專利名稱：與FcRn結(jié)合改變的Fc變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及優(yōu)化的IgG免疫球蛋白變體、用于制備它們的工程化方法、以及它們 的應(yīng)用，尤其是用于治療目的的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗體是各自與特異性抗原結(jié)合的免疫蛋白。在包括人和小鼠在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動(dòng) 物中，抗體是由成對的多肽重鏈和輕鏈構(gòu)成的。每個(gè)鏈由各自的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域 構(gòu)成，因此將通用術(shù)語免疫球蛋白用于這種蛋白。每條鏈由兩個(gè)不同的區(qū)域構(gòu)成，這兩個(gè) 不同的區(qū)域稱為可變區(qū)和恒定區(qū)。輕鏈和重鏈可變區(qū)在抗體之間顯示明顯的序列多樣性， 并且負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原。恒定區(qū)顯示較少的序列多樣性，并且負(fù)責(zé)結(jié)合許多天然蛋白以引發(fā) 重要的生物化學(xué)事件。在人中，有5種不同種類的抗體，包括IgA(它包括IgAl和IgA2亞 類)、IgD, IgE, IgG (它包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞類)、以及IgM0這些抗體種類之 間的區(qū)別特征為他們的恒定區(qū)，盡管V區(qū)也可能存在細(xì)微的不同。IgG抗體是由兩條重鏈 和兩條輕鏈構(gòu)成的四聚體蛋白。IgG重鏈由四個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域從N-末端至C-末端以 VH-CH1-CH2-CH3的順序連接構(gòu)成，VH-CH1-CH2-CH3分別是指重鏈可變結(jié)構(gòu)域、重鏈恒定結(jié) 構(gòu)域1、重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2、和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3 (也稱為VH-C y I-C Y2-CY3,分別是指重鏈 可變結(jié)構(gòu)域、Yl恒定結(jié)構(gòu)域、Y 2恒定結(jié)構(gòu)域、和Y 3恒定結(jié)構(gòu)域)。IgG輕鏈由兩個(gè)免疫 球蛋白結(jié)構(gòu)域從N-末端至C末端以VL-CL的順序連接構(gòu)成，VL-CL分別是指輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在IgG中，F(xiàn)c上C γ 2和C γ 3結(jié)構(gòu)域之間的位點(diǎn)介導(dǎo)與新生兒受體FcRn的相互作 用。與FcRn的結(jié)合會(huì)從內(nèi)體中將內(nèi)吞的抗體再循環(huán)回血流中(Raghavan等人，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181_220 ;Ghetie 等人，2000，Annu Rev Immunol 18 :739_76，它們都通過引用整體并入)。這個(gè)過程結(jié)合由于全長分子的大尺寸所引起的腎過濾的排除致使有 利抗體的血清半衰期介于1至3周。Fc與FcRn的結(jié)合還在抗體運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用。Fc上 的FcRn結(jié)合位點(diǎn)也是細(xì)菌蛋白A和G結(jié)合的位點(diǎn)。通常使用這些蛋白的緊密結(jié)合作為純化 抗體的方法，該方法在蛋白純化期間采用蛋白A或蛋白G親和色譜進(jìn)行。因此，F(xiàn)c上這個(gè)區(qū) 域的保真性對于抗體的臨床特性和它們的純化很重要。大鼠Fc/FcRn復(fù)合體(Burmeister 等人，1994，Nature, 372 :379_383 ；Martin 等人，2001，Mol Cell 7 :867_877，它們都通過 引用整體并入)、以及Fc與蛋白A和G的復(fù)合體(Deisenhofer，1981，Biochemistry 20 2361-2370 ；Sauer-Eriksson 等人，1995，Structure 3 :265_278 ；Tashiro 等人，1995，Curr OpinStruct Biol 5 :471_481，它們都通過引用整體并入)的可用結(jié)構(gòu)使得能夠深入了解 Fc與這些蛋白的相互作用。FcRn受體還負(fù)責(zé)將IgG轉(zhuǎn)移到新生兒的腸和成人腸表皮腔 (Ghetie 禾口 Ward，Annu. Rev. Immunol. ，2000，18 739-766 ；Yoshida 等人，Immunity, 2004, 20(6) 769-783，它們都通過引用整體并入)。大鼠和人Fc結(jié)構(gòu)域的研究證明了一些Fc殘基對FcRn結(jié)合的重要性。大鼠和人序 列在Fc區(qū)(根據(jù)EU索引的編號(hào)為殘基237-443)具有約64%的序列同一性。關(guān)于大鼠/ 人的Fe、FcRn重鏈和FcRn輕鏈(β_2_微球蛋白)的比對參見圖3、4和5。已經(jīng)從大鼠Fe/ FcRn復(fù)合體的現(xiàn)有結(jié)構(gòu)建立了人Fc/FcRn復(fù)合體的模型(Martin等人，2001，Mol Cell 7 867-877，通過引用整體并入)。大鼠和人序列共有對于FcRn結(jié)合很關(guān)鍵的一些殘基，例如 H310 和 H435 (Medesan 等人，1997J. Immunol. 158(5) :221_7 ；Shields 等人，2001，J. Biol. Chem. 276 (9) :6591_6604，它們都通過引用整體并入)。然而，在許多位置，人和大鼠蛋白具 有不同的氨基酸，使得人序列中的殘基與大鼠序列中的殘基具有不同的環(huán)境，并且可能具 有不同的特征。這種變異性限制了將特征從一個(gè)同源物轉(zhuǎn)移到另一同源物的能力。在鼠Fc中，在T252、T254、和T256位點(diǎn)的隨機(jī)突變和噬菌體展示選擇產(chǎn)生了三 突變體T252L/T254S/T256F，該三突變體的FcRn親和力增加了 3. 5倍，血清半衰期增加了 1. 5 倍(Ghetie 等人，1997，Nat. Biotech. 15(7) :637_640，通過引用整體并入)。通過在 位置253、310和435突變破壞Fc/FcRn的相互作用還導(dǎo)致體內(nèi)半衰期降低(Medesan等人 J. Immunol. 1997158 (5) :2211_7，通過引用整體并入)。已經(jīng)在人Fc γ中對一些對于與FcRn結(jié)合很重要的殘基進(jìn)行了突變研究，并且已 經(jīng)證明它們具有增加的血清半衰期。在人Fc Yl中，Hinton等人將三個(gè)殘基分別突變?yōu)榱?外19種常見的氨基酸。Hinton等人發(fā)現(xiàn)某些點(diǎn)會(huì)突變?yōu)镕cRn結(jié)合親和力增加的雙突變體 (Hinton等人2004，J. Biol. Chem. 279(8) :6213_6216 ;Hinton等人 Journal of Immunology 2006,176 :346-356，它們都通過引用整體并入)。在猴子中，兩種突變具有增加的半衰期。 Shields等人將殘基幾乎都突變?yōu)锳la，并且研究了它們與FcRn和Fc γ R的結(jié)合(Shields 等人，2001，J.Biol. Chem. ,276(9) :6591_6604，通過引用整體并入)。Dair Acqua等人使用噬菌體展示選擇了與FcRn結(jié)合的親和力增加的Fc突變 (Dair Acqua 等人 2002，J. Immunol. 169 :5171_5180，通過引用整體并入)。所選擇的 DNA 序列主要為雙突變體和三突變體。該參考文獻(xiàn)表達(dá)了他們所選擇的序列中的一些所編碼的 蛋白，并且發(fā)現(xiàn)某些能比野生型Fc更緊密地結(jié)合FcRn?？贵w和Fc融合蛋白作為治療劑的施用需要指定頻率的注射，該指定頻率與所述 蛋白的清除和半衰期特征相關(guān)。較長的體內(nèi)半衰期容許更少地注射或較低的劑量，這很明
4顯是有利的。盡管過去在Fc結(jié)構(gòu)域中的突變已經(jīng)得到了具有增加的FcRn結(jié)合親和力和體 內(nèi)半衰期的一些蛋白，但是這些突變還沒有鑒定最佳的突變和增強(qiáng)的體內(nèi)半衰期。Fc區(qū)的一個(gè)特征是在N297處發(fā)生的N-連接的糖基化是保守的。這種碳水化 合物或有時(shí)稱為寡糖，在抗體中起著關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和功能作用，并且是抗體必須使用哺乳 動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)制備的一個(gè)主要原因。Umafta等人，1999，Nat Biotechnol 17:176-180; Davies 等人，2001，Biotechnol Bioeng 74 :288_294 ；Mimura 等人，2001，J Biol Chem 276 45539-45547. ；Radaev 等人，2001，J BiolChem 276 :16478_16483 ；Shields 等人， 2001，J Biol Chem 276 :6591_6604 ;Shields 等人，2002，J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons 等人，2002，JImmunol Methods 263:133—147 ；Radaev 等人，2001，J Biol Chem276 16469-16477 ；以及 Krapp 等人，2003，JMol Biol 325 :979_989，它們都通過引用整體并 入)?？贵w已經(jīng)被開發(fā)用于治療用途。關(guān)于這種治療的代表性公開物包括=Chamow等 A, 1996, Trends Biotechnol 14 52-60 ；Ashkenazi φ A,1997, CurrOpin Immunol 9 195-200 ;Cragg 等人，1999，Curr Opin Immunol 11 :541_547 ;Glennie 等人，2000，Immunol Today 21 :403_410 ;McLaughlin 等人，1998，JClin Oncol 16 :2825_2833 ；以及 Cobleigh 等人，1999，J Clin Oncol 17 :2639_2648，它們都通過引用整體并入。對于目前的抗癌治療， 死亡率方面的任何小的改進(jìn)就表明了成功。本文所公開的某些IgG變體增強(qiáng)了抗體限制靶 癌細(xì)胞的進(jìn)一步生長或至少部分破壞靶癌細(xì)胞的能力?？贵w的抗腫瘤效力是通過增強(qiáng)它們介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)子功能例如ADCC、ADCPJP CDC 的能力而達(dá)成的。實(shí)例包括Clynes 等人，1998，ProcNatl Acad Sci USA95 :652_656 ； Clynes 等人，2000，Nat Med 6 443-446 以及 Cartron 等人，2002，Blood 99 :754_758，它們 都通過引用整體并入。人IgGl是用于治療目的的最常用的抗體，并且在此方面已經(jīng)進(jìn)行了大量的工程 化研究。然而，IgG種類的不同同種型包括IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4具有獨(dú)特的物理、生 物和臨床特性。在本領(lǐng)域內(nèi)需要設(shè)計(jì)改良的IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4變體。還需要設(shè)計(jì) 與天然IgG多肽相比改良了與FcRn的結(jié)合和/或增加了體內(nèi)半衰期的這類變體。此外，需 要將具有改良的藥代動(dòng)力學(xué)特性的變體與包括通過改變的Fc γ R結(jié)合而改善效力的修飾 的變體組合。本申請滿足了這些和其他的需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及親本多肽的Fc變體，該變體包括在多肽的Fc區(qū)的至少一個(gè)修飾。在 各實(shí)施方式中，所述變體多肽表現(xiàn)出與親本多肽相比改變的與FcRn的結(jié)合。在某些變化形 式中，修飾可以選自由下列組成的組428L、434M和434S，其中編號(hào)是根據(jù)Kabat等人的EU 索引進(jìn)行的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 252Y/428L、428L/434H、428L/434F、428L/434Y、428L/434A、428L/434M、和 428L/434S。在另一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少一個(gè)修飾M428L/ N434S、V308F/M428L/N434S。在另一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少一個(gè)修 飾259I/434S、308F/434S、308F/428L/434S、259I/308F/434S、307Q/308F/434S、250I/308F/434S和 308F/319L/434S。在另一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少一個(gè)修飾在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括治療需要所述治療的患者的方法，該方法包括 施用有效量的本文所述的Fc變體。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括通過根據(jù)本文所述的修飾對Fc進(jìn)行修飾來增加 抗體或免疫粘附素的半衰期的方法。在另一變體中，本發(fā)明包括與調(diào)控效應(yīng)子功能的另一 Fc變體的FcRn結(jié)合增強(qiáng)的 Fc變體。附圖簡述

圖1.人IgG恒定區(qū)重鏈的序列比對。灰色表示與IgGl的不同，方框內(nèi)的殘基表 示人群中常見的同種異型變異。圖2. (SEQ ID NO :1_6)本發(fā)明中所用的恒定區(qū)的氨基酸序列。圖3. (SEQ ID NO :7_12)示例性變體恒定區(qū)的氨基酸序列。圖4. (SEQ ID NO 13-22)本發(fā)明中所用的VH和VL可變區(qū)的氨基酸序列。圖5. (SEQ ID NO :23_29)示例性變體抗體的氨基酸序列。圖6.野生型與選擇的變體IgGl抗VEGF抗體的相對VEGF結(jié)合。該圖顯示在抗體分 析物與固定的VEGF抗原結(jié)合的結(jié)合期結(jié)束時(shí)的Biacore響應(yīng)單位(RU)。使用抗Her2IgGl 抗體作為陰性對照。圖7.在低(6.0)和高(7. 4)pH下野生型和變體IgG抗體與固定的人FcRn的 Biacore 傳感圖(sensorgram)。圖8.如通過Biacore所測定的在pH6. 0下野生型和選擇的變體IgGl抗體與人 FcRn的FcRn結(jié)合親和力。該圖顯示對數(shù)標(biāo)度的假親和力常數(shù)(Ka*)的圖。圖9.如通過Biacore所測定的變體IgGl抗VEGF抗體與人FcRn的相對結(jié)合。該 表顯示了各變體相對于人野生型(天然的)IgGl的Kf倍數(shù)。η表示各變體被測試的次數(shù)， 均值和SD表示在η次結(jié)合實(shí)驗(yàn)中各個(gè)變體各自的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在每個(gè)單獨(dú)的結(jié)合 實(shí)驗(yàn)中計(jì)算了所有變體相對于野生型IgGl的FcRn倍數(shù)。NB表示沒有檢測到結(jié)合。ND表 示沒有測定對于該具體變體的結(jié)合。NF表示結(jié)合數(shù)據(jù)可能不擬合。圖10.如通過Biacore所測定的變體IgG2和IgGl/2抗VEGF抗體與人FcRn的相 對結(jié)合。該表如圖9中所描述的一樣。圖11.加性的和協(xié)同的取代組合的分析。圖Ila顯示實(shí)驗(yàn)測定的各變體與人FcRn 的結(jié)合倍數(shù)相對于如通過單變體的乘積確定的所預(yù)測的FcRn結(jié)合倍數(shù)的圖。標(biāo)記了變體 數(shù)據(jù)點(diǎn)，直線代表完美的加性作用。圖lib顯示各組合變體的實(shí)驗(yàn)和預(yù)測倍數(shù)之間的不 同。圖Ilc顯示各變體組合的協(xié)同作用。％協(xié)同作用計(jì)算為IOOX [(實(shí)驗(yàn)倍數(shù)/預(yù)測倍 數(shù))_1)]。圖12.如通過Biacore所測定的變體抗TNF、抗CD25、抗EGFR和抗IgE抗體與人 FcRn的相對結(jié)合。該表如圖9中所描述的一樣。圖13.在mFCRn-/-hFCRn+小鼠中野生型和變體抗體的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。該圖繪 制了在單次靜脈內(nèi)給藥后抗體的血清濃度相對于時(shí)間的圖。圖13a顯示來自用IgGl抗體 進(jìn)行的4次研究中的一次(研究3)的數(shù)據(jù)，圖13b顯示來自用IgG2抗體進(jìn)行的研究(研究5)的數(shù)據(jù)。圖14.來自在mFCRn-/-hFCRn+小鼠中用變體和野生型抗體進(jìn)行的所有體內(nèi)藥代 動(dòng)力學(xué)(PK)研究的擬合PK參數(shù)。η表示每組的小鼠數(shù)，提供了 PK參數(shù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD)數(shù)據(jù)。半衰期表示表征抗體從血清中消除的β期。Cmax是觀察到的最大血清濃度， AUC是濃度時(shí)間曲線下的面積，并且清除率是抗體從血清中的清除率。半衰期倍數(shù)計(jì)算為在 各研究中變體抗體的半衰期與野生型IgGl或IgG2親本的半衰期的比。圖15.在mFcRn-/-hFcRn+小鼠中IgGl (圖15a)禾Π IgG2(圖15b)變體抗體的半 衰期與相對于野生型IgGl的FcRn結(jié)合倍數(shù)之間的相關(guān)性。y軸上的數(shù)據(jù)來自圖14，χ軸 上的數(shù)據(jù)來自圖9和10。標(biāo)記出了選擇的變體，圈出了來自重復(fù)實(shí)驗(yàn)的變體數(shù)據(jù)。圖15c 顯示IgGl和IgG2兩者的相關(guān)性數(shù)據(jù)，其中黑線和灰線分別表示IgGl和IgG2數(shù)據(jù)的擬合。圖16. (SEQ ID NO :30_35)本發(fā)明中所用的變體和親本抗TNF Fc免疫粘附素的氨 基酸序列。圖17.如Biacore所測定的抗TNF免疫粘附素與TNF抗原的結(jié)合。圖18.如通過Biacore所測定的變體Fc免疫粘附素與人FcRn的相對結(jié)合。該表 顯示了各變體相對于人野生型(天然的)IgGl的Kf倍數(shù)。η表示各變體被測試的次數(shù)，均 值和SD表示在η次結(jié)合實(shí)驗(yàn)中每個(gè)變體各自的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在每個(gè)單獨(dú)的結(jié)合實(shí) 驗(yàn)中計(jì)算了所有變體相對于各自的IgGl親本的FcRn倍數(shù)。圖19.在mFCRn-/-hFCRn+小鼠中親本和變體Fc免疫粘附素的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。 該圖繪制了在單次靜脈內(nèi)給藥后Fc融合體的血清濃度相對于時(shí)間的圖。圖20.來自mFcRn-/_hFcRn+小鼠中體內(nèi)PK研究的Fc融合體的擬合PK參數(shù)。參 數(shù)如在圖14中所描述的一樣。半衰期的％增加計(jì)算為100乘以變體融合體與野生型IgGl 或IgG2親本的半衰期的比。圖21.如通過Biacore所測定的變體IgGl抗VEGF抗體與短尾猴和人FcRn的相 對結(jié)合。圖21a顯示表格形式的數(shù)據(jù)。圖的說明如圖9中一樣，與人FcRn結(jié)合的數(shù)據(jù)取自 圖9。圖21b顯示了數(shù)據(jù)圖。圖22.在短尾猴中野生型和變體抗體的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。該圖繪制了在單次靜脈 內(nèi)給藥后抗體的血清濃度相對于時(shí)間的圖。圖23.來自在短尾猴中用變體和野生型抗體進(jìn)行的體內(nèi)PK研究的擬合PK參數(shù)。 參數(shù)如圖14中所描述的一樣。發(fā)明詳述本發(fā)明公開了新的Fc結(jié)構(gòu)域變體的制備，所述Fc結(jié)構(gòu)域變體包括在抗體、Fc融 合體、和免疫粘合素中存在的那些，所述Fc結(jié)構(gòu)域變體與FcRn受體的結(jié)合增強(qiáng)。如本文所 提到的，與FcRn的結(jié)合產(chǎn)生了較長的體內(nèi)血清滯留。為了增加體內(nèi)的Fc蛋白滯留，結(jié)合親和力的增加必須在約pH 6的條件下，而在約 PH 7. 4的條件下則保持較低的親和力。盡管仍處于檢測階段，但是相信Fc區(qū)具有較長的體 內(nèi)半衰期，因?yàn)樵赑H 6時(shí)在與內(nèi)體中FcRn的結(jié)合隔離了 Fc (Ghetie和Ward，1997Immunol Today. 18(12) :592_598，通過引用整體并入)。然后內(nèi)體隔室將Fc再循環(huán)到細(xì)胞表面。一 旦隔室向胞外空間開放，較高的PH約7. 4便誘導(dǎo)Fc釋放回血液中。在小鼠中，DairAcqua 等人顯示在PH 6和pH 7. 4的條件下FcRn結(jié)合增加的Fc突變體實(shí)際上與野生型Fc相比
7具有降低的血清濃度和相同的半衰期(Dall，Acqua等人2002，J. Immunol. 169 :5171_5180， 通過引用整體并入)。認(rèn)為在PH 7. 4時(shí)Fc與FcRn的親和力增加阻止了 Fc釋放回血液。 因此，增加Fc體內(nèi)半衰期的Fc突變理想地應(yīng)在較低pH下增加FcRn結(jié)合，而在較高pH下 則仍然容許Fc釋放。氨基酸組氨酸在6.0至7.4的pH范圍內(nèi)會(huì)改變其電荷狀態(tài)。因此， 在Fc/FcRn復(fù)合體的重要位置發(fā)現(xiàn)His殘基并不出乎意料(圖6)。本發(fā)明的另一方面是增加與野生型相比的FcRn結(jié)合，尤其是在較低的pH約pH6.0 下，以促進(jìn)Fc/FcRn在內(nèi)體中的結(jié)合。由于對Fc γ R的差異結(jié)合，尤其是與Fc Y RIIIb結(jié)合 增加并且與Fc γ RIIb結(jié)合降低，已顯示導(dǎo)致效力增加，還公開了與FcRn結(jié)合改變并且與另 一類Fc受體Fc γ R(有時(shí)寫為Fc伽馬R)的結(jié)合改變的Fc變體。定義為了可以更完整地理解本申請，下面列出了一些定義。這些定義的意思涵蓋語法 上的等同物。本文所用的“ADCC”或“抗體依賴件細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”意指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng), 其中表達(dá)Fc γ R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上所結(jié)合的抗體，并且隨后引起靶細(xì) 胞的裂解。本文所用的“ ADCP ”或抗體依賴件細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用意指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng),其中 表達(dá)Fc γ R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上所結(jié)合的抗體，并且隨后引起靶細(xì)胞的 吞噬作用。本文所謂的“修飾”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失，或者與蛋白 化學(xué)連接部分的改變。例如，修飾可以是連接到蛋白上的碳水化合物或PEG結(jié)構(gòu)的改變。本 文所謂的“氨基酸修飾”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失。本文所謂的“氨基酸取代”或“取代”意指將在親本多肽序列的特定位置的氨基酸 替換為另一氨基酸。例如，取代E272Y是指變體多肽，在這種情況下為Fc變體，其中位置 272處的谷氨酸被替換為酪氨酸。本文所謂的“氨基酸插入”或“插入”意指在親本多肽序列的特定位置的氨基酸 序列的添加。例如，-233E或"233E是指在位置233后和位置234前的谷氨酸插入。此 外，-233ADE或"233ADE是指位置233之后和位置234之前的AlaAspGlu插入。本文所謂的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在親本多肽序列的特定位置的氨基酸 序列的去除。例如，E233-或E233#是指在位置233處的谷氨酸缺失。此外，EDA233-或 EDA233#是指在位置233處開始的GluAspAla序列的缺失。本文所用的“變體蛋白”或“蛋白變體”、或“變體”意指由于至少一個(gè)氨基酸修飾 而與親本蛋白不同的蛋白。蛋白變體可以指蛋白本身、包含蛋白的組合物、或編碼它的氨基 酸序列。優(yōu)選地，蛋白變體與親本蛋白相比具有至少一個(gè)氨基酸修飾，例如與親本相比約1 至約70個(gè)氨基酸修飾，優(yōu)選約1至約5個(gè)氨基酸修飾。本文的蛋白變體序列優(yōu)選具有與親 本蛋白序列至少約80%的同源性，并且最優(yōu)選至少約90%的同源性，更優(yōu)選至少約95%的 同源性。變體蛋白可以指變體蛋白本身、包含蛋白變體的組合物、或編碼它的DNA序列。因 此,本文所用的“抗體變體”或“變體抗體”意指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而與親本抗體不同 的抗體，本文所用的“ IgG變體”或“變體ISG”意指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而與親本IgG 不同的抗體，并目.本文所用的“免疫球蛋白變體”或“變體免疫球蛋白”意指由于至少一個(gè)氨
