專利名稱:Gdf8抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域涉及對(duì)生長(zhǎng)與分化因子-8 (growth and differentiationfactor-8)(⑶F8)特異性的表位及其拮抗劑(例如肽模擬物、抗-GDF8抗 體(例如小鼠、人和人源化抗體、其片段等)、重組多核苷酸、抑制性多核苷酸等),所述拮抗 劑可用于體外和/或體內(nèi)抑制GDF8活性。所述領(lǐng)域還涉及在生物樣品中檢測(cè)GDF8的免疫 檢驗(yàn)方法,以及治療、改善、預(yù)防、診斷、預(yù)測(cè)和/或監(jiān)測(cè)GDF8-相關(guān)病癥(例如肌肉病癥、神 經(jīng)肌肉病癥、骨-退行性病癥、代謝或誘導(dǎo)的骨病癥、肥胖病癥、葡萄糖代謝病癥或胰島素 相關(guān)病癥)的方法,尤其是在具有生育能力的婦女中。
背景技術(shù):
生長(zhǎng)及分化因子_8(⑶F8)(也稱作肌抑制素(myostatin))是一種分泌型蛋白 質(zhì),并且是結(jié)構(gòu)相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)超家族的成員。這一超家族的成員具 有生長(zhǎng)-調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生的特性(Kingsley等(1994) Genes Dev. 8 :133_46 ;Hoodless等 (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228 :235_72)。人 GDF8 作為 375 個(gè)氨基酸的前 體蛋白質(zhì)被合成,所述前體蛋白質(zhì)形成同二聚體復(fù)合物。在加工期間,已知為“潛伏-相 關(guān)肽(latency-associated peptide, LAP) ”的氨基端前肽被切割,并且保持與同二聚體 非共價(jià)結(jié)合,形成被命名為“小潛伏復(fù)合物(latent complex) ”的活性復(fù)合物(Miyazono 等(1988)J. Biol. Chem. 263 6407-15 ;Wakefield 等(1988)J. Biol. Chem. 263 7646-54 ; Brown 等(1999)Growth Factors 3 :35_43 ;Thies 等(2001)Growth Factors 18:251-59; Gentry 等(I99O)Biochemistry 29 :6851-δ7 ;Derynck 等(I995)Nature 316 701-05 ; Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 12 :597_641)。蛋白質(zhì)例如卵泡抑素(follistatin) 和卵泡抑素-相關(guān)蛋白質(zhì)包括GASP-I (Gamer等(1999)Dev Biol. 208 :222_232,美國(guó)專利 公開(kāi)No. 2003-0180306-A1 ;美國(guó)專利公開(kāi)No. 2003-0162714-A1),其結(jié)合成熟的GDF8同二 聚體并抑制GDF8生物活性。來(lái)自多種物種的推知的⑶F8氨基酸序列的比對(duì)證明⑶F8是保守的(McPherron 等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 94 12457-61)。人、小鼠、大鼠、豬和雞 GDF8 的序列 在C-端區(qū)中100%相同,而狒狒、牛和羊⑶F8在C-端差異僅為3個(gè)氨基酸。⑶F8跨物種 的高保守性提示⑶F8具有重要的生理功能。已顯示⑶F8通過(guò)抑制成肌細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞的增殖以及分化而在肌肉發(fā)育和內(nèi)穩(wěn) 態(tài)中起主要作用(Lee 和 McPherron (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9 604-7 ;McCroskery 等 (2003) J. Cell Biol. 162 :1135_47)。其在發(fā)育中的骨骼肌中早期表達(dá),并且在成年骨骼肌 中繼續(xù)表達(dá),優(yōu)選地在快速顫搐(fast twitch)類型的骨骼肌中表達(dá)。⑶F8也涉及肌肉-特 異性酶(例如肌酸激酶)的生產(chǎn)和成肌細(xì)胞增殖(W0 00/43781)。成年小鼠中⑶F8的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致顯著的肌肉減少(Zimmers等(2002) Science 296:1486-88)。類似地,多種研究指出提高的⑶F8表達(dá)與HIV-誘導(dǎo)的肌肉消耗相關(guān) (Gonzalez-Cadavid 等(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 95 14938-43)。相反,GDF8 敲除轉(zhuǎn)基因小鼠的特征是顯著的骨骼肌肥大和增生,以及改變的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)(corticalbone structure) (McPherron 等(1997) Nature 387 :83_90 ;Hamrick 等(2000) Bone 27: 343-49)。另外,使GDF8基因無(wú)活性的天然突變顯示在動(dòng)物和人中均引起肥大以及增生 (Lee和McPherron (1997),上文)。例如,在牛中的天然⑶F8突變中,骨骼肌量的提高是明 顯的(Ashmore 等(1974) Growth 38 :501_07 ;Swatland 等(1994) J. Anim. Sci. 38 :752_57 ; McPherron 等,上文;Kambadur 等(1997) Genome Res. 7 910-15)。大量人和動(dòng)物的肌肉和谷歌病癥與功能受損的肌肉組織相關(guān),因此可與⑶F8 相關(guān)。例如,⑶F8可以涉及以下的發(fā)病機(jī)制肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、肌營(yíng)養(yǎng)不良(“MD” ;包括Ducherme,s肌營(yíng)養(yǎng)不良、筋膜肩胛 (fascioscapular)肌營(yíng)養(yǎng)不良和筋膜肩胛肱(facioscapulohumeral)肌營(yíng)養(yǎng)不良)、肌萎 縮、腕管綜合征(carpal turmelsyndrome)、器官萎縮、虛弱、充血性阻塞性肺病(COPD)、老 年性肌肉萎縮、惡病質(zhì)和其它疾病和病癥引起的肌肉消耗綜合征。還相信⑶F8參與大量其它生理學(xué)過(guò)程和相關(guān)病癥,包括2型糖尿病發(fā)生期間的葡 萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)、糖耐量減低(impaired glucose tolerance)、代謝綜合征(即涉及一組健康狀 況(其可包括胰島素抗性、腹部肥胖癥、異常脂肪血癥、高血壓、慢性炎癥、前血栓形成狀態(tài) (prothrombotic state)等)的同時(shí)發(fā)生的綜合征(例如綜合征X),其將人置于2型糖尿 病和/或心臟病的高度風(fēng)險(xiǎn)下)、胰島素抗性(例如創(chuàng)傷如燒傷或氮失衡誘導(dǎo)的抗性)和脂 肪組織病癥(例如肥胖癥、異常脂肪血癥、非酒精性脂肪肝疾病等)(Kim等(2000)Biochem. Biophys. Res. Comm. 281 :902_06)。目前幾乎不存在用于治療這些病癥的可靠或有效的療 法。這些過(guò)程的病理學(xué)表明⑶F8是這些相關(guān)病癥的治療中潛在的靶標(biāo)。除了人中的神經(jīng)肌肉病癥以外,還存在與骨損耗相關(guān)的生長(zhǎng)因子-相關(guān)病癥,例 如骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎,它們主要影響老年和/或絕經(jīng)后的女性。這類代謝性骨疾病和病 癥包括由于慢性糖皮質(zhì)激素療法、過(guò)早的性腺衰竭、雄性激素阻抑、維生素D缺乏、繼發(fā)性 甲狀旁腺功能亢進(jìn)、營(yíng)養(yǎng)缺乏和神經(jīng)性厭食癥(anorexia nervosa)導(dǎo)致的低骨量。盡管 目前針對(duì)這些病癥的許多療法通過(guò)抑制骨再吸收來(lái)發(fā)揮作用,但是促進(jìn)骨形成的療法會(huì)是 有用的替代性治療。因?yàn)镚DF8在骨發(fā)育以及肌肉發(fā)育中起作用,所以GDF8也是用于治療 骨_退行性病癥的極佳的藥理學(xué)靶標(biāo)。與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)家族的其它成員類似,⑶F8被合成為376個(gè)氨基 酸的前體蛋白質(zhì),其含有信號(hào)序列、N-端前肽結(jié)構(gòu)域和被認(rèn)為是活性分子的C-端結(jié)構(gòu)域。 ⑶F8通過(guò)與其前肽結(jié)合而以潛伏形式(潛伏_相關(guān)肽,LAP)被分泌;前肽結(jié)構(gòu)域和C-端 結(jié)構(gòu)域之間的蛋白水解加工產(chǎn)生N-端前肽和成熟形式的⑶F8。未經(jīng)加工的和成熟的⑶F8 均形成二硫鍵_連接的二聚體,并且經(jīng)加工的⑶F8代表了所述蛋白質(zhì)的唯一活性形式。在 血清以及骨骼肌中,可發(fā)現(xiàn)GDF8與能夠調(diào)控其活化、分泌或受體結(jié)合的若干蛋白質(zhì)結(jié)合。GDF8通過(guò)跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶異四聚體受體家族發(fā)揮其作用,其活化增強(qiáng)受 體轉(zhuǎn)磷酸化,導(dǎo)致絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的刺激。已經(jīng)顯示⑶F8通路涉及活性⑶F8 二 聚體與高親和力受體ActIIRB的結(jié)合,所述ActIIRB隨后募集并活化低親和力受體ALK4/ ALK5的轉(zhuǎn)磷酸化。還顯示蛋白質(zhì)Smad 2和Smad 3隨后被活化并與Smad 4形成復(fù)合物, 然后易位至核,隨后活化靶基因轉(zhuǎn)錄。Lee和McPherron (Proc Natl Acad Sci USA2001, 98 =9306-9311)證實(shí)ActRIIB受體能夠體內(nèi)介導(dǎo)GDF8的影響,因?yàn)樾∈笾酗@性負(fù)相形式 ActRIIB的表達(dá)模擬⑶F8基因敲除。
已顯示在⑶F8的影響下,C2C12成肌細(xì)胞在細(xì)胞周期的G0/G1和G2期累積,因此 降低S-期細(xì)胞的數(shù)量。GDF8還誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化的失敗,這與分化標(biāo)記物表達(dá)的強(qiáng)降低 相關(guān)。⑶F8表達(dá)還降低了細(xì)胞在增殖和分化條件下的凋亡速率(Thomas等,J.Biol Chem 2000,275 40235-40243)。肌抑制素(⑶F8)表達(dá)的抑制導(dǎo)致肌肉肥大以及增生(Lee和McPherron,上文; McPherron等,上文)。肌抑制素負(fù)調(diào)節(jié)損傷后的肌肉再生,并且⑶F8無(wú)效小鼠中肌抑制 素的缺乏導(dǎo)致加速的肌肉再生(McCroskery等,(2005) J. Cell. Sci. 118 :3531_41)。人 抗-GDF8抗體(美國(guó)公開(kāi)的申請(qǐng)No. 2004/0142382)已顯示在體外和體內(nèi)結(jié)合⑶F8并且 抑制GDF8活性,包括與骨骼肌量和骨密度負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)的GDF8活性。例如,在野生型小鼠 (Whittemore 等(2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300 :965_71)和肌營(yíng)養(yǎng)不良模型的 mdx 小鼠(Bogdanovich 等(2002) Nature420 :418_21 ;Wagner 等(2002) Ann. Neurol. 52 832-36)的骨骼肌中,肌抑制素-中和抗體提高體重、骨骼肌量和的肌肉尺寸和強(qiáng)度。另外, 這些小鼠中的肌抑制素抗體降低了對(duì)膈的損害,所述膈是也在ALS發(fā)病機(jī)制期間被靶向的 肌肉。已推測(cè)生長(zhǎng)因子例如HGF對(duì)肌肉的作用可歸因于肌抑制素表達(dá)的抑制(McCroskery 等(2005),上文),從而幫助將再生和退化之間的平衡正向移動(dòng)。然而,這些現(xiàn)有技術(shù)的抗 體對(duì)GDF8而言是非特異性的,即這些抗體對(duì)TGF-β超家族的其它成員例如BMPll具有高 親和力。迄今為止,所有已知的⑶F8活性抑制劑(例如前肽、可溶的ActRIIB受體、 抗-GDF8抗體等等)還中和具有重要生物功能的其它因子(例如BMP11、激活蛋白等)的 生物活性。例如激活蛋白和BMPll在胚胎發(fā)生期間起重要作用。激活蛋白βΑ被鑒定為 關(guān)鍵的生殖腺生長(zhǎng)因子,BMPll負(fù)責(zé)中軸骨骼(axial skeleton)的同種轉(zhuǎn)化(homeotic transformation)。純合的BMPll敲除小鼠是圍產(chǎn)期(perinatal)致死的;具有一個(gè)野生型 拷貝的BMPll基因的小鼠是可存活的,但是具有骨骼缺陷。因?yàn)榧せ畹鞍缀虰MPll在胚胎 發(fā)生期間起重要作用,所以抑制GDF8和其它因子(例如BMP11)的拮抗劑提出了理論上的 安全性風(fēng)險(xiǎn),所述安全性風(fēng)險(xiǎn)可以表現(xiàn)為被治療的患者中的毒性或者例如具有生育能力的 女性的生殖毒性。因此存在對(duì)下述化合物和治療方法的需要,所述化合物和治療方法有助 于肌肉量和/或強(qiáng)度和/或骨密度的總體提高(尤其是在人中),但是不干擾例如BMP11。 也就是說(shuō),在期望提高肌肉量、尺寸、強(qiáng)度等等的GDF8-相關(guān)病癥的治療中,尤其是在具有 生育能力的女性中,需要特異性抑制GDF8活性。因?yàn)橐验_(kāi)發(fā)了使用⑶F-8調(diào)節(jié)劑的方法,所以需要開(kāi)發(fā)監(jiān)測(cè)和優(yōu)化對(duì)個(gè)體施用這 類藥劑的方法。具體地,測(cè)量生物流體中GDF-8蛋白質(zhì)水平的能力對(duì)于目前的臨床試驗(yàn)而 言具有重要意義。例如,循環(huán)⑶F-8水平可能診斷可受益于抗-GDF-8療法的病理狀況,或 者可能預(yù)測(cè)哪個(gè)個(gè)體更可能對(duì)抗-GDF-8療法作出應(yīng)答。另外,抗-GDF-8治療期間外周血 中GDF-8水平的改變可以是肌肉量和/或功能的晚期可測(cè)量應(yīng)答的早期指示器。為了完成這樣的優(yōu)化目標(biāo),需要檢測(cè)或監(jiān)測(cè)生物流體(例如血清和血漿)中的 ⑶F-4蛋白質(zhì)水平。期望在用⑶F-8調(diào)節(jié)劑治療之前、期間和之后監(jiān)測(cè)⑶F-8水平,從而例 如鑒定適合這類治療的個(gè)體、監(jiān)測(cè)對(duì)治療的應(yīng)答,和跟蹤治療后進(jìn)展。具體地,需要允許檢 測(cè)和/或定量應(yīng)答GDF-8調(diào)節(jié)劑(包括GDF-8抑制劑和抗-GDF-8抗體)施用的內(nèi)源GDF-8 水平的方法。
因此,提供特異性抑制GDF8活性的化合物和方法以及檢測(cè)和定量生物樣品(例如 血清和血漿)中GDF-8水平的免疫檢驗(yàn)是本發(fā)明的一個(gè)主要目的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于特異性結(jié)合生長(zhǎng)與分化因子8 (GDF8)的抗體或抗原結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn), 所述抗體或抗原加合蛋白特異性地拮抗至少一種GDF8活性(例如GDF8與其受體的結(jié)合或 其它⑶F8-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件)。本發(fā)明還基于⑶F8上被這些特異性抗-GDF8抗體或抗 原結(jié)合蛋白識(shí)別的表位的鑒定,因?yàn)楸景l(fā)明的抗體對(duì)GDF8是特異性的,并且不特異性結(jié)合 例如BMPl 1。除了提供對(duì)GDF8特異性的表位以外,本發(fā)明還提供了對(duì)GDF8特異性的拮抗劑 (在本文中也稱作“特異性GDF8拮抗劑”、“GDF8拮抗劑”等等),例如特異性拮抗(例如抑 制、降低和/或中和)至少一種GDF8活性(例如GDF8-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件(例如GDF8與 其受體(例如其ALK4/ALK5受體)的結(jié)合))并且不顯著拮抗BMPll活性的拮抗劑。本發(fā) 明還提供了用于檢測(cè)和定量生物樣品中GDF-8的方法。在某些實(shí)施方式中,所述方法包括 免疫檢驗(yàn),所述樣品是血清和/或血漿。本發(fā)明還提供了本發(fā)明方法中使用的試劑盒。本 發(fā)明還提供了在治療(包括改善、預(yù)防、診斷、預(yù)測(cè))或監(jiān)測(cè)GDF8-相關(guān)病癥(例如肌肉病 癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨-退行性病癥、代謝或誘導(dǎo)的骨病癥、肥胖病癥、葡萄糖代謝病癥、胰 島素_相關(guān)病癥等等)的方法中使用所公開(kāi)的特異性GDF8拮抗劑的方法。