連續(xù)的，且在分泌前導(dǎo)序列的情形中，是連續(xù)的且在閱 讀框中。然而，增強(qiáng)子不必須是連續(xù)的。連接通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)處的連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。如 果不存在所述位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸接合體或連接體。通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化程序，諸如例如，蛋白A-瓊脂糖，羥磷灰石層析法，凝膠 電泳，透析，或親合層析法，從培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)胤蛛x二價(jià)雙特異性抗體。編碼單克隆抗體的 DNA和RNA容易利用常規(guī)程序分離和測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可以起所述DNA或RNA來(lái)源的作用。 一旦分離后，可以將DNA插入到表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體隨后轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球 蛋白的宿主細(xì)胞諸如HEK 293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞中，以在宿主細(xì)胞中獲得重組 單克隆抗體的合成。二價(jià)雙特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)通過(guò)將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円?到抗體DNA中，或通過(guò)核苷酸合成來(lái)制備。然而，這樣的修飾僅能在非常有限的范圍內(nèi)，例 如如上所述的范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，所述修飾不改變上述抗體特征諸如IgG同種型和抗原結(jié) 合，但可以提高重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白穩(wěn)定性或促進(jìn)純化。提供以下實(shí)施例、序列表和附圖來(lái)幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍在所附權(quán) 利要求中給出。要理解在不偏離本發(fā)明精神的條件下可以對(duì)所述步驟作出改動(dòng)。序列表SEQ ID NO=I野生型<IGF_1R>抗體重鏈的氨基酸序列SEQ ID NO 2野生型<IGF_1R>抗體輕鏈的氨基酸序列SEQ ID NO :3<IGF-1R>VL_VH交換抗體的重鏈(HC*#)的氨基酸序列，其中重鏈結(jié)構(gòu)域VH被替換為輕鏈結(jié)構(gòu)域VL-變體A。SEQ ID NO :4<IGF-1R>VL_VH交換抗體的輕鏈(LC*#)的氨基酸序列，其中輕 鏈結(jié)構(gòu)域VL被替換為重鏈結(jié)構(gòu)域VH-變體A。SEQ ID NO :5IGF_1R胞外域His-鏈霉親和素結(jié)合肽-標(biāo)簽(IGF-IR-His-SBP ECD) 的氨基酸序列SEQ ID NO 6野生型血管生成素_2<ANGPT2>抗體重鏈的氨基酸序列SEQ ID NO 7野生型血管生成素_2<ANGPT2>抗體輕鏈的氨基酸序列SEQ ID NO 8用于杵-進(jìn)入-臼技術(shù)中的具有T366W交換的CH3結(jié)構(gòu)域(杵)的 氨基酸序列SEQ ID NO :9用于杵-進(jìn)入-臼技術(shù)中的具有T366S，L368A，Y407V交換的CH3結(jié) 構(gòu)域(臼)的氨基酸序列SEQ ID NO 10<IGF-1R>VL_VH交換抗體的重鏈(HC*#)的氨基酸序列，其中重 鏈結(jié)構(gòu)域VH被替換為輕鏈結(jié)構(gòu)域VL-變體B。SEQ ID NO 11<IGF-1R>VL_VH交換抗體的輕鏈(LC*#)的氨基酸序列，其中輕 鏈結(jié)構(gòu)域VL被替換為重鏈結(jié)構(gòu)域VH-變體B。SEQ ID NO :12IGF_1R 胞外域 His-鏈霉親和素結(jié)合肽-標(biāo)簽(IGF-IR-His-SBP E⑶)的氨基酸序列。


圖IIgG的示意圖，IgG即為天然存在的特異于一種抗原的完整抗體，其具有兩對(duì) 重鏈和輕鏈，所述重鏈和輕鏈具有處于典型順序的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域。圖2 二價(jià)雙特異性抗體的示意圖，所述二價(jià)雙特異性抗體包括a)特異性結(jié)合第 一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結(jié) 構(gòu)域VL和VH相互替換。圖3 二價(jià)雙特異性抗體的示意圖，所述二價(jià)雙特異性抗體包括a)特異性結(jié)合第 一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結(jié) 構(gòu)域VL和VH相互替換，且其中通過(guò)杵-進(jìn)入-臼技術(shù)改變兩條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域。圖4 二價(jià)雙特異性抗體的示意圖，所述二價(jià)雙特異性抗體包括a)特異性結(jié)合第 一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結(jié) 構(gòu)域VL和VH相互替換，且其中兩條重鏈的恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CH3之一被替換為恒定重鏈結(jié) 構(gòu)域CH1，且另一個(gè)獲恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CH3被替換為恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL。圖5<IGF-1R>VL-VH交換抗體的重鏈*#<IGF-lR>HO#的蛋白序列圖。圖6<IGF_1R>VL-VH交換抗體(具有κ恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL)的輕鏈 *#<IGF-1R>LC***的蛋白序列圖。圖 7 重鏈 ***<IGF_1R>HC*** 表達(dá)載體 pUC-HC***-IGF_lR 的質(zhì)粒圖譜。圖8輕鏈*#<IGF-lR>LO#表達(dá)載體pUC-LO#-IGF_lR的質(zhì)粒圖譜。圖94700-Hyg_0riP表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜。圖10對(duì)于I24IGF-1R表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行的用于檢測(cè)功能性雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體的存在的細(xì)胞FACSIGF-1R-ANGPT2橋連測(cè)定的測(cè)定原理。
圖 11 示范 IGF-IR ECD Biacore。圖12具有HC*和LC*的單特異性二價(jià)<IGF-1R>VL_VH交換抗體(IgGl*)的 SDS-PAGE和大小排阻層析，所述具有HC*和LC*的單特異性二價(jià)<IGF-1R>VL_VH交換抗體 (IgGl*)是從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293E細(xì)胞后的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中分離的。圖13在基于ELISA的結(jié)合測(cè)定中，單特異性<IGF-1R>VL_VH交換抗體和野生型 <IGF-1R>抗體與IGF-IR ECD的結(jié)合。圖14從來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293E細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化的 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH 交換抗體混合物的 SDS-PAGE。圖15對(duì)于I24IGF-1R表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行的用于檢測(cè)純化的抗體混合物中存在功能性 雙特異性〈ANGPT2-IGF-1 R>VL-VH交換抗體的細(xì)胞FACSIGF-1R-ANGPT2橋連測(cè)定的樣品A-F 的結(jié)果。純化的蛋白樣品A-F:A=未處理的124B = 124+2 μ g/mL hANGPT2+hIgG 同種型D = 124+2 μ g/mL hANGPT2+ 來(lái)自 <IGF-1R>CL_CH1 交換抗體和<ANGPT2>野生型抗體的共表達(dá)的、包括雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH 交換抗體的混合物E = 124+2 μ g/mL hANGPT2+<ANGPT2> 野生型抗體F = 124+2 μ g/mL hANGPT2+<IGF_lR> 野生型抗體