8基酸修飾而與親本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。本文所用的“Fe變體”或“變體 壓”意指包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域中的修飾的蛋白。本發(fā)明的Fc變體根據(jù)構(gòu)成它們的氨基酸修飾來定 義。因此。例如N434S或434S是相對于親本Fc多肽在位置434處具有取代絲氨酸的Fc變 體，其中編號(hào)是根據(jù)EU索引進(jìn)行的。同樣地，M428L/N434S定義了具有取代M428L和N434S 的Fc變體。相對于親本Fc多肽。野生型氨基酸的身份可能是非特異性的，在這種情況下， 上述變體稱為428L/434S。注意其中取代的順序是任意提供的，也就是說，例如，428L/434S 是與M428L/N434S相同的Fc變體，等等。對于本發(fā)明所討論的所有位置，編號(hào)根據(jù)EU索引 進(jìn)行。EU索引或如Kabat中的EU索引或EU編號(hào)方案是指EU抗體的編號(hào)(Edelman等人， 1969，Proc Natl Acad SciUSA 63 :78_85，其通過引用整體并入本文)。修飾可以是添加、 缺失、或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。變體可以包含非 天然氨基酸。實(shí)例包括 US 6, 586, 207 ；WO 98/48032 ；WO 03/073238 ；US2004-0214988A1 ；WO 05/35727A2 ；WO 05/74524A2 ;J. W. Chin等人，(2002), Journal of the American Chemical Society 124 :9026_9027 ; J. W. Chin 和 P. G. Schultz，(2002)，ChemBioChem 11 :1135_1137 ； J. W. Chin，等人，(2002) ,PICAS United States of America 99 :11020-11024 ；以及L. Wang 和P.G. Schultz, (2002), Chem. 1-10，它們都通過引用整體并入。如本文所用在本文意指至少兩個(gè)共價(jià)連接的氨基酸，它包括蛋白、多肽、 寡肽和肽。肽基基團(tuán)可以包含天然存在的氨基酸和肽鍵、或合成的肽模擬物結(jié)構(gòu)，即“類似 物”，如類肽(參見Simon等人，PNAS USA89 (20) :9367 (1992)，其通過引用整體并入)。氨 基酸可以是天然存在的或非天然存在的，如本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所了解的一樣。例如高 苯丙氨酸、瓜氨酸、和正亮氨酸是本發(fā)明目的所考慮的氨基酸，并且D-和L- (R或S)構(gòu)型的 氨基酸都可以使用。本發(fā)明的變體可以包含使用非天然氨基酸的修飾，這些非天然氨基酸 使用例如Schultz和同事所開發(fā)的技術(shù)來整合，所述技術(shù)包括但不下于下列文獻(xiàn)中所描述 的方法Cropp & Shultz, 2004, TrendsGenet. 20(12) :625_30 ；Anderson 等人，2004，Proc Natl Acad Sci USA101 (2) :7566_71 ;Zhang 等人，2003，303 (5656) :371_3 ；和 Chin 等人， 2003, Science 301(5635) :964_7，它們?nèi)客ㄟ^引用整體并入。此外，多肽可以包括一個(gè)或 多個(gè)側(cè)鏈或末端的合成衍生、糖基化、PEG化、環(huán)狀排列、環(huán)化、與其他分子的連接子、與蛋白 或蛋白結(jié)構(gòu)域的融合體、以及肽標(biāo)簽或標(biāo)記的添加。本文所用的“_”意指蛋白的位置及其相關(guān)的氨基酸身份。例如，天冬酰胺 297 (還稱為Asn297或N297)是人抗體IgGl中位置297處的殘基。本文所用的“Fab，，或“Fab區(qū)”意指包含VH、CHl、VL和CL免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多 肽。Fab可以指分離狀態(tài)的這個(gè)區(qū)域，或在全長抗體、抗體片段或Fab融合蛋白背景下的這 個(gè)區(qū)域。如本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv區(qū)”意指包含單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域 的多肽。本文所用的“IgG亞類修飾”意指將一種IgG同種型的一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌摹?比對的IgG同種型的對應(yīng)氨基酸的氨基酸修飾。例如，由于在EU位置296處IgGl包含酪 氨酸，IgG2具有苯丙氨酸，因此IgG2中的F296Y取代被認(rèn)為是IgG亞類修飾。本文所用的“非天然存在的修飾”意指非同種型的氨基酸修飾。例如，由于沒有一 種IgG在位置434包含絲氨酸，所以IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4中的取代434S被認(rèn)為是非 天然存在的修飾。
本文所用的“氨基酸”和“氨基酸身份”意指可以在特定的、指定的位置存在的20 種天然存在的氨基酸或任何非天然類似物中的一種。本文所用的“效應(yīng)子功能”意指由于抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體的相互作用而引 起的生物化學(xué)事件。效應(yīng)子功能包括但不限于ADCC、ADCPJP⑶C。本文所用的“ IgG Fc配體”意指來自仵何牛物體的與IgG抗體的Fc區(qū)結(jié)合形成 Fc/Fc配體復(fù)合體的分子，優(yōu)選多肽。Fc配體包括但不限于Fc y R、Fc y R、Fc y R、FcRn、Clq、 C3、結(jié)合甘露聚糖的凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌(staphylococcal)蛋白Α、葡萄球菌蛋 白G、和病毒Fc y R0 Fc配體還包括Fc受體同源物(FcRH)，它們是與Fc γ R同源的Fc受體 家族(Davis 等人，2002，Immunological Reviews 190 123-136，其通過引用整體并入)。Fc 配體可以包括結(jié)合Fc的未發(fā)現(xiàn)的分子。具體的IgG Fc配體是FcRn和Fc γ受體。本文所 用的“Fe配體”意指來自仵何牛物體的與抗體的Fc區(qū)結(jié)合形成Fc/Fc配體復(fù)合體的分子， 優(yōu)選多肽。本文所用的“Fe Y警體”、“Fc Y R”或“Fe伽馬R”意指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)并且由 Fc γ R基因編碼的蛋白家族的任何成員。在人中，這個(gè)家族包括但不限于Fc γ RI (⑶64)，其 包括同種型Fc y RIa、Fc y Rib、和Fc y RIc ；Fc y RII (CD32)，其包括同種型Fc y RIIa (包括 同種異型 Η131 禾口 R131)、Fc γ RIIb (包括 Fc YRIIb-I 禾口 Fc YRIIb—2)、禾口 Fc γ RIIc ；以及 Fc y RIII (CD16)，其包括同種型Fc y RIIIa (包括同種異型V158和F158)禾口 Fc γ RIIIb (包 括同種異型 Fc γ RIIIb-NAl 和 Fcy RIIIb-NA2) (Jefferis 等人，2002，Immunol Lett 82: 57-65，通過引用整體并入)；以及任何未發(fā)現(xiàn)的人Fc YR或Fc YR同種型或同種異型。 Fc γ R可以來自任何生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。小鼠Fc γ R包括但不限 于 Fc γ RI (CD64)、Fc γ RII (CD32)、Fc γ RIII (CD16)、禾口 Fc γ RII1—2 (CD16—2)、以及任何未 發(fā)現(xiàn)的小鼠Fc YR或Fc YR同種型或同種異型。本文所用的“FcRn”或“新生兒Fc受體”意指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)并且至少部分 由FcRn基因編碼的蛋白。FcRn可以來自任何生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和 猴。如本領(lǐng)域所已知的，功能FcRn蛋白包含兩條多肽，它們通常稱為重鏈和輕鏈。輕鏈?zhǔn)?β -2-微球蛋白，重鏈由FcRn基因編碼。除非本文中另外指明，否則FcRn或FcRn蛋白是 指FcRn重鏈與β-2-微球蛋白的復(fù)合體。具體的感興趣的FcRn序列顯示在附圖中，特別 是人的。本文所用的“親本多肽”意指隨后被修飾產(chǎn)牛變體的未被修飾的多肽。親本多肽 可以是天然存在的多肽、或天然存在的多肽的變體或工程化形式。親本多肽可以指多肽本 身、包含親本多肽的組合物、或編碼它的氨基酸序列。因此,本文所用的“親本免疫球蛋白，， 意指被修飾產(chǎn)生變體的未被修飾的免疫球蛋白多肽，本文所用的“親本抗體”意指被修飾產(chǎn) 生變體抗體的未被修飾的抗體。應(yīng)了解“親本抗體”包括如下文中所列出的已知的商業(yè)上 的重組制備的抗體。本文所用的“位置”意指蛋白序列中的定位。位置可以順序編號(hào)，或者根據(jù)已建立 的形式例如用于抗體編號(hào)的EU索引編號(hào)。本文所用的“靶抗原”意指被給定抗體的可變R特異件結(jié)合的分子。靶抗原可以 是蛋白、碳水化合物、脂、或其他化合物。本文所用的“靶細(xì)胞”意指表達(dá)靶抗原的細(xì)胞。
本文所用的“可變區(qū)”意指包含一個(gè)或多個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白區(qū)域，所述一 個(gè)或多個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域基本上由分別構(gòu)成κ、λ、和重鏈免疫球蛋白基因座的V κ、νλ、和/或 VH基因的任一種編碼。本文所謂的fMMMir意指天然存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基 因變異。WT蛋白具有未被有意修飾的氨基酸序列或核苷酸序列。本發(fā)明涉及表現(xiàn)出相對于野生型抗體與FcRn的結(jié)合增加的抗體。例如，在某些情 況下，增加的結(jié)合導(dǎo)致抗體的細(xì)胞再循環(huán)并且由此增加了半衰期。此外，表現(xiàn)出與FcRn結(jié) 合增加并且與其他Fc受體例如Fc γ R的結(jié)合有所改變的抗體可用于本發(fā)明?？贵w本申請涉及包含調(diào)節(jié)與FcRn的結(jié)合的氨基酸修飾的抗體。特別感興趣的是最低 限度地包含F(xiàn)c區(qū)或其功能變體的抗體，所述Fc區(qū)在較低的pH下表現(xiàn)出增加的結(jié)合親和 力，而在較高的PH下不表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)的結(jié)合改變。傳統(tǒng)的抗體結(jié)構(gòu)單位通常包含四聚體。各四聚體通常由兩對相同的多肽鏈構(gòu)成， 每對具有一條“輕”鏈(通常具有約25kDa的分子量)和一條“重”鏈(通常具有約50-70kDa 的分子量)。人輕鏈被分為K和λ輕鏈。重鏈被分為μ、δ、Υ、α、或ε，它們分別將抗 體同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgAjP IgE。IgG具有幾個(gè)亞類，包括但不限于IgGl、IgG2、 IgG3、和IgG4。IgM具有包括但不限于IgMl和IgM2的亞類。因此，本文所用的“同種型”意 指通過免疫球蛋白恒定區(qū)的化學(xué)和抗原特征所定義的任何免疫球蛋白亞類。已知的人免疫 球蛋白同種型為 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgMl、IgM2、IgDjP IgE。各鏈的氨基末端部分包括約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，該可變區(qū)主要 負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。在可變區(qū)中，重鏈和輕鏈的每個(gè)V結(jié)構(gòu)域集合了三個(gè)環(huán)以形成抗原結(jié)合位 點(diǎn)。每個(gè)環(huán)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(后面稱為“CDR”)，其中氨基酸序列的變異是最顯著的。各鏈的羧基末端部分定義了恒定區(qū)，該恒定區(qū)主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能。Kabat等人收 集了重鏈和輕鏈可變區(qū)的大量主要序列。根據(jù)序列的保守程度，他們將個(gè)體的主要序列分 為CDR和框架，并制作了它們的列表(參見SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (具有 免疫學(xué)重要性的序列)，第5版，NIH publication, No. 91-3242，Ε. A. Kabat等人，其通過引 用整體并入)。在免疫球蛋白的IgG亞類中，重鏈中具有幾個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。本文所謂的“兔 疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域”意指具有獨(dú)特的三級(jí)結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白R(shí)域。本發(fā)明中所感興趣的 是重鏈結(jié)構(gòu)域，包括重鏈恒定(CH)結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在IgG抗體的背景下，每個(gè)IgG 同種型具有三個(gè)CH區(qū)。因此，在IgG背景下的“CH”結(jié)構(gòu)域如下“CH1”是指根據(jù)Kabat中 的EU索引的位置118-220，“CH2”是指根據(jù)Kabat中的EU索引的位置237-340，并且“CH3，， 是指根據(jù)Kabat中的EU索引的位置341-447。另一類重鏈Ig結(jié)構(gòu)域是鉸鏈區(qū)。本文所謂的“鉸鏈”或“鉸鏈區(qū)”或“抗體鉸鏈 區(qū)”或“免疫球蛋白鉸鏈區(qū)”意指包含抗體的第一和第二恒定結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸的柔性多 肽。在結(jié)構(gòu)上，IgG CHl結(jié)構(gòu)域在EU位置220處結(jié)束，并且IgG CH2結(jié)構(gòu)域在EU位置237 處的殘基開始。因此，對于IgG，抗體鉸鏈在本文中定義為包括位置221 (IgGl中的D221)至 236 (IgGl中的G236)，其中編號(hào)根據(jù)Kabat中的EU索引進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，例如在 Fc區(qū)的背景下，包含較低的鉸鏈，其中“較低的鉸鏈”通常是指位置226或230。
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本發(fā)明所特別感興趣的是Fc區(qū)。如本文所用的“Fe”和“Fe區(qū)”意指包含抗體的 恒定區(qū)，而不包含第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和在一些情況下的部分鉸鏈的多肽。因此， Fc是指IgA、IgDJP IgG的后兩個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；IgE和IgM的后三個(gè)恒定區(qū)免 疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；以及這些結(jié)構(gòu)域N末端的柔性鉸鏈。對于IgA和IgM，F(xiàn)c可以包括J鏈。 對于IgG，如圖1中所示，F(xiàn)c包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域C伽馬2和C伽馬3 (Cg2和Cg3)以及 C伽馬I(Cgl)和C伽馬2(Cg2)之間的較低的鉸鏈區(qū)。盡管Fc區(qū)的界線可以變化，但是人 IgG重鏈Fc區(qū)通常被定義為包括殘基C226或P230至其羧基末端，其中編號(hào)是根據(jù)Kabat 中的EU索引進(jìn)行。如下文所述，F(xiàn)c可以指分離狀態(tài)的這個(gè)區(qū)域，或在Fc多肽背景下的這 個(gè)區(qū)域。如本文所用的“Fe多肽”意指構(gòu)成全部或部分的Fc區(qū)的多肽。Fc多肽包括抗體、 Fc融合體、分離的Fe、和Fc片段。在一些實(shí)施方式中，抗體為全長的。本文所謂的“全長抗體”意指構(gòu)成天然生物學(xué) 形式的抗體的結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)和恒定區(qū)，包括一個(gè)或多個(gè)本文所列出的修飾?？蛇x擇地，抗體可以為多種結(jié)構(gòu)，包括但不限于抗體片段、單克隆抗體、雙特異性 抗體、微型抗體(minibody)、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體(有時(shí)在本文中稱為“抗體模擬物”)、嵌 合抗體、人源化抗體、抗體融合體(有時(shí)稱為“抗體軛合物”)以及它們每種各自的片段?？贵w片段在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體是抗體片段。特別感興趣的是包含F(xiàn)c區(qū)、Fc融合體、和 重鏈恒定區(qū)(CH1-鉸鏈-CH2-CH3)的抗體，還包括重鏈恒定區(qū)融合體。具體的抗體片段包括但不限于⑴包含VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域的Fab片段； ( )包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(iii)包含單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域的Fv片段； (iv)包含單個(gè)可變區(qū)的dAb片段(Ward等人，1989，Nature 341 :544_546，其通過引用整體 并入本文)；(ν)分離的⑶R區(qū)；(vi)F(ab' ) 2片段，包含兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段； (vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽連接子連接，該肽連接子容 許兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(Bird等人，1988，Science 242:423-426 ；Huston等 人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 :5879_5883，它們通過引用整體并入)；(viii)雙 特異性單鏈FV(W0 03/11161，通過引用并入本文)；以及(ix) “雙鏈抗體”或“三鏈抗體”， 通過基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(Tomlinson等人，2000，Methods Enzymol. 326 461-479 ；W094/13804 ；HolIiger 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 =6444-6448, 它們都通過引用整體并入)?？贵w片段可以被修飾。例如，可以通過摻入連接VH和VL結(jié)構(gòu) 域的二硫橋來穩(wěn)定分子(Reiter等人，1996，Nature Biotech. 14 1239-1245，通過引用整 體并入)。 嵌合抗體和人源化抗體 在一些實(shí)施方式中，骨架組分可以為來自不同物種的混合物。同樣地，如果蛋白 為抗體，則此抗體可以為嵌合抗體和/或人源化抗體。一般來說，“嵌合抗體”和“人源化抗 體”都是指組合了來自不止一個(gè)物種的區(qū)域的抗體。例如，“嵌合抗體”在傳統(tǒng)上包含來自 小鼠(或在某些情況下為大鼠)的可變區(qū)和來自人的恒定區(qū)?！叭嗽椿贵w”一般是指具有 交換為人抗體中所存在的序列的可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)的非人抗體。一般而言，在人源化抗體 中，除CDR外，整個(gè)抗體是由人來源的多核苷酸編碼，或者與由人來源的多核苷酸編碼的抗 體在⑶R之外具有同一性。一些或所有的⑶R是由非人生物體來源的核酸編碼的，將它們移植到人抗體可變區(qū)的β片層框架區(qū)以產(chǎn)生抗體，該抗體的特異性由植入的CDR決定。這 類抗體的制備描述于例如，WO 92/11018 Jones, 1986, Nature 321 :522_525 ；Verhoeyen 等人，1988，Science 239 1534-1536，它們的全文通過引用并入。通常需要將所選的受體框 架殘基“回復(fù)突變”為相應(yīng)的供體殘基以重新獲得在最初的移植構(gòu)建體中丟失的親和力(US 5530101 ；US 5585089 ；US 5693761 ；US 5693762 ；US6180370 ；US 5859205 ；US 5821337 ； US 6054297 ；US 6407213，它們都通過引用整體并入)。人源化抗體最佳地還含有至少一 部分免疫球蛋白恒定區(qū)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)，因此通常包含人Fc區(qū)。人源化 抗體還可以使用具有遺傳工程化的免疫系統(tǒng)的小鼠制備。Roque等人，2004，Biotechnol. Prog. 20 :639-654，其通過引用整體并入。用于人源化和改造非人抗體的多種技術(shù)和方法 是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的(參見 Tsurushita 禾口 Vasquez，2004，Humanization of Monoclonal Antibodies (單克隆抗體的人源化)，Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science(USA)；和本文所引用的參考文獻(xiàn)，它們都通過引用整體并入)。人源化方法包括 但不限于下列文獻(xiàn)所述的方法Jones等人，1986，Nature 321 :522_525 ；Riechmann等人， 1988 ；Nature 332 :323_329 ；Verhoeyen 等人，1988，Science, 239 1534-1536 ；Queen 等人， 1989, Proc Natl Acad Sci，USA 86 10029-33 ；He 等人，1998，J. Immunol. 160 1029-1035 ； Carter 等人，1992，Proc Natl Acad Sci USA89 :4285_9 ;Presta 等人，1997，Cancer Res. 57(20) 4593-9 ；Gorman 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor等人，1998，Protein Engll :321_8，它們都通過引用整體并入。人源化或降低非人 抗體可變區(qū)免疫原性的其他方法可以包括表面重建方法，例如Roguska等人，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :969_973中所述的方法，所述文獻(xiàn)通過引用整體并入。在一個(gè)實(shí)施 方式中，如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的，親本抗體具有成熟的親和力。如USSN 11/004,590中所述， 可以采用基于結(jié)構(gòu)的方法進(jìn)行人源化和親和力成熟。可以采用基于選擇的方法使抗體可 變區(qū)人源化和/或親和力成熟，所述方法包括但不限于下列文獻(xiàn)中所述的方法Wu等人， 1999，J.Mol. Biol. 294 :151_162 ；Baca 等人，1997，J. Biol. Chem. 272(16) :10678_10684 ； Rosok 等人，1996，J. Biol. Chem. 271 (37) 22611-22618 ；Rader 等人，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :8910_8915 ;Krauss 等人，2003，ProteinEngineering 16(10) :753_759， 它們都通過引用整體并入。其他人源化方法可包括僅將CDR的部分移植，包括但不限于 下列文獻(xiàn)中所述的方法:USSN09/810, 510 ；Tan 等人，2002，J. Immunol. 169 :1119_1125 ；De Pascalis等人，2002，J. Immunol. 169 :3076_3084，它們都通過引用整體并入。雙特異性抗體在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體為多特異性抗體，尤其是雙特異性抗體，有時(shí)還 稱為“雙鏈抗體”。它們是結(jié)合兩個(gè)(或更多個(gè))不同抗原的抗體。雙鏈抗體可以通過本 領(lǐng)域內(nèi)已知的多種方法制備(Holliger 和 Winter，1993，Current Opinion Biotechnol. 4 446-449，其通過引用整體并入)，例如，以化學(xué)方法制備或從雜交瘤制備。微型抗體在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體是微型抗體。微型抗體是包含連接至CH3結(jié)構(gòu)域的scFv 的最小化抗體樣蛋白。Hu等人，1996，Cancer Res. 56 :3055_3061，通過引用整體并入。在 一些情況下，scFv可以連接到Fc區(qū)，并且可以包含一些或整個(gè)的鉸鏈區(qū)?？贵w融合體
