專利名稱：用于肺部傳遞給藥的組合物的制作方法
用于肺部傳遞給藥的組合物本發(fā)明涉及直接肺部傳遞多肽例如域抗體的方法，并涉及適于直接肺部傳遞的特 定多肽組合物。本發(fā)明還涉及這樣的組合物在藥物中的用途，所述藥物例如用于治療和診 斷肺病，例如用于治療慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
背景技術(shù)：
治療劑或診斷劑經(jīng)常不能滲透入組織或器官中，因而不能在特別需要的位置產(chǎn)生 所需的治療或診斷作用。因此，需要將這樣的治療劑或診斷劑直接給予組織或器官的方法，例如直接給予 到肺組織，使該藥劑產(chǎn)生較長的治療窗。還需要包含這樣的治療劑或診斷劑的特定組合物，所述組合物尤其適于直接給予 特定的組織或器官，例如需要包含特別適合于直接給予到肺的治療劑或診斷劑的組合物。 這樣的組合物可用于疾病的治療、診斷或預(yù)防，例如用于呼吸道疾病的治療、診斷或預(yù)防， 其中所述藥劑被配制用于直接局部給予至肺組織。這樣的藥劑的實例為域抗體(dAb)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，結(jié)合肺組織中的靶的域抗體(dAb)可用于生產(chǎn)治療或預(yù)防呼吸道疾病 的組合物，其中所述組合物適于局部給予到肺組織。在一個實施方案中，可以使用多達(dá)約 10mg/kg的結(jié)合肺組織靶的dAb。在另一個實施方案中，肺組織的靶介導(dǎo)肺部炎癥或肺病 (參見W02007049017的公開內(nèi)容，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。一個令人感興趣的靶是腫瘤壞死因子(TNF- α )途徑，人們相信該途徑與肺病(如 C0PD)和哮喘的發(fā)病有關(guān)。已產(chǎn)生了一些抑制TNFRl的域抗體(dAb)，對這些域抗體(dAb)已有描述(例如在 WO 2007049017和WO 06038027中)，它們可有效治療肺部炎癥或呼吸道疾病，例如慢性阻 塞性肺病(COPD)。TNF-α具有與COPD相關(guān)的廣譜炎性作用，通過釋放蛋白酶導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞、 單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞粘液分泌的活化和肺實質(zhì)的破壞(Barnes PJ等人，Chronic obstructive pulmonary disease :molecular and cellular mechanisms. Eur Respir J. 2003 年 10 月；22 (4) :672-88)。已公布的研究表明，與一般吸煙者和哮喘患者相比，TNF- α在COPD患者的誘導(dǎo)痰
(Keatings VM ^A, Differences in interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonary disease or asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1996 年 2 月；153 (2) 530-4)。另外，增加的TNF-α表達(dá)可能暫時與COPD患者的病情惡化相關(guān)(Calikoglu M等 人’ Leptin and TNF-alpha levels in patients with chronic obstructive pulmonary disease and their relationship to nutritional parameters. Respiration. 2004 年 1 月-2 月；71(1) :45-50)。TNFRl的表達(dá)似乎在分離自COPD患者的外周T細(xì)胞上增加(Hodge. G.等人， Increased intracellular T helper 1 proinflammatory cytokine production inperipheral blood, BAL and intraepithelial T cells of COPD subjects. Clin. Exp. Immunol. 2007. 150(1). 22-29)。此外，升高的外周可溶性TNFRl水平與急性肺損傷患者和呼吸機(jī)誘導(dǎo)性肺損傷患 者的發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)(Parsons，P. E.等人，Elevated plasma levels of soluble TNF receptors are associated with morbidity and mortality in patients with acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005. 288 :L426_L431)。腫瘤壞死因子α是一種在病理狀況下的體液中以低濃度存在的多效性細(xì)胞因 子。它是免疫學(xué)和病理生理反應(yīng)的主要介導(dǎo)物。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞 產(chǎn)生，但也由許多其它細(xì)胞類型產(chǎn)生，包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。TNF-a 一般以^kDa前體合成，其以膜結(jié)合形式儲存于細(xì)胞上。在由細(xì)胞釋放之前，前體形式轉(zhuǎn)變 為可溶性的17kDa TNF-a，并由TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TACE)或其它基質(zhì)金屬蛋白酶活化。TNF-a是結(jié)合兩種不同的細(xì)胞表面受體的同三聚體，兩種受體為55_60kDa TNFRl 鏈和70-80kDa TNFR2鏈，它們均以非共價結(jié)合的同三聚體受體復(fù)合物存在。TNFR由廣泛的 細(xì)胞表達(dá)。例如，迄今還沒有在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)不表達(dá)TNFRl的細(xì)胞類型，而TNFR2主要由免疫細(xì) 胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。TNFRl和TNFR2是主要在它們的胞外結(jié)構(gòu)域中具有同源性的單跨膜糖蛋白， 它們包含4個串聯(lián)重復(fù)的富半胱氨酸基序。它們包含幾個具有已知功能意義的基序。TNFRl 和TNFR2均包含胞外前配體結(jié)合裝配結(jié)構(gòu)域(PLAD)(與配體結(jié)合區(qū)不同)，其預(yù)復(fù)合受體， 特別是在被TNF-α配體活化時促進(jìn)三聚化。TNFRl包含至受體的羧基末端約80個氨基酸 長度的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)基序，對TNFRl的死亡誘導(dǎo)活性很關(guān)鍵。于0°C的結(jié)合研究確定了 TNF- α對兩種TNFR的高親和性結(jié)合，對TNFRl的Kd值約 為 300-600ρΜ，對 TNFR2 的 Kd 值約為 70_200pm (MacEwan DJ.等人，TNF receptor subtype signalling :differences and cellular consequences. Cell Signal. 2002年6月；14(6) 477-92)。然而，TNFRl (而不是TNFR2)于生理溫度時是可溶性TNF-α的高親和性受體(Kd = 19ρΜ)，這主要由TNF-α對TNFRl的非常慢的離去速率驅(qū)動。TNF-a與TNFRl的復(fù)合物非 常穩(wěn)定，平均存活時間為大約48分鐘，更有可能被內(nèi)化(相比于解離)，產(chǎn)生在胞內(nèi)持續(xù)存 在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物。