實(shí)施例材料和一般方法關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.，等， Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫目的的蛋白質(zhì)序列)，第 5 版， Public Health Service (公眾健康服務(wù))，National Institutes ofHealth (全國(guó)衛(wèi)生研 究所)，Bethesda，MD. (1991))中提供。按照EU編號(hào)對(duì)抗體鏈的氨基酸進(jìn)行編號(hào)和提及 (Edelman, GM.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國(guó)科學(xué)院院報(bào))63 (1969) 78-85 ；Kabat, Ε· Α·,等，Sequences ofProteins of Immunological Interest (免疫目的的蛋白質(zhì)序列)， 第 5 版，PublicHealth Service (公眾健康服務(wù))，National Institutes ofHealth (全國(guó) 衛(wèi)生研究所)，Bethesda, MD. (1991))。重組DNA技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)方法操作 DNA，如 Sambrook，J.等·，Molecular cloning :Alaboratory manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))；Cold Spring Harbor LaboratoryPress (冷泉港實(shí)驗(yàn)室 出版社)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約，1989中所述。分子生物學(xué)試劑按照供應(yīng)商 說(shuō)明使用?；蚝铣伤杌騾^(qū)段由通過(guò)化學(xué)合成制備的寡核苷酸制備。側(cè)連單限制性內(nèi)切核 酸酶裂解位點(diǎn)的600-1800bp長(zhǎng)的基因區(qū)段通過(guò)寡核苷酸的退火和連接包括PCR擴(kuò) 增來(lái)裝配，并隨后通過(guò)所指出的限制位點(diǎn)例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆到基于 pPCRScript (Stratagene)的pGA4克隆載體中。亞克隆基因片段的DNA序列通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證。基因合成片段按照Geneart的給定說(shuō)明書(Regensburg，德國(guó))來(lái)訂購(gòu)。DNA序列確定DNA j^5 ^lJ it il ^ MediGenomix GmbH(Martinsried, H Bl ) $ Sequiserve GmbH(Vaterstetten，德國(guó))進(jìn)行的雙鏈測(cè)序來(lái)確定。DNA和代表序列合成和序列數(shù)據(jù)管理GCG (Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計(jì)算小組)，Madison，威斯康星)的軟件 包10. 2版和Infomax載體NTlAdvance suite 8. O版用于序列構(gòu)建、作圖、分析、注解和說(shuō)明。表達(dá)載體為了表達(dá)所述抗體，應(yīng)用用于基于具有CMV-內(nèi)含子A啟動(dòng)子的cDNA構(gòu)造或基于 具有CMV啟動(dòng)子的基因組構(gòu)造的細(xì)胞中(例如在HEK293EBNA或HEK293-F)瞬時(shí)表達(dá)的表 達(dá)質(zhì)粒的變體。除抗體表達(dá)盒以外，所述載體包括-復(fù)制起點(diǎn)，其容許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，和-β -內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性?？贵w基因的轉(zhuǎn)錄單元由以下元件組成-5’末端處的特有限制性位點(diǎn)_來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，-在cDNA構(gòu)造的情形中，隨后是內(nèi)含子A序列，_人抗體基因的5’ _非翻譯區(qū)，-免疫球蛋白重鏈信號(hào)序列，-人抗體鏈(野生型或具有結(jié)構(gòu)域交換)，其作為cDNA或作為具有免疫球蛋白外 顯子_內(nèi)含子構(gòu)造的基因組構(gòu)造-具有加A信號(hào)序列的3’非翻譯區(qū)，和-3’末端處的特有的限制性位點(diǎn)。如下所述的包括所述抗體鏈的融合基因通過(guò)PCR和/或基因合成產(chǎn)生并使用已知 的重組方法和技術(shù)來(lái)裝配，所述重組方法和技術(shù)通過(guò)在各種載體中例如利用特有的限制性 位點(diǎn)來(lái)連接相應(yīng)的核酸區(qū)段來(lái)實(shí)現(xiàn)。亞克隆的核酸序列通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證。為了瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染，通過(guò)來(lái)自轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒制備物來(lái)制備更大量的質(zhì)粒(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)如Current Protocols in Cell Biology (當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)方 案)(2000), Bonifacino, J. S. , Dasso, Μ. , Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.禾口 Yamada, K. Μ.(編輯)，John Wiley & Sons，Inc 中所述來(lái)使用。雙特異性抗體通過(guò)在貼壁生長(zhǎng)的HEK293-EBNA中或在懸浮生長(zhǎng)的HEK29-F細(xì)胞中 瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染各種表達(dá)質(zhì)粒來(lái)表達(dá)，如下所述。HEK293-EBNA系統(tǒng)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雙特異性抗體通過(guò)在貼壁生長(zhǎng)的HEK293-EBNA細(xì)胞(表達(dá)EB病毒核抗原的人胚 腎細(xì)胞系293 ；美國(guó)典型培養(yǎng)物中心，保藏號(hào)ATCC#CRL-10852，Lot. 959 218)中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染各種表達(dá)質(zhì)粒(例如編碼重鏈和修飾的重鏈，以及相應(yīng)的輕鏈和修飾的輕鏈)來(lái)表達(dá)， 所述細(xì)胞是在添加了 10%超低IgG FCS(胎牛血清，Gibco), 2mM L-谷氨酰胺(Gibco), ^P 250yg/ml 遺傳霉素(geneticin) (Gibco)的 DMEM (Dulbecco ’ s modified Eagle’ smedium， Gibco (Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基))中培養(yǎng)的。