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是抗體融合蛋白(有時(shí)在本文中稱為“抗體軛 合物”)。一種類型的抗體融合體包括Fc融合體，它連接了 Fc區(qū)與軛合配偶體。如本文所 用的“E^^”意指其中一個(gè)或多個(gè)多肽可操作地連接至Fc區(qū)的蛋白。本文中的Fc融 合體意指與已有技術(shù)中所用的術(shù)語“免疫粘附素”、“Ig融合體”、“Ig嵌合體”、和“受體球蛋 白”(有時(shí)用破折號(hào))(Chamow 等人，1996，Trends Biotechnol 14 :52_60 ；Ashkenazi 等人， 1997, Curr Opin Immunol 9 195-200，它們通過引用整體并入)是同義的。Fc融合體組合 了免疫球蛋白Fc區(qū)與融合配偶體，該融合配偶體通常可以為任何蛋白或小分子。事實(shí)上， 任何蛋白或小分子都可以連接至Fc以產(chǎn)生Fc融合體。蛋白融合配偶體可以包括但不限于 任何抗體的可變區(qū)、受體的靶結(jié)合區(qū)、粘附分子、配體、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、或一些其他 的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域。小分子融合配偶體可以包括將Fc融合體導(dǎo)向治療靶的任何治療劑。 這種靶可以為疾病所涉及的任何分子，優(yōu)選為胞外受體。因此，可以將IgG變體連接至一個(gè) 或多個(gè)融合配偶體。在一個(gè)替代性實(shí)施方式中，IgG變體與另一種治療化合物軛合或可操 作地連接。治療化合物可以為細(xì)胞毒素劑、化療劑、毒素、放射性同位素、細(xì)胞因子或其他治 療活性劑。IgG可以連接至多種非蛋白性聚合物中的一種，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧 化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。除了 Fc融合體之外，抗體融合體包括重鏈恒定區(qū)與一個(gè)或多個(gè)融合配偶體(還包 括任何抗體的可變區(qū))的融合體，而其他抗體融合體則基本上或全部為具有融合配偶體的 全長抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，融合配偶體的作用是介導(dǎo)靶結(jié)合，因此其在功能上類似于抗 體可變區(qū)(事實(shí)上，可以是抗體可變區(qū))。事實(shí)上，任何蛋白或小分子都可以連接至Fc以制 備Fc融合體(或抗體融合體)。蛋白融合配偶體可以包括但不限于受體的靶結(jié)合區(qū)、粘 附分子、配體、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、或一些其他的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域。小分子融合配偶 體可以包括將Fc融合體導(dǎo)向治療靶的任何治療劑。這種靶可以為疾病所涉及的任何分子， 優(yōu)選為胞外受體。軛合配偶體可以是蛋白性的或非蛋白性的；后者一般使用抗體上和軛合配偶 體上的官能團(tuán)制備。例如，連接子是本領(lǐng)域中已知的；例如同型或異型雙功能連接子 是熟知的(參見，1994Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers (Pierce化學(xué)公司1994年的目錄，交聯(lián)劑的技術(shù)部分)，第155-200頁，通過 引用并入本文)。合適的軛合物包括但不限于如下文所述的標(biāo)記，藥物和細(xì)胞毒素劑，包括但不限 于細(xì)胞毒性藥物(例如，化療劑)或毒素或此類毒素的活性片段。適合的毒素和它們的相 應(yīng)片段包括白喉A鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、瀉果素、巴豆毒素、酚霉 素、依諾霉素等。細(xì)胞毒素劑還包括放射性化學(xué)物質(zhì)，它們通過將放射性同位素軛合至抗體 或?qū)⒎派湫院怂亟Y(jié)合至已經(jīng)共價(jià)連接至抗體的螯合劑來制備。其他的實(shí)施方式使用刺孢霉 素、auristatins、格爾德霉素、美登素、和倍癌霉素(duocarmycin)和類似物；對于后者，參 見U. S. 2003/0050331A1，其通過引用整體并入。抗體的共價(jià)修飾抗體的共價(jià)修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且一般但并非總是在翻譯后進(jìn)行。例 如，通過使抗體的特定氨基酸殘基與能夠與所選擇的側(cè)鏈或N末端或C末端殘基反應(yīng)的有 機(jī)衍生劑反應(yīng)將幾種類型的抗體共價(jià)修飾引入分子中。
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半胱氨酰殘基最通常的是與諸如氯乙酸或氯乙酰胺的α -鹵代乙酸酯(和對應(yīng)的 胺)反應(yīng)以得到羧甲基或羧氨基甲基衍生物。半胱氨酰殘基還可以通過與下列物質(zhì)的反應(yīng) 來衍生溴三氟丙酮、α -溴-β -(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝 基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚、 或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3- 二唑等。組氨酰殘基通過在ρΗ5. 5-7. 0下與焦碳酸二乙酯反應(yīng)來衍生，因?yàn)檫@個(gè)試劑對組 氨酰側(cè)鏈?zhǔn)窍鄬μ禺惖摹Ｒ部墒褂脤︿灞郊柞＜谆寤?；該反?yīng)優(yōu)選在ΡΗ6. 0下在0. IM 二甲胂酸鈉中進(jìn)行。賴氨?；桶被┒藲埢c琥珀酸或其他羧酸酐反應(yīng)。使用這些試劑的衍生具有 逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷的作用。用于衍生含α氨基的殘基的合適試劑包括亞氨酸酯，如甲 基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；0-甲基異脲；2，4_戊 二酮；和轉(zhuǎn)氨酶所催化的與乙醛酸的反應(yīng)。精氨酰殘基通過與一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)來修飾，尤其是苯乙二醛、2，3-丁二 酮、1，2_環(huán)己二酮、和水合茚三酮。精氨酸殘基的衍生需要反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，這是因 為胍官能團(tuán)的PKa較高。此外，這些試劑可以與賴氨酸基團(tuán)以及精氨酸ε-氨基反應(yīng)?？梢赃M(jìn)行酪氨酰殘基的特定修飾，尤其感興趣的是通過與芳族重氮化合物或四硝 基甲烷反應(yīng)而將光譜標(biāo)記引入酪氨酰殘基中。最常見的是，使用N-乙?；溥蚝退南趸?烷來分別形成0-乙?；野滨Ｎ镔|(zhì)和3-硝基衍生物。使用1251或1311將酪氨酰殘基碘 化以制備用于放射性免疫測定的標(biāo)記蛋白，上文所述的氯胺T法是合適的。羧基側(cè)基(天冬氨?；蚬劝滨?選擇性地通過與碳二亞胺(R' -N = C = N-R') 反應(yīng)來修飾，其中R和R’任選地為不同的烴基，如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳 二亞胺或1-乙基-3_(4-氮鐺-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰殘 基通過與銨離子反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。用雙官能劑進(jìn)行的衍生可用于將抗體交聯(lián)至水不溶性支持體基質(zhì)或表面以供多 種方法使用，包括下面所述的方法。常用的交聯(lián)劑包括例如，1，1-雙(重氮乙?；?-2-苯 乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如與4-疊氮水楊酸的酯；同型雙官能亞氨酸酯，包 括二琥珀酰亞胺酯如3，3' -二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)、和雙官能的馬來酰亞胺， 如雙-N-馬來酰亞胺基-1，8-辛烷。諸如甲基-3-[(對疊氮苯基)二硫基]丙亞胺酯的衍生 劑會(huì)產(chǎn)生光活化的中間體，該中間體能夠在存在光的條件下形成交聯(lián)?？蛇x擇地，可以采用 反應(yīng)性的水不溶性基質(zhì)如溴化氰活化的碳水化合物和美國專利第3，969，287,3, 691，016、 4，195，128,4, 247，642,4, 229，537、和4，330，440號(hào)中所述的反應(yīng)性基質(zhì)來進(jìn)行蛋白固定， 所述專利都通過弓I用整體并入。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基經(jīng)常分別脫酰胺化為對應(yīng)的谷氨酰和天冬胺酰殘 基?？蛇x擇地，這些殘基在弱酸條件下進(jìn)行脫酰胺化。這些殘基的任一形式都屬于本發(fā) 明的范圍。其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化；絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷 酸化；賴氨酸、精氨酸、和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(Τ. Ε. Creighton，Proteins Structure and MolecularProperties (蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)禾口分子特性)，W. H. Freeman & Co·， San Francisco，第79-86頁[1983]，通過引用整體并入)；N-末端胺的乙?；?；和任何C-末 端羧基的酰胺化。
糖基化另一種類型的共價(jià)修飾是糖基化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文所公開的IgG變 體可以被修飾以包含一種或多種工程化糖形。如本文所用的“工程化糖形”意指共價(jià)連接 至IgG的碳水化合物組合物，其中所述碳水化合物組成在化學(xué)上與親本IgG的碳水化合物 組成不同。工程化糖形可用于多種目的，包括但不限于增強(qiáng)或降低效應(yīng)子功能。工程化 糖形可以通過許多本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備(Umafia等人，1999，Nat Biotechnol 17: 176-180 ；Davies 等人，2001，Biotechnol Bioeng 74 :288_294 ;Shields 等人，2002，J Biol Chem277 :26733_26740 ；Shinkawa 等人，2003，J Biol Chem 278 :3466_3473 ；US6, 602, 684 ； USSN 10/277, 370 ；USSN 10/113, 929 ；PCT WO 00/61739A1 ；PCT WO 01/29246A1 ；PCT WO 02/31140A1 ；PCT WO 02/30954A1，它們都通過引用整體并入；(Potelligent 技術(shù)[Biowa， Inc.，Princeton, NJ] ； GlyCoMAb 糖基化工程技術(shù)[Glycart Biotechnology AG, Zurich, Switzerland]).這些技術(shù)中的一些基于調(diào)控巖藻糖基化水平和/或?qū)η泄矁r(jià) 連接至Fc區(qū)的寡糖，例如，通過在工程化的或其他形式的各種生物體或細(xì)胞系(例如 Lec-13CH0細(xì)胞或大鼠雜交瘤YB2/0細(xì)胞)中表達(dá)IgG ；通過調(diào)節(jié)參與糖基化通路的酶(例 如FUT8[a 1，6_巖藻糖轉(zhuǎn)移酶]和/或β 1_4_Ν_乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III [GnTIII])；或通 過在IgG表達(dá)之后修飾碳水化合物進(jìn)行。工程化糖形通常是指不同的碳水化合物或寡糖； 因此IgG變體例如抗體或Fc融合體可以包含工程化糖形?？蛇x擇地，工程化糖形可以指包 含不同碳水化合物或寡糖的IgG變體。如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的，糖基化模式可取決于蛋白序 列(例如，存在或不存在特定的糖基化氨基酸殘基，在下文中討論)或產(chǎn)生蛋白的宿主細(xì)胞 或生物體。具體的表達(dá)系統(tǒng)在下文中討論。多肽的糖基化通常為N-連接的或0-連接的。N-連接的是指碳水化合物部分 與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈的連接。其中χ為除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰 胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，是碳水化合物部分與天冬酰氨側(cè)鏈酶促連接的識(shí)別 序列。因此，多肽中這些三肽序列的任一種的存在產(chǎn)生可能的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基 化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、或木糖中的一種與羥基氨基酸的連接，所述羥基氨 基酸最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸?？贵w中糖基化位點(diǎn)的添加是通過改變氨基酸序列使其含有上述三肽序列的一種 或多種來方便地完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。改變還可以通過將一個(gè)或多個(gè)絲氨酸 或蘇氨酸殘基添加到初始序列或用一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基取代初始序列來進(jìn)行 (用于0-連接的糖基化位點(diǎn))。為了方便，抗體氨基酸序列優(yōu)選通過在DNA水平的改變來 改變，尤其是通過在預(yù)選的堿基突變編碼靶多肽的DNA使得產(chǎn)生將翻譯成所需的氨基酸的 密碼子。增加抗體上碳水化合物部分?jǐn)?shù)目的其他方法為將糖苷化學(xué)偶聯(lián)或酶促偶聯(lián)至蛋 白。這些方法的有利之處在于它們不需要在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有用于N-連接的和0-連接 的糖基化的糖基化能力的蛋白。依據(jù)所用的偶聯(lián)方式，糖可以連接至(a)精氨酸和組氨酸； (b)游離羧基；(c)游離巰基，如半胱氨酸的游離巰基；(d)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸、或 羥脯氨酸的游離羥基；(e)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基；或(f)谷氨 酰胺的酰胺基。這些方法描述在WO 87/05330以及Aplin和Wriston，1981，CRC Crit. Rev. Biochem.，第259-306頁，它們都通過引用整體并入。
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可以通過化學(xué)法或酶法完成初始抗體上所存在的碳水化合物部分的移除。化學(xué)去 糖基化需要將蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。這種處理導(dǎo)致了除了連接糖 (N-乙?；咸前坊騈-乙?；肴樘前?之外大部分或所有的糖被裂解，而多肽則保持完 整。化學(xué)去糖基化描述在 Hakimuddin 等人，1987，Arch. Biochem. Biophys. 259 52 和 Edge 等人，1981，Anal. Biochem. 118 131中，它們通過引用整體并入。多肽上碳水化合物部分 的酶促裂解可以通過使用多種內(nèi)切和外切糖苷酶來達(dá)成，如Thotakura等人，1987，Meth. Enzymol. 138 350中所述，其全文通過引用并入?？梢酝ㄟ^使用化合物衣霉素來防止在可 能的糖基化位點(diǎn)的糖基化，如Duskin等人，1982，J. Biol. Chem. 257 3105中所述，其全文通 過引用并入。衣霉素阻斷蛋白-N-糖苷鍵形成。另一種類型的抗體共價(jià)修飾包括將抗體連接至多種非蛋白性的聚合物上，包括但 不限于，多種多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，這通過下列文獻(xiàn)中所述的方法進(jìn) 行例如，2005-2006PEG Catalog fromNektar Therapeutics (2005-2006 年來自 Nektar 治療劑的PEG目錄)(可得自Nektar網(wǎng)站)美國專利4，640，835 ；4, 496，689 ；4, 301，144 ； 4，670，417 ；4, 791，192或4，179，337，它們都通過引用全文并入。此外，如本領(lǐng)域中已知的， 氨基酸取代可以在抗體中的多個(gè)位置進(jìn)行，以促進(jìn)諸如PEG的聚合物的添加。參見，例如美 國公開第2005/0114037A1號(hào)，其通過引用整體并入。標(biāo)記的抗體在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體的共價(jià)修飾包括添加一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記。在一些情 況下，考慮的是抗體融合體。術(shù)語“標(biāo)記基團(tuán)”意指任何檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，標(biāo) 記基團(tuán)經(jīng)由各種長度的間隔子臂偶聯(lián)至抗體上以降低可能的位阻。標(biāo)記蛋白的各種方法是 本領(lǐng)域內(nèi)已知的，可以使用它們進(jìn)行本發(fā)明。一般來講，標(biāo)記依據(jù)檢測它們的測定分為多種類型a)同位素標(biāo)記，它可以是放 射性同位素或重同位素；b)磁性標(biāo)記(例如磁性粒子)；C)氧化還原活性部分；d)光學(xué)染 料；酶基團(tuán)(例如，辣根過氧化物酶、β _半乳糖苷酶、熒光素酶；堿性磷酸酶)；e)生物素化 基團(tuán)；和f)被二級(jí)報(bào)道物所識(shí)別的預(yù)先確定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、二抗的 結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽等)。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記基團(tuán)經(jīng)由各種長度的間 隔子臂偶聯(lián)至抗體上以降低可能的位阻。標(biāo)記蛋白的各種方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，可以使 用它們進(jìn)行本發(fā)明。具體的標(biāo)記包括光學(xué)染料，包括但不限于生色團(tuán)、磷光體和熒光團(tuán)，其中后一種 具體用于許多情況中。熒光團(tuán)可以為“小分子”熒光或蛋白性熒光。所謂“熒光標(biāo)記”意指可以經(jīng)由其固有的熒光特性檢測的任何分子。合適的熒 光標(biāo)記包括但不限于熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、藻紅、香豆素、甲基-香豆 素、芘、孔雀石綠(Malacite green)、均二苯乙烯、熒光黃、Cascade BlueJ、德克薩斯紅、 IAEDANS、EDANS、B0DIPY FL、LC 紅 640、Cy 5,Cy 5. 5、LC 紅 705、俄勒岡綠(Oregon Green)、 Alexa-Fluor 染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、AlexaFluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yelloff 禾口 R-藻紅蛋白(PE) (MolecularProbes, Eugene, OR)、FITC、羅丹明、和德克薩斯紅(Pierce，Rockford, IL)、Cy5、Cy5. 5、Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA)。包括熒光團(tuán)的合適的光學(xué)染料描述在Richard P. Haugland的Melecular Probes Handbook (分子探針手冊)中，該手冊通過引用整體并入。合適的蛋白性熒光標(biāo)記還包括但不限于綠色熒光蛋白，包括Renilla、 Ptilosarcus、或 Aequorea 種類的 GFP(Chalfie 等人，1994， Science263 :802_805)； EGFP (Clontech Laboratories, Inc.，Genbank 登錄號(hào) U55762)；藍(lán)色熒光蛋白(BFP， Quantum Biotechnologies, Inc.1801de MaisonneuveBlvd. West,8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9 ；Stauber, 1998, Biotechniques 24 462-471 ；Heim ^A, 1996, Curr. Biol. 6 178-182)；加強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories, Inc.)