TNFRl和TNFR2均還能夠結(jié)合與TNF-a同源(30%氨基酸同一性) 的淋巴毒素。淋巴毒素在男性中的功能性作用很大程度上是未知的。膜結(jié)合型TNF-a結(jié)合并活化TNFRl和TNFR2 二者。而可溶性TNF_a不結(jié)合 TNFR2，相比于膜結(jié)合型TNF-a對TNFR2的活化，隨后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著降低。TNFR2 — 旦被活化，就被基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)切割為可溶性形式，其仍能夠結(jié)合TNF-a配體 (Pennica D 等人，Biochemical properties of the 75~kDa tumor necrosis factor receptor. Characterization of ligand binding, internalization, and, receptor phosphorylation. J Biol Chem. 1992 年 10 月 15 日；267(29) :21172-8)。多個實驗方案已揭示，TNF-Rl啟動TNF-α的大部分生物活性。TNF-α與TNF-Rl 的結(jié)合觸發(fā)一系列胞內(nèi)事件，其最終導(dǎo)致兩種主要轉(zhuǎn)錄因子的活化核因子kB(NF-kB)和 c-Jun。這些轉(zhuǎn)錄因子的作用是誘導(dǎo)表達(dá)對于不同生物學(xué)過程都重要的基因，所述生物學(xué)過 程包括細(xì)胞的生長及死亡、發(fā)育、瘤形成和免疫、炎癥以及應(yīng)激反應(yīng)。對于單核細(xì)胞增生李斯特菌或結(jié)核分枝桿菌的感染，TNFRl缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出更高的敏感性，但卻能抵抗 TNF-α或白介素-1介導(dǎo)的體內(nèi)致命性，并且能抵抗由脂多糖和D-半乳糖胺誘導(dǎo)的內(nèi)毒素 休克模型。還已經(jīng)表明，TNFRl能控制早期移植物抗宿主病。使用TNFR2缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠的研究已表明，TNFR2在幾種有益的免疫學(xué)過程中 起重要作用。已表明TNFR2在以下方面起作用抗原驅(qū)動的T細(xì)胞應(yīng)答和增殖(The type 1 receptor(CD120a) is the high-affinity receptor for soluble tumor necrosis factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 年 1 月 20 日；95 (2) :570-5.)、抗腫瘤作 用(Zhao X 等人，Tumor necrosis factor receptor 2-mediated tumor suppression is nitric oxide dependent and involves angiostasis. Cancer Res. 2007 年 5 月 1 日；67(9) :4443-50)、缺血誘導(dǎo)的新血管化(Goukassian DA，等人，Tumor necrosis factor-alpha receptor p75 is required in ischemia-induced neovascularization. Circulation. 2007年2月13日；115(6) :752-62)、樹突細(xì)胞-天然殺傷細(xì)胞交擾朗格漢斯 細(xì)胞遷移° 最后，Higuchi Y 等人(Higuchi, Y.等人，Tumor necrosis factor receptors 1 and 2 Differentially Regulate Survival, Cardiac Dysfunction, and Remodeling in Transgenic Mice With Tumor Necrosis Factor Induced Cardiomyopathy. Circulation. 2004 ；109 :1892-1897)表明，經(jīng)由TNFR2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以在細(xì)胞因子介導(dǎo)的 心力衰竭發(fā)病機(jī)理中起保護(hù)心臟的作用。TNFRl的特異性阻斷可以潛在地使TNF-α經(jīng)由 TNFR2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮出其某些有益的免疫功能，同時消除TNFRl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的有害作用。臨床前研究和臨床研究已鑒定并驗證，在許多免疫介導(dǎo)的炎性疾病中，TNF-α為 關(guān)鍵的疾病分子和免疫治療干預(yù)的治療靶。臨床適應(yīng)癥包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、 強(qiáng)直性脊柱炎和銀屑病。最近的臨床發(fā)現(xiàn)表明，許多慢性炎性疾病共有某些致病途徑，而 其它疾病限于具體的疾病表型。使用抗-TNFa劑作為探測劑，已證實TNF-α能調(diào)節(jié)其它 促炎細(xì)胞因子例如IL-Ia和IL-I β、向關(guān)節(jié)的炎性細(xì)胞募集、基質(zhì)金屬蛋白酶和滑液血管
(Taylor PC 等人，Tumour necrosis factor alpha as a therapeutic target for immune-mediated inflammatory diseases. Curr Opin Biotechnol.2004年 12 月；15 (6) 557-63)。TNF-α可以在肺病如COPD和哮喘中起關(guān)鍵作用，并增強(qiáng)炎性反應(yīng)，通過蛋白酶的 釋放導(dǎo)致上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞粘液分泌的活化以及肺實質(zhì)的破 壞。COPD的特征在于緩慢進(jìn)行性發(fā)展的氣管狹窄，這是完全不可逆的。傳統(tǒng)意義上， COPD包括慢性支氣管炎和肺氣腫兩方面的臨床表現(xiàn)或病理表現(xiàn)。在臨床上，慢性支氣管炎 定義的基礎(chǔ)是引起痰性咳嗽的粘液產(chǎn)生，而肺氣腫是肺泡破壞的病理過程。除了顯著的炎 性浸潤以外，在診斷患有COPD的患者的氣管中，粘液細(xì)胞增生增加和肥大均是明顯的。盡 管臨床上相關(guān)的粘液分泌的主要部位仍是較大的氣管，但大部分氣流阻塞被認(rèn)為存在于非 軟骨的膜細(xì)支氣管和末端氣管中。小氣管的長期炎癥導(dǎo)致上皮下纖維化、細(xì)支氣管壁厚度 增加以及粘液性氣道阻塞。與一般吸煙者和哮喘患者相比，在COPD患者的誘導(dǎo)痰中存在較高濃度的 TNF- α (Keatings VM 等 人’ Differences in interleukin-8 and tumour necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonarydisease or asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1996年 2 月；153 (2) :530-4)。另夕卜，增加 WTNF-Ci表達(dá)可能暫時與COPD患者的病情惡化相關(guān)(先前援引的Calikoglu等人，2004)。 盡管似乎還沒有研究肺組織中的TNFRl和TNFR2表達(dá)，但已表明外周可溶性TNFR2水平在 COPD患者中增加，而TNFRl的表達(dá)似乎在分離自COPD患者的外周T細(xì)胞上增加(Hodge. G.等人，Increased intracellular T helper 1 proinflammatory cytokine production in peripheral blood, BAL and intraepithelial T cells of COPD subjects. Clin. Exp. Immunol. 