因此,在一個(gè)方面中,本發(fā)明提供了對(duì)GDF8的拮抗劑,其中所述拮抗劑包括GDF8 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽模擬物至少之一;經(jīng)分離的核酸,其編碼GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽模擬物的 氨基酸;對(duì)GDF8特異性的抑制多核苷酸;和特異性結(jié)合GDF8但是不特異性結(jié)合BMPll的 抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了本文所述的拮抗劑,其中所述拮抗劑是GDF8結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的肽模擬物,并且選自基本上由選自以下的氨基酸序列組成的組SEQ ID N0:4的 氨基酸序列、SEQ ID NO 6的氨基酸序列、SEQ ID NO 8的氨基酸序列、SEQ ID NO 10的氨 基酸序列和SEQ IDNO 12的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了下述拮抗劑, 所述拮抗劑是本文所述的肽模擬物并且被環(huán)化。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了下書(shū)拮 抗劑,所述拮抗劑是本文所述的肽模擬物,并且通過(guò)二硫鍵被環(huán)化。在任意一個(gè)或多個(gè)實(shí)施 方式中,本發(fā)明提供了下述拮抗劑,所述拮抗劑是本文所述的肽模擬物并且具有至少一個(gè) D-氨基酸。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了下述拮抗劑,所述拮抗劑是可用作免疫原的肽 模擬物。在另一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了本文所述的拮抗劑,其中所述拮抗劑是 特異性結(jié)合GDF8并且不特異性結(jié)合BMPll的抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段, 其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白選自多克隆抗體;單克隆抗體;單特異性抗體;多特異 性抗體(polyspecific antibody);人源化抗體;四聚體抗體;四價(jià)抗體;多樣特異性 抗體(multispecific antibody);單鏈抗體(single chain antibody);結(jié)構(gòu)域—特 異性抗體;單結(jié)構(gòu)域抗體;結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體;融合蛋白;ScFc融合蛋白;單-鏈抗 體(single-chainantibody);嵌合抗體;合成抗體;重組抗體;雜合抗體;經(jīng)突變的抗 體;⑶R-移植的抗體;抗體片段,其可包括Fab、F(ab' )2、Fab'片段、Fv片段、單-鏈Fv(ScFv)片段、Fd片段、dAb片段;抗原結(jié)合蛋白,包括雙抗體(diabody)、CDR3肽、受約束 的(constrained)FR3-CDR3-FR4肽、微體(nanobody)、二價(jià)微體、小模塊免疫藥物(SMIPs)、 鯊魚(yú)(shark)可變IgNAR結(jié)構(gòu)域和小體(minibody)。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的拮抗劑 是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的拮抗劑是人源化的抗體。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了 一種拮抗劑,所述拮抗劑是對(duì)GDF8特異性的抗 體、抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或其片段,其由至少一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)組成,所述互補(bǔ)性決定區(qū) 包含選自以下的氨基酸序列SEQ IDNO 19的氨基酸序列、SEQ ID NO 20的氨基酸序列、 SEQ ID NO 21的氨基酸序列、SEQ ID NO 22的氨基酸序列、SEQ ID NO 23的氨基酸序列、 SEQ ID NO 24的氨基酸序列、SEQ ID NO 25的氨基酸序列、SEQ IDNO 26的氨基酸序列、 SEQ ID NO 27的氨基酸序列、SEQ ID NO 28的氨基酸序列、SEQ ID NO 29的氨基酸序列、 SEQ ID NO 30的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的拮抗劑是包含下述重鏈的抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合 蛋白或其片段,所述重鏈包含第一、第二和第三⑶R,其中所述第一⑶R包含選自SEQ ID NO 19的氨基酸序列和SEQ ID NO 15的氨基酸序列的氨基酸;所述第二⑶R包含選自SEQ ID NO :20的氨基酸序列和SEQ ID NO :26的氨基酸序列的氨基酸;所述第三⑶R包含選自 SEQID NO 21的氨基酸序列和SEQ ID NO 27的氨基酸序列的氨基酸。在一些實(shí)施方式中, 本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合蛋白包含下述重鏈,所述重鏈包含選自SEQ ID N0:14的氨基酸序 列和SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的拮抗劑是包含下述輕鏈的抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合 蛋白,所述輕鏈包含第一、第二和第三⑶R,其中所述第一⑶R包含選自SEQ ID N0:22的氨 基酸序列和SEQ ID NO 28的氨基酸序列的氨基酸;所述第二⑶R包含選自SEQ ID NO 23 的氨基酸序列和SEQID NO 29的氨基酸序列的氨基酸;所述第三⑶R包含選自SEQ ID NO 24的氨基酸序列和SEQ ID NO :30的氨基酸序列的氨基酸。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的 拮抗劑是包含下述輕鏈的抗體或抗原結(jié)合蛋白,所述輕鏈包含選自SEQ ID N0:16的氨基酸 序列和SEQ ID NO 17的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的拮抗劑是下述抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,其包 含含有SEQ ID N0:16的氨基酸序列的輕鏈,還包含含有SEQID NO 14的氨基酸序列的重 鏈。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的拮抗劑是下述抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,其包含含有 SEQ ID N0:17的氨基酸序列的輕鏈,還包含含有SEQ ID NO 18的氨基酸序列的重鏈。在 一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了編碼包含本發(fā)明GDF8拮抗劑的任意一種或多種氨基酸的 多核苷酸,如本文所述。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的拮抗劑是下述抑制性多核苷酸,其特異性結(jié)合GDF8 并且選自SiRNA分子和反義分子。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了任意一種或多種編碼 本發(fā)明拮抗劑的本文所述多核苷酸。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了編碼下述氨基酸序 列的多核苷酸,所述氨基酸序列選自SEQ ID NO :4的氨基酸序列、SEQ ID NO :6的氨基酸序 列、SEQID NO 8的氨基酸序列、SEQ ID NO 10的氨基酸序列和SEQ ID NO 12的氨基酸序 列。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了下述多核苷酸,其中所述經(jīng)分離的多核苷酸主要由選 自以下的核酸序列組成SEQ ID NO 3的核酸序列、SEQ ID NO 5的核酸序列、SEQ ID NO 7的核酸序列、SEQ IDNO 9的核酸序列、SEQ ID NO 11的核酸序列,及其片段的核酸序列。