； 熒光素酶(Ichiki 等人，1993，J. Immunol. 150 =5408-5417) ； β 半乳糖苷酶(Nolan 等人， 1988，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 :2603_2607)和 Renilla(W092/15673、W095/07463、 W098/14605、W098/26277、W099/49019、美國專利第 5292658、5418155、5683888、5741668、 5777079、5804387、5874304、5876995、5925558號(hào))。本段中上面所引用的所有參考文獻(xiàn)特 意通過引用并入本文。IgG 變體在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供變體IgG蛋白。最低限度下，IgG變體包含含有重 鏈CH2-CH3區(qū)的抗體片段。此外，合適的IgG變體包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(例如，包括較低的鉸鏈 區(qū))，而且包含重鏈恒定區(qū)(CH1-鉸鏈-CH2-CH3)的IgG變體也可用于本發(fā)明，它們都可以 與融合配偶體融合。IgG變體包括相對于親本IgG多肽的一種或多種氨基酸修飾，在一些情況下為相 對于野生型IgG的一種或多種氨基酸修飾。IgG變體可以具有一種或多種優(yōu)化的性質(zhì)。IgG 變體由于至少一個(gè)氨基酸修飾而與其親本IgG的氨基酸序列不同。因此，IgG變體與其親 本相比具有至少一個(gè)氨基酸修飾。可選擇地，IgG變體與親本相比可以具有多于一個(gè)氨基 酸修飾，例如與親本相比具有約1至50個(gè)氨基酸修飾，優(yōu)選約1至10個(gè)氨基酸修飾，最優(yōu) 選約1至約5個(gè)氨基酸修飾。因此，IgG變體的序列和親本Fc多肽的序列是基本上同源的。例如，本文中的變 體IgG變體序列具有與親本IgG變體序列約80%的同源性，優(yōu)選至少約90%的同源性，并 且最優(yōu)選至少約95%的同源性。修飾可以使用分子生物學(xué)以遺傳方法進(jìn)行，或者可以酶促 或化學(xué)方法進(jìn)行。抗體的靶抗原事實(shí)上，任何抗原都可以被IgG變體靶向，包括但不限于屬于下列靶抗原中的 蛋白、亞基、結(jié)構(gòu)域、基序、和/或表位，所述靶抗原包括可溶性因子如細(xì)胞因子和膜結(jié) 合因子，所述膜結(jié)合因子包括跨膜受體17-IA、4-lBB、4Dc、6-酮-PGFla、8_異_PGF2a、 8-氧-dG、Al腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、激活蛋白、激活蛋白A、激活蛋白AB、激活蛋白B、 激活蛋白C、激活蛋白R(shí)IA、激活蛋白R(shí)IAALK-2、激活蛋白R(shí)IB ALK-4、激活蛋白R(shí)IIA、激活 蛋白 RIIB、ADAM、ADAMlO, ADAMl2, ADAMl5, ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS, ADAMTS4、 ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α -1-抗胰蛋白酶、α -V/ β -1 拮抗物、 ANG、Ang、APAF-I、APE、APJ, APP, APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗 Id、ASPARTIC、心房利鈉 因子、av/b3 整聯(lián)蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴細(xì)胞刺激因子(BlyS)、BACE、 BACE-I、Bad、BAFF, BAFF-R、Bag-U BAK, Bax, BCA-1、BCAM、Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF、bFGF、 BID、Bik、BIM、BLC, BL-CAM、BLK, BMP、BMP_2BMP_2a、BMP-3 成骨蛋白、BMP_4BMP_2b、BMP-5、BMP-6Vgr-I、BMP-7(0P-1)、BMP-8(BMP_8a、0P-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、 BRK-2、RPK-U BMPR-II (BRK-3)、BMPs, b_NGF、Β0Κ、鈴蟾肽、骨源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、BPDE, BPDE-DNA, BTC、補(bǔ)體因子 3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、CIO、CA125、CAD-8、降鈣素、cAMP、癌胚抗 原(CEA)、癌相關(guān)抗原、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織 蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶0、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋 白酶 X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCLl、CCLll、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、 CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、 CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCRU CCRlO, CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、 CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla、CDllb、 CDllc、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、 CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67 蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、 CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD123、 CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉 毒桿菌(Clostridium botulinum)毒素、產(chǎn)氣莢膜芽抱桿菌(Clostridium perfringen) 毒素、CKb8-l、CLC, CMV, CMV UL、CNTF, CNTN-U COX、C-Ret、CRG-2、CT-U CTACK, CTGF, CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL, CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、 CXCL9、CXCL10, CXCLlU CXCLl2, CXCLl3, CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCRU CXCR2、 CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細(xì)胞角蛋白腫瘤相關(guān)抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰變加 速因子、des (1-3) -IGF-I (腦 IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-U DNA 酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、 ECAD, EDA、EDA-AU EDA-A2、EDAR、EGF, EGFR(ErbB-I)、EMA, EMMPRIN、ΕΝΑ、內(nèi)皮素受體、腦 啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO, ERCC、內(nèi)皮細(xì) 胞選凝素、ET-1、因子Ila、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)、Fas、 FcRl、FEN-I、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、FL、FLIP、 Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、分形素(Fractalkine)、FZDU FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、 FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、⑶2、⑶3、⑶F、⑶F_l、GDF-3 (Vgr-2)、 GDF-5 (BMP-14、CDMP-1)、GDF-6 (BMP-13、CDMP-2)、GDF-7 (BMP-12、CDMP-3)、GDF-8 (肌肉 生長抑制素(Myostatin))、GDF-9、GDF-15 (MIC-I)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-I、GFR-α 1、 GFR-α 2、GFR-α 3、GITR、胰高血糖素、Glut 4、糖蛋白 IIb/IIIa(GP Ilb/IIIa)、GM-CSF、 gpl30、gp72、GR0、生長激素釋放因子、半抗原(NP-cap or ΝΙΡ-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV)gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF)、H印B gpl20、類肝 素酶、Her2、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、單純孢疹病毒(HSV) gB 糖 蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)、HIV gpl20、HIV IIIB gp 120V31oop、HLA, HLA-DR、HMl. 24、HMFG PEM, HRG, Hrk、人心肌肌球蛋白、人巨細(xì)胞病毒 (HCMV)、人生長激素(HGH)、HVEM、1-309、IAP、I CAM, ICAM-U ICAM-3、ICE、I COS, IFNg、Ig、 IgA 受體、IgE、IGF、IGF 結(jié)合蛋白、IGF-1R、IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL、IL-U IL-1R、IL-2、 IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、 IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF) - α、INF- β、INF- y、抑制素、iNOS、胰島素 A-鏈、胰島 素B-鏈、胰島素樣生長因子1、整聯(lián)蛋白α2、整聯(lián)蛋白α3、整聯(lián)蛋白α4、整聯(lián)蛋白α 4/ β 、整聯(lián)蛋白α4/β7、整聯(lián)蛋白a5(aV)、整聯(lián)蛋白α5/β1、整聯(lián)蛋白α5/β3、整聯(lián)蛋
19白α 6、整聯(lián)蛋白β 1、整聯(lián)蛋白β 2、干擾素Y、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放酶2、激肽釋放 酶5、激肽釋放酶6、、激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽 釋放酶Li、激肽釋放酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、KC、KDR、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子 (KGF)、層粘連蛋白 5、LAMP、LAP、LAP(TGF-I)、潛伏性 TGF-1、潛伏性 TGF-lbpl、LBP、LDGF, LECT2、Lefty、路易斯(Lewis)-Y 抗原、路易斯-Y 相關(guān)抗原、LFA-l、LFA_3、Lfo、LIF、LIGHT、 脂蛋白、LIX、LKN、Lptn, L-選擇蛋白、LT_a、LT_b、LTB4、LTBP-I、肺表面活性物質(zhì)、黃體生 成素、淋巴毒素 β 受體、Mac-UMAdCAM, MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP, M-CSF, MDC、Mer、METALL0PR0TEASE S,MGDF 受體、MGMT、MHC (HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP_1_ α、MK、 MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、 MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo, MSK, MSP、粘蛋白(Mucl)、MUC18、苗勒(Mullerian)抑制 物質(zhì)、Mug、MuSK, ΝΑΙΡ、NAP、NCAD, N-鈣粘蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、中性溶酶、神經(jīng)營養(yǎng)蛋 白 _3、-4 或-6、Neurturin、神經(jīng)元生長因子(NGF)、NGFR、NGF_3、nN0S、N0、N0S、Npn、NRG_3、 NT、NTN、OB、OGGl、OPG, OPN、OSM、0X40L、0X40R、pl50、p95、PADPr、甲狀旁腺激素、PARC、 PARP, PBR、PBSF, PCAD, P-鈣粘蛋白、PCNA, PDGF, PDGF, PDK-U PECAM, ΡΕΜ、PF4、PGE、PGF、 PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰島素原、松弛素原、蛋白 C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp, Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL, RANTES, RANTES、松弛素A-鏈、松弛素B-鏈、腎素、呼吸道合胞病毒(RSV) F、RSV Fgp、Ret、 類風(fēng)濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-U SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、 SIGIRR、SK-I、SLAM、SLPI、SMAC,SMDF,SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、 TAG-72(腫瘤相關(guān)糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T-細(xì)胞受體(例如，T-細(xì)胞受體α / β )、TdT、 TECK, ΤΕΜ1、ΤΕΜ5、ΤΕΜ7、ΤΕΜ8、TERT^ PLAP-樣堿性磷酸酶、TfR, TGF、TGF- α、TGF- β、 TGF-β 泛特異性Pan Specific) ,TGF-β RI (ALK-5)、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、 TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4、TGF-β 5、凝血酶、胸腺 Ck_l、促甲狀腺激素、Tie、 TIMP、TIQ、組 只因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-α β、TNF-β 2, TNFc、 TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL RlApo-2、DR4)、TNFRSFIOB (TRAIL R2DR5、KILLER、 TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF IOC(TRAIL R3DcR 1、LIT、TRID)、TNFRSF IOD (TRAIL R4DcR2、 TRUNDD)、TNFRSF 11A(RANK0DF R,TRANCE R)、TNFRSFIlB(0PG OCIF、TRl)、TNFRSF12(TWEAKR FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEMATAR, HveA, LIGHT R、TR2)、 TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、 TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSFIA(TNF RI CD120a、p55_60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、 p75-80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNFRIII、TNFC R)、TNFRSF4 (0X40ACT35、 TXGP1R)、TNFRSF5 (CD40p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-I、APT 1、CD95)、TNFRSF6B (DcR3M68、 TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1BB CD 137、I LA)、TNFRSF21 (DR6)、 TNFRSF22(DcTRAIL R2TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo_3、LARD、 TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配體、TL2)、TNFSFl 1 (TRANCE/RANK 配體 ODF、 OPG 配體),TNFSF12 (TWEAK Apo_3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配體、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、 TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSFIA (TNF-a 連接素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、 TNFSFlB(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGP1)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMU IMD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Αρο-l 配體、ΑΡΤΙ 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體 CD153)、TNFSF9 (4-1ΒΒ 配體 CD137 配 體)、TP-I、t-PA、Tpo, TRAIL、TRAIL R、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、TRANCE、轉(zhuǎn)移受體、TRF, Trk, TR0P-2、TSG、TSLP、腫瘤相關(guān)抗原CA 125、表達(dá)路易斯Y相關(guān)碳水化合物的腫瘤相關(guān)抗原、 TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-U VECAD, VE-鈣粘蛋白、VE-鈣粘蛋 白-2、VEFGR-I (flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI, VIM、病毒抗原、VLA, VLA-U VLA-4、VNR 整聯(lián)蛋白、馮維勒布蘭德(von ffillebrand)因子、WIF-I、WNT1、WNT2、WNT2B/13、 WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、 WNT1OA、WNT1OB、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCRl、XCRl、XEDAR、XIAP、XPD、以及激素和生長 因子的受體。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)了解上述所列的靶不只是指具體的蛋白和生物分子，而是 指生物化學(xué)通路或包含它們的通路。例如，提到CTLA-4作為靶抗原意指構(gòu)成T細(xì)胞共刺激 通路的配體和受體也是靶，所述配體和受體包括01^-4、87-1、87-2丄028、以及任何其他未 發(fā)現(xiàn)的配體或受體。因此，如本文所用的靶不僅是指具體的生物分子，而是指與所述靶相互 作用的一組蛋白和所述靶所屬于的生物化學(xué)通路的成員。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)了解上述 靶抗原、結(jié)合它們的配體或受體、或它們的相應(yīng)生物化學(xué)通路的其他成員中的任何一種可 以可操作地連接至本發(fā)明的Fc變體以產(chǎn)生Fc融合體。因此，例如，靶向EGFR的Fc融合體 可以通過將Fc變體可操作地連接至EGF、TGF-b、或發(fā)現(xiàn)的或未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合EGFR的任何其 他配體來構(gòu)建。因此，本發(fā)明的Fc變體可以可操作地連接至EGFR以產(chǎn)生結(jié)合EGF、TGF-b、 或發(fā)現(xiàn)的或未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合EGFR的任何其他配體的Fc融合體。因此，事實(shí)上，任何多肽，無 論是配體、受體還是一些其他的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域，包括但不限于上述靶和構(gòu)成它們的相 應(yīng)生物化學(xué)通路的蛋白，都可以可操作地連接至本發(fā)明的Fc變體以得到Fc融合體。合適抗原的選擇取決于所需的應(yīng)用。對于抗癌治療，期望具有表達(dá)限制在癌細(xì)胞 內(nèi)的靶。已證明特別適于抗體治療的一些靶是具有信號(hào)傳導(dǎo)功能的那些。其他治療抗體通 過抑制受體與其軛合配體之間的結(jié)合阻斷受體的信號(hào)傳導(dǎo)來發(fā)揮其作用。治療抗體的另一 個(gè)作用機(jī)制是引起受體下調(diào)。其他抗體不通過它們的靶抗原的信號(hào)傳導(dǎo)起作用。在一些情 況下，使用針對傳染病的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，將本發(fā)明的Fc變體整合到抗細(xì)胞因子的抗體中?？蛇x擇地， 將Fc變體與細(xì)胞因子融合或軛合。如本文所用的“細(xì)胞因子”意指用于由一個(gè)細(xì)胞群釋 放的作為細(xì)胞間調(diào)節(jié)物作用于另一細(xì)胞的蛋白的通用術(shù)語。例如，Penichet等人，2001， J Immunol Methods 248 :91_101中所述，其特意通過引用并入，細(xì)胞因子可以與抗體融合 以提供許多期望的特性。這些細(xì)胞因子的實(shí)例為淋巴因子、單核因子、和傳統(tǒng)的多肽激素。 