專利名稱：外源蛋白或肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)革蘭氏陽(yáng)性菌宿主細(xì)胞制備外源蛋白或肽。
背景技術(shù)：
PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/IB2005/054022(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩02006/072845)描述了重組革蘭 氏陽(yáng)性菌株(嗜堿芽孢桿菌(B.hal0dUrans)Alk36)，與其它革蘭氏陽(yáng)性菌株相比，其具有 過(guò)量產(chǎn)生鞭毛蛋白(FliC)的能力。該重組菌株在重組菌株的表面產(chǎn)生高水平穩(wěn)定和可溶 的重組鞭毛蛋白。為了達(dá)到此目的，對(duì)重組菌株進(jìn)行基因修飾以利于嵌合多肽的表達(dá)，該嵌 合多肽包括鞭毛蛋白單體以及插入到其可變區(qū)的選擇肽?；蛐揎棸?i)使染色體上用 于編碼功能性鞭毛蛋白的hag基因失活；(ii)使細(xì)胞壁蛋白酶wprA失活；以及(iii)用含 有編碼框內(nèi)鞭毛多肽融合蛋白基因的多拷貝載體轉(zhuǎn)化重組菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人利用改性鞭毛I(xiàn)II型分泌系統(tǒng)開(kāi)發(fā)出一種制備治療肽的方法，通過(guò)所述 系統(tǒng)，由修飾的嗜堿芽孢桿菌Alk36菌株(NCIMB41533)將治療肽輸出到培養(yǎng)基中。修飾包括通過(guò)干擾使鞭毛基因(hag基因)失活，阻止功能性鞭毛蛋白的表達(dá)。干 擾可以是通過(guò)將內(nèi)源基因替換為不編碼肽或編碼非功能性鞭毛多肽的DNA序列來(lái)實(shí)施。在 這種情況下，非功能性鞭毛多肽為缺少SEQ ID NO :1所示的氨基酸14-226的缺失突變體。 干擾hag基因詳述于PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/IB2005/054022(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩02006/072845)，該申 請(qǐng)以參閱的方式全文并入于此。除了通過(guò)PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/IB2005/054022(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩02006/072845)公開(kāi)的 基因修飾之外，通過(guò)使編碼鞭毛帽蛋白的fliD基因靶向失活，改變嗜堿芽孢桿菌(Ahag) 菌株的基因組可以獲得嵌合鞭毛蛋白單體的輸出。帽蛋白有助于鞭毛蛋白單體聚合形成鞭 毛絲。帽蛋白包括位于鞭毛絲尖端的5 FliD亞基并需要處在適當(dāng)?shù)奈恢靡允贡廾鞍装l(fā) 生聚合。fliD基因的失活導(dǎo)致未聚合的嵌合鞭毛蛋白單體分泌至細(xì)胞外介質(zhì)。在這種情況 下，非功能性FliD多肽如SEQ ID N0:2所示。選擇與文獻(xiàn)所述由枯草芽胞桿菌中鑒定的關(guān)鍵蛋白酶同源的蛋白酶基因用于基 因靶向失活。該序列是通過(guò)進(jìn)入日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ ；http://gib. genes, nig. ac. jp) 檢索嗜堿芽孢桿菌C-125基因組鑒定得到的。這些序列包括wprA(BH2080)、alp (BH0684)、 vpr (BH0831), apr (ΒΗ0696), asp (ΒΗ0855)和 aprX(BH 1930)基因。為了改善嗜堿芽孢桿菌Alk36的分泌能力，可通過(guò)靶向滅活這些關(guān)鍵蛋白酶基因 對(duì)其基因組進(jìn)行進(jìn)一步改造。所得菌株嗜堿芽孢桿菌Alk36( Δ hag、Δ fliD、AwprA、Aalp、 Δ apr, Δ vpr, Δ asp)，稱為BhFD05，用含有與N-端鞭毛蛋白區(qū)或C-端鞭毛蛋白區(qū)相連的 融合多肽，或位于鞭毛蛋白可變區(qū)，與N-端和C-端區(qū)均相連的融合多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明一方面提供一種制備基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白的方法，該方法包 括