為了轉(zhuǎn)染，F(xiàn)uGENE 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Molecular Biochemicals (羅氏分子生物化學(xué)))按照FuGENE 試劑(μ 1)與DNA (μ g)的比 例為4 1(在3 1 6 1的范圍內(nèi))來(lái)使用。利用摩爾比為1 1(等摩爾)的編碼 (修飾的和野生型)輕鏈和重鏈的質(zhì)粒，所述摩爾比范圍是1 2 2 1，由各種質(zhì)粒來(lái)分 別表達(dá)蛋白。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西格瑪(Sigma)]和NAA [Gibco] 飼養(yǎng)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后第5-11天通過(guò)離心法收獲包含雙特異性抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清并保 存在-20°C。關(guān)于在例如HEK293細(xì)胞中進(jìn)行人免疫球蛋白的重組表達(dá)的一般信息提供在 Meissner, P.等，Biotechnol. Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程)75 (2001) 197-203 中。HEK293-F系統(tǒng)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雙特異性抗體通過(guò)利用HEK293-F系統(tǒng)(Invitrogen)按照供應(yīng)商的說(shuō)明瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染各種質(zhì)粒(例如編碼重鏈和修飾的重鏈，以及相應(yīng)的輕鏈和修飾的輕鏈)來(lái)生成。簡(jiǎn) 言之，用四種表達(dá)質(zhì)粒和293feCtin或fectin(Invitrogen)的混合物來(lái)轉(zhuǎn)染在搖瓶中 或在攪拌發(fā)酵器中在無(wú)血清FreeStyle 293表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)中懸浮生長(zhǎng)的 HEK293-F (Invitrogen)。對(duì)于 2L 搖瓶(Corning)，HEK293-F 細(xì)胞以 1. 0E*6 細(xì)胞 /mL 的 密度接種在600mL中并以120rpm，8% C02溫育。第二天，用ca. 42mL的Α)具有600 μ g 等摩爾比的分別編碼重鏈或修飾的重鏈，和相應(yīng)輕鏈的總質(zhì)粒DNA (1 μ g/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)和 B) 20ml Opti-MEM+l. 2mL 293fectin 或 fectin (2 μ 1/mL)的混合 物，轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度為ca. 1.5E*6細(xì)胞/mL的細(xì)胞。在發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)葡萄糖的消耗，添加葡 萄糖溶液。在5-10天后收獲包含分泌的抗體的上清，并且直接由上清純化抗體或冷凍并保 存上清。蛋白確定純化的抗體和衍生物的蛋白濃度通過(guò)利用基于氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù) 確定280nm處的光密度(OD)來(lái)確定，其依照Pace等，ProteinScience (蛋白質(zhì)科學(xué))，1995， 4,2411-1423。上清中抗體濃度的確定抗體和衍生物在細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的濃度通過(guò)使用蛋白質(zhì)A瓊脂糖-珠 (Roche(FS))的免疫沉淀法來(lái)評(píng)估。60yL蛋白質(zhì)A瓊脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris, pH 7. 5,150mM NaCl，1 % Nonidet_P40)洗滌三次。隨后，將 l_15mL 細(xì)胞培養(yǎng)物上 清應(yīng)用于在TBS-NP40中預(yù)平衡的蛋白質(zhì)A瓊脂糖珠。室溫下溫育1小時(shí)后，將該珠在 Ultrafree-MC-過(guò)濾柱(Amicon)上用 0. 5mL TBS-NP40 洗滌 1 次，用 0. 5mL 2x 磷酸鹽緩沖 液(2xPBS，Roche(FS))洗滌2次并用0. 5mL IOOmM檸檬酸鈉pH 5，O簡(jiǎn)單洗滌4次。通 過(guò)添加35μ 1NuPAGE LDS樣品緩沖液(Invitrogen)洗脫結(jié)合的抗體。樣品的一半分 別與NuPAGE 樣品還原劑混合或保持未還原，并在70°C加熱10分鐘。因此，將5-30 μ 1 應(yīng)用于4-12%^[10>八0￡ 8丨8-111^8 SDS-PAGE(Invitrogen)(具有MOPS 緩沖液，以用于非 還原的SDS-PAGE且具有NuPAGE 抗氧化運(yùn)行緩沖液添加劑(Invitrogen)的MES緩沖 液，以用于還原的SDS-PAGE)并用考馬斯藍(lán)染色。
抗體和衍生物在細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的濃度通過(guò)親合HPLC層析法來(lái)定量測(cè)量。簡(jiǎn) 言之，將包含結(jié)合蛋白質(zhì)A的抗體和衍生物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清應(yīng)用于在200mM KH2P04， IOOmM檸檬酸鈉，pH 7. 4中的應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)Poros A/20柱，并在安 捷倫(Agilent)HPLC 1100系統(tǒng)上用200mM NaCl，IOOmM檸檬酸，pH 2. 5洗脫。洗脫的蛋白 通過(guò)UV吸光度和峰面積整合來(lái)量化。純化的標(biāo)準(zhǔn)IgGl抗體作為標(biāo)準(zhǔn)物。備選地，抗體和衍生物在細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的濃度通過(guò)夾心-IgG-ELISA來(lái)測(cè)量。 簡(jiǎn)言之，將Str印taWell高結(jié)合鏈霉親和素A-96孔微量滴定板(Roche(FS))用IOOyL/ 孔0. 1 μ g/mL的生物素化的抗人IgG捕獲分子F(ab，)2<h-Fc y >BI (Dianova)，在室溫下包 被1小時(shí)或備選地在4°C包被過(guò)夜并隨后用200 μ L/孔PBS，0. 05%吐溫(PBST，Sigma (西 格瑪))洗滌3次。將100 μ L/孔包含各種抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清在PBS (Sigma (西格瑪)) 中的稀釋物系列加入到孔中并在微量滴定板搖動(dòng)器上，以室溫溫育1-2小時(shí)?？子?00 μ L/ 孔PBST洗滌三次并且用100 μ 1濃度為0. 1 μ g/mL的F (ab ‘) 2<hFc y >P0D (Dianova)作為 檢測(cè)抗體，在微量滴定板搖動(dòng)器上，在室溫下檢測(cè)結(jié)合的抗體1-2小時(shí)。未結(jié)合的檢測(cè)抗體 用200 μ L/孔PBST洗滌三次洗掉，并且結(jié)合的檢測(cè)抗體通過(guò)添加100 μ L ABTS/孔來(lái)檢測(cè)。 在Tecan Fluor分光計(jì)上，以405nm的測(cè)量波長(zhǎng)(參照波長(zhǎng)492nm)來(lái)進(jìn)行吸光度的確定。蛋白質(zhì)純化參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。簡(jiǎn)言之，將抗體應(yīng)用于蛋白 質(zhì)A瓊脂糖柱(GE healthcare (GE健康護(hù)理))并用PBS洗滌。在pH 2. 8實(shí)現(xiàn)抗體洗脫， 并隨后立即中和樣品。在PBS中或在20mM組氨酸，150mM NaCl pH 6.0中，通過(guò)大小排阻層 析(Superdex 200，GEhealthcare (GE健康護(hù)理))將聚集的蛋白質(zhì)與單體抗體分開。匯集 單體抗體級(jí)分，如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWC0)離心濃縮器濃縮，冷凍和 在_20°C或-80°C保存。