細(xì)胞因子中包括生長激素，如人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素、和牛生長激素；甲 狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素 (FSH)、促甲狀腺激素(TSH)、和黃體生成素(LH)；肝細(xì)胞生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子； 催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子；苗勒抑制物質(zhì)；小鼠促性腺 素相關(guān)肽；抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生 長因子，如NGF-β ；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β ；胰島素樣 生長因子-I和胰島素樣生長因子-II ；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素，如干擾素-α、干擾素-β和干擾素-Y ；集落刺激因子(CSFs)，如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)、粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)、和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白細(xì)胞介素(IL)，如IL-U IL-I α、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 ； IL-15，一種如 TNF α 或TGF- β的腫瘤壞死因子；C5a ；以及其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所 用的術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白和天然序列細(xì)胞因子的生 物活性等同物。細(xì)胞因子和可溶性靶如TNF超家族成員是用于本發(fā)明變體的優(yōu)選靶。例如，抗 VEGF、抗CTLA-4、和抗TNF抗體或它們的片段是用于增加FcRn結(jié)合的Fc變體的特別好的抗 體。針對這些靶的治療劑常涉及到自身免疫性疾病的治療，并且需要在長的時(shí)間期間內(nèi)進(jìn) 行多次注射。因此，由本發(fā)明的變體所實(shí)現(xiàn)的較長的血清半衰期和較低頻率的治療是特別 優(yōu)選的。已經(jīng)被批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)或正在開發(fā)的許多抗體和Fc融合體可獲益于本發(fā) 明的Fc變體。這些抗體和Fc融合體在本文中稱為“臨床產(chǎn)品和候選物”。因此，在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc多肽可用于一系列的臨床產(chǎn)品和候選物中。例如，靶 向CD20的許多抗體可受益于本發(fā)明的Fc多肽。例如，本發(fā)明的Fc多肽可用于基本上 與下列物質(zhì)類似的抗體利妥昔單抗(Rituxan , IDEC/Genentech/Roche)(參見，例 如，US 5，736，137)，它是經(jīng)批準(zhǔn)用于治療非霍奇金(Non-Hodgkin)淋巴瘤的抗⑶20嵌 合抗體；HuMax-⑶20，它是目前由Genmab開發(fā)的抗⑶20，是US 5，500, 362中描述的 ^L CD20 #， AME-133(Applied Molecular Evolution), hA20(Immunomedics, Inc.), HumaLYM(Intracel)和 PR070769 (PCT/US2003/040426，標(biāo)題為 “ Immunoglobulin Variants and Uses Thereof (免疫球蛋白變體及其用途)”)。靶向許多表皮生長因子受體家族成 員包括 EGFR (ErbB-I)、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)的許多抗體可 以受益于本發(fā)明的Fc多肽。例如，本發(fā)明的Fc多肽可用于基本上與下列物質(zhì)類似的抗 體曲妥單抗(Herceptin , Genentech)(參見，例如US 5，677，171)，被批準(zhǔn)用于治療乳 腺癌的人源化抗Her2/neu抗體；目前由Genentech公司開發(fā)的培妥珠單抗(rhuMab_2C4， Omnitarg ) ；US 4，753，894 中描述的抗 Her2 抗體；西妥昔單抗(ErbitUX , Imclone) (US 4, 943, 533 ；PCT WO 96/40210)，一種在臨床試驗(yàn)中用于多種癌癥的抗EGFR嵌合抗 體；目前由 Abgenix-Immunex-Amgen 開發(fā)的 ABX_EGF(US 6，235，883)；目前由 Genmab 開發(fā) 的 HuMax-EGFr (USSN 10/172，317) ；425、EMD55900、EMD62000、和 EMD72000 (Merck KGaA) (US 5，558，864 ；Murthy 等人 1987，ArchBiochem Biophys. 252(2) 549-60 ；Rodeck 等人， 1987，J Cell Biochem. 35(4) :315_20 ;Kettleborough 等人，1991，Protein Eng. 4(7) 773-83) ；ICR62 (Institute of Cancer Research (美國癌癥研究所))(PCT WO 95/20045 ； Modjtahedi 等人，1993，J. Cell Biophys. 1993，22 (1-3) 129-46 ；Modjtahedi 等人，1993， Br J Cancer. 1993,67(2) :247_53 ;Modjtahedi 等人，1996，Br J Cancer, 73 (2) :228_35 ； Modjtahedi 等人，2003，Int J Cancer, 105(2) :273_80) ；TheraCIMhR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular,古巴(US 5, 891, 996 ；US 6,506,883 ； Mateo 等 人，1997, Immunotechnology, 3(1) :71_81) ；mAb-806(Ludwi g Institue for Cancer Research, MemorialSloan-Kettering(Ludwig 癌癥研究所，紀(jì)念斯隆-凱特 琳癌癥中心))(Jungbluth 等人 2003，Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2) :639_44)；
22KSB-102(KS Biomedix) ；MR1-1 (IVAX，National Cancer Institute (美國國家癌癥研究 所))(PCT WO 0162931A2)；和 SClOO (Scancell) (PCT WO 01/88138)。在另一優(yōu)選實(shí)施方 式中，本發(fā)明的Fc多肽可用于阿侖珠單抗(Campath , Millenium)，目前被批準(zhǔn)用于 治療B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病的人源化單克隆抗體。本發(fā)明的Fc多肽可用于基本 上與其他臨床產(chǎn)品和候選物類似的多種抗體或Fc融合體中，這些其他臨床產(chǎn)品和候選物 包括但不限于莫羅單抗 CD3 (Orthoclone OKT3 )，Ortho Biotech/Johnson&Johnson 開發(fā)的抗CD3抗體；替伊莫單抗(Zevalin )，IDEC/Schering AG所開發(fā)的抗CD20抗 體；吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg )，Celltech/ffyeth 所開發(fā)的抗CD33(p67蛋白)抗體；阿法賽特(alefac印t) (Amevive ), Biogen所開 發(fā)的抗LFA-3FC融合體)；阿昔單抗(ReoPro )，由Centocor/Lilly開發(fā)；巴利昔單抗 (Simulect ),由Novartis開發(fā)；帕利珠單抗(Synagis )，由MedImmune開發(fā)；英夫利 昔單抗(Remicade )，由Centocor所開發(fā)的抗TNFci抗體；阿達(dá)木單抗(Humira ),由 Abbott所開發(fā)的抗TNFa抗體；Humicade ，由Celltech所開發(fā)的抗TNFa抗體；依那西 普(Enbrel ),由 Immunex/Amgen 所開發(fā)的抗 TNF a Fc 融合體；ABX-CBL，由 Abgenix 所開 發(fā)的抗CD147抗體；ABX-IL8，由Abgenix所開發(fā)的抗IL8抗體；ABX-MA1，由Abgenix所 開發(fā)的抗 MUC18 抗體；Pemtumomab (R1549，90Y-muHMFGl)，由 Antisoma 所開發(fā)的抗 MUCl ； Therex(R1550)，由 Antisoma 所開發(fā)的抗 MUCl 抗體；AngioMab (AS1405)，由 Antisoma 開 發(fā)；HuBC-I，由 Antisoma 開發(fā)；Thioplatin (AS1407)，由 Antisoma 開發(fā)；Antegren (那他 珠單抗)，由Biogen所開發(fā)的抗α _4_ β _1 (VLA-4)和α _4_ β ~7抗體；VLA-1單克隆抗體 (mAb)，由Biogen所開發(fā)的抗VLA-I整聯(lián)蛋白抗體；LTBR mAb，由Biogen所開發(fā)的抗淋巴毒 素 β 受體(LTBR)抗體；CAT-152，由劍橋抗體技術(shù)公司(Cambridge Antibody Technology) 所開發(fā)的抗TGF-β 2抗體J695，由劍橋抗體技術(shù)公司和Abbott所開發(fā)的抗IL-12抗體； CAT-192，由劍橋抗體技術(shù)公司和Genzyme所開發(fā)的抗TGFi3 1抗體；CAT-213，由劍橋抗體 技術(shù)公司所開發(fā)的抗嗜酸細(xì)胞活化趨化因子1抗體；LymphoStat-B ，由劍橋抗體技術(shù)公 司和Human Genome Sciences Inc.所開發(fā)的抗Blys抗體；TRAIL-RlmAb，由劍橋抗體技 術(shù)公司和Human GenomeSciences, Inc.開發(fā)的抗TRAIL-Rl抗體；Avastin (貝伐珠單抗， rhuMAb-VEGF)，由Genentech所開發(fā)的抗VEGF抗體；由Genentech所開發(fā)的抗HER受體家族 抗體；抗組織因子(ATF)，由Genentech所開發(fā)的抗組織因子抗體；Xolair (奧馬珠單抗)， 由Genentech所開發(fā)的抗IgE抗體；Raptiva (依法珠單抗)，由Genentech和Xoma所開發(fā) 的抗 CDlla 抗體；MLN-02 抗體(原 LDP-02)，由 Genentech 和 Millenium Pharmaceuticals 開發(fā)；HuMax CD4，由Genmab所開發(fā)的抗CD4抗體；HuMax_IL15，由Genmab和Amgen開發(fā)的 抗 IL15 抗體；HuMax-Inflam,由 Genmab 禾口 Medarex 開發(fā)；HuMax-癌癥，由 Genmab 禾口 Medarex 和Oxford GcoSciences開發(fā)的抗類肝素酶I抗體；HuMax-淋巴瘤，由Genmab和Amgen開 發(fā)；HuMax-TAC，由 Genmab 開發(fā)；IDEC-131，由 IDEC Pharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD40L 抗 體；IDEC-151 (克立昔單抗)，由 IDEC Pharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD4 抗體；IDEC-114,由 IDEC Pharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD80 抗體；IDEC-152，由 IDECPharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD23 ；由IDEC Pharmaceuticals開發(fā)的抗巨噬細(xì)胞遷移因子(MIF)抗體；BEC2，由Imclone 所開發(fā)的抗獨(dú)特型抗體；IMC-1C11，由Imclone所開發(fā)的抗KDR抗體；DC101，由Imclone所開發(fā)的抗flk-1抗體；由Imclone所開發(fā)的抗VE鈣粘蛋白抗體；CEA_CideTM(拉貝珠單 抗)，由Immunomedics所開發(fā)的抗癌胚抗原(CEA)抗體；LymphoCideTM(依帕珠單抗)，由 Immunomedics 所開發(fā)的抗 CD22 抗體；AFP-Cide,由 Immunomedics 開發(fā)；MyelomaCide,由 Immunomedics 開發(fā)；LkoCide,由 Immunomedics 開發(fā)；ProstaCide,由 Immunomedics 開發(fā)； MDX-010,由Medarex所開發(fā)的抗CTLA4抗體；MDX-060，由Medarex所開發(fā)的抗CD30抗體； 由 Medarex 所開發(fā)的 MDX-070 ；由 Medarex 所開發(fā)的 MDX-018 ；OsidenT(IDM-I)，由 Medarex 禾口 Immuno-Designed Molecules 所開發(fā)的抗 Her2 抗體；HuMax -CD4,由 Medarex 禾口 Genmab 所開發(fā)的抗CD4抗體；HuMax-IL15，由Medarex和Genmab所開發(fā)的抗IL15抗體；CNTO 148， 由 Medarex和 Centocor/J&J所開發(fā)的抗TNF α 抗體；CNTO 1275，由 Centocor/J&J所開發(fā)的 抗細(xì)胞因子抗體；MORlOl和M0R102，由MorphoSys所開發(fā)的抗細(xì)胞間粘附分子_1 (ICAM-I) (CD54)抗體；M0R201，由MorphoSys所開發(fā)的抗成纖維細(xì)胞生長因子受體3 (FGFR-3)抗 體；Nuvion (維西珠單抗)，由ProteinDesign Labs所開發(fā)的抗CD3抗體；HuZAF ，由 Protein Design Labs所開發(fā)的抗γ干擾素抗體；由Protein Design Labs所開發(fā)的抗 α 5β 1整聯(lián)蛋白；由Protein Design Labs所開發(fā)的抗IL-12 ； ING-I,由Xoma所開發(fā)的抗 Ep-CAM抗體；和MLN01，由Xoma所開發(fā)的抗β 2整聯(lián)蛋白抗體，本段中上文所引用的所有參 考文獻(xiàn)都特意通過引用并入?？梢詫⒈景l(fā)明的Fc多肽整合到上述臨床候選物和產(chǎn)品中，或者整合到基本上與 它們類似的抗體和Fc融合體中?？梢詫⒈景l(fā)明的Fc多肽整合到人源化、親和力成熟、工程 化、或以一些其他方式修飾的形式中的上述臨床候選物和產(chǎn)品中。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc多肽用于治療自身免疫適應(yīng)癥、炎性適應(yīng)癥、或 移植適應(yīng)癥。與這些疾病相關(guān)的靶抗原和臨床產(chǎn)品和候選物包括但不限于抗α 4β 7整聯(lián) 蛋白抗體，如LDP-02 ；抗β 2整聯(lián)蛋白抗體，如LDP-Ol ；抗補(bǔ)體(C5)抗體，如5G1. 1 ；抗CD2 抗體，如 BTI-322.MEDI-507 ；抗 CD3 抗體，如 0ΚΤ3 ；SMART 抗 CD3、抗 CD4 抗體，如 IDEC-151、 MDX-CD4、0KT4A ；抗 CDlla 抗體；抗 CD14 抗體，如 IC14 ；抗 CD18 抗體；抗 CD23 抗體，如 IDEC 152 ；抗CD25抗體，如賽尼哌；抗CD40L抗體，如5c8、Antova、IDEC-131 ；抗CD64抗體，如 MDX-33 ；抗CD80抗體，如IDEC-114 ；抗CD147抗體，如ABX-CBL ；抗內(nèi)皮細(xì)胞選凝素抗體，如 CDP850 ；抗gpIIb/IIIa抗體，如ReoPro/阿昔單抗；抗ICAM-3抗體，如ICM3 ；抗ICE抗體，如 VX-740 ；抗 FcRl 抗體，如 MDX-33 ；抗 IgE 抗體，如 rhuMab_E25 ；抗 IL-4 抗體，如 SB-240683 ； 抗IL-5抗體，如SB-240563、SCH55700 ；抗IL-8抗體，如ABX-IL8 ；抗干擾素Y抗體；抗 TNF (TNF, TNFa, TNFa, TNF- α )抗體，如 CDP571、CDP870、D2E7、英夫利昔單抗、MAK-195F ；和 抗 VLA-4 抗體，如 Antegren。本發(fā)明的Fc變體，如與FcRn的結(jié)合增加的那些，可用于TNF抑制劑分子中以提供 增強(qiáng)的特性。可用的TNF抑制劑分子包括抑制哺乳動(dòng)物中TNF-α作用的任何分子。合適的 實(shí)例包括Fc融合體Enbrel (依那西普)和抗體Humira (阿達(dá)木單抗)和Remicade (英夫利昔單抗)。使用本發(fā)明的Fc變體工程化以增加FcFn結(jié)合的單克隆抗體(如 Remicade和Humira)可以通過增加的半衰期變得更有效力。在一些實(shí)施方式中，使用抗傳染病的抗體。抗真核細(xì)胞的抗體包括靶向酵母細(xì) 胞的抗體，所述酵母細(xì)胞包括但不限于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢 森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸克魯維酵母(K. Iactis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)和巴斯德畢赤酵母 (P. pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)、和耶羅威亞解脂酵母(Yarrowia lipolytica)。也可以使用抗其他真菌細(xì)胞的抗體，包括與下列菌株相關(guān)的靶抗原念珠菌屬菌 株，包括光滑念珠菌(Candida glabrata)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、克魯斯念珠 菌(C. krusei)、葡萄牙念珠菌(C. Iusitaniae)和麥芽糖念珠菌(C. maltosa)；以及曲霉 屬(Aspergillus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、球孢子菌屬 (Coccidioides)、芽生菌屬(Blastomyces)、禾口青霉菌屬(Penicillium)等。直接針對與原生動(dòng)物相關(guān)的靶抗原的抗體包括但不限于與下列原生動(dòng)物有 關(guān)的抗體錐蟲屬(Trypmosoma)；利什曼原蟲屬(Leishmania)，包括杜氏利什曼原蟲 (Leishmania donovani)；癥原蟲屬(Plasmodium spp.)；卡氏月市囊蟲(Pneumocystis carinii)、小球隱抱子蟲(Cryptosporidium parvum)、蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)、 溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、和卡耶塔環(huán)孢子蟲(Cyclospora cayetanensis)0也可使用抗原核抗原的抗體，包括抗合適的細(xì)菌的抗體，合適的細(xì)菌如致病的 和不致病的原核生物，包括但不限于芽孢桿菌屬(Bacillus)，包括炭疽桿菌(Bacillus anthracis)；弧菌屬(Vibrio)，例如霍亂弧菌(V. cholerae)；埃希氏菌屬(Escherichia), 例如腸毒性的大腸桿菌(E. coli)；志賀氏菌屬(Shigella)，例如，痢疾志賀氏菌 (S. dysenteriae)；沙門氏菌屬(Salmonella)，例如，傷寒沙門氏菌(S. typhi)；分支桿菌屬 (Mycobacterium)，例如，結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、麻風(fēng)分支桿菌(M. 1印rae)；梭 狀芽孢桿菌屬(Clostridium)，例如肉毒桿菌(C. botulinum)、破傷風(fēng)桿菌(C. tetani)、艱 難梭菌(C. difficile)、產(chǎn)氣莢膜桿菌(C. perfringens)；棒桿菌屬(Cornyebacterium)， 例如白喉棒狀桿菌(C. diphtheriae)；鏈球菌屬(Str印tococcus)，釀膿鏈球菌 (S. pyogenes)、月市炎鏈球菌(S. pneumoniae)；葡萄球菌屬(Staphylococcus),例如金黃色 葡萄球菌(S. aureus)；嗜血桿菌屬(Haemophilus)，例如，流感嗜血桿菌(H. influenzae)； 奈瑟氏菌屬(Neisseria)，例如，腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)、淋病奈瑟氏球 菌(N. gonorrhoeae)；耶爾森氏菌屬(Yersinia)，例如，Y. lamblia、鼠疫耶爾森氏菌 (Y.pestis)；假單胞菌屬(Pseudomonas)，例如綠膿假單胞菌(P. aeruginosa)、惡臭假單胞 菌(P. puti da)；衣原體屬(Chlamydia)，例如，沙眼衣原體(C. trachomatis)；博德特氏菌 屬(Bordetella)，例如百日咳博德特氏菌(B. pertussis)；密螺旋體屬(Tr印onema)，例如， 梅毒密螺旋體(T. palladium)；炭疽芽孢桿菌(B. anthracis)、鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏菌 屬(Brucella spp. )、土拉熱弗朗西絲氏菌(F. tularensis)、鼻疽假單胞菌(B. mallei)、類 鼻疽假單胞菌(B. pseudomallei)、鼻疽假單胞菌、類鼻疽假單胞菌、肉毒桿菌、沙門氏菌屬 (Salmonella spp.) ,SEB V.霍亂毒素 B、大腸桿菌 0157 :H7、李斯特菌屬(Listeria spp·)、 白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)，紅酵母屬(Rhodotorula species)、異常漢森 酵母(Hansenula anomala)、腸桿菌屬(Enterobacter sp·)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp·)、李其jf特菌屬(Listeria sp.)、支原菌屬(Mycoplasma sp.)等。在一些方面，抗體是針對病毒感染的，這些病毒包括但不限于包括正粘液病毒 (例如，流感病毒)、副粘液病毒(例如，呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒)、腺病