培養(yǎng)保藏于NCIMB的保藏號(hào)為41533的嗜堿芽孢桿菌BhFD05，和使該菌株表達(dá)并分泌基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白于細(xì)胞外培養(yǎng)基，其中，所述基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白包括外源肽(i)框內(nèi)插入到鞭毛蛋白可變區(qū)，外源肽的N-端一側(cè)側(cè)接于鞭毛多肽的N-端片段，或者外源肽的C-端一側(cè)側(cè)接于鞭毛 多肽的C-端片段，或(ii)融合到鞭毛多肽的C-端。嗜堿芽孢桿菌鞭毛蛋白的N-端、C-端和可變區(qū)描述于PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/ IB2005/054022(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?WO 2006/072845)。嗜堿芽孢桿菌BhFD05于2007年12月17日以保藏號(hào)NCIMB41533保藏于NCIMB Ltd(Furguson Building, CraibstoreEstate, Buchsburn,Aberdeen ΑΒ210ΥΑ)。含有嵌合蛋白的培養(yǎng)基可作為粗品使用。該粗品可為無(wú)細(xì)胞粗品。所述方法包括將嵌合蛋白從培養(yǎng)基中部分或全部純化出來(lái)。本發(fā)明的另一方面提供了一種由第一方面的方法制備得到的基于鞭毛蛋白的嵌 合蛋白，其包括外源肽(i)框內(nèi)插入到鞭毛蛋白可變區(qū)，外源肽的N-端一側(cè)側(cè)接于鞭毛多 肽的N-端片段，或者外源肽的C-端一側(cè)側(cè)接于鞭毛多肽的C-端片段，或(ii)融合到鞭毛 多肽的C-端。所述外源肽可只融合到鞭毛多肽的N-端片段?；蛘?，所述外源肽可只融合到全長(zhǎng)鞭毛多肽的C-端?；诒廾鞍椎那逗系鞍卓商娲缘?，或者還包括融合到外源肽N-端的多肽標(biāo) 簽。這種標(biāo)簽可用于分離嵌合蛋白。該標(biāo)簽還可在蛋白質(zhì)印跡分析中用作特異性目標(biāo)。這 種標(biāo)簽可以是已知標(biāo)簽，例如FLAG-標(biāo)簽、HIS-標(biāo)簽等等。也可將不止一個(gè)標(biāo)簽副本融合 到外源肽的N-端?；诒廾鞍椎那逗系鞍卓商娲缘兀蛘哌€包括與外緣區(qū)，S卩外源肽的至少一 側(cè)相鄰，或相連的切割位點(diǎn)?？商峁┡c外源區(qū)的兩側(cè)均相鄰的切割位點(diǎn)，即，切割位點(diǎn)可側(cè) 接于外源區(qū)。切割位點(diǎn)可為已知的切割位點(diǎn)，例如可被化學(xué)試劑例如溴化氰識(shí)別的甲硫氨 酸切割位點(diǎn)。外源肽(或多肽)可為治療肽，其可選自由抗菌肽、抗病毒肽和免疫原性肽組成的組。當(dāng)外源肽為抗菌肽時(shí)，可以是一種陽(yáng)離子肽。這種陽(yáng)離子肽可以是抑菌素 (Indolicidin)。當(dāng)外源肽為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒肽時(shí)，可為以商品名“Fuzeon”市售的“恩夫韋地 (Enfuvirtide) ”。它可以由“西夫韋肽(Sifuvirtide) ”替代，西夫韋肽被當(dāng)作Fuzeon的有 潛力的改善劑。當(dāng)外源肽為免疫原性肽時(shí)，可以是HIV抗原肽。該HIV肽可為所有的HIV-I亞型 CV3南非分離物的可變區(qū)的共有序列。表達(dá)的外源肽的大小介于12-75個(gè)氨基酸之間。標(biāo)簽純化后從不同構(gòu)建體獲得的 產(chǎn)物介于2-20mg/L。本發(fā)明進(jìn)一步延伸到本發(fā)明第二方面的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白在用于制備治 療用途的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三方面提供了編碼本發(fā)明第二方面的嵌合蛋白的核酸，該核酸包括編碼⑴鞭毛多肽的N-端片段；鞭毛多肽的可變區(qū)；或者，鞭毛多肽的C-端片段的核苷酸序 列，和編碼框內(nèi)插入到編碼鞭毛多肽的可變區(qū)的核苷酸序列的外源肽的核苷酸序列，或編 碼(ii)融合到鞭毛多肽C-端的外源多肽或治療肽的核苷酸序列。核酸可包括編碼鞭毛多肽的N-端片段的核苷酸序列，該鞭毛多肽的C-末端與編 碼外源肽的核苷酸序列框內(nèi)相連。編碼外源肽的核苷酸序列可在位于SEQ ID NO 3所示核苷酸162至核苷酸606間 的任何核苷酸之后鄰接插入。
編碼外源肽的核苷酸序列可如框內(nèi)融合一樣，在SEQ ID NO 3所示核苷酸816之 后鄰接插入。本發(fā)明的第四方面提供了包括編碼本發(fā)明第二方面的嵌合蛋白的核酸序列的表達(dá)盒。編碼嵌合蛋白的核酸序列可被整合到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)。本發(fā)明的第五方面提供了一種包括編碼本發(fā)明第二方面的嵌合蛋白的核酸序列 的核酸載體，其可操作地與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(TRE)連接。核酸載體可以是外染色體質(zhì)粒。