在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了包含任意一種或多種本發(fā)明多核苷酸的宿主細(xì) 胞,其中所述多核苷酸與調(diào)控序列可操作地連接。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了包含本 發(fā)明任意多核苷酸的載體。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了包含含有任意一種或多種本 發(fā)明多核苷酸的載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了從本文所述經(jīng)培養(yǎng)的包含任意一種或多種本發(fā) 明多核苷酸的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)GDF8拮抗劑并分離宿主細(xì)胞所表達(dá)的GDF8拮抗劑的方法。 還在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了通過(guò)本文所述用于生產(chǎn)GDF8拮抗劑的方法生產(chǎn)的經(jīng) 分離的⑶F8拮抗劑。在本發(fā)明的另一方面中,本發(fā)明提供了檢測(cè)來(lái)自受試者的樣品中GDF8存在的測(cè) 定法,其包含以下步驟將(i)樣品和(ii)特異性結(jié)合GDF8的捕獲試劑和(iii)特異性結(jié) 合GDF8的檢測(cè)試劑合并,并檢測(cè)捕獲試劑與GDF8之間是否發(fā)生特異性結(jié)合,其中特異性結(jié) 合的檢測(cè)表明樣品中存在GDF8。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,樣品中的GDF8與樣品中存在的GDF8結(jié)合蛋白和 抗-GDF8解離。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的檢驗(yàn)還包括在將樣品與捕獲試劑合并之前將 樣品與酸性緩沖液合并,如本文所述。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明檢驗(yàn)的酸性緩沖液具有約 PH 1.0和pH 6.0之間的pH。在另一實(shí)施方式中,酸性緩沖液的pH約為pH 2.5。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了任意一種或多種本文所述的檢驗(yàn),其中樣品 選自血清、全血、血漿、活組織檢查樣品、組織樣品、細(xì)胞懸浮液、唾液、口腔流體(oral fluid)、腦脊液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗、淚液、胃液、滑液和粘液。在另一 實(shí)施方式中,本發(fā)明提供的樣品選自全血、血清或血漿。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了任意一種或多種本文所述檢驗(yàn),其中所述檢 測(cè)步驟包含至少一種夾層檢驗(yàn)(sandwich assay)和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)。在一些實(shí)施方式 中,所述檢測(cè)步驟包含夾層檢驗(yàn)。在一些實(shí)施方式中,檢測(cè)步驟包含至少以下之一檢測(cè) 與樣品接觸的固體光學(xué)表面處折射指數(shù)的改變;檢測(cè)發(fā)光的改變;測(cè)量顏色的改變;檢 測(cè)放射性的改變;使用biolayer干涉測(cè)定法(interferometry)測(cè)量;使用懸臂-檢測(cè) (cantilever-detection)測(cè)量;使用無(wú)標(biāo)記的內(nèi)在成像測(cè)量;和使用聽(tīng)覺(jué)檢測(cè)測(cè)量。在一 些實(shí)施方式中,本發(fā)明的檢測(cè)步驟測(cè)量顏色的改變。在一些實(shí)施方式中,檢測(cè)步驟包括選自 以下的檢驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)(ELISA);電-化學(xué)發(fā)光檢驗(yàn)(ECL);放射免疫檢驗(yàn)(RIA); 固-相放射免疫檢驗(yàn)(SPRIA);免疫印跡;免疫沉淀;熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)。在另一 實(shí)施方式中,檢測(cè)步驟包括ELISA。在一個(gè)實(shí)施方式中,通過(guò)化合物與特異性結(jié)合GDF8的檢測(cè)試劑的特異性結(jié)合檢 測(cè)GDF8的存在,其中所述化合物還包含可檢測(cè)的標(biāo)記。在另一實(shí)施方式中,可檢測(cè)的標(biāo)記 包括至少一種選自以下的標(biāo)記酶標(biāo)記;發(fā)光標(biāo)記;蛋白質(zhì)標(biāo)記;維生素標(biāo)記;發(fā)色標(biāo)記; 放射性同位素標(biāo)記和電子致密分子(electron dense molecule)標(biāo)記。在另一實(shí)施方式中, 可檢測(cè)的標(biāo)記是蛋白質(zhì),并且還包括生物素。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的檢驗(yàn)提供了選自以下的捕獲試劑抗-GDF8抗體、抗 原結(jié)合蛋白或其片段;GDF8結(jié)合蛋白;和GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明的檢 驗(yàn)提供的捕獲劑是抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段,并且選自RK35、RK22、MY0-028、 MY0-029和JA16。在一些實(shí)施方式中,捕獲試劑是RK35。在一些實(shí)施方式中,捕獲試劑是RK22。在本發(fā)明檢驗(yàn)的一個(gè)實(shí)施方式中,提供的檢測(cè)試劑選自抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合 蛋白或其片段;GDF8結(jié)合蛋白和GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中,檢測(cè)試劑是抗-GDF8 抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段,并且選自RK22和RK35。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明的檢驗(yàn)提 供的檢測(cè)試劑是RK35。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明的檢驗(yàn)提供的檢測(cè)試劑是RK22。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了下述檢驗(yàn),其中捕獲試劑是RK22,并且檢測(cè)試劑 是RK35。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了下述檢驗(yàn),其中捕獲試劑是RK35并且檢測(cè)試劑 是 RK22。在本發(fā)明的另一方面中,本發(fā)明提供了定量來(lái)自受試者的樣品中GDF8存在的檢 驗(yàn),所述檢驗(yàn)包括以下步驟將⑴樣品和(ii)特異性結(jié)合GDF8的捕獲試劑和(iii)特異 性結(jié)合GDF8的檢測(cè)試劑合并,檢測(cè)捕獲試劑與GDF8之間是否發(fā)生特異性結(jié)合并定量樣品 中的GDF8水平,其中特異性結(jié)合的檢測(cè)表明樣品中存在GDF8,并且可以被定量。在本發(fā)明 的一個(gè)實(shí)施方式中,樣品中的GDF8與樣品中存在的GDF8結(jié)合蛋白和抗-GDF8解離。在一 個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的檢驗(yàn)還包括在將樣品與捕獲試劑合并之前將樣品與酸性緩沖液合 并,如本文所述。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明檢驗(yàn)的酸性緩沖液具有約PH 1.0和pH 6.0之 間的pH。在另一實(shí)施方式中,酸性緩沖液的pH約為pH 2.5。