2007. 150 (1). 22-29.)。而且，升高的外周可溶性TNFRl水平與急性肺損 傷患者和呼吸機(jī)誘導(dǎo)性肺損傷患者的發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)(Parsons，P. Ε.等人， Elevated plasma levels of soluble TNF receptoes are associated with morbidity and mortality in patients with acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005. 288 :L426_L431)。在伴有體重減輕和骨骼肌減少的COPD患者中，TNF-α的血清濃度和外周單核細(xì) 胞的誘導(dǎo)性TNF-α生產(chǎn)增加。這意味著在惡病質(zhì)病因?qū)W中TNF-α通常與嚴(yán)重COPD相關(guān)。因此，已產(chǎn)生了抗-TNFRl域抗體來抑制TNFRl靴(參見例如W02007049017和 W006038027中的公開內(nèi)容)。尤其需要通過直接肺部傳遞這樣的抗TNFRl域抗體，來實現(xiàn)例如治療或預(yù)防肺病 的TNFRl靶的局部抑制，因此，需要包含可抑制TNFRl靶的藥劑(例如抗TNFRl域抗體)的 組合物，所述組合物尤其適于直接給予到肺組織。這樣的組合物可用于治療或預(yù)防呼吸道 疾病，例如COPD或哮喘或肺結(jié)節(jié)病。短語“免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域”是指獨立于其它不同的V區(qū)或結(jié)構(gòu)域，特異性結(jié) 合抗原或表位的抗體可變結(jié)構(gòu)域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以與其它可變區(qū) 或可變結(jié)構(gòu)域以一定形式(例如同多聚體或異多聚體)存在，其中所述其它區(qū)或結(jié)構(gòu)域不 是單免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域進(jìn)行抗原結(jié)合所需要的(即其中免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域獨 立于其它不同的可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合抗原)?！坝蚩贵w”或“dAb”與本文使用的術(shù)語“免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域”相同。在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是人抗體可變結(jié)構(gòu) 域，但也包括其它物種如嚙齒類動物(例如WO 00/29004中所公開的，其內(nèi)容整體通過引用 結(jié)合到本文中)、護(hù)士鯊和駱駝類Vhh dAb的單抗體可變結(jié)構(gòu)域。駱駝類Vhh是免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域多肽，其來源于包括駱駝、無峰駝、羊駝、單峰駝和原駝的物種，產(chǎn)生天然缺少 輕鏈的重鏈抗體。“結(jié)構(gòu)域”是折疊的蛋白結(jié)構(gòu)，其具有與蛋白的其它部分無關(guān)的三級結(jié)構(gòu)。一般而 言，結(jié)構(gòu)域形成蛋白的獨立功能特性，在許多情況下，可以添加、除去或轉(zhuǎn)移至其它蛋白，而 不喪失蛋白和/或結(jié)構(gòu)域的其余部分的功能。“單抗體可變結(jié)構(gòu)域”是折疊的多肽結(jié)構(gòu)域， 其包含特征為抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列。因此其包括完整的抗體可變結(jié)構(gòu)域和修飾的可變結(jié) 構(gòu)域，例如其中一個或多個環(huán)已被不以抗體可變結(jié)構(gòu)域為特征的序列替代，或者已被截短 或包含N末端或C末端延長的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及保留全長結(jié)構(gòu)域的至少結(jié)合活性和特 異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段。發(fā)明概述我們現(xiàn)在已開發(fā)了包含以下或由以下組成的組合物(a)多肽，例如抗體(例如單 克隆抗體)或免疫球蛋白多肽，例如域抗體(dAb)，或者例如納米抗體，以及(b)藥學(xué)上可接受的緩沖液，其中所述組合物包含液滴，且在所述組合物中存在的液滴中，約40%或以上 (例如50%或以上)的液滴小于約6微米，例如約1微米至約6微米，例如小于約5微米， 例如約1微米至約5微米。這些組合物例如尤其適于通過直接局部肺部傳遞給予患者。例 如，這些組合物可以直接給予到肺，例如通過吸入，例如通過使用噴霧器裝置。因此，本發(fā)明提供包含以下或由以下組成的組合物(a)多肽，例如免疫球蛋白多 肽，例如域抗體(dAb)或例如納米抗體組合物，以及(b)藥學(xué)上可接受的緩沖液，其中所述 組合物包含液滴，且在所述組合物中存在的液滴中，約40%或以上(例如50%或以上)的 液滴小于約6微米，例如約1微米至約6微米，例如小于約5微米，或例如約1微米至約5 微米，例如通過直接局部肺部傳遞給予患者。這些組合物可以包含生理學(xué)上可接受的緩沖 液，其具有約4至約8的pH范圍，例如約7至約7. 5，并且其粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含1.2% (重量/體積)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度。在所述組合物中存在的液滴中，至少40%的液滴、例如50%或以上、例如80%或 以上的液滴的大小小于約6微米，例如約1微米至約6微米。小于約6微米的液滴大小范 圍可以為例如約1微米至約6微米，例如約2微米至約5微米，對于傳遞至深肺，其可優(yōu)選 為例如約2微米至約3微米。目前已知的藥學(xué)上可接受的緩沖液的實例包括磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、 乙酸鹽緩沖液和組氨酸緩沖液。所述緩沖液還可以包含添加劑，例如(a)增加粘度的物質(zhì)， 例如PEG，例如PEG 1000 ；糖，例如蔗糖、甘露糖、Iutrol (例如Iutrol 44)，和/或(b)穩(wěn)定 劑，例如洗滌劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上所述的組合物，其還進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、稀 釋劑或賦形劑。所述多肽可以包含以下或由以下組成例如治療性、預(yù)防性或診斷性多肽，其需要 向受試者傳遞，例如至多約150個氨基酸的所述多肽。所述多肽可以為例如抗體(例如單克隆抗體)或免疫球蛋白多肽，或者它們可以 為例如多肽結(jié)構(gòu)域，例如單體，例如至多約150個氨基酸。所述多肽可以包含以下或由以下組成例如域抗體(“dAb”)，例如域抗體(dAb)單體。所述多肽還可以包含以下或由以下組成非IgG樣的骨架，例如親和體 (affibody) 0本文使用的術(shù)語“多肽”或域抗體(“dAb”)還用于指例如與其它分子融合或綴合 或結(jié)合的多肽或dAb，例如需要將其傳遞給患者，例如Albudab，其中dAb與人血清白蛋白結(jié) 合，以延長半衰期(參見例如WO 2005118642和WO 2006059106，其教導(dǎo)通過引用結(jié)合到本 文中)。