提供部分樣品進(jìn)行隨后的例如通過(guò)SDS-PAGE，大小排阻層析法或質(zhì) 譜法進(jìn)行的蛋白質(zhì)分析和分析表征。SDS-PA GENuPAGE 預(yù)制凝膠系統(tǒng)(Irwitrogen)按照供應(yīng)商的說(shuō)明來(lái)使用。具體地，使用 10%或 4-12%NuPAGE Novex Bis-TRIS 預(yù)制凝膠(pH 6.4)和NuPAGE MES (還 原的凝膠，具有NuPAGE 抗氧化運(yùn)行緩沖液添加劑)或MOPS(未還原的凝膠)運(yùn)行緩沖液。分析性大小排阻層析法用于確定抗體聚集和低聚狀態(tài)的大小排阻層析法通過(guò)HPLC層析法來(lái)進(jìn)行。簡(jiǎn)言 之，將蛋白質(zhì)A純化抗體應(yīng)用于安捷倫(Agilent)HPLC 1100系統(tǒng)上處于300mM NaCl, 50mM KH2P04/K2HP04，pH 7· 5 中的 TosohTSKgel G3000SW 柱或 Dionex HPLC-系統(tǒng)上處于 2x PBS 中的Superdex200柱(GE healthcare (GE健康護(hù)理))。洗脫的蛋白通過(guò)UV吸光度和峰面 積的整合來(lái)量化。BioRad凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)物151-1901作為標(biāo)準(zhǔn)物。質(zhì)譜法交換(crossover)抗體的總?cè)ヌ腔|(zhì)量通過(guò)電噴射離子化質(zhì)譜法(ESI-MS)來(lái) 確定和驗(yàn)證。簡(jiǎn)言之,用在IOOmM KH2P04/K2HP04, pH 7中的50mU N-糖苷酶F(PNGaseF， ProZyme)在37°C，以至多2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度，將100 μ g純化的抗體去糖基化12-24小 時(shí)，并隨后在S印hadexG25柱(GE healthcare (GE健康護(hù)理))上通過(guò)HPLC來(lái)脫鹽。各種重鏈和輕鏈的質(zhì)量在去糖基化和還原后通過(guò)ESI-MS來(lái)確定。簡(jiǎn)言之，在115 μ 1中的50 μ g 抗體用60 μ 1 IM TCEP和50 μ 1 8Μ鹽酸胍來(lái)溫育，并隨后脫鹽?？傎|(zhì)量和還原的重鏈和輕 鏈的質(zhì)量通過(guò)在裝配有NanoMate源的Q-StarElite MS系統(tǒng)上進(jìn)行ESI-MS來(lái)確定。IGF-IR ECD 結(jié)合 ELISA產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性在使用IGF-IR胞外結(jié)構(gòu)域(EOT)的ELISA測(cè)定中評(píng)估。 為了該目的，將IGF-IR的胞外結(jié)構(gòu)域(殘基1-462)，其包括與N-端His-鏈霉親和素結(jié) 合肽-標(biāo)簽(His-SBP)融合的α鏈(根據(jù)McKern等，1997 ；Ward等，2001)的人IGF-IR 胞外域的天然前導(dǎo)序列和LI-富含半胱氨酸-12結(jié)構(gòu)域(Ll-cysteine rich-12domain)， 克隆到pcDNA3載體衍生物中并在HEK293F細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。IGF-IR-His-SBP ECD的蛋 白質(zhì)序列在SEQ ID N0:12中給出。Str印taWell高結(jié)合鏈霉親和素A-96孔微量滴定板 (Roche (羅氏))用100 μ L/孔含有可溶性IGF-IR-E⑶-SBP融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)物上清在 4°C包被過(guò)夜并用200 μ L/孔PBS，0. 05%吐溫(PBST，Sigma(西格瑪))洗滌三次。隨后， 將100 μ L/孔在包含1% BSA(級(jí)分V，Roche (羅氏))的PBS (Sigma (西格瑪))中的各種 抗體的稀釋物系列和作為參照的野生型<IGF-1R>抗體加入到孔中并在微量滴定板搖動(dòng)器 上在室溫下溫育1-2小時(shí)。對(duì)于稀釋物系列，將等量的純化的抗體應(yīng)用于所述孔。該孔用 200 μ L/孔PBST洗滌三次并且結(jié)合的抗體用濃度為0. 1 μ g/mL(l 8000)的100 μ L/孔 F(ab ‘)2<hFc y >P0D (Dianova)作為檢測(cè)抗體在微量滴定板搖動(dòng)器上，以室溫檢測(cè)1_2小 時(shí)。未結(jié)合的檢測(cè)抗體使用200 μ L/孔PBST洗滌三次洗掉，并且結(jié)合的檢測(cè)抗體通過(guò)添加 100 μ L ABTS/孔來(lái)檢測(cè)。在TecanFluor分光計(jì)上，以405nm的測(cè)量波長(zhǎng)(參照波長(zhǎng)492nm) 來(lái)進(jìn)行吸光度的確定。IGF-IR ECD Biacore產(chǎn)生的抗體與人IGF-IR ECD的結(jié)合也通過(guò)利用BIACORE TlOO儀器(GE healthcare Biosciences AB (GE健康護(hù)理生物科學(xué)AB)，Uppsala，瑞典)的表面等離振子 共振來(lái)研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)于親合性測(cè)量，通過(guò)用于呈遞正對(duì)Fc標(biāo)記的人IGF-IR E⑶(human IGF-IR ECD-Fc tagged)的抗體的胺偶聯(lián)在CM5芯片上固定山羊-抗-人IgG，JIR 109-005-098 抗體。結(jié)合在 HBS 緩沖液(HBS_P(10mM HEPES, 150mM NaCl，0. 005%吐溫 20， ph 7.4)中，25°C測(cè)量。將IGF-IR E⑶(R&D系統(tǒng)或內(nèi)部純化的)以不同濃度加入到溶液中。 締合通過(guò)注射IGF-IR E⑶80秒-3分鐘來(lái)測(cè)量；解離通過(guò)用HBS緩沖液洗滌芯片表面3-10 分鐘來(lái)測(cè)量且KD值利用1 1朗繆爾結(jié)合模型(Langmuir binding model)來(lái)評(píng)估。由于 <IGF-1R>抗體的低負(fù)載密度和捕獲水平，獲得單價(jià)IGF-IR ECD結(jié)合。從樣品曲線中減去陰 性對(duì)照數(shù)據(jù)(例如緩沖液曲線)，以用于校正系統(tǒng)固有的基線漂移和用于噪音信號(hào)的降低。 使用Biacore TlOO評(píng)估軟件1. 1. 1版用于S曲線(sensorgrams)的分析和用于親合性數(shù) 據(jù)的計(jì)算。圖11顯示Biacore測(cè)定的示意圖。實(shí)施例1制備、表達(dá)、純化和表征單特異性二價(jià)<IGF_1R>抗體，其中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相 互替換(本文中縮寫為<IGF-1R>VL-VH交換抗體)。實(shí)施例IA制備關(guān)于單特異件二價(jià)<IGF-1R>VL_VH交換抗體的表汰質(zhì)粒包括本實(shí)施例中所述的各種前導(dǎo)序列的單特異性二價(jià)<IGF-1R>VL_VH交換抗體的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列源自WO 2005/005635中所述的人<IGF_1R>抗體重鏈(SEQ ID NO :1，質(zhì)粒4843-pUC-HC-IGF-lR)和輕鏈(SEQ ID NO :2，質(zhì)粒4842-pUC-LC-IGF-lR)，且 重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域源自人抗體(C-K和IgGl)。編碼<IGF_1R>抗體前導(dǎo)序列、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和人重鏈恒定結(jié)構(gòu)域1 (CHl) 的基因區(qū)段連接并與人、I"重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(鉸鏈-CH2-CH3)的Fc結(jié)構(gòu)域的5’末端融 合。編碼通過(guò)用VL結(jié)構(gòu)域交換VH結(jié)構(gòu)域(VL-VH交換)獲得的各種融合蛋白的DNA通過(guò) 基因合成產(chǎn)生，并在以下表示為<IGF-1R>HC*#(SEQ ID NO 10)。