25毒、鼻病毒、冠狀病毒、呼腸孤病毒、披膜病毒(例如，風(fēng)疹病毒)、細(xì)小病毒、痘病毒(例如， 類天花病毒、痘苗病毒)、腸道病毒(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇腸道病毒)、肝炎病毒 (包括甲型、乙型和丙型)、皰疹病毒(例如，單純孢疹病毒、水痘_帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病 毒、EB病毒)、輪狀病毒、諾瓦克(Norwalk)病毒、漢坦病毒、沙粒病毒、桿狀病毒(例如，狂 犬病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括HIV、HTLV-I和HTLV-II)、乳多泡病毒(例如，乳頭瘤病毒)、 多瘤病毒、和細(xì)小核糖核酸病毒等。優(yōu)化的IgG變體特性本申請還提供經(jīng)過優(yōu)化而具有多種治療相關(guān)特性的IgG變體。被工程化或預(yù)測顯 示一種或多種優(yōu)化的特性的IrG變體在本文中稱為“優(yōu)化的IgG變體”?？梢员粌?yōu)化的最 優(yōu)選特性包括但不限于增強(qiáng)或降低FcRn親和力并增加或降低體內(nèi)半衰期。合適的實(shí)施方 式包括顯出如下特性的抗體在較低的PH下，如在與內(nèi)體相關(guān)的pH如pH 6. O下與FcRn結(jié) 合親和力增加，而在較高的PH如7. 4下保持較低的親和力，從而容許進(jìn)入內(nèi)體的攝取增加， 但釋放速率則正常。類似地，這些具有被調(diào)控的FcRn結(jié)合的抗體可以任選地具有其他期望 的特性，例如，被調(diào)控的 FcyR 結(jié)合，如在 U. S. S. N. 11/174，287、11/124，640、10/822，231、 10/672，280、10/379，392、和2005年10月21日提交的申請?zhí)枮?1/256，060且題目為“具 有優(yōu)化的效應(yīng)子功能的IgG免疫球蛋白變體”的專利申請中所述的。也就是說，優(yōu)化的特 性還包括但不限于對Fc γ R的親和力增強(qiáng)或減弱。在一任選的實(shí)施方式中，IgG變體被 優(yōu)化為具有除了 FcRn結(jié)合特性之外，還具有增強(qiáng)的對人活化Fc y R，優(yōu)選Fc y RIIIa的親 和力。在又一任選的替代性實(shí)施方式中，IgG變體被優(yōu)化為具有降低的對人抑制性受體 Fc y RIIb的親和力。也就是說，具體的實(shí)施方式涵蓋了顯示增加的與FcRn的結(jié)合和增加的 與Fc YRIIIa的結(jié)合的抗體的用途。其他實(shí)施方式利用了顯示增加的與FcRn的結(jié)合和增 加的與Fc YRIIIa的結(jié)合的抗體的用途。預(yù)計(jì)這些實(shí)施方式在人中提供具有增強(qiáng)的治療特 性例如增強(qiáng)的效應(yīng)子功能和較高的抗癌效力的IgG多肽。在替代性實(shí)施方式中，IgG變體 被優(yōu)化為具有增加的或降低的對FcRn的親和力和增加的或降低的對人Fc y R的親和力，人 Fc γ R 包括但不限于 FcYRI、FcYRIIa、FcYRIIb、FcYRIIc、FcYRIIIa、fn Fc YRIIIb，包 括它們的等位基因變異。預(yù)計(jì)這些實(shí)施方式在人中提供具有增強(qiáng)的治療特性例如增強(qiáng)的血 清半衰期和降低的效應(yīng)子功能的IgG多肽。在其他實(shí)施方式中，IgG變體提供增強(qiáng)的對FcRn 的親和力和增強(qiáng)的對一種或多種Fc γ R的親和力，而降低的對一種或多種其他Fc γ R的親 和力。例如，IgG變體可以具有增強(qiáng)的與FcRn和Fc γ RIIIa的結(jié)合，而降低的與FcyRIIIb 的結(jié)合。可選擇地，IgG變體可以具有降低的與FcRn和與Fc γ R結(jié)合。在另一實(shí)施方式中， IgG變體可以具有降低的對FcRn的親和力和增強(qiáng)的對Fc y RI Ib的親和力，而降低的對與一 種或多種活化Fc γ R的親和力。在另一實(shí)施方式中，IgG變體可以具有增加的血清半衰期 和降低的效應(yīng)子功能。優(yōu)選的實(shí)施方式包括與人FcRn和Fc γ R結(jié)合的優(yōu)化，然而，在替代性實(shí)施方式中， IgG變體具有增強(qiáng)的或降低的對來自非人生物體的FcRn ^P FcyR的親和力，非人生物體包 括但不限于嚙齒動(dòng)物和非人的靈長類。被優(yōu)化用于結(jié)合非人FcRn的IgG變體可用于實(shí)驗(yàn) 中。例如，可以使用用于多種疾病的小鼠模型，該小鼠模型能夠測試給定藥物候選物的特 性，如效力、毒性和藥代動(dòng)力學(xué)特性。如本領(lǐng)域中所已知的，可以將癌細(xì)胞移植或注入小鼠 以模擬人的癌癥，此過程稱為異種移植。包括被優(yōu)化用于FcRn的IgG變體的IgG變體的測試可以提供關(guān)于蛋白的清除特征、其清除機(jī)制等的有價(jià)值信息。還可以優(yōu)化IgG變體以具 有增強(qiáng)糖基化形式的官能度和/或溶解特性。Fc配體包括但不限于FcRn、Fc y R、Clq、和 蛋白A和G，它可以來自任何來源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、或猴，優(yōu)選為人。在替 代性優(yōu)選實(shí)施方式中，將IgG變體優(yōu)化為比親本IgG變體的糖基化形式更穩(wěn)定和/或更可溶。IgG變體可以包括調(diào)控與非FcRn和Fc γ R的Fc配體之間的相互作用的修飾，所述 非FcRn和Fc γ R的Fc配體包括但不限于補(bǔ)體蛋白和Fc受體同源物(FcRH)。FcRH包括但 不限于 FcRHl、FcRH2、FcRH3、FcRH4、FcRH5、和 FcRH6 (Davis 等人，2002，Immunol. Reviews 190 :123-136，其通過引用整體并入)。優(yōu)選地，IgG變體的Fc配體特異性將決定它的治療效用。用于治療目的的給定IgG 變體的效用取決于靶抗原的表位或形式以及所治療的疾病或適應(yīng)癥。對于大多數(shù)的靶和適 應(yīng)癥，增強(qiáng)的FcRn結(jié)合可能是優(yōu)選的，因?yàn)樵鰪?qiáng)的FcRn結(jié)合可以導(dǎo)致血清半衰期的增加。 較長的血清半衰期容許治療劑較低頻率的給藥或較少給藥。這在治療劑是為了響應(yīng)需要重 復(fù)施用的適應(yīng)癥而提供時(shí)是尤其優(yōu)選的。對于某些靶和適應(yīng)癥，降低的FcRn親和力可能是 優(yōu)選的。這在期望變體Fc具有增強(qiáng)的清除率或降低的血清半衰期時(shí)，例如在用作成像劑或 輻射治療劑的Fc多肽中時(shí)是尤其優(yōu)選的。可以使用包括這樣的IgG變體的IgG變體提供增強(qiáng)的對FcRn的親和力和增強(qiáng) 的對活化Fc γ R的親和力和/或降低的對抑制性Fc γ R的親和力。對于某些靶和適應(yīng)癥， 還有利的是使用對不同的活化Fc γ R提供不同的選擇性的IgG變體，例如，在一些情況下 可能期望增強(qiáng)與Fc y RIIa和Fc Y RIIIa而非Fc y RI的結(jié)合，而在其他情況下，僅增強(qiáng)與 Fc y RIIa的結(jié)合可能是優(yōu)選的。對于某些靶和適應(yīng)癥，可能優(yōu)選的是利用改變FcRn結(jié)合 并增強(qiáng)Fc γ R介導(dǎo)的效應(yīng)子功能和補(bǔ)體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能二者的IgG變體，而對于其他情 況下，可能有利的是利用增強(qiáng)FcRn結(jié)合或血清半衰期以及Fc γ R介導(dǎo)的或補(bǔ)體介導(dǎo)的效應(yīng) 子功能的IgG變體。對于某些靶或癌癥適應(yīng)癥，可能有利的是降低或消除一個(gè)或多個(gè)效應(yīng) 子功能，例如通過敲除與Clq、一種或多種Fc y R、FcRn、或一種或多種其他Fc配體的結(jié)合進(jìn) 行。對于其他靶和適應(yīng)癥，可能優(yōu)選的是利用提供與抑制性Fc γ RIIb結(jié)合增強(qiáng)，而與活化 Fc Y R結(jié)合為野生型水平、被降低或消除的IgG變體。這在例如當(dāng)IgG變體的目標(biāo)是抑制炎 性或自身免疫性疾病或以某種方式調(diào)控免疫系統(tǒng)的時(shí)候是特別可用的。由于自身免疫性疾 病通常持續(xù)很久并且治療要重復(fù)給藥，用具有增加的半衰期而不是增加的FcRn的Fc變體 進(jìn)行它們的治療是尤其優(yōu)選的?？梢赃M(jìn)行修飾來改善IgG穩(wěn)定性、溶解性、功能、或臨床用途。在優(yōu)選的實(shí)施方式 中，IgG變體可以包括在人中降低的免疫原性的修飾。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用USSN 11/004, 590中所述的方法降低IgG變體的免疫原性，USSN 11/004, 590通過引用整體并入。 在替代性實(shí)施方式中，IgG變體是人源化的(Clark, 2000, Immunol Today 21 =397-402, ffl 過引用整體并入)。IgG變體可以包括降低免疫原性的修飾。降低免疫原性的修飾可以包括降低源自 親本序列的加工肽與MHC蛋白的結(jié)合的修飾。例如，可以工程化氨基酸修飾以便沒有或有 最少數(shù)目的免疫表位預(yù)計(jì)與任何主要MHC等位基因高親和力結(jié)合。本領(lǐng)域內(nèi)已知在蛋白 序列中鑒定MHC結(jié)合表位的若干方法，它們可以用于對在IgG變體中的表位評分。參見，例如 W098/52976 ；WO 02/079232 ；WO 00/3317 ；USSN 09/903，378 ；USSN10/039, 170 ；USSN 60/222, 697 ；USSN 10/754, 296 ；PCT WO 01/21823 ；和 PCT WO 02/00165 ；Mallios,1999, Bioinformatics 15 432-439 ；Mallios,2001, Bioinformatics 17 942-948 ；Sturniolo 等人，1999，Nature Biotech. 17 555-561 ；WO 98/59244 ；WO 02/069232；WO 02/77187 ； Marshall 等人，1995，J. Immunol. 154 :5927_5933 ；以及Hammer 等人，1994，J. Exp. Med. 180 2353-2358，它們都通過引用整體并入?？梢允褂没谛蛄械男畔泶_定給定肽-MHC相互 作用的結(jié)合評分(參見，例如Mallios，1999，Bioinformatics 15 :432_439 ；Mallios，2001， Bioinformatics 17 第 942-948 頁；Sturniolo 等人，1999，Nature Biotech. 17 :555_561， 它們都通過引用整體并入)。工程化IgG變體本發(fā)明的變體可以通過多種方法設(shè)計(jì)。本文所述的變體可以是插入、缺失、取代、 其他修飾、或這些的組合和其他改變。本發(fā)明的一個(gè)特別新穎的實(shí)施方式是改善或降低Fc 多肽與Fc配體的結(jié)合的插入和缺失的設(shè)計(jì)。如本文所公開的，可以進(jìn)行插入或缺失以增加 或降低Fc多肽對FcRn的親和力?？梢酝ㄟ^合理的方法或通過包括使用隨機(jī)組分例如隨機(jī) 或半隨機(jī)的文庫產(chǎn)生或篩選的方法來設(shè)計(jì)插入和缺失。在替代性實(shí)施方式中，公開了增加 或降低Fc多肽對FcRn的親和力的取代。骨架修飾插入和缺失變體Fc多肽可以通過用變體氨基酸取代Fc多肽位置的親本氨基酸產(chǎn)生。通過將 Fc多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代為變體氨基酸，改變了那些位置上的側(cè)鏈。最可用的取 代通過改變Fc側(cè)鏈而更改Fc特性。取代的側(cè)鏈可以直接或間接與和Fc功能或特性相關(guān) 的Fc結(jié)合配偶體相互作用。該至少一個(gè)取代改變了親本Fc多肽的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈的共價(jià) 結(jié)構(gòu)?？蛇x擇地，可以產(chǎn)生改變親本Fc多肽的骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)的變體Fc多肽。蛋白中 的骨架原子是肽氮、α碳、羰基或肽碳和羰基氧。改變骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)提供改變Fc多肽的 特性的另外的方法。Fc骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)可以通過添加原子到骨架中來改變，例如，通過插 入一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或從骨架中減去原子來改變，例如通過缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。骨 架的共價(jià)結(jié)構(gòu)還可以通過將骨架的各原子改變?yōu)槠渌觼砀淖?Deechongkit等人，JAm Chem Soc. 2004. 126(51) :16762_71，通過引用整體并入)。如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的和本文所 示例的，F(xiàn)c多肽中氨基酸的插入或缺失可以通過插入或缺失編碼Fc多肽的DNA中的相應(yīng) 核苷酸來進(jìn)行?？蛇x擇地，如本領(lǐng)域中所已知，氨基酸的插入或缺失可以在Fc多肽合成期 間進(jìn)行。改變Fc多肽與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配偶體(例如，F(xiàn)c y R、FcRn、Clq)的相互作用的氨 基酸插入或缺失的設(shè)計(jì)可以通過考慮Fc多肽及其結(jié)合配偶體的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)來進(jìn)行。在 次優(yōu)選的實(shí)施方式中，該設(shè)計(jì)可以通過考慮Fc多肽的結(jié)構(gòu)和關(guān)于參與與結(jié)合配偶體的結(jié) 合的Fc區(qū)的信息來進(jìn)行。這種信息可以通過誘變實(shí)驗(yàn)、噬菌體展示實(shí)驗(yàn)、同源性比較、計(jì)算 機(jī)建?；蚱渌椒ǐ@得。影響Fc結(jié)合相互作用但是不影響Fc多肽的整體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、表達(dá)或Fc用途 的插入或缺失的氨基酸序列的優(yōu)選位置為參與Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用的環(huán)。為了改 變 FcRn 與 Fc 多肽的結(jié)合，位置 244-257、279-284、307-317、383-390、和 428-435 是插入
28或缺失的優(yōu)選環(huán)位置(根據(jù)Kabat等人的EU索引編號(hào)，Burmeister等人，1994，Nature, 372 :379-383 ;Martin 等人，2001，Mol Cell 7 :867_877，它們都通過引用整體并入)。為 了改變Fc γ受體與Fc多肽的結(jié)合，位置229-239、266-273、294-299、和324-331是插入或 缺失的優(yōu)選環(huán)位置(根據(jù)Kabat等人的EU索引編號(hào)，PDB編號(hào)1E4K. pdb，Sondermann等 人Nature. 2000406 :267，它們都通過引用整體并入)。環(huán)是不參與α螺旋或β片層結(jié) 構(gòu)的多肽區(qū)域。環(huán)位置是不在α螺旋或β片層結(jié)構(gòu)中的位置(van Holde, Johnson和 Ho. Principles of Physical Biochemistry (物理生化原理)· Prentice Hall,New Jersey 1998，第1章，第2-67頁，通過引用整體并入)。環(huán)位置是優(yōu)選的是因?yàn)楣羌茉优cα螺旋 和β片層的骨架原子相比通常是更柔韌的并且不太可能參與氫鍵。因此，由于一個(gè)或多個(gè) 氨基酸的插入或缺失而引起的環(huán)的加長或縮短不太可能引起Fc多肽的大的破壞性改變， 包括穩(wěn)定性、表達(dá)或其他問題?？梢允褂貌迦牒腿笔砀淖兌嚯牡拈L度。例如，在環(huán)區(qū)域，改變環(huán)長度會(huì)導(dǎo)致環(huán) 的柔性和構(gòu)象熵改變。環(huán)中的插入通常增加環(huán)的構(gòu)象熵，環(huán)的構(gòu)象熵用Boltzman常數(shù)乘 以可能的構(gòu)象數(shù)的自然對數(shù)來定義(van Holde, Johnson和Ho. Principles of Physical Biochemistry (物理生化原理).PrenticeHall，New Jersey 1998，第 78 頁，通過引用整體 并入)。通過將至少一個(gè)氨基酸插入到多肽中，多肽可用的構(gòu)象總數(shù)增加了。這些額外的構(gòu) 象可能有益于形成有利的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，因?yàn)镕c多肽可以使用額外構(gòu)象之一 來結(jié)合Fc結(jié)合蛋白。在這種情況下，插入可能導(dǎo)致較強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用。如 果額外的構(gòu)象沒有用于結(jié)合界面，則插入可能導(dǎo)致較弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，因 為額外的構(gòu)象會(huì)與結(jié)合活性構(gòu)象相競爭。類似地，多肽片段的缺失也可能導(dǎo)致較強(qiáng)或較弱 的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用。如果降低可能的骨架構(gòu)象數(shù)的片段的缺失移除了結(jié)合活性 構(gòu)象，則該缺失可能導(dǎo)致較弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用。如果缺失不移除結(jié)合活性構(gòu) 象，則該缺失可能導(dǎo)致較強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，因?yàn)樵撊笔Э赡芤瞥c結(jié)合活 性構(gòu)象競爭的構(gòu)象。可以使用插入和缺失來改變Fc多肽中氨基酸的位置和取向。因?yàn)椴迦牒腿笔б?起骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)改變，它們必然會(huì)引起骨架原子的位置改變。圖7比較了在三個(gè)不同的 骨架中標(biāo)記為Ll至L4的相同環(huán)片段的骨架位置。參考骨架結(jié)構(gòu)含有4個(gè)環(huán)片段，而缺失 骨架缺乏片段Li，插入片段在片段Ll之前即片段Ll的N-末端包含額外的片段。插入和 缺失會(huì)引起插入或缺失位點(diǎn)附近的骨架結(jié)構(gòu)的最大改變。通過缺失環(huán)的N-末端附近的片 段，例如，片段Li，環(huán)縮短了，并且剩余的片段的位置向更接近環(huán)N-末端的位置移動(dòng)。這具 有將L2片段向之前的Ll片段位置和向環(huán)N-末端移動(dòng)的效果。這種L2片段向Ll片段的 位置移動(dòng)可能增強(qiáng)Fc/Fc結(jié)合配偶體復(fù)合體的結(jié)合，并且在當(dāng)現(xiàn)有信息表明位于L2的一個(gè) 或多個(gè)氨基酸在位于Ll時(shí)能夠促進(jìn)Fc結(jié)合配偶體的相互作用時(shí)這是優(yōu)選的。例如，如果 L2含有丙氨酸和酪氨酸，并且之前將兩個(gè)Ll氨基酸取代為丙氨酸和酪氨酸導(dǎo)致Fc變體的 結(jié)合增加，則Ll缺失可能產(chǎn)生對Fc結(jié)合配偶體的親和力增加的Fc變體。類似地，在環(huán)的N末端側(cè)將多肽片段插入Fc多肽中會(huì)引起環(huán)片段的位置移向環(huán)的 C-末端側(cè)。在圖7中，在片段Ll之前即片段Ll的N-末端插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變了骨 架構(gòu)象，包括使Ll片段移至環(huán)的C-末端。這種類型的插入在已知位于片段Ll的氨基酸位 于L2位置時(shí)能夠促進(jìn)相互作用的時(shí)候是優(yōu)選的，因?yàn)樵摬迦肟赡軐?dǎo)致較強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用。如果期望較弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，則可以使用插入來將不利的 氨基酸移至新的位置。插入的、缺失的和參考片段(圖7中的Ll至L4)可以是Fc多肽中 的一個(gè)或多于一個(gè)的氨基酸。可選擇地，可以在環(huán)的C-末端以類似于環(huán)的N-末端的插入或缺失的方式使用插 入或缺失。環(huán)C-末端的插入可能導(dǎo)致插入的N-末端位置向環(huán)N-末端移動(dòng)。環(huán)C-末端的 缺失可能導(dǎo)致缺失的N-末端位置向環(huán)C-末端移動(dòng)。在環(huán)的N-末端還是C-末端使用插入 或缺失的選擇基于位于環(huán)中的氨基酸、對增加或降低Fc/Fc結(jié)合配偶體親和力的期望、和 所需的位置移動(dòng)。插入或缺失可用于Fc多肽的任何區(qū)域，包括環(huán)、α螺旋和β片層區(qū)。優(yōu)選的插 入和缺失位置包括環(huán)區(qū)域，它是非α螺旋或β片層區(qū)的那些區(qū)域。環(huán)是優(yōu)選的是因?yàn)樗?們一般能比α螺旋或β片層更好地接受骨架中的改變。導(dǎo)致較強(qiáng)的蛋白/蛋白相互作用 的插入或缺失的尤其優(yōu)選的位置在環(huán)的N-末端或C-末端邊緣。如果環(huán)的側(cè)鏈參與了 Fe/ Fc結(jié)合配偶體相互作用，則在邊緣的插入或缺失會(huì)導(dǎo)致結(jié)合相互作用中強(qiáng)的有害改變的可 能性較低。環(huán)的正中心的缺失更可能移除Fc/Fc結(jié)合配偶體界面的重要?dú)埢?，環(huán)的正中心 的插入更可能產(chǎn)生Fc/Fc結(jié)合配偶體界面的不利相互作用。缺失或插入的殘基數(shù)目可以通 過所需的骨架改變的大小來決定，其中15個(gè)或更少的殘基的插入或缺失是優(yōu)選的，10個(gè)或 更少的殘基的插入或缺失是更優(yōu)選的，并且5個(gè)或更少的殘基的插入或缺失是最優(yōu)選的。一旦設(shè)計(jì)出Fc缺失變體的位置和大小，便完全確定了整個(gè)多肽序列，可以通過本 領(lǐng)域內(nèi)已知的方法構(gòu)建多肽。然而Fc插入變體則具有設(shè)計(jì)要插入的至少一個(gè)氨基酸的序列的額外步驟。包括 Ser, Thr、Asn, Gin、Ala、Gly、His的極性殘基的插入優(yōu)選在預(yù)期在Fc多肽中暴露的位置。 包括Ser、Thr、和Ala的較小氨基酸是尤其優(yōu)選的，因?yàn)樾〕叽缥蛔韪蓴_Fc/Fc結(jié)合配偶體 相互作用的可能性較小。Ser和Thr還具有與Fc結(jié)合配偶體上的原子形成氫鍵的能力。插入還具有增加的靈活性，插入的多肽可以設(shè)計(jì)成有利于與Fc結(jié)合配偶體的 相互作用，如在需要較強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合配偶體結(jié)合時(shí)所期望的。骨架插入的長度可以通 過對具有簡單通用的插入序列的變體骨架建模來確定。例如，可以構(gòu)建不同長度的聚 絲氨酸、聚甘氨酸或聚丙氨酸插入，并進(jìn)行建模。建?？梢酝ㄟ^多種方法進(jìn)行，包括基于 包含插入的同源物的已知三維結(jié)構(gòu)的同源物建模，可以通過包括如下的計(jì)算機(jī)建模進(jìn) ^T MODELLER (M. A. Marti-Renom 等人.Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29，291—325， 2000)和 ROSETTA(KuhIman 等人(2003). Science 302，1364-8)，它們都通過引用整體并 入。通常，最初制備多種骨架構(gòu)象，最終的骨架結(jié)構(gòu)則在確定側(cè)鏈特征之后確定。側(cè)鏈可 以通過PDA 算法設(shè)計(jì)(us 6，188，965 ；6，269，312 ；6，403，312 ；6，801，861 ；6，804，611 ； 6，792，356 ；6，950，754 禾口 USSN09/782, 004 ；09/927，790 ；10/101，499 ；10/666，307 ； 10/666311 ；10/218, 102，它們都通過引用整體并入)?？梢赃M(jìn)行插入和缺失來以類似于所述用于改變FcRn結(jié)合特性的方法的方式改變 Fc多肽與Fc γ R的結(jié)合。Fc結(jié)構(gòu)域在圖1中所指示的位置結(jié)合Fc y R0 Fc/Fc y R復(fù)合體 的結(jié)構(gòu)包括 PDB 編號(hào) 1Τ89 禾口 IIIS (Radaev S 等人 J. Biol. Chem.第 276 卷，第 16469-16477 頁，通過引用整體并入)展示了兩種結(jié)構(gòu)之間的相互作用殘基和環(huán)。諸如在US11/124620 和US6737056(它們都通過引用整體并入)中所發(fā)現(xiàn)的那些誘變結(jié)果全都可用于確定適當(dāng)?shù)墓羌芏ㄎ灰苿?dòng)?？梢酝ㄟ^本文所述的方法將插入和缺失設(shè)計(jì)在Fc多肽之外的任何多肽中。例 如，TNF超家族成員APRIL的插入或缺失可以借助于其三維結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)1XU1. pdb， Hymowitz，等人(2005) J. Biol. Chem. 280 :7218，通過引用整體并入)來設(shè)計(jì)?？梢栽O(shè)計(jì)插 入或缺失來增加APRIL與其受體TACI的結(jié)合。優(yōu)選作為插入或缺失位點(diǎn)的環(huán)殘基為殘基 Serll8-Vall24、Aspl64-Phel67、Prol92-Alal98、Pro221-Lys226。這些環(huán)與 APRIL/TACI 復(fù) 合體中的TACI相互作用并且介導(dǎo)結(jié)合。整合多肽的變體IgG變體可以基于人IgG序列，因此人IgG序列用作其他序列與之比較的“基本” 序列，其他序列包括但不限于來自其他生物體的序列，如嚙齒動(dòng)物和靈長類序列。IgG變體 還可以包含來自其他免疫球蛋白種類的序列，如IgA、IgE、IgD、IgM等。本發(fā)明包括盡管 IgG變體是在一個(gè)親本IgG的背景下工程化的，但是可以將變體工程化到或“轉(zhuǎn)移”到另一 個(gè)第二親本IgG的背景中。這通過確定第一和第二 IgG之間的“等同”或“對應(yīng)”殘基和取 代來進(jìn)行，通常是基于IgG序列之間的序列或結(jié)構(gòu)同源性進(jìn)行。為了確定同源性，將本文所 列的第一 IgG的氨基酸序列直接與第二 IgG的序列進(jìn)行比較。使用容許必須的插入和缺失 以保持比對(即，避免通過任意缺失和插入消除保守殘基)的本領(lǐng)域內(nèi)已知的一種或多種 同源比對程序(例如使用物種之間的保守殘基)比對序列后，定義等同于第一 IgG變體的 一級(jí)序列的具體氨基酸的殘基。保守殘基的比對優(yōu)選應(yīng)保留100%的這種殘基。然而，大 于75%或小至50%的保守殘基比對也足以定義等同殘基。等同殘基還可以通過測定第一 和第二 IgG的結(jié)構(gòu)同源性來定義，結(jié)構(gòu)同源性在結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定的IgG的三級(jí)結(jié)構(gòu)水平進(jìn) 行。在這種情況下，等同殘基被定義為在比對后親本或前體的具體氨基酸殘基的兩個(gè)或多 個(gè)主鏈原子的原子坐標(biāo)(N上的N，CA上的CA、C上的C和0上的0)在0. 13nm之內(nèi)且優(yōu)選 為0. Inm的殘基。在最佳的模型被定向和定位以使蛋白的非氫蛋白原子的原子坐標(biāo)最大程 度的重疊之后，便完成了比對。無論如何確定等同或?qū)?yīng)殘基，也無論制備IgG的親本IgG 的身份如何，所傳達(dá)的意思是由此發(fā)現(xiàn)的IgG變體可以被工程化到與IgG變體具有明顯的 序列或結(jié)構(gòu)同源性的任何第二親本IgG中。因此，例如，如果通過使用上述方法或測定等 同殘基的其他方法制備了其中親本抗體為人IgGl的變體抗體，則可以將變體抗體工程化 到結(jié)合不同抗原的另一 IgGl親本抗體、人IgG2親本抗體、人IgA親本抗體、小鼠IgG2a或 IgG2b親本抗體等中。同樣，如上文所述，親本IgG變體背景不會(huì)影響IgG變體轉(zhuǎn)移至其他 親本IgG的能力。提供了工程化、制備、和篩選IgG變體的方法。所述方法不旨在限制于任何具體的 應(yīng)用或操作理論。相反，所提供的方法旨在一般性地示例出可以用實(shí)驗(yàn)方法工程化、制備 和篩選一種或多種IgG變體以獲得具有優(yōu)化的效應(yīng)子功能的IgG變體。USSN 10/754, 296 和USSN 10/672,280中描述了用于設(shè)計(jì)、制備和測試抗體和蛋白變體的多種方法，USSN 10/754，296和USSN 10/672，280都通過引用整體并入?？梢允褂枚喾N蛋白工程化方法來設(shè)計(jì)具有優(yōu)化的效應(yīng)子功能的IgG變體。在一 個(gè)實(shí)施方式中，可以使用基于結(jié)構(gòu)的工程化方法，其中使用可用的結(jié)構(gòu)信息來指導(dǎo)取代、插 入或缺失。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以使用計(jì)算篩選方法，其中根據(jù)它們在計(jì)算機(jī)計(jì)算中 的能量適合性(energetic fitness)來設(shè)計(jì)取代。參見，例如USSN 10/754，296和USSN