所述多肽，例如域抗體分子，例如dAb單體，可以結(jié)合目標(biāo)靶，例如存在于肺組織 中的靶，所述靶可以為例如在肺病癥或肺疾病或肺障礙中起作用的靶，例如，所述靶可以為 TNF受體，例如TNFRl。所述多肽還可以結(jié)合一個以上的靶，例如它們可以為雙重靶向dAb， 例如在W02004058821中所述那些。dAb可以結(jié)合任何目標(biāo)靶分子。dAb還可以為具有一定形式或格式(formatted) 的dAb，例如它們可以為dAb-FC融合蛋白，或者它們可以連接至另一個基團(tuán)，例如PEG基團(tuán)。dAb還可以為連接另一個分子的基團(tuán)，例如作為融合蛋白，例如連接至結(jié)合靶的另一個 分子。本發(fā)明還涉及如上所述的組合物的用途，例如域抗體(dAb)組合物，例如其結(jié)合 肺組織中的靶，用于通過直接局部肺部傳遞給予患者。還提供本文所述的組合物，例如本文所述的dAb組合物，用于藥物，所述藥物用于 例如治療、預(yù)防或診斷呼吸道疾病或肺疾病或肺障礙，例如COPD或哮喘或肺結(jié)節(jié)病。本發(fā)明還涉及組合物(例如上述的dAb組合物)在生產(chǎn)用于治療、預(yù)防或診斷呼 吸道疾病或肺疾病或肺障礙的藥物中的用途。在一個實施方案中，可以使用至多約IOmg結(jié) 合肺組織中的靶的dAb。肺組織中的靶可以為介導(dǎo)肺炎癥或肺疾病的靶。還提供治療、預(yù)防或診斷疾病或病癥(例如呼吸道病癥或肺疾病或肺障礙)的方 法，其包括給予患者一定量(例如治療有效量)的本文所述組合物，例如dAb組合物。作 為日劑量給予的劑量范圍可以在約5mg/Kg患者體重至約0. 005mg/Kg患者體重，例如約 0. 5mg/Kg至約0. lmg/Kg患者體重。在某些實施方案中，將組合物直接給予到肺組織，例如 通過吸入，例如通過使用噴霧器、鼻內(nèi)裝置或吸入裝置。本發(fā)明進(jìn)一步涉及傳遞裝置，例如噴霧器、吸入器或鼻內(nèi)傳遞裝置，以及其用途， 其用于向患者提供一定劑量(例如計量劑量)的本文所述組合物(例如dAb組合物)，以治 療或預(yù)防或診斷疾病或病癥(例如呼吸道疾病或病癥)，其中吸入器或鼻內(nèi)傳遞裝置裝有 dAb制劑，并且例如提供計量的日劑量，例如包含至多IOmg dAb?？梢砸罁?jù)本發(fā)明使用不同 類型的噴霧器裝置，例如噴射式噴霧器裝置，如PARI，以及例如振蕩篩噴霧器，例如eFlow 和Aeroneb，還有例如超聲裝置，例如DeVilbiss和Kun-88。本發(fā)明還提供生產(chǎn)本發(fā)明的組合物的方法，其包括以下步驟混合(a)多肽，例如 域抗體(dAb)和(b)藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如這樣的緩沖液其具有約4至約8的pH 范圍，例如約7至約7. 5，并且其粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含1.2% (重量/ 體積)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度。還可以加入添加劑，例如藥學(xué)上可接受 的稀釋劑、載體或賦形劑，和/或增加粘度的藥劑，和/或穩(wěn)定劑。本發(fā)明還涉及本文所述的組合物(例如本文所述的域抗體(dAb)組合物)用于診 斷目的(例如用于造影)的用途，其中免疫球蛋白樣分子(例如域抗體)的重鏈部分或輕 鏈部分可以有利地包含可檢測標(biāo)記。適宜的可檢測標(biāo)記和用于標(biāo)記藥劑的方法是本領(lǐng)域眾 所周知的。適宜的可檢測標(biāo)記包括例如放射性同位素(例如銦-111、锝_99m或碘-131)、 正電子發(fā)射標(biāo)記(例如氟-19)、順磁離子(例如釓(Gadlinium) (III)、錳(II))、表位標(biāo)記 (標(biāo)簽)、親和標(biāo)記(例如生物素、抗生物素蛋白)、自旋標(biāo)記、酶、熒光基團(tuán)或化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。 當(dāng)不使用標(biāo)記時，可以通過表面等離子體共振或其它適宜的方法測定復(fù)合物形成。本發(fā)明還涉及本文所述的組合物(例如本文所述的域抗體(dAb)組合物)在制備 噴霧器、吸入器或鼻內(nèi)傳遞裝置中的用途，用于提供局部傳遞至肺的長效吸入dAb制劑。本發(fā)明還涉及將組合物(例如本文所述的域抗體(dAb)組合物，其結(jié)合肺組織中 的靶)給予患者以在肺組織中產(chǎn)生長治療窗的方法，該方法包括向所述患者的肺組織局部 給予有效量的所述組合物，例如本文所述的所述域抗體(dAb)組合物。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)多肽組合物如dAb組合物的方法，所述組合物用于例如治療、 預(yù)防或診斷肺病癥或肺疾病，所述方法包括混合(a)多肽和(b)生理學(xué)上可接受的緩沖液，所述緩沖液具有約4至約8的pH范圍，并且其粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含 1. 2% (重量/體積)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)多肽組合物如dAb組合物的方法，其包括以下步驟(a)混 合多肽和生理學(xué)上可接受的緩沖液，所述緩沖液例如這樣的緩沖液其具有約4至約8的 PH范圍，并且其粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含1.2% (重量/體積)蔗糖的 50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度，然后(b)，使得自步驟(a)的多肽和緩沖液組合物通過 噴霧器、吸入器或鼻內(nèi)傳遞裝置。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及生理學(xué)上可接受的緩沖液在制備例如用于肺部傳遞的多肽 組合物(例如dAb組合物)中的用途，所述緩沖液具有約4至約8的pH范圍，并且其粘度 約等于約2%至約10% PEG 1000在含1. 2% (重量/體積)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中 的溶液的粘度。本發(fā)明還涉及將所需分子傳遞入系統(tǒng)循環(huán)中的方法，所述方法包括首先通過吸入 (例如使用噴霧器、鼻內(nèi)裝置或吸入裝置)將本文所述的組合物給予到肺。本發(fā)明還涉及本文所述的dAb以及本文所述包含這些dAb的組合物，涉及如上所 述的dAb的用途，以及制備這些dAb組合物的方法，并且還涉及例如如上所述的噴霧器或吸 入器裝置，其包含這些dAb組合物。附圖簡述

圖1 顯示了針對TNFRl的Domlh-131前導(dǎo)域抗體的氨基酸序列。圖2 顯示了在人TNFRl受體結(jié)合測定中的TNF-α劑量曲線。每種樣品均以4份 復(fù)制品測試。圖 3 顯示了 D0M1H-131-202、D0M1H-131-206 和 D0M1H-131-511 在人 TNFRl 受體 結(jié)合測定中的抑制。每種樣品均以4份復(fù)制品測試。圖 4 顯示了 D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和 D0M1H-131-206 的蛋白酶穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖5 顯示了緩沖液和裝置對GSK 1995056Α(511)的霧化液滴大小的影響。圖6:顯示了在各種裝置中霧化后依據(jù)通過SEC檢測的二聚體形成評價的 D0M1H-131-511(511)穩(wěn)定性。圖7 顯示了使用Pari LC裝置對206AT 40mg/ml至多1小時的SEC追蹤。圖8 顯示了 RBA結(jié)果，表明D0M1H-131-511 (511)在霧化后保留活性。圖 9 顯示了 D0M1H-131-202Q02)、D0M1H-131-206Q06)和 D0M1H-131-511 (511) 在Pari E-flow和LC+中的噴霧器測試。在Britton-Robinson或配制緩沖液中的蛋白濃 度為5mg/ml。標(biāo)準(zhǔn)品(藥物X)作為對照以其自身用于傳遞的配制緩沖液測試。圖10 顯示了在使用振蕩篩噴霧器(E-flow，Pari)霧化前和霧化后對 D0M10-53-474 的 SEC 追蹤。圖11 顯示了在使用噴射式噴霧器(LC+，Pari)霧化前和霧化后對D0M10_53_474 的SEC追蹤。圖顯示了以下的氨基酸序列(a)毒蜥外泌肽4(G4S)3D0M^i-14融合蛋 白(DAT0115)、(b)D0M10-53-474(抗 IL_13dAb)、(c)D0M10-275-78 (抗 IL_13dAb)、(d) D0M4-130-202(抗 IL-1R1)和(e)D0M4-130-201(抗 IL-1R1)。