初步地，VL-CHl結(jié)構(gòu)域與 稍微不同的序列(SEQ ID NO :3)融合；由于此連接的表達(dá)產(chǎn)量較小，因此選擇顯示與野生 型抗體相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)產(chǎn)量的SEQ10。<IGF_1R>抗體前導(dǎo)序列，重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和人輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)的基因 區(qū)段作為獨(dú)立的鏈連接。編碼通過(guò)用VH結(jié)構(gòu)域交換VL結(jié)構(gòu)域(VL-VH交換)獲得的各種融 合蛋白的DNA通過(guò)基因合成產(chǎn)生，并在以下表示為<IGF-1R>LC*# (重鏈(SEQ ID NO 11)。初步地，VH-CL結(jié)構(gòu)域與稍微不同的序列(SEQ ID NO 4)融合；由于此連接的表達(dá)產(chǎn) 量較小，因此選擇顯示與野生型抗體相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)產(chǎn)量的SEQ ID NO=Il0圖5和圖6顯示修飾的<IGF-1R>HC#*重鏈和修飾的<IGF-1R>LC*#輕鏈的蛋白 質(zhì)序列的示意圖。以下，簡(jiǎn)要描述各種表達(dá)載體載體pUC-HC * * * -IGF-IR載體pUC-HO#-IGF-lR是例如用于在HEK293 (EBNA)細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)VL-VH交換 <IGF-1R>重鏈HC*#(cDNA構(gòu)造的表達(dá)盒；具有CMV-內(nèi)含子A)或用于在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定 表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒。除<IGF_1R>HC * * *表達(dá)盒以外，該載體包含-來(lái)自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其容許該質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制，和-β -內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性。<IGF-1R>HC*#基因的轉(zhuǎn)錄單元由以下元件組成-5’末端處的AscI限制性位點(diǎn)，_來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，_隨后的內(nèi)含子A序列，-人抗體基因的5’-非翻譯區(qū)，-免疫球蛋白輕鏈信號(hào)序列，-人<IGF_1R>成熟HC***鏈，其編碼與人γ1-重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(鉸鏈-CH2-CH3)的Fc結(jié)構(gòu)域的5’末端融合的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和人κ -輕鏈恒 定結(jié)構(gòu)域(CL)的融合體-具有加A信號(hào)序列的3’非翻譯區(qū)，和-3’末端處的限制性位點(diǎn)SgrAI。重鏈*#VL-VH交換<IGF_lR>HO#表達(dá)載體pUC-HO#-IGF_lR的質(zhì)粒圖譜顯示 在圖7中。<IGF-1R>HC*#(包括信號(hào)序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO :10中提供。載體pUC-LC * * * -IGF-IR載體pUC-LO#-IGF-lR是例如用于在HEK293 (EBNA)細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)VL-VH交換<IGF-1R>輕鏈LC***(cDNA構(gòu)造的表達(dá)盒；具有CMV-內(nèi)含子A)或用于在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定 表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒。除<IGF_1R>LC * * *表達(dá)盒以外，該載體包含-來(lái)自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其容許該質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制，和-β -內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性。<IGF-1R>LC*#基因的轉(zhuǎn)錄單元由以下元件組成-5，末端處的限制性位點(diǎn)Sse8387I_來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，_隨后的內(nèi)含子A序列，-人抗體基因的5’-非翻譯區(qū)，-免疫球蛋白重鏈信號(hào)序列，-人<IGF_1R>成熟LC***鏈，其編碼人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和人γ 1-重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)的融合體_具有加A信號(hào)序列的3’非翻譯區(qū)，和-3’末端處的限制性位點(diǎn)SalI和FseI。輕鏈#VL_VH交換<IGF_lR>LO#表達(dá)載體pUC-LO#-IGF_lR的質(zhì)粒圖譜顯示 在圖8中。<IGF-1R>LC*#(包括信號(hào)序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO 11中提供。質(zhì)粒pUC-HO#-IGF_lR和pUC-LO#-IGF_lR可以用于瞬時(shí)或穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染到例 如HEK293，HEK293EBNA或CHO細(xì)胞(2-載體系統(tǒng))中。為了比較的原因，野生型<IGF_1R> 抗體由與該實(shí)施例中所述的那些類似的質(zhì)粒4842-pUC-LC-IGF-lR(SEQ ID NO 2)和 4843-pUC-HC-IGF-lR(SEQ IDNO 1)瞬時(shí)表達(dá)。為了在HEK293EBNA細(xì)胞中獲得瞬時(shí)表達(dá)的較高表達(dá)水平，可以將<IGF_1R>HC*** 表達(dá)盒經(jīng)由AscI、SgrAI位點(diǎn)和將<IGF-1R>LC#*表達(dá)盒經(jīng)由Sse8387I和FseI位點(diǎn)亞克 隆到包含以下各項(xiàng)的4700pUC-Hyg_0riP表達(dá)載體中-OriP 元件，和_潮霉素抗性基因，其作為選擇性標(biāo)記物?？梢詫⒅劓満洼p鏈轉(zhuǎn)錄單元亞克隆到2個(gè)獨(dú)立的4700-pUC-Hyg_0riP載體中，從 而進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(2-載體系統(tǒng))或可以將它們克隆到一個(gè)共同的4700-pUC-Hyg-0riP載體 (1-載體系統(tǒng))中，從而隨后用由此產(chǎn)生的載體進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。圖9顯示基礎(chǔ)載體 4700-pUC-0riP的質(zhì)粒圖譜。實(shí)施例IB制備單特異性二價(jià)<IGF-1R>VL_VH交換抗體表達(dá)質(zhì)粒包括野生型<IGF_1R>抗體的交換的Fab序列的<IGF_1R>融合基因(HC#*和 LC***融合基因)使用已知的重組方法和技術(shù)，通過(guò)連接相應(yīng)的核酸區(qū)段來(lái)裝配。編碼IGF-IR HC***和LC***的核酸序列分別通過(guò)化學(xué)合成來(lái)合成并隨后在 Geneart (Regensburg,德國(guó))處，克隆到基于 pPCRScript (Stratagene)的 pGA4 克隆載體 中。將編碼IGF-IR HC***的表達(dá)盒經(jīng)由PvuII和BmgBI限制位點(diǎn)連接到各種大腸桿菌質(zhì) 粒中，以生成最終載體pUC-HC*#-IGF-lR ；將編碼各種IGF-IR LC***的表達(dá)盒經(jīng)由PvuII 和SalI限制位點(diǎn)連接到各種大腸桿菌質(zhì)粒中，以生成最終載體pUC-LC*#-IGF-lR。