本發(fā)明的第六方面提供了一種含有本發(fā)明第五方面的核酸載體的細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞可為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，如芽孢桿菌屬的細(xì)胞，例如，嗜堿芽孢桿菌 (B. halodurans)菌種的細(xì)胞。這些細(xì)胞可為保藏于NCIMB的保藏號(hào)為41533的菌株嗜堿芽 孢桿菌 BhFD05(Ahag、AfliD、AwprA、Δ alp、Aapr、Avpr> Δ asp)的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白，，可互換使用，表示任何肽鍵連接的氨基酸鏈，不論長(zhǎng)度或翻 譯后修飾。除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的意思一 致。如有沖突，以本發(fā)明文件包括的定義為準(zhǔn)。盡管與本發(fā)明類似或等同的方法和材料可 在實(shí)踐或?qū)嶒?yàn)中應(yīng)用，優(yōu)選的方法和材料描述如下。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)和其 它參考文獻(xiàn)以參閱的方式全文并入與此。本文公開(kāi)的材料、方法和實(shí)例僅用于說(shuō)明，并不用 于限制本發(fā)明的范圍。下面將結(jié)合非限制性實(shí)施例、序列表和附圖對(duì)本發(fā)明特征作進(jìn)一步的說(shuō)明。


圖1 :pSEC194(5.498kb)的質(zhì)粒圖。分別為用于在芽孢桿菌和大腸桿菌中復(fù)制的 溫度敏感的ori(pE194)和ColEl ori。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(粗體)，用于克隆。由DNAMAN， Version 4. 1創(chuàng)建的質(zhì)粒圖；圖2A 來(lái)自于不同的缺陷蛋白酶的嗜堿芽孢桿菌菌株的細(xì)胞外樣本的SDS-PAGE 比較示意圖，嗜堿芽孢桿菌菌株在PH8.5下，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(泳道1-5，0D6oo 1.6)和靜止 期(泳道6-10，OD6tltl 5)分泌HIV抗原融合蛋白。泳道1和6，菌株BhFDOl ；泳道2和7，菌 株BhFD02 ；泳道3和8，BhFD03 ；泳道4和9，BhFD04 ；泳道5和10, BhFD05和泳道11，分子 量標(biāo)記物(Fermentas)。箭頭表示HIV抗原融合肽；圖2B 利用抗-FLAG抗體針對(duì)攜帶HIV抗原肽的嵌合鞭毛蛋白進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡 分析。箭頭表示FLAG HIV抗原融合肽；
圖3A 層析之后，對(duì)嗜堿芽孢桿菌菌株BhFD05中的嵌合鞭毛蛋白的胞外蛋白片段 的SDS PAGE凝膠分析。泳道1，分子量標(biāo)記物(Fermentas)；泳道2，pSECNHIVC7 FLAG-親 和洗脫液。箭頭表示鞭毛蛋白-HIV抗原融合蛋白；圖3B 利用MEIV3b 4抗體進(jìn)行的3A的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1，低分子量標(biāo)記物 (Biorad)；泳道2，pSECNC7(陰性對(duì)照)和泳道3，pSECNHIVC7。箭頭表示鞭毛蛋白-HIV抗 原融合蛋白；
圖4A =FLAG-親和層析后，對(duì)嗜堿芽孢桿菌菌株BhFD05中攜帶FLAG-標(biāo)簽的嵌合 鞭毛蛋白的胞外蛋白片段的SDS PAGE凝膠分析。泳道1，低分子量梯度(Fermentas)；泳道 2，pSECNFFuzC7和泳道3，pSECNF2SifC7。箭頭表示Fuzeon 和西夫韋肽鞭毛融合蛋白；圖4B 使用抗-FLAG抗體針對(duì)由嗜堿芽孢桿菌BhFD05的嵌合鞭毛蛋白表達(dá)盒中 得到的細(xì)胞外蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1，低分子量標(biāo)記物；泳道2，pSECNF2SifC7 ； 和泳道3，pSECNFFuzC7。箭頭表示Fuzeon 和西夫韋肽鞭毛融合蛋白；圖5 確證Fuzeon表達(dá)及完整性的基于質(zhì)譜(MS)的數(shù)據(jù)。(A)嵌合鞭毛基因產(chǎn)物 pSECNFFuzC7的酶切報(bào)告及鑒別的肽。相關(guān)肽Fuzeon 的序列標(biāo)示了下劃線。(B)質(zhì)量為 2606. 240 的 MS/MS 譜，證實(shí)了 Fuzeon 肽的 N-端區(qū)域 GGVDMYTSLIHSLIEESQNQQEK 的存在。 (C)質(zhì)量為1109. 51的MS/MS譜，證實(shí)了 Fuzeon肽的C-端區(qū)域WASLWNWF的存在。(D)質(zhì) 量為1230. 