在本發(fā)明的另一方面中,本發(fā)明提供了用于在受試者中治療(包括改善和/或預(yù) 防)⑶F8-相關(guān)病癥的藥物組合物,其包含可藥用載劑和至少一種⑶F8拮抗劑,所述⑶F8 拮抗劑選自GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽模擬物;經(jīng)分離的核酸,其編碼GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域肽模擬 物的氨基酸;GDF8特異性的抑制性多核苷酸;和特異性結(jié)合GDF8但是不特異性結(jié)合BMPll 的抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的藥物組合物包含對(duì)GDF8特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽 模擬物,其基本上由選自以下的氨基酸序列組成SEQ IDNO :4的氨基酸序列、SEQ ID NO 6 的氨基酸序列、SEQ ID NO 8的氨基酸序列、SEQ ID NO 10的氨基酸序列和SEQ ID NO 12 的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的藥物組合物包含經(jīng)分離的核酸,其編碼對(duì)⑶F8特異 性的氨基酸,所述核酸基本上由選自以下的核酸序列組成SEQ ID NO :3的核酸序列、SEQ ID NO 5的核酸序列、SEQ ID NO 7的核酸序列、SEQ ID NO 9的核酸序列、SEQ ID NO 11 的核酸序列及其片段的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的藥物組合物包含特異性結(jié)合GDF8但是不特異性結(jié) 合BMPll的抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段,其包含含有SEQ ID NO 16的氨基酸序 列的輕鏈,并且其中所述抗體還包含含有SEQ ID NO :14的氨基酸序列的重鏈。在另一實(shí)施 方式中,本發(fā)明的藥物組合物提供了特異性結(jié)合GDF8但是不特異性結(jié)合BMPll的抗-GDF8 抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段,其包含含有SEQ ID NO :18的氨基酸序列的輕鏈,并且其中所 述抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段還包含含有SEQ ID NO :17的氨基酸序列的重鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的藥物組合物包含下述抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合蛋白 或其片段,其特異性結(jié)合⑶F8但是不結(jié)合BMPll并且包含至少一個(gè)下述互補(bǔ)性決定區(qū) (⑶R),所述⑶R包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO 19的氨基酸序列、SEQ ID NO 20 的氨基酸序列、SEQID NO 21的氨基酸序列、SEQ ID NO 22的氨基酸序列、SEQ ID NO 23的氨基酸序列、SEQ ID NO 24的氨基酸序列、SEQ ID NO :25的氨基酸序列、SEQ ID NO 26 的氨基酸序列、SEQ ID NO 27的氨基酸序列、SEQ IDNO 28的氨基酸序列、SEQ ID NO 29 的氨基酸序列、SEQ ID NO 30的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的藥物組合物被用于在哺乳動(dòng)物患者中治療選自以下 的GDF8相關(guān)病癥肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨_退行性病癥、代謝或誘導(dǎo)的骨病癥、肥胖 病癥、葡萄糖代謝病癥和胰島素相關(guān)病癥。在本發(fā)明的藥物組合物的另一實(shí)施方式中,其 中GDF8相關(guān)病癥選自肌營(yíng)養(yǎng)不良、ALS、肌肉萎縮、器官萎縮、腕管綜合征、虛弱、充血性阻 塞性肺病、老年性肌肉萎縮、惡病質(zhì)、肌肉消耗綜合征、肥胖癥、2型糖尿病、糖耐量減低、代 謝綜合征、胰島素抗性、營(yíng)養(yǎng)病癥、過(guò)早的性腺衰竭、雄性激素阻抑、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢 進(jìn)、骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、骨量過(guò)低(low bone mass)、維生素D缺乏和神經(jīng)性厭食 癥。本發(fā)明的另一方面提供了在哺乳動(dòng)物患者中治療(包括改善和/或預(yù)防) GDF8-相關(guān)病癥的方法,所述方法包括對(duì)患者施用治療有效量的幾乎無(wú)毒到無(wú)毒的GDF8特 異性拮抗劑。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明的方法提供的本發(fā)明的拮抗劑選自GDF8結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的肽模擬物;經(jīng)分離的核酸,其編碼GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽模擬物的氨基酸;GDF8特異 性的抑制性多肽;和特異性結(jié)合GDF8但不特異性結(jié)合BMPll的抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合蛋 白或其片段。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供的本發(fā)明的拮抗劑是GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽模擬 物,并且所述⑶F8結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上由選自以下的氨基酸序列組成SEQ ID N0:4的氨基 酸序列、SEQ ID NO 6的氨基酸序列、SEQID NO 8的氨基酸序列、SEQ ID NO 10的氨基酸 序列,和SEQ ID NO 12的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的治療方法提供了下述治療方法,其中本發(fā)明的拮抗 劑是編碼GDF8特異性氨基酸的經(jīng)分離的核酸,其基本上由選自以下的核酸序列組成SEQ ID NO :3的核酸序列、SEQ ID NO :5的核酸序列、SEQ ID NO :7的核酸序列、SEQ ID NO :9的 核酸序列、SEQ IDNO=Il的核酸序列,及其片段的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了下述治療方法,其中本發(fā)明的拮抗劑是抗-GDF8 抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段,其特異性結(jié)合GDF8但不特異性結(jié)合BMP11,并且包含含有 SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的輕鏈,還包含含有SEQ ID NO 14的氨基酸序列的重鏈。在 一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的治療方法提供的本發(fā)明的拮抗劑是抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合蛋 白或其片段,其特異性結(jié)合⑶F8但不特異性結(jié)合BMP11,并且包含含有SEQID NO :18的氨基 酸序列的輕鏈,其中所述抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段還包含含有SEQ ID N0:17的氨基酸 序列的重鏈。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的治療方法提供的本發(fā)明的拮抗劑是抗-GDF8抗 體、抗原結(jié)合蛋白或其片段,其特異性結(jié)合GDF8但是不結(jié)合BMPll并且包含至少一個(gè)下述 互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R),所述⑶R包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO :19的氨基酸序列、 SEQ ID NO 20的氨基酸序列、SEQ ID NO 21的氨基酸序列、SEQ ID NO 22的氨基酸序列、 SEQ ID NO 23的氨基酸序列、SEQ IDNO 24的氨基酸序列、SEQ ID NO 25的氨基酸序列、 SEQ ID NO 26的氨基酸序列、SEQ ID NO 27的氨基酸序列、SEQ ID NO 28的氨基酸序列、 SEQ ID NO 29的氨基酸序列、SEQ ID NO 30的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的治療方法提供的GDF8-相關(guān)病癥選自受試者中的肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨-退行性病癥、代謝或誘導(dǎo)的骨病癥、肥胖病癥、葡萄 糖代謝病癥和胰島素相關(guān)病癥。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的治療方法提供的 GDF8-相關(guān)病癥選自肌營(yíng)養(yǎng)不良、ALS、肌肉萎縮、器官萎縮、腕管綜合征、虛弱、充血性阻 塞性肺病、老年性肌肉萎縮、惡病質(zhì)、肌肉消耗綜合征、肥胖癥、2型糖尿病、糖耐量減低、代 謝綜合征、胰島素抗性、營(yíng)養(yǎng)病癥、過(guò)早的性腺衰竭、雄性激素阻抑、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢 進(jìn)、骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、骨量過(guò)低、維生素D缺乏和神經(jīng)性厭食癥。