亞克隆的核酸序列通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證。為了瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，通過(guò)來(lái)自轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物 的質(zhì)粒制備物來(lái)制備更大量的質(zhì)粒(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)。實(shí)施例IC瞬時(shí)表汰單特異件二價(jià)<IGF-1R>VL_VH交換抗體,通過(guò)質(zhì)譜法純化和證實(shí)特征重組<IGF_1R> VL-VH交換抗體通過(guò)在HEK293-F懸浮細(xì)胞中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pUC-HC***-IGF-lR 和 pUC-LC***-IGF_lR 進(jìn)行表達(dá)，如上所述。根據(jù)以上所述，通過(guò)蛋白質(zhì)A親合層析法，由過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化 表達(dá)和分泌的單特異性二價(jià)<IGF-1R>VL-VH交換抗體。簡(jiǎn)言之，來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的包含 <IGF-1R>VL-VH交換抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清通過(guò)離心和過(guò)濾來(lái)凈化并應(yīng)用于用PBS緩沖液 (IOmM Na2HP04, ImM KH2P04,137mM NaCl 禾Π 2. 7mM KCl, pH 7.4)平衡的蛋白質(zhì) A HiTrap MabSelectXtra柱(GE healthcare (GE健康護(hù)理))。用PBS平衡緩沖液及隨后的0. IM檸 檬酸鈉緩沖液，PH 5.5洗出未結(jié)合的蛋白，并用PBS洗滌。用IOOmM檸檬酸鈉，pH 2. 8實(shí)現(xiàn) 抗體的洗脫，隨后立即用300 μ 1 2Μ Tris pH 9. 0/2ml級(jí)分來(lái)中和樣品。在20mM組氨酸， 150mM NaCl pH 6. 0 中，通過(guò)在 HiLoad26/60Superdex 200 制備級(jí)柱(GE healthcare (GE 健康護(hù)理))上進(jìn)行的大小排阻層析法將聚集的蛋白質(zhì)與單體抗體分開，且隨后利用 MILLIPOREAmicon Ultra-15離心濃縮器濃縮單體抗體級(jí)分。在-20°C或-80°C下冷凍和 保存<IGF-1R>VL-VH交換抗體。<IGF-1R>VL_VH交換的完整性通過(guò)存在和缺乏還原劑的 SDS-PAGE和隨后用考馬斯亮藍(lán)染色來(lái)分析，如上所述。<IGF-1R>VL-VH交換抗體的單體狀 態(tài)通過(guò)分析性大小排阻層析法證實(shí)。(圖12)提供表征的樣品，以進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析和 功能表征。ESI質(zhì)譜法驗(yàn)證完全去糖基化的<IGF-1R>VL-VH交換抗體的理論分子量。實(shí)施例ID在IGF-IR ECD結(jié)合ELISA中和通過(guò)Biacore分析單特異性二價(jià)<IGF-1R>VL_VH 交換抗體的IGF-IR結(jié)合特性單特異性二價(jià)<IGF-1R>VL_VH交換抗體的結(jié)合特性如上所述在使用IGF-1R胞外 結(jié)構(gòu)域(ECD)的ELISA測(cè)定中評(píng)估。為了該目的，將IGF-IR的胞外結(jié)構(gòu)域(殘基1-462) 克隆到pcDNA3載體衍生物中并在HEK293F細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，所述IGF-IR的胞外結(jié)構(gòu)域 包括與N-端His-鏈霉親和素結(jié)合肽-標(biāo)簽(His-SBP)融合的α鏈(根據(jù)McKern等， 1997 ；Ward等，2001)的人IGF-IR胞外域的天然前導(dǎo)序列和LI-富含半胱氨酸-12結(jié)構(gòu)域。 IGF-IR-His-SBP E⑶的蛋白質(zhì)序列在上文中給出。獲得的滴定曲線顯示<IGF-1R>VL_VH交 換抗體是功能性的并表現(xiàn)出在該方法的誤差范圍內(nèi)的與野生型<IGF-1R>抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合 特性和動(dòng)力學(xué)，并因此似乎是完全功能性的(圖13)。這些發(fā)現(xiàn)通過(guò)Biacore采用各自的純化抗體來(lái)確證。實(shí)施例IG使用過(guò)表達(dá)GF-IR的124細(xì)胞通過(guò)FACS分析單特異性二價(jià)<IGF-1R>VL_VH交換 抗體的IGF-IR結(jié)合特件為了驗(yàn)證，通過(guò)FACS研究<IGF-1R>VL_VH交換抗體與在124細(xì)胞(表達(dá)重組人 IGF-IR的NIH3T3細(xì)胞，Roche(FS))表面上過(guò)表達(dá)的IGF-IR的結(jié)合活性。簡(jiǎn)言之， 5xlOE5 124細(xì)胞/FACS管用純化的<IGF-1R>VL-VH交換抗體和作為參照的野生型<IGF-1R> 抗體的稀釋物來(lái)溫育，并在冰上溫育1小時(shí)。未結(jié)合的抗體用4ml冰冷PBS(Gibco)+2%FCS(Gibco)洗去。隨后，離心細(xì)胞(5分鐘，400g)并且在避光條件下，用F (ab ‘)2<hFc γ >PE 綴合物(Dianova)在冰上檢測(cè)結(jié)合的抗體1小時(shí)。未結(jié)合的檢測(cè)抗體用4ml冰冷 PBS(Gibco)+2% FCS(Gibco)洗去。隨后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心(5分鐘，400g)，重新懸浮在 300-500 μ L PBS 中，并且在 FACSCalibur 或 FACS Canto (BD (FL2 通道，10. 000 細(xì)胞 / 獲得 物)上量化結(jié)合的檢測(cè)抗體。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，包括各自的同種型對(duì)照，以排除任何非特異性 結(jié)合事件。<IGF-1R>VL-VH交換抗體和野生型<IGF_1R>參照抗體與124細(xì)胞上的IGF-IR 的結(jié)合導(dǎo)致相當(dāng)?shù)钠骄鶡晒鈴?qiáng)度的濃度依賴性偏移。實(shí)施例2單特異件二價(jià)<ANGPT2>野牛型抗體的描沭實(shí)施例2A制備單特異件二價(jià)<ANGPT2>野牛型抗體的表汰質(zhì)粒包括本實(shí)施例中所述的各種前導(dǎo)序列的單特異性二價(jià)ANGPT2<ANGPT2>野生型 抗體的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列源自W02006/045049中所述的人<ANGPT2>抗體重 鏈(SEQ ID NO 6)和輕鏈(SEQID NO :7)，且重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域源自人抗體(C-κ和 IgGl)。將野生型<ANGPT2>抗體克隆到與前述實(shí)施例IA中所述的載體類似的質(zhì)粒 SB04-pUC-HC-ANGPT2(SEQ ID NO 6)和 SB06-pUC-LC_ANGPT2(SEQ ID NO 7)中。為了比較的原因和為了共表達(dá)實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)實(shí)施例3)，由質(zhì)粒SB04-pUC-HC-ANGPT2和 SB06-pUC-LC-ANGPT2瞬時(shí)(共_)表達(dá)野生型<ANGPT2>抗體。實(shí)施例2B制備單特異性二價(jià)<ANGPT2>野生型抗體的表達(dá)質(zhì)粒編碼ANGPT2>HC和LC的核酸序列分別通過(guò)化學(xué)合成來(lái)合成并隨后在 Geneart (Regensburg,德國(guó))處，克隆至Ij 基于 pPCRScript (Stratagene)的 pGA4 克隆 載體中。