圖 13a-d 顯示了某些抗 TNFRl dAb 的氨基酸序列(a)Domlh-131_201、(b)Dom lh-131-203、 (c)Dom lh_131_204、 (d)Domlh-131-205。圖 14a_i :顯示了 某些抗 VEGF dAb 的氨基酸序列(a) Doml5-26_593、(b) Dom 15-26-501、 (c)Dom 15-26-555、 (d)Dom 15-26-558、 (e)Dom 15-26-589、 (f) Dom 15-26-591dAb、(g)Dom 15-26-594、(h)Dom 15-26-595、(i)DMS 1529 (VEGF dAb 1546-593-Fc 融合蛋白)。發(fā)明詳述定義短語“免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域”是指獨立于其它V區(qū)或結(jié)構(gòu)域、特異性結(jié)合抗原 或表位的抗體可變結(jié)構(gòu)域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以與其它可變區(qū)或可變 結(jié)構(gòu)域以一定形式(例如同多聚體或異多聚體)存在，其中其它區(qū)或結(jié)構(gòu)域不是單免疫球 蛋白可變結(jié)構(gòu)域進(jìn)行抗原結(jié)合所需要的(即其中免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域獨立于其它的 可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合抗原)?！坝蚩贵w”或“dAb”與本文使用的術(shù)語“免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域” 相同。在某些實施方案中，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域為人抗體可變結(jié)構(gòu)域，但也包括其它物 種如嚙齒類動物(例如WO 00/29004中所公開的，其內(nèi)容整體通過引用結(jié)合到本文中)、護(hù) 士鯊和駱駝類Vhh dAb的單抗體可變結(jié)構(gòu)域。駱駝類Vra是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域多肽， 其來源于包括駱駝、無峰駝、羊駝、單峰駝和原駝等物種，產(chǎn)生天然缺少輕鏈的重鏈抗體?！敖Y(jié)構(gòu)域”是折疊的蛋白結(jié)構(gòu)，其具有與蛋白的其它部分無關(guān)的三級結(jié)構(gòu)。一般而 言，結(jié)構(gòu)域形成蛋白的獨立功能特性，在許多情況下可以添加、除去或轉(zhuǎn)移至其它蛋白，而 不喪失蛋白和/或結(jié)構(gòu)域的其余部分的功能?！皢慰贵w可變結(jié)構(gòu)域”是折疊的多肽結(jié)構(gòu)域， 其包含特征為抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列。因此其包括完整的抗體可變結(jié)構(gòu)域和修飾的可變結(jié) 構(gòu)域，例如其中一個或多個環(huán)已被不以抗體可變結(jié)構(gòu)域為特征的序列替代，或者已被截短 或包含N末端或C末端延長的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及保留全長結(jié)構(gòu)域的至少結(jié)合活性和特 異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段。術(shù)語“多肽”是指任何種類的多肽，例如肽；人蛋白；人蛋白片段；非人來源的蛋白 或蛋白片段；工程改造形式的蛋白或蛋白片段；酶；抗原；藥物；涉及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子 如受體分子；抗體，包括免疫球蛋白超家族的多肽，例如抗體多肽或T-細(xì)胞受體多肽。所述多肽例如可以為抗體或免疫球蛋白多肽，或者它們可以為例如多肽結(jié)構(gòu)域， 例如單體，例如至多約150個氨基酸。所述多肽可有用地包含以下或由以下組成例如域抗體(“dAb”)，例如dAb單體。所述多肽還可以包含以下或由以下組成非IgG樣骨架，例如親和體。本文使用的術(shù)語“多肽”或域抗體(“dAb”)還用于指例如與其它分子融合或綴 合或結(jié)合的多肽或dAb。例如，所述多肽例如dAb可被PEG化，PEG化的dAb例如描述于 W02004081(^6。所述多肽例如dAb可以與血清白蛋白結(jié)合，例如它們可以為W02005118642 和W02006059106中所述的連接血清白蛋白的dAb (Albudab)。有利的是，所述抗體多肽可以包含重鏈(Vh)多肽和輕鏈(VJ多肽，或者包含重鏈 (Vh)多肽或輕鏈(Vl)多肽的單域抗體庫(single domain antibody repertoires)。本文 使用的抗體多肽是修飾的或未修飾的抗體或抗體組成部分的多肽。因此，術(shù)語抗體多肽包 括重鏈、輕鏈、重鏈-輕鏈二聚體、Fab片段、F(ab' )2片段、重鏈單結(jié)構(gòu)域、輕鏈單結(jié)構(gòu)域、Dab片段或Fv片段(包括單鏈Fv(SCFV))。構(gòu)建這樣的抗體分子和編碼它們的核酸的方法 是本領(lǐng)域眾所周知的。本文所述包含多肽(如域抗體)的組合物可以結(jié)合肺組織中的靶，所述靶選自 TNFRl、IL-I、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、 IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα 1、IL_13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、 IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、 CD56、CD 138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、凝乳酶、 FGF、弗林蛋白酶、內(nèi)皮素-1、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(例如嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、嗜酸性 粒細(xì)胞趨化因子_2、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM-I、I COS, IgE、IFNa、1-309、 整聯(lián)蛋白、L-選擇素、MIF、MIP4、MDC、MCP-U MMPs、嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、骨橋蛋白、 0X-40、PARC、PD-U RANTES, SCF、SDF-I、唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素8、TARC, TGFb, 疑血醇、Tim-I、TNF、TNFRl、TRANCE、類姨蛋白醇、VEGF, VLA—4、VCAM、 α 4 β 7、CCR2、CCR3、 CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、α ν β 6、α ν β 8、cMET 禾口 CD8。