本發(fā)明的另一方面提供了診斷、預(yù)測(cè)或檢測(cè)受試者是否遭受GDF8-相關(guān)病癥的方 法,所述方法包括步驟從受試者獲得第一樣品;將第一樣品與本發(fā)明的拮抗劑合并;檢測(cè) 第一樣品中GDF8的存在;定量第一樣品中的GDF8水平;從未遭受GDF8-相關(guān)病癥的受試 者獲得第二樣品;將第二樣品與拮抗劑合并;檢測(cè)第二樣品中的GDF8水平;定量第二樣品 中的⑶F8水平并且比較第一和第二樣品中的⑶F8水平;其中與第一樣品相比,第二樣品中 GDF8水平的提高、降低或類似表明GDF8-相關(guān)病癥的嚴(yán)重性是否改變。本發(fā)明的另一方面提供了監(jiān)測(cè)GDF8-相關(guān)病癥嚴(yán)重性的方法,所述方法包括步 驟(i)從受試者獲得第一樣品;(ii)將第一樣品與權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的拮抗劑合 并;(iii)檢測(cè)第一樣品中GDF8的存在;(iv)定量第一樣品中的GDF8水平;(ν)從未遭 受GDF8-相關(guān)病癥的受試者中獲得第二樣品;(vi)將第二樣品與拮抗劑合并;(vii)檢測(cè) 第二樣品中的⑶F8水平;(viii)定量第二樣品中的⑶F9水平;和(ix)比較第一和第二 樣品中的GDF8水平;其中與第二樣品相比,第一樣品中GDF8水平的提高、降低或類似表明 ⑶F8-相關(guān)病癥的嚴(yán)重性是否改變。本發(fā)明的另一方面提供了預(yù)測(cè)受試者會(huì)發(fā)生GDF8-相關(guān)病癥的可能性的方法,所 述方法包括步驟(i)從受試者獲得第一樣品;(ii)將第一樣品與權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng) 的拮抗劑合并;(iii)檢測(cè)第一樣品中GDF8的存在;(iv)定量第一樣品中的GDF8水平;(ν) 從未遭受GDF8-相關(guān)病癥的受試者中獲得第二樣品;(vi)將第二樣品與拮抗劑合并;(vii) 檢測(cè)第二樣品中的GDF8水平;(viii)定量第二樣品中的GDF9水平;和(ix)比較第一和第 二樣品中的GDF8水平;其中與第一樣品相比,第二樣品中GDF8水平的提高、降低或類似表 明受試者會(huì)發(fā)生GDF8-相關(guān)病癥的可能性。本發(fā)明的另一方面提供了預(yù)測(cè)受試者會(huì)發(fā)生GDF8-相關(guān)病癥的可能性的方法,所 述方法包括步驟(i)從受試者獲得第一樣品;(ii)將第一樣品與權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng) 的拮抗劑合并;(iii)檢測(cè)第一樣品中GDF8的存在;(iv)定量第一樣品中的GDF8水平;(ν) 從未遭受GDF8-相關(guān)病癥的受試者中獲得第二樣品;(vi)將第二樣品與拮抗劑合并;(vii) 檢測(cè)第二樣品中的GDF8水平;(viii)定量第二樣品中的GDF9水平;和(ix)比較第一和第 二樣品中的GDF8水平;其中與第二樣品相比,第一樣品中GDF8水平的提高、降低或類似表 明受試者會(huì)發(fā)生GDF8-相關(guān)病癥的可能性。本發(fā)明的另一方面提供了藥物組合物在制備用于在哺乳動(dòng)物患者中治療(包括 改善和/或預(yù)防)⑶F8-相關(guān)病癥的藥物中的用途,其中所述藥物組合物包含可藥用載劑 和至少一種選自以下的GDF8拮抗劑GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽模擬物;經(jīng)分離的核酸,其編碼 GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域肽模擬物的氨基酸;GDF8特異性的抑制性多核苷酸;和特異性結(jié)合GDF8 但是不特異性結(jié)合BMPll的抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段。本發(fā)明的另一方面提供了用于在來(lái)自受試者的樣品中檢測(cè)GDF8存在的試劑盒,所述試劑盒包含特異性結(jié)合GDF8的捕獲試劑和特異性結(jié)合GDF8的檢測(cè)試劑,其中GDF8對(duì) 捕獲和檢測(cè)試劑的特異性結(jié)合的檢測(cè)表明樣品中存在GDF8。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的 試劑盒還包含酸性緩沖液。本發(fā)明的另一方面提供了用于定量來(lái)自受試者的樣品中GDF8的試劑盒,所述試 劑盒包含特異性結(jié)合GDF8的捕獲試劑和特異性結(jié)合GDF8的檢測(cè)試劑,其中GDF8對(duì)捕獲和 檢測(cè)試劑的特異性結(jié)合的檢測(cè)允許定量樣品中的GDF8。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的試劑 盒還包含酸性緩沖液。在另一方面中,本發(fā)明提供了本文所述的抗體,其中所述抗體是特異性結(jié)合GDF8 但是不特異性結(jié)合BMPll的抗-GDF8抗體、抗原結(jié)合蛋白或其片段,其中所述抗體或抗原 結(jié)合蛋白選自多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、四聚 體抗體、四價(jià)抗體、多樣特異性抗體、單鏈抗體、結(jié)構(gòu)域-特異性抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、結(jié)構(gòu) 域-缺失的抗體、融合蛋白、ScFc融合蛋白、單-鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜 合抗體、經(jīng)突變的抗體、CDR-移植的抗體,抗體片段,所述抗體片段可包括Fab、F(ab' )2、 Fab'片段、Fv片段、單-鏈Fv (ScFv)片段、Fd片段和dAb片段,抗原結(jié)合蛋白,所述抗原 結(jié)合蛋白可包括雙抗體、⑶R3肽、受約束的FR3-⑶R3-FR4肽、微體、二價(jià)微體、小模塊免疫 藥物(SMIPs)、鯊魚(yú)可變IgNAR結(jié)構(gòu)域和小體。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的拮抗劑是單克 隆抗體。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的拮抗劑是人源化抗體。在一些實(shí)施方式中,抗體是 抗-GDF8抗體。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的抗體是下述抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,其 包含含有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的輕鏈,還包含含有SEQ ID NO 14的氨基酸序列的 重鏈。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的抗體是下述抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,其包含含有 SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的輕鏈,還包含含有SEQ ID NO 18的氨基酸序列的重鏈。序列簡(jiǎn)述DNA和氨基酸序列公開(kāi)于序列表中,并列舉在表1中。表 1
SEQ ID NO說(shuō)明1氨基酸序列成熟人GDF82氨基酸序列人GDF8前體3DNA序列肽模擬物(GEl)4氨基酸序列肽模擬物(GEl)5DNA序列肽模擬物(GE2)6氨基酸序列肽模擬物(GE2)
權(quán)利要求
生長(zhǎng)與分化因子8(GDF8)的特異性拮抗劑,其中所述拮抗劑是特異性結(jié)合GDF8并且不特異性結(jié)合BMP11的抗 GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白選自下述構(gòu)成的組多克隆抗體;單克隆抗體;單特異性抗體;多特異性抗體;人源化抗體;四聚體抗體;四價(jià)抗體;多樣特異性抗體;單鏈抗體;結(jié)構(gòu)域 特異性抗體;單結(jié)構(gòu)域抗體;結(jié)構(gòu)域 缺失的抗體;融合蛋白;ScFc融合蛋白;單 鏈抗體;嵌合抗體;合成抗體;重組抗體;雜合抗體;經(jīng)突變的抗體;CDR 移植的抗體;抗體片段,包括Fab、F(ab′)2、Fab′片段、Fv片段、單 鏈Fv(ScFv)片段、Fd片段、dAb片段;抗原結(jié)合蛋白,包括雙抗體、CDR3肽、受約束的FR3 CDR3 FR4肽、微體、二價(jià)微體、小模塊免疫藥物(SMIPs)、鯊魚(yú)可變IgNAR結(jié)構(gòu)域和小體。