62的MS/MS譜，證實(shí)了 Fuzeon 肽的片段NEQELLELDK的存在；圖6A =FLAG-親和層析后，對(duì)嗜堿芽孢桿菌菌株BhFD05中攜帶FLAG-標(biāo)簽的 嵌合鞭毛蛋白的胞外蛋白片段的SDS PAGE凝膠分析。泳道1，低分子量梯度；泳道2， PSECNFINDC7。箭頭表示抗菌素鞭毛融合蛋白；圖6B 攜帶pSECNFINDC7 FLAG-標(biāo)簽的嵌合鞭毛蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1， 分子量標(biāo)記物(Fermentas)；泳道2，pSECNFINDC7 FLAG-親和洗脫液。箭頭表示抗菌素鞭 毛融合蛋白；圖7 確證抗菌素表達(dá)及完整性的基于質(zhì)譜(MS)的數(shù)據(jù)。(A)嵌合鞭毛基因產(chǎn) 物PSECNFINDC7的酶切報(bào)告及鑒別的肽。相關(guān)肽抗菌素的序列標(biāo)示了下劃線。(B)質(zhì)量為 1115. 59Da的MS/MS譜，證實(shí)了抗菌素肽的N-端區(qū)域(GGVDMILPWK，aa 195-204)的存在。 (C)質(zhì)量為1703. 79Da的MS/MS譜，涉及抗菌素肽的N-端部分，通過(guò)K194后的缺失酶切產(chǎn) 生的DDDDKGGVDMILPWK(aa 190-204)，包含圖8A所示的酶切報(bào)告中未得到清楚證明的兩個(gè) 胰蛋白酶肽。(D)質(zhì)量為1113. 542的MS/MS譜，證實(shí)殼聚糖肽WPffffPWR的存在；圖8 顯示菌株BhFD05 (pSECNF2Sif) OD600 4 . 0的細(xì)胞外上清液的FLAG-標(biāo)簽純化 的SDS-PAGE凝膠圖譜。泳道1，分子量標(biāo)記物(Fermentas)；泳道2，F(xiàn)LAG-親和洗脫液；箭 頭表示NF2Sif肽；圖9 確證嵌合鞭毛基因產(chǎn)物pSECNF2Sif，西夫韋肽的基于質(zhì)譜(MS)的數(shù) 據(jù)。MS/MS譜證實(shí)了組成西夫韋肽C-末端的重疊肽序列，質(zhì)量為1772.8372Da的 ILEESQEQQDRNER(A)，質(zhì)量為 2243. 0657Da 的 ILEESQEQQDRNERDLLE (B)的存在；圖10 顯示菌株BhFD05 (pSECNF2Sif) OD600 4 . 0的細(xì)胞外上清液的FLAG-標(biāo)簽純化 的SDS-PAGE凝膠圖譜。泳道1，分子量標(biāo)記物(Fermentas)；泳道2，粗樣品和泳道3FLAG-標(biāo) 簽洗脫液；箭頭表示NCF2Sif肽；和圖11 確證嵌合鞭毛基因產(chǎn)物pSECNCF2Sif，西夫韋肽的基于質(zhì)譜(MS)的數(shù)據(jù)。MS/MS譜證實(shí)了質(zhì)量為3938. 6768Da的抗病毒肽的N-端區(qū)域，LEESGADYKDDDDKGGVDMSTOTW EREIENYTR(A)，以及質(zhì)量為 2243. 0669Da 的 C-端區(qū)域 ILEESQEQQDRNERDLL E (B)的存在；宿主遺傳背景的發(fā)展實(shí)施例1
權(quán)利要求
一種制備基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)保藏于NCIMB的保藏號(hào)為41533的嗜堿芽孢桿菌BhFD05(Δhag、ΔfliD、ΔwprA、Δalp、Δapr、Δvpr、Δasp)菌株，和使該菌株表達(dá)并分泌高水平的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白于細(xì)胞外培養(yǎng)基中；其中，所述基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白包括外源肽，該外源肽(i)框內(nèi)插入到鞭毛蛋白可變區(qū)，外源肽的N 端一側(cè)側(cè)接于鞭毛多肽的N 端片段，或者外源肽的C 端一側(cè)側(cè)接于鞭毛多肽的C 端片段，或(ii)融合到鞭毛多肽的C 端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述含有嵌合蛋白的培養(yǎng)基作為粗品使用，且從 培養(yǎng)基中能夠純化得到部分或全部的嵌合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法制備的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其包括外源肽，該外 源肽(i)框內(nèi)插入到鞭毛蛋白可變區(qū)，外源肽的N-端一側(cè)側(cè)接于鞭毛多肽的N-端片段，或 者外源肽的C-端一側(cè)側(cè)接于鞭毛多肽的C-端片段，或(ii)融合到鞭毛多肽的C-端。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其中所述外源肽只融合到鞭毛多 肽的N-端片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其中所述外源肽融合到鞭毛多肽 的C-端。