本文所述包含多肽(如域抗體)的組合物還可以結(jié)合系統(tǒng)性靶，例如所述靶可以 為GLP-1、毒蜥外泌肽和干擾素。在一個實施方案中，本文所述的包含多肽(如域抗體)的組合物可以結(jié)合選自 TNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中的蛋白的靶。在某些實施方案中，該蛋白靶選自TNFa、TNFi3、TNFR2、 TRADD、FADD、半胱天冬酶-8、TNF受體相關(guān)因子(TRAF)、TRAF2、受體互作蛋白(RIP)、Hsp90、 Cdc37、IKK α、ΙΚΚβ、NEMO、kB抑制劑(IkB)、NF_kB、NF-kB必需調(diào)節(jié)物、凋亡信號調(diào)節(jié)性 激酶-1 (aSMase)、中性神經(jīng)磷脂酶(nSMase)、ASKl、組織蛋白酶-B、生發(fā)中心激酶(GSK)、 GSK-3、死亡結(jié)構(gòu)域蛋白相關(guān)因子(FADD)、中性神經(jīng)磷脂酶活化相關(guān)因子(FAN)、FLIP、 JunD, NF-kB激酶抑制劑(IKK)、MKK3、MKK4、MKK7、IKK γ、有絲分裂原活化的蛋白激酶/ Erk 激酶激酶(MEKK)、MEKKl、ΜΕΚΚ3、NIK、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、PKC- ζ、RelA, Τ2Κ、TRAFU TRAF5、死亡效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(DED)、死亡結(jié)構(gòu)域(DD)、死亡誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物 (DISC)、凋亡蛋白抑制劑(IAP)、c-Jim N-末端激酶(JNK)、有絲分裂原活化的蛋白激酶 (MAPK)、磷酸肌醇-30H 激酶(PI3K)、蛋白激酶 A(PKA)、PKB、PKC、PLAD, PTEN、rel 同源結(jié) 構(gòu)域(RHD)、真正令人感興趣的新基因(RING)、應(yīng)激激活的蛋白激酶(SAPK)、TNF α轉(zhuǎn)化酶 (TACE)、死亡結(jié)構(gòu)域蛋白沉默子(SODD)和TRAF相關(guān)的NF_kB活化劑(TANK)。關(guān)于這些優(yōu) 選的靶，參考W004046189、W004046186和W004046185 (通過引用結(jié)合到本文中)，這些文獻(xiàn) 為如何選擇用于靶向胞內(nèi)靶的抗體單可變結(jié)構(gòu)域提供了指引。本發(fā)明尤其涉及TNFRl拮抗劑，其為如本文所述配制的域抗體，并涉及其在制備 用于治療、抑制或預(yù)防肺部炎癥和/或呼吸道疾病例如COPD或哮喘的藥物中的用途。還提供本文所述用于肺部傳遞的組合物，其包含結(jié)合IL-13的分子例如dAb，例如 用于治療哮喘。這些dAb的實例描述于例如W02007/085815，在本文也稱為D0M10-275-78 和 D0M10-275-78。本發(fā)明進(jìn)一步提供本文所述的用于肺部傳遞的組合物，其包含結(jié)合IL-13的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，例如用于治療哮喘，其具有與圖12b (Dom 10-53-474)或圖12c (Dom 10-275-78)中公開的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者其與圖12b或圖12c中公開的 氨基酸序列具有例如80%的同一性，例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或 97% 的同一性。本發(fā)明進(jìn)一步提供本文所述的用于肺部傳遞的組合物，其包含結(jié)合IL-IRl的免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，例如用于治療炎性病癥，例如肺部炎癥或肺病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎， 并具有與圖12d(Dom 4-130-202)或圖12e(Dom 4-130-201)中公開的氨基酸序列相同的 氨基酸序列，或者其與圖12d或圖12e中公開的氨基酸序列具有例如80%的同一性，例如 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或 97%的同一性。還提供用于肺部傳遞的本文所述組合物，其包含與Dom4-130-202的氨基酸序列 (示于圖12d)至少97%相同的氨基酸序列。還提供本文所述用于肺部傳遞的組合物，其包含與Dom4-130-202的氨基酸序列 (示于圖12e)至少98%相同的氨基酸序列。還提供本文所述用于肺部傳遞的組合物，例如用于治療癌癥，所述組合物包含結(jié) 合VEGF的分子，例如dAb，例如W02007080392和W02007066106中的任何實例。本發(fā)明進(jìn)一步提供本文所述的用于肺部傳遞的組合物，其包含結(jié)合VEGF的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，例如用于治療癌癥，其具有與圖14中公開的氨基酸序列相同的氨 基酸序列，或者其與圖14中公開的氨基酸序列具有例如80%的同一性，例如85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或 97%或 98%、99% 的同一性。還提供本文所述的用于肺部傳遞的組合物，其包含抗VEGF免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含的氨基酸序列與D0M15-26-593的氨基酸序列(示于圖14a)至少97% 相同。還提供本文所述的用于肺部傳遞的組合物，其包含抗VEGF免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含的氨基酸序列與D0M15-26-593的氨基酸序列(示于圖14a)至少97% 相同，且其還包含抗體恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供本文所述的用于肺部傳遞的組合物，其包含抗VEGF免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含的氨基酸序列選自D0M15-26-593的氨基酸序列(示于圖14a) 和D0M15-26-593-Fc融合蛋白的氨基酸序列(DMS1529 ；示于圖14i)。本發(fā)明的組合物尤其適于直接傳遞至肺，因此所述組合物可用于治療、抑制、預(yù)防 或診斷肺或呼吸道病癥或疾病，例如在傳遞部位或接近傳遞部位。然而，所述組合物雖然能夠首先傳遞至肺，但卻可以用于治療機(jī)體其它部分的疾 病，例如系統(tǒng)疾病。這是因為組合物首先被傳遞至肺，隨后可能被吸收入系統(tǒng)循環(huán)，因此能 夠治療肺病之外的疾病。例如，結(jié)合GLP受體的分子可傳遞至肺，這些分子可用于治療諸如 糖尿病或肥胖的疾病。這些分子的實例包括在W02006/059106中所述那些分子，以及連接 至albudab的毒蜥外泌肽-4的分子(在本文被描述為毒蜥外泌肽4 (G4Q 3D0M^i-14融合 蛋白(DAT0115))，或任何與datOl 15氨基酸序列具有例如80%同一性(例如85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%、98%或99%同一性)的分子?？