將編碼<ANGPT2>HC的表達(dá)盒克隆到各種大腸桿菌質(zhì)粒中，以生成最終載體 SB04-pUC-HC-ANGPT2 ；將編碼各種<ANGPT2>LC的表達(dá)盒克隆到各種大腸桿菌質(zhì)粒中，以生 成最終載體SB06-pUC-LC-ANGPT2。亞克隆的核酸序列通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證。為了瞬時(shí)和穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染，通過(guò)來(lái)自轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒制備物來(lái)制備更大量的質(zhì)粒(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)。實(shí)施例3表達(dá)雙特異性二價(jià)<ANGPT2-IGF-1R>抗體，其中在特異性結(jié)合IGF-1R的重鏈和輕 鏈中，恒定結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換(本文中縮寫為<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體)。實(shí)施例3A在HEK293EBNA細(xì)胞中瞬時(shí)共表達(dá)和純化<IGF-1R>VL_VH交換抗體和<ANGPT2>野 生型抗體以生成雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體為了生成通過(guò)位于一側(cè)的<IGF_1R>VL-VH交換抗體Fab識(shí)別IGF-1R并通過(guò) 位于另一側(cè)的<ANGPT2>野生型Fab區(qū)識(shí)別<ANGPT2>的功能性雙特異性抗體，2個(gè)編碼 <IGF-1R>VL-VH交換抗體(實(shí)施例1A)的表達(dá)質(zhì)粒與2個(gè)編碼<ANGPT2>野生型抗體的表達(dá) 質(zhì)粒(實(shí)施例2A)共表達(dá)。假設(shè)野生型重鏈HC和VL-VH交換重鏈HC***統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，這導(dǎo) 致雙特異性二價(jià)<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體的生成。在兩種抗體同等充分表達(dá)并不考慮副產(chǎn)物的假設(shè)下，這應(yīng)該導(dǎo)致比例為1 2 1的三種主要產(chǎn)物A)<IGF-1R>VL-VH交 換抗體，B)雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體和C) <ANGPT2>野生型抗體的。可以 預(yù)期有幾種副產(chǎn)物。然而，由于僅交換VL-VH結(jié)構(gòu)域，副產(chǎn)物的頻率與完整Fab交換相比應(yīng) 該降低。請(qǐng)注意，由于<ANGPT2>野生型抗體表現(xiàn)出比<IGF-1R>野生型和<IGF-1R>VL_VH 交換抗體更高的表達(dá)瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)量，<ANGPT2>野生型抗體質(zhì)粒和<IGF-1R>VL-VH交換抗體 質(zhì)粒的比例向著有利于<ANGPT2>野生型抗體表達(dá)的方向偏移。為了生成主要產(chǎn)物A)<IGF-1R>VL-VH交換抗體，B)雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體和C) <ANGPT2>野生型抗體的混合物，在如上所述懸浮 的HEK293-F細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染四種質(zhì)粒pUC-HO#-IGF-lR和pUC-LO#-IGF_lR和質(zhì)粒 SB04-pUC-HC-ANGPT2 和 SB06-pUC_LC_ANGPT2。收獲的上清包含主要產(chǎn)物 A) <IGF_1R>VL-VH 交換抗體，B)雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體和C) <ANGPT2>野生型抗體的混合 物，并表示為“雙特異性VL-VH交換混合物”。包含雙特異性VL-VH交換混合物的細(xì)胞培養(yǎng) 物上清通過(guò)離心收獲并隨后如上所述進(jìn)行純化。該抗體混合物的完整性通過(guò)所述的在存在和缺乏還原劑的SDS-PAGE并隨后用考 馬斯亮藍(lán)染色以及通過(guò)大小排阻層析來(lái)分析。如預(yù)期地那樣，SDS-PAGE顯示制備物中存在 2條不同的重鏈和輕鏈(還原的凝膠)(圖14)。提供表征的樣品，以進(jìn)行隨后的蛋白分析 和功能表征。實(shí)施例3B^h I24IGF-1R表汰細(xì)朐K^hM朐FACS橋連測(cè)丨定中檢測(cè)丨功能t牛雙特異十牛 <ANGPT2-IGF~1R>VL-VH 交換抗體為了證實(shí)來(lái)自實(shí)施例3A中所述的瞬時(shí)共表達(dá)的主要產(chǎn)物A) <IGF-1R>VL-VH交換 抗體，B)雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體和C) <ANGPT2>野生型抗體的純化雙 特異性VL-VH交換混合物中存在功能性雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體，對(duì)124 細(xì)胞(表達(dá)重組人IGF-IR的NIH3T3細(xì)胞，Roche(FS))進(jìn)行細(xì)胞FACSIGF-1R-ANGPT2 橋連測(cè)定。該測(cè)定的原理在圖10中描述。純化的抗體混合物中存在的的雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體能夠同時(shí)結(jié)合124細(xì)胞中的IGF-IR和結(jié)合ANGPT2 ；且因 此應(yīng)該用兩個(gè)相對(duì)的Fab區(qū)橋連它的兩個(gè)靶抗原。簡(jiǎn)言之，5xlOE5I24細(xì)胞/FACS管與總純化抗體混合物溫育，并在冰上溫育1小時(shí) (滴定160 μ g/ml混合物)。將各種純化抗體野生型<IGF-1R>和<ANGPT2>應(yīng)用于124細(xì) 胞作為對(duì)照。未結(jié)合的抗體用4ml冰冷PBS (Gibco)+2% FCS(Gibco)洗去，離心細(xì)胞(5分 鐘，400g)并且用50 μ 1 2 μ g/mL人ANGPT2 (R&D Systems (R&D系統(tǒng)))在冰上檢測(cè)結(jié)合的 雙特異性抗體1小時(shí)。隨后，用4ml冰冷PBS (Gibco)+2% FCS(Gibco)洗滌一次或兩次，洗 去未結(jié)合的ANGPT2,離心細(xì)胞(5分鐘，400g)并且用50 μ 1 5 μ g/mL<ANGPT2>mIgGl_生物 素抗體(BAM0981，R&D Systems (R&D系統(tǒng)))在冰上檢測(cè)結(jié)合的ANGPT245分鐘；備選地，用 50 μ 1 5 μ g/mL mlgGl-生物素-同種型對(duì)照(R&D Systems (R&D系統(tǒng)))溫育細(xì)胞。未結(jié) 合的檢測(cè)抗體用4ml冰冷PBS (Gibco)+2% FCS(Gibco)洗去，離心細(xì)胞(5分鐘，400g)并且 在避光條件下，用50 μ 1 1 400鏈霉親和素-PE綴合物(Invitrogen/Zymed)在冰上檢 測(cè)結(jié)合的檢測(cè)抗體45分鐘。未結(jié)合的鏈霉親和素-PE綴合物用4ml冰冷PBS (Gibco) +2% FCS(Gibco)洗去。隨后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心(5分鐘，400g)，重新懸浮在300-500 μ L PBS中，并且在FACSCalibur (BD (FL2通道，10. 000細(xì)胞/獲得物)上量化結(jié)合的鏈霉親和素-PE綴 合物。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，包括各自的同種型對(duì)照，以排除任何非特異性結(jié)合事件。另外，包括 純化的單特異性二價(jià)IgGl抗體<IGF-1R>和<ANGPT2>，作為對(duì)照。圖15中的結(jié)果顯示使用來(lái)自交叉抗體(<IGF-1R>VL_VH交換抗體)與野生型抗 體(<ANGPT2>野生型抗體)的共表達(dá)的純化抗體交叉混合物(<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換 抗體)溫育導(dǎo)致熒光的顯著偏移，這說(shuō)明存在能夠同時(shí)結(jié)合124細(xì)胞中的IGF-IR和結(jié)合 ANGPT2的功能性雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體；并由此使用兩個(gè)相對(duì)的Fab 區(qū)橋連它的兩個(gè)靶抗原。