3110/672，280、以及本文所引用的參考文獻(xiàn)，它們都通過引用整體并入。可以使用序列比對來指導(dǎo)在指定位置的取代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解序列 信息的使用可以控制可能不利于蛋白結(jié)構(gòu)的取代的引入。序列來源可能廣泛地變化， 并且包括一個(gè)或多個(gè)已知的數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫包括但不限于=Kabat數(shù)據(jù)庫(美國西 北大學(xué))Johnson & Wu,2001，Nucleic AcidsRes. 29 205-206 Johnson & Wu,2000， NucleicAcids Res. 28 214-218) ；IMGT—_ (IMGT，the international ImMunoGeneTics information system ; Lefranc 等人，1999，Nucleic Acids Res. 27 :209_212 ；Ruiz 等 人，2000NucleicAcids Res. 28 219~221 ；Lefranc φ 人，2001，Nucleic Acids Res. 29 207-209 ;Lefranc 等人，2003，Nucleic Acids Res. 31 :307_310)；和 VBASE，它們都通過引 用整體并入?？梢詮姆N系序列或來自包括但不限于哺乳動(dòng)物的任何生物體的天然存在的抗 體序列的序列比對獲得、匯編、和/或產(chǎn)生抗體序列信息。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解使用人 或基本上是人的序列還可以在施用給人時(shí)具有較低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。更一般性的核酸或蛋 白數(shù)據(jù)庫即不是特別針對抗體的其他數(shù)據(jù)庫包括但不限于Swi ssProt、GenBank Entrez、和 EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫。比對的序列可以包括￥!1、￥1^、01、和/或(^序列。本領(lǐng)域內(nèi)已知 大量的基于序列的比對程序和方法，并且它們都可以用于進(jìn)行序列比對?？蛇x擇地，可以使用隨機(jī)或半隨機(jī)誘變法在所需位置進(jìn)行氨基酸修飾。在這些情 況下，位置是隨機(jī)選擇的，或者使用簡單化的規(guī)則進(jìn)行氨基酸改變。例如，可以將所有殘基 都突變?yōu)楸彼?，這稱為丙氨酸掃描。這類方法可以與采用選擇法來篩選較高水平的序列 多樣性的更復(fù)雜的工程化方法結(jié)合。如本領(lǐng)域所已知的，多種選擇技術(shù)可以用于此類方法， 包括例如，展示技術(shù)，如噬菌體展示、核糖體展示、細(xì)胞表面展示等，如下文所描述的。制備和篩選IgG變體的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。抗體分子生物學(xué)、表達(dá)、純化 和篩選的一般方法描述于Antibody Engineering (抗體工程化)，Duebel & Kontermann 編輯，Springer-Verlag, Heidelberg, 2001 ；禾口 Hayhurst&Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5 683-689 ；Maynard & Georgiou，2000，Arrnu Rev Biomed Eng 2 :339_76 巾。
USSN 10/754，296 ；USSN10/672, 280 ；和 USSN 10/822，231 ；以及 11/124，620 中所描述的方 法，它們都通過引用整體并入。本發(fā)明的優(yōu)選變體包括圖8中出現(xiàn)的那些。本發(fā)明的替代 性優(yōu)選變體包括圖9中出現(xiàn)的那些。本發(fā)明的另外的替代性優(yōu)選變體包括圖10中出現(xiàn)的 那些。如實(shí)施例中所示例的，這些變體顯示與Fc受體FcRn的結(jié)合增加。制備IgG變體IgG變體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法制備。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用 IgG變體序列來制備編碼成員序列的核酸，如果需要可以然后將該核酸克隆到宿主細(xì)胞中， 表達(dá)并測定。這些實(shí)踐使用熟知的方法進(jìn)行，并且可以使用的多種方法描述在Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊)，第 3 版(Maniatis, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,2001)；禾口Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))(John Wiley & Sons)中，它們都通過引用整體并入。 可以將編碼IgG變體的核酸整合到表達(dá)載體中以表達(dá)蛋白。表達(dá)載體通常包括與控制或調(diào) 節(jié)序列、選擇標(biāo)志物、任何融合配偶體和/或另外的元件可操作地連接即置于功能關(guān)系的 蛋白。可以通過在合適的條件下培養(yǎng)用核酸，優(yōu)選含有編碼IgG變體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化的宿主細(xì)胞以誘導(dǎo)或引起蛋白表達(dá)來制備IgG變體?？梢允褂枚喾N合適的宿主細(xì)胞，包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞和酵母。例如，可以使用的多種細(xì)胞系描述在自 美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得的ATCC細(xì)胞系目錄 中，其通過引用整體并入。將外源核酸引入宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，并且可以 隨所用的宿主細(xì)胞而變化。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在IgG變體表達(dá)后，將其純化或分離?？贵w可以用本領(lǐng)域的 那些技術(shù)人員所已知的多種方法來分離或純化。標(biāo)準(zhǔn)的純化方法包括色譜技術(shù)、電泳、免 疫、沉淀、透析、過濾、濃縮、和色譜聚焦技術(shù)。如本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，多種天然蛋白結(jié)合抗 體，例如細(xì)菌蛋白A、G和L，并且這些蛋白可用于純化。通常，能夠通過特定融合配偶體來進(jìn) 行純化。例如，如果使用GST融合體，則可以使用谷胱甘肽樹脂來純化蛋白；如果使用His 標(biāo)簽，則使用Ni+2親和色譜，或如果使用flag標(biāo)簽，則使用固定的抗flag抗體。對于合適 的純化技術(shù)的一般指南，參見AntibodyPurification principles and Practice (抗體純 化原理與實(shí)踐)，第3版，Scopes, Springer-Verlag，NY，1994，其通過引用整體并入。篩選IgG變體Fc變體可以使用多種方法來篩選，包括但不限于使用體外測定、體內(nèi)和基于細(xì) 胞的測定以及選擇技術(shù)的那些方法。可以將自動(dòng)和高通量篩選技術(shù)用于篩選方法。篩選 可以采用融合配偶體或標(biāo)記，例如，免疫標(biāo)記、同位素標(biāo)記、或小分子標(biāo)記，如熒光或發(fā)色染 料。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在體外測定中篩選Fc變體的功能和/或生物物理特性。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，篩選蛋白的官能度，例如其催化反應(yīng)的能力或其與其靶的結(jié)合親和力。如本領(lǐng)域中所已知的，篩選方法的亞類為選擇文庫的有利成員的那些方法。該方 法在本文中稱為“選擇方法”，并且這些方法可用于在本發(fā)明中篩選Fc變體。當(dāng)使用選擇方 法篩選蛋白文庫時(shí)，僅繁殖、分離、和/或觀察那些有利的文庫成員，即符合一些選擇標(biāo)準(zhǔn) 的成員。可用于本發(fā)明中篩選蛋白文庫的許多選擇方法是本領(lǐng)域內(nèi)所已知的?？捎糜诒景l(fā) 明中的其他選擇方法包括不依賴于展示如體內(nèi)方法的方法。稱為“定向進(jìn)化”法的一組選 擇方法是包括在選擇期間配對或延伸有利序列，有時(shí)會(huì)摻入新的突變的那些方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用一種或多種基于細(xì)胞的測定或體內(nèi)測定來篩選Fc變 體。對于這類測定，通常外源地添加純化的或非純化的蛋白以便使細(xì)胞暴露于屬于文庫的 單個(gè)變體或變體庫。這些測定通常但不總是基于Fc多肽的功能；S卩，F(xiàn)c多肽結(jié)合其靶并介 導(dǎo)諸如效應(yīng)子功能、配體/受體結(jié)合抑制、凋亡等的一些生物化學(xué)事件的能力。這些測定通 常包括監(jiān)控細(xì)胞對IgG的反應(yīng)，例如細(xì)胞存活、細(xì)胞死亡、細(xì)胞形態(tài)改變、或轉(zhuǎn)錄激活，如天 然基因或報(bào)道基因的細(xì)胞表達(dá)。例如，這些測定可以測量Fc變體引起ADCC、ADCP、或CDC的 能力。對于一些測定，可能需要添加另外的細(xì)胞或組分即除靶細(xì)胞之外的細(xì)胞或組分，例如 血清補(bǔ)充物、或效應(yīng)子細(xì)胞，如外周血單核細(xì)胞(PBMC)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。這些額外的 細(xì)胞可以來自任何生物體，優(yōu)選人、小鼠、大鼠、兔、和猴。抗體可能引起表達(dá)靶的某些細(xì)胞 系凋亡，或它們可能介導(dǎo)被添加到測定中的免疫細(xì)胞對靶細(xì)胞的攻擊。監(jiān)控細(xì)胞死亡或存 活率的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括染料、免疫化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、和放射性試劑的使用。轉(zhuǎn)錄 激活還可以作為在基于細(xì)胞的測定中測定功能的方法?？蛇x擇地，基于細(xì)胞的篩選使用被 用編碼變體的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來進(jìn)行。也就是說，F(xiàn)c變體不是外源地添加到細(xì)胞中 的。
IgG變體的生物特性可以在細(xì)胞、組織和整個(gè)生物體實(shí)驗(yàn)中表征。如本領(lǐng)域所已知 的，藥物通常在動(dòng)物中測試以測量藥物治療疾病或疾病模型的效力或測量藥物的藥代動(dòng)力 學(xué)、毒性和其他特性，所述動(dòng)物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、貓、豬和猴。這些動(dòng)物可以 被稱為疾病模型。治療劑通常在小鼠中測試，所述小鼠包括但不限于裸小鼠、SCID小鼠、異 種移植小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠(包括敲入和敲除)。此實(shí)驗(yàn)可以提供測定蛋白用作治療劑的可 能的有意義的數(shù)據(jù)?？梢允褂萌魏紊矬w，優(yōu)選哺乳動(dòng)物進(jìn)行測試。例如，由于猴與人的遺 傳相似性，它們可能是合適的治療模型，因此可以用于測試IgG的效力、毒性、藥代動(dòng)力學(xué) 或其他特性。在人中的測試最終需要被批準(zhǔn)作為藥物，因此當(dāng)然包括了這些實(shí)驗(yàn)。因此，可 以在人中測試IgG以測定它們的治療效力、毒性、免疫原性、藥代動(dòng)力學(xué)、和/或其他臨床特 性。使用IgG變體的方法IgG變體可用于大量產(chǎn)品中。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG變體為治療試劑、診斷試劑、 或研究試劑，優(yōu)選為治療試劑。IgG變體可用于單克隆或多克隆的抗體組合物中。在優(yōu)選的 實(shí)施方式中，IgG變體用于殺傷具有靶抗原的靶細(xì)胞，例如癌細(xì)胞。在替代性實(shí)施方式中， IgG變體用于阻斷、拮抗或激動(dòng)靶抗原，例如拮抗細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體。在替代性的優(yōu) 選實(shí)施方式中，IgG變體用于阻斷、拮抗或激動(dòng)靶抗原并殺傷具有靶抗原的靶細(xì)胞。IgG變體可用于多種治療目的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將包含IgG變體的抗體施用 給患者以治療抗體相關(guān)病癥。為了該目的的“M”包括人和其他動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物并且 最優(yōu)選為人。本文所謂的“抗體相關(guān)病癥”或“抗體反應(yīng)件病癥”或“病況”或“疾病”意指可 以通過施用包含IgG變體的藥物組合物而改善的病癥。抗體相關(guān)病癥包括但不限于自身 免疫性疾病、免疫疾病、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)疾病、以及腫瘤和瘤形成性疾病，包括癌癥。 本文所謂的“癌癥(cancer) ”和“癌癥(cancerous) ”是指或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為未 調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長的生理病況。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤(包 括脂肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、間皮瘤、施萬細(xì)胞瘤、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病和惡性 淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG變體是施用給患者的唯一治療活性劑?？蛇x擇地，IgG變 體與一個(gè)或多個(gè)其他治療劑組合施用，所述其他治療劑包括但不限于細(xì)胞毒素劑、化療劑、 細(xì)胞因子、生長抑制劑、抗激素劑、激酶抑制劑、抗血管發(fā)生劑、保心劑、或其他治療劑。IgG 變體可以與一種或多種其他治療方案同時(shí)施用。例如，IgG變體可以與化療、放療、或化療 和放療兩者一起施用給患者。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG變體可以與可能是或不是IgG變體 的一種或多種抗體結(jié)合施用。根據(jù)另一實(shí)施方式，使用IgG變體和一個(gè)或多個(gè)其他抗癌治 療來治療離體的癌細(xì)胞。包括了這種離體治療可用于骨髓移植，并且尤其是自體骨髓移植。 當(dāng)然包括了可以與另外的治療技術(shù)如手術(shù)組合使用IgG變體。可以使用多種其他治療劑來與IgG變體一起施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG與抗 血管發(fā)生劑一起施用。本文所用的“抗血管發(fā)牛劑”意指在某種稈度上阻斷、或干擾血管發(fā) 育的化合物。抗血管發(fā)生劑因子可以為例如與參與促進(jìn)血管發(fā)生的生長因子或生長因子 受體結(jié)合的小分子或蛋白，例如抗體、Fc融合體、或細(xì)胞因子。本文優(yōu)選的抗血管發(fā)生因子 為與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合的抗體。在替代性實(shí)施方式中，IgG與誘導(dǎo)或增強(qiáng)獲得 性免疫反應(yīng)的治療劑例如靶向CTLA-4的抗體一起施用。在替代性實(shí)施方式中，IgG與酪氨
34酸激酶抑制劑一起施用。本文所用的“酪氨酸激_抑制劑”意指在某種程度上抑制酪氨酸 激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在替代性實(shí)施方式中，IgG變體與細(xì)胞因子一起施用。包括了其中配制了 IgG變體和一種或多種治療活性劑的藥物組合物。通過混 合具有所需純度的IgG與任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物科學(xué))第16版，0sol，A.編輯，1980，通過引用整體 并入)以凍干制劑或水溶液的形式制備用于儲(chǔ)存的IgG變體制劑。用于體內(nèi)施用的制劑優(yōu) 選為無菌的。這通過用無菌濾膜過濾或其他方法容易實(shí)現(xiàn)。本文所公開的IgG變體和其他 治療活性劑還可以配制成免疫脂質(zhì)體和/或裝入微膠囊中。治療活性IgG變體在制劑中的濃度可以按重量計(jì)從約0. 至100%變化。在優(yōu) 選的實(shí)施方式中，IgG的濃度在0. 003至1. 0摩爾的范圍內(nèi)。為了治療患者，可以施用治療 有效劑量的IgG變體。本f所謂的“治療有效劑量”意指產(chǎn)牛其所施用的效果的劑量。準(zhǔn) 確的劑量取決于治療目的，并且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用已知的技術(shù)來確定。劑量可以 在0. 01mg/kg至100mg/kg體重或更大的范圍內(nèi)，例如0. 01、0· 1、1. 0、10、或50mg/kg體重， 優(yōu)選為1至10mg/kg。如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的，可能需要調(diào)整蛋白降解、全身性遞送或是局部 遞送、新蛋白酶合成的速率、以及年齡、體重、一般健康、性別、飲食、施用時(shí)間、藥物相互作 用和病況嚴(yán)重程度，并且這可以由本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。包含IgG變體的藥物組合物優(yōu)選為無菌水溶液形式的施用可以以多種方法進(jìn)行， 包括但不限于口服、皮下、靜脈內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)、耳內(nèi)、眼內(nèi)、直腸、陰道、經(jīng)皮、局部(例 如，凝膠、藥膏、洗劑、乳劑等)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)(例如從Aradigm商購獲得的AERx 吸 入技術(shù)、或從Nektar Therapeutics商購獲得的Inhance 肺部遞送系統(tǒng)等)。本文所述的 治療劑可以與其他治療劑同時(shí)施用，即，本文所述的治療劑可以與其他治療或治療劑共同 施用，其他治療或治療劑包括例如，小分子、其他生物制劑、放射治療、手術(shù)等。