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其包括融合到外源肽 N-端一側(cè)的多肽標(biāo)簽。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其包括與外源肽區(qū)域相 連的至少一個(gè)切割位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其中所述外源多肽為治 療多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其中所述外源肽為抗菌肽，且為 抑菌素。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其中所述外源肽為抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒肽，且為恩夫韋地。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其中所述外源肽為抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒肽，且為西夫韋肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其中所述外源肽為免疫原性肽， 且為一種HIV抗原肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求3-12任一項(xiàng)所述的治療肽在用于制備治療用藥物中的應(yīng)用。
14.編碼根據(jù)權(quán)利要求3-12任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白的核酸，所述核酸包括編碼(i)鞭 毛多肽的N-端片段；鞭毛多肽的可變區(qū)；或者，鞭毛多肽的C-端片段的核苷酸序列，和編 碼框內(nèi)插入到編碼鞭毛多肽的可變區(qū)的核苷酸序列的外源多肽或治療肽的核苷酸序列，或 編碼(ii)融合到鞭毛多肽C-端的外源多肽或治療肽的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸，其中編碼外源肽或治療肽的核苷酸序列在位于SEQ ID NO 3的核苷酸162至核苷酸606間的任何核苷酸之后鄰接插入。
16.包括編碼權(quán)利要求3-12任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白的核酸序列的表達(dá)盒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的表達(dá)盒，其中所述編碼嵌合蛋白的核酸序列被整合至宿主細(xì)胞的染色體中。
18.包括編碼權(quán)利要求3-12任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白的核酸序列的核酸載體，其可操作 地與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子連接。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的核酸載體，其為外染色體質(zhì)粒。
20.含有權(quán)利要求18或19所述的核酸載體的細(xì)菌細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)菌細(xì)胞，其為NCIMB保藏號(hào)為41533的菌株嗜堿芽孢桿 菌 Alk36(Ahag、AfliD、AwprA、A alp, Aapr、Avpr、Δ asp)的命名為 BhFD05 的細(xì)胞。
全文摘要
一種制備基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白的方法，包括培養(yǎng)保藏于NCIMB的保藏號(hào)為41533的嗜堿芽孢桿菌BhFD05(Δhag、ΔfliD、ΔwprA、Δalp、Δapr、Δvpr、Δasp)菌株。使該菌株表達(dá)并分泌高水平的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白于細(xì)胞外培養(yǎng)基中。所述基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白包括外源肽(i)框內(nèi)插入到鞭毛蛋白可變區(qū)，外源肽的N-端一側(cè)側(cè)接于鞭毛多肽的N-端片段，或者外源肽的C-端一側(cè)側(cè)接于鞭毛多肽的C-端片段，或(ii)融合到鞭毛多肽的C-端。
文檔編號(hào)C07K14/31GK101970469SQ200880124570
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日
發(fā)明者伊沙克·巴爾托洛梅斯·戈博, 埃爾迪·伯杰, 埃里卡·瑪格麗特·迪·普萊西, 莫林·伊莉莎白·拉爾文, 邁克爾·克雷格·克蘭普頓 申請(qǐng)人:Csir公司