與此相反，各自<IGF-1R>和<Ang-2>對(duì)照抗體在FACS橋連測(cè)定 中不引起熒光的偏移?？傊?，這些數(shù)據(jù)顯示通過(guò)共表達(dá)可以生成各自的野生型和交換質(zhì)粒功能性雙特異 性抗體。正確的雙特異性抗體的產(chǎn)率可以通過(guò)例如使用杵-進(jìn)入白技術(shù)以及二硫鍵穩(wěn)定作 用來(lái)促進(jìn)野生型和修飾的交換重鏈的異型二聚化來(lái)提高(見(jiàn)實(shí)施例4)。實(shí)施例4表汰H有修飾的CH3結(jié)構(gòu)域(杵-講入-臼)的二價(jià)雙特異件 ANGPT2-IGF~1R>VL-VH 交換抗體為了進(jìn)一步提高雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL_VH交換抗體的產(chǎn)率，將杵-進(jìn) 入_臼技術(shù)應(yīng)用于<IGF-1R>VL-VH交換和野生型<ANGPT2>抗體的共表達(dá)，以獲得同質(zhì)和功 能性的雙特異性抗體制劑。為了該目的，<IGF-1R>VL-VH交換抗體的重鏈*HC*中的CH3結(jié) 構(gòu)域被替換為具有T366W交換的SEQ ID NO 8的CH3結(jié)構(gòu)域(杵)，且野生型<ANGPT2>抗 體的重鏈中的CH3結(jié)構(gòu)域被替換為具有T366S，L368A，Y407V交換的SEQ ID NO 9的CH3結(jié) 構(gòu)域(白)，或反之亦然。另外，可以包括二硫鍵以增加穩(wěn)定性和產(chǎn)率以及另外的殘基形成 離子鍵并增加異型二聚化產(chǎn)率(EP 1870459A1)。由此生成的具有修飾的CH3結(jié)構(gòu)域(杵-進(jìn)入-臼)的二價(jià)雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH交換抗體的瞬時(shí)共表達(dá)和純化如實(shí)施例3中所述進(jìn)行。應(yīng)該注意到異型二聚化的優(yōu)化可以例如通過(guò)使用不同的杵-進(jìn)入-白技術(shù)諸如將 額外的二硫鍵引入CH3結(jié)構(gòu)域中，例如，將Y349C引入“杵鏈”中并將D356C引入“臼鏈”中 和/或與由EP 1870459A1所述的用于杵殘基的R409D ；殘基K370E(K409D)和用于臼殘基 的D399K ；E357K相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。與實(shí)施例4類似地，可以制備具有修飾的CH3結(jié)構(gòu)域(杵-進(jìn)入-臼)的其他二 價(jià)雙特異性VL-VH交換抗體，它們針對(duì)ANGPT2和另一靶抗原(使用上述ANGPT2重鏈和輕 鏈和針對(duì)所述其他靶標(biāo)的抗體的VL-VH交換重鏈和輕鏈***HC***和LC***，由此兩條重鏈 均通過(guò)“杵_進(jìn)入-臼”而被修飾)，或針對(duì)IGF-IR和另一靶標(biāo)(使用針對(duì)所述其他靶標(biāo)的 抗體的重鏈和輕鏈和上述IGF-1R VL-VH交換重鏈和輕鏈***HC***和LC***，由此兩條重鏈 均通過(guò)“杵-進(jìn)入-白”而被修飾)。
權(quán)利要求
二價(jià)雙特異性抗體，其包括a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各自在包括抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的 初始界面的界面處相接觸；其中所述界面被改變以促進(jìn)形成所述二價(jià)雙特異性抗體，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與所述二價(jià)雙特異性抗體內(nèi)的另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接觸的 一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域 的界面內(nèi)生成凸起，所述凸起可以定位在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凹洞中且b)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與所述二價(jià)雙特異性抗體內(nèi)的第一 CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接觸的第二 CH3 結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在所述第二 CH3結(jié)構(gòu)域的 界面內(nèi)生成凹洞，在所述凹洞中可以定位所述第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凸起。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于所述具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色 氨酸(W)組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于所述具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，纈氨 酸(V)組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于通過(guò)引入半胱氨酸(C)作為每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)位置處的氨基酸來(lái)進(jìn)一步改變兩個(gè) CH3結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于兩條重鏈的恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CH3之一被替換為恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CHl ；且另一個(gè)恒定重 鏈結(jié)構(gòu)域CH3被替換為恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL。
7.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的二價(jià)雙特異性抗體的方法，其包括下列步驟a)用以下各項(xiàng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可變結(jié) 構(gòu)域VL和VH相互替換；b)在容許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。
8.一種宿主細(xì)胞，其包括-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子；-載體，其包括編碼特異性結(jié)合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可變結(jié) 構(gòu)域VL和VH相互替換。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的二價(jià)雙特異性抗體的組合物，優(yōu)選藥物或診斷組合物。
10.一種藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的二價(jià)雙特異性抗體和至少一種 藥用賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型的結(jié)構(gòu)域交換的、二價(jià)的、雙特異性抗體，及其制備和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/46GK101903404SQ200880121900
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2008年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者克里斯蒂安·克萊因, 沃爾夫?qū)ぶx弗 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司