實(shí)施例下面提供實(shí)施例來示例本發(fā)明。這些實(shí)施例不旨在將本發(fā)明限制于任何具體的應(yīng) 用或操作理論。對于本發(fā)明所討論的所有位置，編號(hào)根據(jù)Kabat的EU索引(Kabat等人， 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest ( ^W^^^M^t^WSS/!5 列)，第 5 版，United States Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda，其通過引用整體并入)進(jìn)行。抗體領(lǐng)域內(nèi)的那些技術(shù)人員應(yīng)了解該規(guī)定包括在 特定免疫球蛋白序列區(qū)的非順序編號(hào)，這使得免疫球蛋白家族的保守位置具有標(biāo)準(zhǔn)化的參 考。因此，如通過EU索引所定義的任何給定免疫球蛋白的位置不需要對應(yīng)于其順序序列。實(shí)施例1 :Fc變體的DNA構(gòu)建、表達(dá)和純化。工程化IgG抗體的Fc區(qū)的氨基酸修飾以改善它們對新生兒Fc受體FcRn的親和 力。在大量不同的人IgG恒定鏈(圖2)的背景下篩選變體，所述不同的人IgG恒定鏈包括 IgGl、IgG2和含有CHl和IgGl的上部鉸鏈和IgG2的Fc區(qū)的雜合IgG序列。本領(lǐng)域的那 些技術(shù)人員應(yīng)了解由于IgGl和IgG2Fc區(qū)與Fc γ R和補(bǔ)體的不同相互作用，這些不同的親 本Fc區(qū)將具有不同的Fc γ R介導(dǎo)的和補(bǔ)體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能特性。在這些親本IgG恒定 鏈背景中的Fc變體的示例性序列顯示在圖3中。在靶向血管內(nèi)皮因子(VEGF)的抗體的背景下工程化Fc變體。重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH和VL)是人源化形式的抗體A4. 6. 1的重鏈和輕鏈可變區(qū)，抗體A4. 6. 1還稱為貝伐珠單 抗(Avastin )，它已被批準(zhǔn)用于治療多種癌癥。這種抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列顯示 在圖4中。在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pTT5中構(gòu)建編碼抗VEGF抗體的重鏈和輕鏈的基因。從 IMAGE克隆獲得人IgGl和IgG2恒定鏈基因，并且將其亞克隆到pTT5載體中。使用PCR 誘變構(gòu)建IgGl/2基因。編碼抗VEGF抗體的VH和VL基因是商業(yè)上合成的(Blue Heron Biotechnologies, Bothell WA)，將其亞克隆到編碼合適的 CL、IgGU IgG2 禾口 IgGl/2 恒定 鏈的載體中。使用QuikChange 定點(diǎn)誘變法(Stratagene，La Jolla CA)利用定點(diǎn)誘變 構(gòu)建氨基酸修飾。對所有DNA進(jìn)行測序以確定序列的保真性。使用脂質(zhì)體(Ilipofectamine)(Invitrogen, Carlsbad CA)將含有重鏈基因 (VH-C y I-C y 2-C γ 3)的質(zhì)粒與含有輕鏈基因(VL-C κ )的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到293Ε細(xì)胞中，并 在 FreeStyle 293 培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad CA)中生長。生長 5 天后，使用 MabSelect 樹脂(GE Healthcare)的通過蛋白A親和力從培養(yǎng)物上清液中純化抗體。通過二辛可寧酸 (bicinchoninic acid, BCA)測定(Pierce)來測定抗體濃度。實(shí)施例2.保持與抗原結(jié)合的Fc變體抗體所表達(dá)的變體抗體的保真性通過證明它們保持著對抗原的特異性來確定。使用采 用Biacore 3000儀器進(jìn)行的表面等離子體共振(SPR，Biacore)監(jiān)測VEGF結(jié)合。使用標(biāo) 準(zhǔn)方法通過用N-羥基琥珀酰亞胺/N-乙基-N’-(-3- 二甲基氨基-丙基)碳二亞胺(NHS/ EDC)偶聯(lián)將重組VEGF(VEGF-165，P印roTech，Rocky Hill,NJ)粘附到CM5芯片表面。將野 生型和變體抗體作為分析物注射，并且獲得了以共振單位(RU)測量的響應(yīng)。解離期太低而 測量不到真正的平衡常數(shù)，因此在結(jié)合期結(jié)束時(shí)通過測量RU來測定相對結(jié)合，相對結(jié)合應(yīng) 與蛋白濃度(其在實(shí)驗(yàn)中保持恒定)和結(jié)合速率常數(shù)成比例。數(shù)據(jù)(圖6)顯示與不結(jié)合 VEGF的陰性對照抗Her2抗體相反，變體抗VEGF抗體保持與抗原結(jié)合。實(shí)施例3.與人FcRn結(jié)合的測量在pH6. O下測量變體抗體與人FcRn的結(jié)合，在pH6. O下其在內(nèi)體中自然結(jié)合。 構(gòu)建編碼FcRn的β 2微球蛋白和His標(biāo)記的α鏈基因的載體，將其共同轉(zhuǎn)染到293Τ細(xì) 胞中，并用鎳色譜純化。通過使用標(biāo)準(zhǔn)NHS/EDC化學(xué)法將人FcRn偶聯(lián)至CM5芯片表面在 Biacore 3000儀器上測量ρΗ 6. O下抗體對人FcRn (hFcRn)的親和力。野生型和變體抗體 以25-lOOnM的濃度用于流動(dòng)相并且以共振單位測量響應(yīng)。獲得了在ρΗ 6. O下的結(jié)合和解 離期，然后注射PH 7. 4的緩沖液以測量在較高ρΗ下抗體從受體的釋放?？贵w和緩沖液的 循環(huán)僅提供了基線響應(yīng)，將該基線響應(yīng)從各樣品的傳感圖中減去。圖7顯示在兩個(gè)相關(guān)ρΗ下，天然IgGl和選擇的Fc變體抗體與人FcRn結(jié)合的 Biacore傳感圖。該數(shù)據(jù)顯示在ρΗ 6. O下野生型和變體抗體容易與FcRn芯片結(jié)合并且在 該P(yáng)H下解離緩慢，因?yàn)樗鼈冊趦?nèi)體中，然而在pH7. 4下，則迅速釋放，因?yàn)樗鼈儽粡膬?nèi)體再 循環(huán)回膜上并且暴露于較高的血清ρΗ下。FcRn結(jié)合/解離曲線不與簡單的Langmuir模型擬合，這可能是由于抗體和受體的 多價(jià)性或芯片的異質(zhì)性所致。通過用固定在ORU時(shí)的折射率(RI)改變與構(gòu)象改變模型擬 合來測定假Ka值(稱為Ka*)。選擇的變體抗體的這些值繪制在圖8中。根據(jù)等式倍數(shù)= (野生型KaV變體Ka*)計(jì)算各變體與其親本IgG相比的相對親和力。IgGlFc區(qū)中的所有
36Fc變體的相對結(jié)合數(shù)據(jù)顯示在圖9中，具有IgG2Fc區(qū)(恒定鏈IgGl和IgGl/2)的抗體中 變體的結(jié)合數(shù)據(jù)顯示在圖10中。對于一些變體，多次(η)重復(fù)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對于它們來說通 過在各具體的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中與野生型IgG親本相比來計(jì)算倍數(shù)。如圖9和10中所示，這些數(shù) 據(jù)的平均提供了均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖9和10顯示在ρΗ 6.0下大量工程化變體以比野生型IgGl高的親和力與人 FcRn結(jié)合。改善很大程度上取決于給定位置的取代身份。例如，使用2倍作為改善結(jié)合的 標(biāo)準(zhǔn)，則在IgG2中位置434的很多突變增加了親和力(A、S、Y、F和W)；—些是中性的(在 野生型IgG2的2倍之內(nèi))(G、H、M和T)；很多取代降低了親和力(小于0. 5倍)(D、E、K、 P、R和V)。IgGl背景下較高的結(jié)合不一定意味著IgG2中的較高結(jié)合(例如，434T在IgGl 中改善了結(jié)合但是在IgG2中不改善)。此外，單變體所提供的改善在組合后并不總是加性 的。圖Ila通過繪制選擇的雙取代變體的實(shí)驗(yàn)性FcRn結(jié)合倍數(shù)相對于構(gòu)成它們的各單獨(dú)變 體的FcRn結(jié)合倍數(shù)乘積的圖來圖示性顯示這一點(diǎn)。直線代表完美的加性作用，即從單取代 的乘積所預(yù)計(jì)或預(yù)測的值。許多雙變體落在這條線上或接近該線(259I/319I、259I/428L、 319I/428L 和 308F/428L)。幾種變體是低于加性的(319I/308F、252Y/428L 和 428L/434M)。 對于這些變體，尤其是在后兩種(252Y/428L和428L/434M)的情況下，單取代的親和力改善 似乎在組合時(shí)是彼此不相容的。出人意料的是，變體259I/308F和428L/434S的FcRn親和 力改善比從它們各自的單取代的親和力所預(yù)計(jì)的要高。這些特定的單取代在組合時(shí)具有意 料之外的協(xié)同改善。實(shí)驗(yàn)性親和力與從單變體的親和力預(yù)測的親和力之間的差異繪制在圖 lib中，其中變體根據(jù)它們的復(fù)合單變體分組(259I、308F和3191在左側(cè)，與482L的組合在 右側(cè))。協(xié)同作用可以通過如下量化計(jì)算實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值相比的倍數(shù)，然后將其標(biāo)準(zhǔn)化為 1并轉(zhuǎn)化為百分比(％協(xié)同作用=100X [(實(shí)驗(yàn)倍數(shù)/預(yù)測倍數(shù))-1)]。該分析繪制在圖 lib中，其中變體根據(jù)它們的復(fù)合單變體分組。該圖再次突出了一些變體的協(xié)同作用，尤其 是259I/308F和428L/434S。圖lib和Ilc還強(qiáng)調(diào)了組合來自篩選的一些最佳單取代的非 預(yù)測性。例如，盡管428L與434S和2591的組合提供了協(xié)同結(jié)合改善，但252Y或434M在 與428L組合時(shí)則具有負(fù)面影響。428L與434S的組合和428L與434M的組合之間的顯著差 異進(jìn)一步突出了在給定位置的取代的具體氨基酸身份的重要性。實(shí)施例4.測試在其他抗體背景中的變體在靶向其他抗原的抗體背景中構(gòu)建選擇的變體，所述其他抗原包括=TNF(TNFa)、 ⑶25 (TAC)、EGFR和IgE。圖4提供用于本發(fā)明的靶向這些抗原的抗體的VH和VL區(qū)氨基酸 序列。野生型和Fc變體抗TNF抗體含有全長的人抗體阿達(dá)木單抗(Humira )的可變區(qū)， 阿達(dá)木單抗目前已被批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)、銀屑 病關(guān)節(jié)炎(PsA)、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)和克羅恩(Crohn)病(CD)。野生型和Fc變體抗CD25 抗體為人源化形式的抗 TAC 抗體(Junghans 等人，1990，CancerResearch 50 1495-1502)， 其被稱為HI. 8/L1抗TAC。野生型和Fc變體抗EGFR抗體為人源化形式的鼠抗體C225，它 稱為H4. 42/L3. 32C225。最后，野生型和Fc變體抗IgE抗體含有人源化抗體奧馬珠單抗的 可變區(qū)(Xolair ),奧馬珠單抗被批準(zhǔn)用于治療過敏性哮喘。如上文所述構(gòu)建、表達(dá)并純化野生型和變體抗體。通過如上文所述的Biacore測 試在ρΗ 6.0下抗體與人FcRn的結(jié)合。變體抗TNF、抗CD25、抗EGFR和抗IgE抗體與人FcRn 的相對結(jié)合數(shù)據(jù)提供在圖12中。如可以看到的，變體在靶向多種抗原的抗體的背景下改善
377 FcRn親和力。實(shí)施仿I丨5.在敲入人FcRn的小鼠中的藥代云力力學(xué)t駘為了測試選擇的變體改善體內(nèi)半衰期的能力，在鼠FcRn敲出純合性且為人FcRn 敲入雜合性(mFcRn" hFcRn+) (Petkova 等人，2006，IntImmunol 18 (12) 1759-69，通過引用 整體并入)的B6小鼠中進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，所述小鼠在本文中稱為hFcRn或hFcRn+小 鼠。對通過體重(20-30g范圍)隨意選擇的4-7只雌性小鼠的組給予抗VEGF抗體(2mg/ kg)的單次靜脈內(nèi)尾靜脈注射。在各時(shí)間點(diǎn)，從框下叢(orbital plexus)抽取血液(約 50 μ 1)，加工成血清，并在-80°C下儲(chǔ)存直到分析。研究持續(xù)時(shí)間為28天或49天。在這些 研究期間動(dòng)物未受損傷。使用兩種ELISA測定來測定抗體濃度。在前兩個(gè)研究(稱為研究1和研究2)中， 將山羊抗人Fc抗體(Jackson Immuno research)粘附至板上，用PBST (具有0. 05%吐溫 的磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌孔，并用在PBST中的3% BSA封閉。添加血清或校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，然后 用PBST洗滌、添加銪標(biāo)記的抗人IgG (Perkin Elmer)，再次用PBST洗滌。收集時(shí)間分辨熒 光信號(hào)。對于研究3-5，使用類似的ELISA檢測血清濃度，但是使用重組VEGF(VEGF-165， PeproTech,Rocky Hill,NJ)作為捕獲試劑并且用生物素化的抗人κ抗體和銪標(biāo)記的鏈酶 親和素進(jìn)行檢測。使用WinNonLin(Pharsight Inc,Mountain View CA)利用非房室模型測 定各個(gè)小鼠的PK參數(shù)。將標(biāo)稱時(shí)間和劑量用于點(diǎn)的統(tǒng)一加權(quán)。所用的時(shí)間點(diǎn)(λ Z范圍) 為從第4天至研究結(jié)束，然而所有時(shí)間點(diǎn)都用于較快清除的變體，Ρ257Ν和P257L。在mFcRn+hFcRn+小鼠中進(jìn)行了 5種抗體PK研究。圖13分別顯示野生型和變體 IgGl (研究3)和IgG2(研究5)的血清濃度數(shù)據(jù)。在mFcRn+hFcRn+小鼠中進(jìn)行的所有體 內(nèi)PK研究的擬合PK參數(shù)提供在圖14中。PK數(shù)據(jù)包括表示表征抗體從血清中消除的β期 的半衰期、表示觀察到的最大血清濃度的Cmax、表示濃度時(shí)間曲線下的面積的AUC、表示抗 體從血清中的清除的清除率。還提供了各變體相對于IgGl或IgG2親本抗體的計(jì)算的半衰 期改善或降低倍數(shù)[半衰期倍數(shù)=半衰期(變體)/半衰期(野生型)]。該數(shù)據(jù)顯示在pH 6. O下具有增強(qiáng)的FcRn親和力的大量工程化Fc變體抗體延長 了體內(nèi)半衰期。圖15a顯示體內(nèi)半衰期相對于IgGl抗體的FcRn結(jié)合倍數(shù)的圖，其中標(biāo)記了 選擇的變體。來自重復(fù)試驗(yàn)(在圖中圈出)的結(jié)果表明來自體內(nèi)模型的數(shù)據(jù)是可再現(xiàn)的。 最佳的單變體包括308F和434S ；最佳的雙變體包括259I/308F、308F/428L、308F/434S和 428L/434S ；并且最佳的三變體為259I/308F/428L。在FcRn親和力和體內(nèi)半衰期之間具有 大致相關(guān)性，但不是完全可預(yù)測的。顯著地，F(xiàn)cRn結(jié)合分別改善了 3. 4倍和3. 5倍的變體 257L和257N的體內(nèi)半衰期分別降低0. 6和0. 3。該圖還再次突出了在給定位置的取代的 氨基酸身份的重要性_盡管308F/434S提供明顯的半衰期改善，但是308F/434M則剛剛優(yōu) 于 IgGl。圖15b顯示體內(nèi)半衰期相對于IgG2變體抗體的FcRn結(jié)合倍數(shù)的圖，其中標(biāo)記出 了變體。當(dāng)將IgG2體內(nèi)數(shù)據(jù)與IgGl體內(nèi)數(shù)據(jù)相比時(shí)(圖15c)，觀察到了出乎意料的結(jié)果。 相比于IgGlFc區(qū)，變體在IgG2Fc區(qū)的背景下提供顯著較高的體內(nèi)半衰期改善。在所有5 個(gè)研究中來自所有抗體的單變體和雙變體的最長半衰期為12. 2和16. 5，它們分別由434S IgG2和428L/434S IgG2提供。盡管IgG2中的變體與IgGl中的變體的倍數(shù)改善相當(dāng)或甚至 比IgGl中的變體的倍數(shù)改善更低(434S IgGl倍數(shù)=3. 8、434SIgG2倍數(shù)=4. 9、428L/434SIgGl倍數(shù)=17. 3、428L/434S IgG2倍數(shù)=14. 8)這一事實(shí)，但I(xiàn)gG2變體相對于IgGl顯著 改善了半衰期。因此，意料之外的是，IgG2抗體可以最好地應(yīng)用于Fc變體以改善在哺乳動(dòng) 物中的體內(nèi)半衰期。實(shí)施例6.變體免疫粘附素還評定了本發(fā)明的Fc變體改善免疫粘附素(還稱為Fc融合體)的半衰期的能 力。將選擇的Fc變體工程化到抗TNF免疫粘附素依那西普(Enbrel )中。依那西普是人 TNF受體2 (TNF RII)和人IgGl的Fc區(qū)的融合體，并且在臨床上被批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和銀屑病。還構(gòu)建該Fc融合體的 IgG2Fc區(qū)形式，并將選擇的Fc變體也構(gòu)建在此背景下。本發(fā)明中表征的抗TNF免疫粘附素 的氨基酸序列提供在圖16中。使用遞歸式PCR構(gòu)建基因，并將其亞克隆到pTT5載體中，使 用QuikChange 誘變法構(gòu)建Fc變體。如上所述在293E細(xì)胞中表達(dá)免疫粘附素并純化。通過Biacore測試與重組TNF的結(jié)合來確定純化的免疫粘附素的結(jié)合特異性。 將免疫粘附素捕獲在使用標(biāo)準(zhǔn)的伯胺偶聯(lián)產(chǎn)生的固定的蛋白A/G(PierCe)CM5傳感芯片 (Biacore)上。將免疫粘附素固定在蛋白A/G表面，并且將系列稀釋的重組TNF注射到抗體 結(jié)合表面，接下來是解離期。在每次循環(huán)后，用緩沖液使表面再生。通過在注射受體之前將 時(shí)間和響應(yīng)調(diào)零來處理數(shù)據(jù)并且用參考通道將其減去以計(jì)算由于注射所引起的改變。將動(dòng) 力學(xué)數(shù)據(jù)與1 1結(jié)合模型(Langmuir)擬合。從這些擬合中所獲得的平衡結(jié)合常數(shù)(Ka) 提供在圖17中。該結(jié)果顯示變體免疫粘附素保持著與商業(yè)的enbrel相當(dāng)?shù)腡NF親和力。使用如上文所述的Biacore測試在pH 6. O下變體免疫粘附素與人FcRn的結(jié)合。 結(jié)果(圖18)表明，與抗體背景中類似，變體與它們的IgGl和IgG2親本免疫粘附素蛋白相 比改善了與FcRn的結(jié)合。如上文所述在mFcRn+hFcRn+小鼠中測試變體免疫粘附素的半衰期。以2mg/kg的 變體和親本IgGl免疫粘附素注射每組12只的小鼠。使用類似于上文所述的ELISA檢測血 清濃度，不同的是使用山羊抗人TNF RII抗體作為捕獲試劑；用生物素化的抗人κ抗體和 銪標(biāo)記的鏈酶親和素進(jìn)行檢測。圖19顯示野生型IgGlFc和變體Fc免疫粘附素的血清濃 度數(shù)據(jù)。來自PK研究的如上文所述的擬合PK參數(shù)在圖20中提供。還提供各變體計(jì)算的 半衰期％增加，它計(jì)算為100乘以變體Fc融合體的半衰期與野生型IgGlFc親本的半衰期 的比。結(jié)果表明變體在免疫粘附素的背景下延長了體內(nèi)半衰期。^MM 7.在非人 靈長類中的藥代云力力學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)充分確定生物制劑在非人靈長類中的ρΚ特性能夠預(yù)測它們在人中的特性。 在短尾猴(食蟹猴(macaca fascicularis))中進(jìn)行了 PK研究以評定變體抗VEGF抗體在 非人的靈長類中改善血清半衰期的能力。在短尾猴中的PK研究制備中，測量了在pH 6.0下變體抗體與短尾猴(cyno) FcRn (cFcRn)的結(jié)合。如上文對于人FcRN所述構(gòu)建、表達(dá)并純化cFcRn。變體抗VEGF抗體 與cFcRn的結(jié)合使用如上文所述的Biacore來測量。數(shù)據(jù)提供在圖21中。結(jié)果表明變體 改善了對cyno FcRn的親和力，這與它們對于人FcRn的作用類似。在較高pH(7.4)下的解 離也極為迅速(數(shù)據(jù)未顯示)，這與關(guān)于結(jié)合人FcRn所觀察到的情況類似。由于人和cyno 受體的高度序列同源性(FcRn α鏈96%，β _2_微球蛋白91 % )，結(jié)果并不出乎意料。在非人靈長類中體內(nèi)研究了變體的ΡΚ。將重2. 3-5. Ikg的雄性短尾猴(食蟹猴
39(macaca fascicularis)，也稱為食蟹猴(crab-eating Macaque))按重量隨意選擇，并分為 5組，每組3只猴子。用4mg/kg抗體給予猴子單次1小時(shí)的外周靜脈輸注。從輸注完成后 5分鐘至90天的分離靜脈中抽取血液樣品(Iml)，將其加工為血清，并儲(chǔ)存在-70°C下。在 這些研究期間動(dòng)物未受損傷。如上文所述使用VEGF捕獲方法測定抗體濃度。如小鼠PK研究中所做的一樣通過 將濃度相對于時(shí)間的函數(shù)與非房室模型擬合來測定PK參數(shù)。然而，使用第10天至第90天 的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行PK參數(shù)測定。PK結(jié)果繪制在圖22中，并且擬合的參數(shù)提供在圖23中。結(jié)果 顯示變體將抗體的體內(nèi)半衰期增加了多達(dá)3. 2倍。在最佳的情況下(428L/434S變體)半 衰期從9. 7天延長到了 31. 1天。短尾猴中所獲得的PK結(jié)果與mFcRn+hFcRn+小鼠中所獲 得的那些結(jié)果一致，這驗(yàn)證了 hFcRn小鼠模型作為評估變體體內(nèi)PK特性的系統(tǒng)，并且支持 來自那些研究的結(jié)論。盡管為了示例的目的而在上文中描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但是本領(lǐng)域的那 些技術(shù)人員應(yīng)了解可以在不背離所附的權(quán)利要求所述的發(fā)明的情況下進(jìn)行大量的細(xì)節(jié)改 變。本文所引用的所有參考文獻(xiàn)都以其整體并入。
權(quán)利要求
一種包含相對于野生型人Fc區(qū)的至少一個(gè)修飾的變體Fc區(qū)，其中所述修飾選自由下列組成的組252Y/428L、252Y/434S和428L/434S，其中編號(hào)根據(jù)EU索引進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述修飾為428L/434S。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述修飾為252Y/428L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述修飾為252Y/434S。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述變體包括抗體或免疫粘附素，并且其中所述 Fc區(qū)選自由下列組成的組=IgGU lgG2、lgG3和lgG4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的變體，其中所述變體包含IgGlFc區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的變體，其中所述變體包含IgG2Fc區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的變體，其中所述變體與具有所述野生型Fc區(qū)的所述抗體或免 疫粘附素相比在哺乳動(dòng)物中具有較長的血清半衰期。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的變體，其中所述哺乳動(dòng)物為表達(dá)人FcRn的小鼠或非人的靈長類。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的變體，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的變體，其中所述抗體或免疫粘附素對選自由下列組成的組 的抗原具有特異性血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)、⑶25、表皮生長 因子受體(EGFR)和IgE。
12.一種包含IgG2Fc區(qū)的變體的變體抗體或變體免疫粘附素，其中所述變體抗體或免 疫球蛋白包含相對于野生型IgG2Fc區(qū)的1至5個(gè)修飾，其中至少一個(gè)所述修飾在位置434 處，其中編號(hào)根據(jù)EU索引進(jìn)行，并且其中所述變體抗體或變體免疫粘附素與具有所述野生 型IgG2Fc區(qū)的所述抗體或免疫粘附素相比在哺乳動(dòng)物中具有較長的血清半衰期。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的變體，其中所述變體包含在434S處的至少一個(gè)修飾和在選 自由252和428組成的組的位置處的一個(gè)修飾。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的變體，其中所述哺乳動(dòng)物為表達(dá)人FcRn的小鼠或非人的靈 長類。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的變體，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
16.一種包含相對于野生型人Fc區(qū)的至少兩個(gè)修飾的變體Fc區(qū)，其中至少一個(gè)修飾為 428L，并且至少一個(gè)修飾在位置252或434處，其中編號(hào)根據(jù)EU索引進(jìn)行。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的變體，其中所述Fc區(qū)包括抗體或免疫粘附素，并且其中所 述抗體或免疫粘附素包含IgGl或IgG2Fc區(qū)，并且其中所述變體與具有所述野生型人Fc區(qū) 的所述抗體或免疫粘附素相比在哺乳動(dòng)物中具有較長的血清半衰期，其中所述哺乳動(dòng)物為 表達(dá)人FcRn的小鼠、非人的靈長類、或人。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含相對于野生型人Fc區(qū)的至少一個(gè)修飾的變體Fc區(qū)，其中所述修飾選自由下列組成的組434S、252Y/428L、252Y/434S和428L/434S，并且編號(hào)根據(jù)EU索引進(jìn)行。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101910199SQ200880123009
公開日2010年12月8日 申請日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者A·張伯倫, B·達(dá)希亞特, G·A·拉扎, J·R·德斯賈萊斯, S·B·卡基 申請人:Xencor公司