2.權(quán)利要求1的拮抗劑,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白包含至少一個(gè)下述互補(bǔ)性決定 區(qū)(⑶R),所述互補(bǔ)性決定區(qū)包含選自SEQ ID NO 19的氨基酸序列、SEQ ID NO 20的氨基 酸序列、SEQ ID NO 21的氨基酸序列、SEQ ID NO 22的氨基酸序列、SEQ ID NO 23的氨基 酸序列、SEQ IDNO 24的氨基酸序列、SEQ ID NO 25的氨基酸序列、SEQ ID NO 26的氨基 酸序列、SEQ ID NO 27的氨基酸序列、SEQ ID NO 28的氨基酸序列、SEQ ID NO 29的氨基 酸序列、SEQ ID NO :30的氨基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的拮抗劑,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白包含重鏈,并且其中所述重鏈 包含第一、第二和第三互補(bǔ)性決定區(qū),其中所述第一互補(bǔ)性決定區(qū)包含選自SEQ ID NO: 19的氨基酸序列和SEQ ID N0:25的 氨基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列,其中所述第二互補(bǔ)性決定區(qū)包含選自SEQ ID NO 20的氨基酸序列、SEQ ID NO 26的 氨基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列,并且其中所述第三互補(bǔ)性決定區(qū)包含選自SEQ ID NO :21的氨基酸序列、SEQ ID NO 27的氨基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的拮抗劑,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白包含下述重鏈,所述重鏈含有 選自SEQ ID NO 14的氨基酸序列和SEQ ID NO 18的氨基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求2的拮抗劑,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白包含下述輕鏈,并且其中所述 輕鏈包含第一、第二和第三互補(bǔ)性決定區(qū),其中所述第一互補(bǔ)性決定區(qū)包含選自SEQ ID NO :22的氨基酸序列和SEQ ID N0:28的 氨基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列,其中所述第二互補(bǔ)性決定區(qū)包含選自SEQ ID NO :23的氨基酸序列和SEQ ID N0:29的 氨基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列,并且其中所述第三互補(bǔ)性決定區(qū)包含選自SEQ ID NO :24的氨基酸序列和SEQ ID NO 30的氨基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的拮抗劑,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白包含下述輕鏈,所述輕鏈包含 選自SEQ ID NO 16的氨基酸序列和SEQ ID NO 17的氨基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的拮抗劑,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白包含含有SEQIDNO 16的氨基 酸序列的輕鏈,并且其中所述抗體還包含含有SEQ IDNO 14的氨基酸序列的重鏈。
8.權(quán)利要求1的拮抗劑,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白包含含有SEQIDNO 17的氨基 酸序列的輕鏈,并且其中所述抗體還包含含有SEQ IDNO 18的氨基酸序列的重鏈。
9.多核苷酸,其編碼包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的GDF8拮抗劑的氨基酸。
10.包含權(quán)利要求9的多核苷酸的宿主細(xì)胞,其中所述多核苷酸與調(diào)控序列可操作地 連接。
11.包含權(quán)利要求9的多核苷酸的載體。
12.包含權(quán)利要求11的載體的宿主細(xì)胞。
13.生產(chǎn)⑶F8拮抗劑的方法,所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求12的包含多核苷酸的宿主細(xì) 胞,并分離所述宿主細(xì)胞表達(dá)的所述GDF8拮抗劑。
14.經(jīng)分離的⑶F8拮抗劑,其是通過(guò)權(quán)利要求13的方法生產(chǎn)的。
15.檢測(cè)來(lái)自受試者的樣品中GDF8存在的檢驗(yàn),所述檢驗(yàn)包括以下步驟(a)將⑴樣品;( )特異性結(jié)合GDF8的捕獲試劑; (iii)特異性結(jié)合GDF8的檢測(cè)試劑; 合并,并(b)檢測(cè)所述捕獲試劑與GDF8之間是否發(fā)生特異性結(jié)合, 其中特異性結(jié)合的檢測(cè)表明所述樣品中存在GDF8。
16.權(quán)利要求15的檢驗(yàn),所述檢驗(yàn)還包括在(a)中合并之前將所述樣品與酸性緩沖液口井O
17.根據(jù)權(quán)利要求16的檢驗(yàn),其中所述酸性緩沖液的pH在約pH1. 0和pH 6. 0之間。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的檢驗(yàn),其中所述酸性緩沖液的pH為約pH2.5。
19.權(quán)利要求15的檢驗(yàn),其中所述捕獲試劑選自抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白;GDF8 結(jié)合蛋白和⑶F8結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的組。
20.權(quán)利要求19的檢驗(yàn),其中所述捕獲試劑是抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,并且選自 RK35 和 RK22。
21.權(quán)利要求20的檢驗(yàn),其中所述捕獲試劑是RK35。
22.權(quán)利要求20的檢驗(yàn),其中所述捕獲試劑是RK22。
23.權(quán)利要求15的檢驗(yàn),其中所述檢測(cè)試劑選自抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白;GDF8 結(jié)合蛋白和⑶F8結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的組。
24.權(quán)利要求23的檢驗(yàn),其中所述檢測(cè)試劑是抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,并且選自 RK35 和 RK22。
25.權(quán)利要求24的檢驗(yàn),其中所述檢測(cè)試劑是RK35。
26.權(quán)利要求24的檢驗(yàn),其中所述檢測(cè)試劑是RK22。
27.定量來(lái)自受試者的樣品中GDF8的檢驗(yàn),所述檢驗(yàn)包括以下步驟(a)將⑴樣品;( )特異性結(jié)合GDF8的捕獲試劑; (iii)特異性結(jié)合GDF8的檢測(cè)試劑; 合并,并(b)檢測(cè)所述捕獲試劑與GDF8之間是否發(fā)生特異性結(jié)合,并(c)定量GDF8水平;其中特異性結(jié)合的檢測(cè)表明所述樣品中GDF8的存在能夠被定量。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的檢驗(yàn),所述檢驗(yàn)還包括在(a)中合并之前將所述樣品與酸性緩 沖液合并。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的檢驗(yàn),其中所述酸性緩沖液的pH在約pH1. 0和pH 6. 0之間。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的檢驗(yàn),其中所述酸性緩沖液的pH為約pH2.5。
31.包含可藥用載體和⑶F8拮抗劑的藥物組合物,其中所述拮抗劑是特異性結(jié)合⑶F8 但不特異性結(jié)合BMPll的抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白。
32.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物,其中所述特異性結(jié)合GDF8但不特異性結(jié)合 BMPll的抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白包含含有SEQ IDNO 16的氨基酸序列的輕鏈,并且 其中所述抗體還包含含有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的重鏈。