梢允褂帽景l(fā)明的藥物、組合物以及制劑和方法治療、抑制或預(yù)防的呼吸道病癥 或疾病包括肺部炎癥、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、過敏性肺炎、帶有嗜酸粒細(xì)胞增多的 肺部浸潤、環(huán)境性肺病、肺炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化、間質(zhì)性肺病、原發(fā)性肺高血壓、肺血 栓栓塞、胸膜疾病、縱隔疾病、橫隔膜疾病、肺換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫停、急性呼吸 窘迫綜合征、間皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主疾病、肺癌、變應(yīng)性鼻炎、過敏、石綿沉著病、曲霉腫、曲霉病、支氣管擴(kuò)張、慢性支氣管炎、肺氣腫、嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎、特發(fā) 性肺纖維化、侵襲性肺炎球菌疾病、流感、非結(jié)核性分枝細(xì)菌、胸腔積液、肺塵癥、肺囊蟲病 (pneumocytosis)、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著癥、肺炭疽、肺水腫、肺栓塞、肺部炎癥、 肺組織細(xì)胞增多病X、肺高血壓、肺諾卡菌病、肺結(jié)核、肺靜脈閉塞性疾病、類風(fēng)濕性肺病、肉 樣瘤病、Wegener氏肉芽腫病和非小細(xì)胞肺癌。因此，本發(fā)明提供本文所述的用于肺部傳遞的組合物，其包含免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域結(jié)合TNFR1，并具有與圖1或圖13中公開的氨基酸序列相同的氨基酸序 列，或者其與圖1或圖13中公開的氨基酸序列具有例如80%的同一性，例如85%、86%、 87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%^； 97%的同一性。本發(fā)明還提供本文所述的用于肺部傳遞的組合物，其包含抗TNFCI受體1型 (TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含與D0Mlh-131-206的氨基酸序列 (示于圖1)至少93%相同的氨基酸序列。本發(fā)明還提供本文所述的用于肺部傳遞的組合物，其包含抗TNFa受體1型 (TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含與DOMlh-131-511的氨基酸序列 (示于圖1)至少95%相同的氨基酸序列?？捎糜诒景l(fā)明的組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與本文公開的抗TNFRl dAb的氨基酸序列 的差異不超過25個氨基酸位置，并具有與本文公開的抗TNFRl dAb的CDRl序列具有至少 50%同一性的⑶Rl序列?？捎糜诒景l(fā)明組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與本文公開的抗TNFRl dAb的氨 基酸序列的差異不超過25個氨基酸位置，并具有與本文公開的抗TNFRl dAb的CDR2序列 具有至少50%同一性的⑶R2序列?？捎糜诒景l(fā)明的組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與本文公開的抗TNFRl dAb 的氨基酸序列的差異不超過25個氨基酸位置，并具有與本文公開的抗TNFRl dAb的CDR3 序列具有至少50%同一性的⑶R3序列?？捎糜诒景l(fā)明的組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與本文公開的抗TNFRl dAb 的氨基酸序列的差異不超過25個氨基酸位置，并具有分別與本文公開的抗TNFRl dAb的 ⑶Rl或⑶R2序列具有至少50%同一性的⑶Rl序列和⑶R2序列?？捎糜诒景l(fā)明組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與本文公開的抗TNFRl dAb的氨 基酸序列的差異不超過25個氨基酸位置，并具有分別與本文公開的抗TNFRl dAb的CDR2 或⑶R3序列具有至少50%同一性的⑶R2序列和⑶R3序列?？捎糜诒景l(fā)明的組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與本文公開的抗TNFRl dAb 的氨基酸序列的差異不超過25個氨基酸位置，并具有分別與本文公開的抗TNFRl dAb的 ⑶Rl或⑶R3序列具有至少50%同一性的⑶Rl序列和⑶R3序列。
可用于本發(fā)明組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與本文公開的抗TNFRl dAb的氨 基酸序列的差異不超過25個氨基酸位置，并具有分別與本文公開的抗TNFRl dAb的CDR1、 ⑶R2或⑶R3序列具有至少50%同一性的⑶Rl序列、⑶R2序列和⑶R3序列。可用于本發(fā)明組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有與本文公開的抗TNFRl dAb的CDRl序列 具有至少50%同一性的⑶Rl序列?？捎糜诒景l(fā)明的組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有與本文公開的抗TNFRl dAb的CDR2序 列具有至少50%同一性的⑶R2序列。可用于本發(fā)明的組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有與本文公開的抗TNFRl dAb的CDR3序 列具有至少50%同一性的⑶R3序列?？捎糜诒景l(fā)明組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有分別與本文公開的抗TNFRl dAb的CDRl 和⑶R2序列具有至少50%同一性的⑶Rl和⑶R2序列。可用于本發(fā)明組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有分別與本文公開的抗TNFRl dAb的CDR2 和⑶R3序列具有至少50%同一性的⑶R2和⑶R3序列?？捎糜诒景l(fā)明的組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu) 域，其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有分別與本文公開的抗TNFRl dAb的 CDRl和CDR3序列具有至少50%同一性的CDRl和CDR3序列。可用于本發(fā)明組合物的域抗體可以包含結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 其中結(jié)合TNFRl的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有分別與本文公開的抗TNFRl dAb的CDRl、 CDR2和CDR3序列具有至少50%同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列?？捎糜诒景l(fā)明肺部傳遞組合物的多肽、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和拮抗劑可以抵 抗以下的一種或多種絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、基質(zhì) 金屬蛋白酶、羧肽酶(例如羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋 白酶、彈性蛋白酶、溶菌酶(leukozyme)、胰酶、凝血酶、纖溶酶、組織蛋白酶(例如組織蛋白 酶G)、蛋白酶(例如蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶幻、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、半胱天 冬酶(例如半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶9、半胱天 冬酶12、半胱天冬酶1 、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶、梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶、 菠蘿蛋白酶和分離酶。