33.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物,其中所述特異性結(jié)合GDF8但不特異性結(jié)合 BMPll的抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白包含含有SEQ IDNO 18的氨基酸序列的輕鏈,并且 其中所述抗體還包含含有SEQ ID NO :17的氨基酸序列的重鏈。
34.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物,其中所述特異性結(jié)合GDF8但不結(jié)合BMPll的 抗-GDF8抗體包含至少一個(gè)下述互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R),所述互補(bǔ)性決定區(qū)包含選自SEQ ID NO 19的氨基酸序列、SEQ ID NO 20的氨基酸序列、SEQ ID NO 21的氨基酸序列、SEQ ID NO :22的氨基酸序列、SEQ ID NO :23的氨基酸序列、SEQ ID NO :24的氨基酸序列、SEQ IDNO 25的氨基酸序列、SEQ ID NO 26的氨基酸序列、SEQ ID NO 27的氨基酸序列、SEQ ID NO 28的氨基酸序列、SEQ ID NO 29的氨基酸序列、SEQ ID NO 30的氨基酸序列構(gòu)成的組 的氨基酸序列。
35.用于在哺乳動(dòng)物患者中治療GDF8-相關(guān)病癥的方法,所述方法包括對(duì)所述患者施 用治療有效量的幾乎無(wú)毒到無(wú)毒的GDF8特異性拮抗劑。
36.權(quán)利要求35的方法,其中所述GDF8拮抗劑是特異性結(jié)合GDF8但不特異性結(jié)合 BMPll的抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白。
37.如權(quán)利要求36所述的方法,其中所述GDF8拮抗劑是特異性結(jié)合GDF8但不特異性 結(jié)合BMPll的抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,其包含含有SEQ ID NO :16的氨基酸序列的輕 鏈,并且其中所述抗體還包含含有SEQ ID NO :14的氨基酸序列的重鏈。
38.如權(quán)利要求36所述的方法,其中所述GDF8拮抗劑是特異性結(jié)合GDF8但不特異性 結(jié)合BMPll的抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,其包含含有SEQ ID NO :18的氨基酸序列的輕 鏈,并且其中所述抗體還包含含有SEQ ID NO :17的氨基酸序列的重鏈。
39.如權(quán)利要求36中所述的方法,其中所述特異性結(jié)合GDF8但不特異性結(jié)合BMPll的 抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白包含至少一個(gè)下述互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R),所述互補(bǔ)性決定區(qū) 包含選自SEQ ID NO 19的氨基酸序列、SEQ ID NO 20的氨基酸序列、SEQ ID NO 21的氨 基酸序列、SEQ IDNO 22的氨基酸序列、SEQ ID NO 23的氨基酸序列、SEQ ID NO 24的氨 基酸序列、SEQ ID NO 25的氨基酸序列、SEQ ID NO 26的氨基酸序列、SEQ ID NO 27的氨 基酸序列、SEQ ID NO 28的氨基酸序列、SEQ IDNO 29的氨基酸序列、SEQ ID NO 30的氨 基酸序列構(gòu)成的組的氨基酸序列。
40.用于診斷、測(cè)定或預(yù)測(cè)、或檢測(cè)受試者是否遭受GDF8-相關(guān)病癥的方法,所述方法 包括下述步驟(a)從所述受試者獲得第一樣品;(b)將第一樣品與如權(quán)利要求9所述的拮抗劑合并;(c)檢測(cè)所述第一樣品中GDF8的存在;(d)定量所述第一樣品中的GDF8水平;(e)從未遭受GDF8-相關(guān)病癥的受試者獲得第二樣品;(f)將所述第二樣品與所述拮抗劑合并;(g)檢測(cè)所述第二樣品中的GDF8水平;(h)定量所述第二樣品中的GDF9水平并且(i)比較所述第一樣品和所述第二樣品中的GDF8水平;其中與所述第二樣品相比,所述第一樣品中GDF8水平的提高、降低或類似指示患者是 否遭受⑶F8-相關(guān)病癥。
41.藥物組合物在制備用于在哺乳動(dòng)物患者中治療GDF8-相關(guān)病癥的藥物中的用途, 其中所述藥物組合物包含可藥用載劑和GDF8拮抗劑,其中所述GDF8拮抗劑是特異性結(jié)合 GDF8但不特異性結(jié)合BMPll的抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白。
42.用于在來(lái)自受試者的樣品中檢測(cè)GDF8的存在或?qū)DF8進(jìn)行定量的試劑盒,所述 試劑盒包含特異性結(jié)合GDF8的捕獲試劑,和特異性結(jié)合GDF8的檢測(cè)試劑,其中檢測(cè)到GDF8 對(duì)所述捕獲和檢測(cè)試劑的特異性結(jié)合指示所述樣品中存在GDF8。
43.如權(quán)利要求78中所述的試劑盒,其還包含酸性緩沖液。
44.對(duì)生長(zhǎng)與分化因子8(GDF8)特異性的抗體,其中特異性結(jié)合GDF8但不特異性結(jié)合 BMPll的抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白,并且其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白選自多克隆 抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、四聚體抗體、四價(jià)抗體、多樣 特異性抗體、單鏈抗體、結(jié)構(gòu)域_特異性抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、結(jié)構(gòu)域_缺失的抗體、融合蛋 白、ScFc融合蛋白、單-鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜合抗體、經(jīng)突變的抗體、 ⑶R-移植的抗體,抗體片段,所述抗體片段包括Fab、F(ab' )2、Fab'片段、Fv片段、單-鏈 Fv (ScFv)片段、Fd片段和dAb片段,抗原結(jié)合蛋白,所述抗原結(jié)合蛋白包括雙抗體、CDR3肽、 受約束的FR3-⑶R3-FR4肽、微體、二價(jià)微體、小模塊免疫藥物(SMIPs)、鯊魚(yú)可變IgNAR結(jié)構(gòu) 域和小體構(gòu)成的組。
45.權(quán)利要求44的抗體,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
46.權(quán)利要求45的抗體,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白包含含有SEQIDN0:16的氨基 酸序列的輕鏈。并且其中所述抗體還包含含有SEQ IDNO :14的氨基酸序列的重鏈。
47.權(quán)利要求44的抗體,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白是人源化抗體。
48.權(quán)利要求47的抗體,其中所述抗體或抗原結(jié)合蛋白包含含有SEQIDN0:17的氨基 酸序列的輕鏈,并且其中所述抗體還包含含有SEQ IDNO 18的氨基酸序列的重鏈。
全文摘要
本公開(kāi)文本提供了與生長(zhǎng)與分化因子-8(GDF8)相關(guān)的、可能體外和/或體內(nèi)抑制GDF8活性和信號(hào)的新穎分子,尤其是對(duì)GDF8特異性的表位和GDF8的其它特異性拮抗劑,尤其是抗-GDF8抗體或抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或其片段。本公開(kāi)文本還提供了用于檢測(cè)和定量GDF8的免疫測(cè)定法。本公開(kāi)文本還提供了用于診斷、預(yù)防、改善和治療與GDF8相關(guān)的病癥(例如肌肉、骨和胰島素代謝的退行性病癥)的方法。最后,本公開(kāi)文本提供了通過(guò)使用本發(fā)明的抗體、多肽、多核苷酸和載體治療這類病癥的藥物。
文檔編號(hào)C07K16/22GK101970487SQ200880123772
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月1日
發(fā)明者麗莎·安娜·柯林斯-萊西, 克里斯托弗·約翰·科克蘭, 吉爾特路達(dá)·馬什特爾德·維爾德曼, 向-陽(yáng)·譚, 愛(ài)德華·羅蘭德·拉瓦利, 約翰·亞當(dāng)·諾瓦克, 里奧德米拉·詹納迪弗那·特切斯迪阿可瓦, 里耶茲·卡里姆, 金伯利·安·馬克特 申請(qǐng)人:惠氏有限責(zé)任公司