在具體的實施方案中，所述蛋白酶為胰蛋白酶、彈性蛋白酶或溶菌酶 (leucozyme)。所述蛋白酶還可以由生物提取物、生物勻化物或生物制備物提供。在一個實 施方案中，所述蛋白酶為存在于痰、粘液(例如胃粘液、鼻涕、支氣管粘液)、支氣管肺泡灌 洗液、肺勻化物、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液中的蛋白酶。在一個實施方案中，所述蛋 白酶為在眼睛和/或淚液中存在的蛋白酶。這種存在于眼睛中的蛋白酶的實例包括半胱天 冬蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、解整合素樣金屬蛋白酶(ADAM)和具有血 小板反應(yīng)蛋白基序的ADAM、蛋白體、組織纖溶酶原激活物、分泌酶、組織蛋白酶B和D、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、絲氨酸蛋白酶rassi、遍在蛋白蛋白酶體途徑(UPP)。在一個實施方案 中，所述蛋白酶為非細(xì)菌蛋白酶。在一個實施方案中，所述蛋白酶為動物(例如哺乳動物， 例如人)蛋白酶。在一個實施方案中，所述蛋白酶為GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如在 人中存在的GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶。本文列出的這樣的蛋白酶還可以用于本文所述 方法，包括將文庫所有組成部分與蛋白酶接觸。—方面，本發(fā)明的組合物包含蛋白酶抗性的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述 可變結(jié)構(gòu)域在以下條件下抗蛋白酶與i)至少10yg/ml濃度(c)的蛋白酶于37°C溫育 至少1小時的時間⑴時；或者與(ii)至少40yg/ml濃度(c’ )的蛋白酶于30°C溫育至 少1小時的時間(t)時。在一個實施方案中，蛋白酶(例如胰蛋白酶)對可變結(jié)構(gòu)域的比 率(mol/mol)為8，000-80，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域，例如當(dāng)C為10 μ g/ml時，所述比率為 800-80, 000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域；或者當(dāng)C或C’為100 μ g/ml時，所述比率為8，000-80, 000 蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，蛋白酶(例如胰蛋白酶)對可變結(jié)構(gòu)域的比率 (基于重量/重量，例如yg/yg)為16，000-160，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域，例如當(dāng)C為 10 μ g/ml時，所述比率為1，600-160，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域；或者當(dāng)C或C’為IOOyg/ ml時，所述比率為1，6000-160，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述濃度(c 或c’)為至少100或1000 μ g/ml蛋白酶。在一個實施方案中，所述濃度(c或c’)為至少 100或1000 μ g/ml蛋白酶。參考本文關(guān)于在用肽或多肽的庫或文庫工作時適于所用蛋白 質(zhì)水解活性的條件的描述(例如重量/重量參數(shù))。這些條件可用于確定某種具體的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抗性的條件。在一個實施方案中，時間(t)為或約為1、3或 M小時或過夜(例如約12-16小時)。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域在條件(i)下是抗 性的，且濃度(c)為或約為10或100 μ g/ml蛋白酶，時間⑴為1小時。在一個實施方案 中，可變結(jié)構(gòu)域在條件(ii)下是抗性的，且濃度(c’)為或約為40 μ g/ml蛋白酶，時間⑴ 為或約為3小時。在一個實施方案中，所述蛋白酶選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶、溶菌酶和胰 酶。在一個實施方案中，所述蛋白酶為胰蛋白酶。在一個實施方案中，所述蛋白酶為在痰、 粘液(例如胃粘液、鼻涕、支氣管粘液)、支氣管肺泡灌洗液、肺勻化物、肺提取物、胰腺提取 物、胃液、唾液或淚液或眼睛中存在的蛋白酶。在一個實施方案中，所述蛋白酶為在眼睛和/ 或淚液中存在的蛋白酶。在一個實施方案中，所述蛋白酶為非細(xì)菌蛋白酶。在一個實施方 案中，所述蛋白酶為動物(例如哺乳動物，例如人)蛋白酶。在一個實施方案中，所述蛋白 酶為GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如在人中存在的GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶。本文 列出的這些蛋白酶還可以用于本文所述的方法，包括將文庫所有組成部分與蛋白酶接觸。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域抗胰蛋白酶和/或至少一種選自以下的其它蛋白 酶彈性蛋白酶、溶菌酶和胰酶。例如，抗性針對胰蛋白酶和彈性蛋白酶；胰蛋白酶和溶菌 酶；胰蛋白酶和胰酶(pacreatin)；胰蛋白酶、彈性蛋白酶和溶菌酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶 和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶和溶菌酶；或者胰蛋白酶、胰酶和溶菌酶。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域在條件(i)或(ii)下溫育時展示在噬菌體上，例 如以106-1013(例如IO8-IO12)復(fù)制單位(感染性病毒體)的噬菌體文庫大小。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域在于條件(i)或(ii)下溫育后特異性結(jié)合其靶， 例如使用BiaCore TM或ELISA進(jìn)行評價，例如噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA。在一個實施方案中，本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合A蛋白或L蛋白。在一個實施方案中，在條件(i)或(ii)下溫育后存在對A或L蛋白的特異性結(jié)合。在一個實施方案中，本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域例如在條件(i)或(ii)下溫育后，在 ELISA (例如噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA)中可具有至少0. 404的OD45tl讀數(shù)。在一個實施方案中，本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域在凝膠電泳中展示(基本上)單一條帶， 例如在條件⑴或(ii)下溫育后。本文所述的組合物包含(a)多肽，例如域抗體(dAb)，和(b)生理學(xué)上可接受的緩 沖液，例如具有約4至約8的pH范圍，并且其粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含 1. 2% (重量/體積)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度的緩沖液；其中所述組合 物包含液滴，在所述組合物中存在的液滴中，約40%或以上(例如50%或以上)的液滴小 于約6微米，例如約1微米至約6微米的范圍，例如小于約5微米，例如約1微米(或約2 微米)至約5微米。對于深肺傳遞，有益的粒徑可為約1微米至約3微米。可按照本發(fā)明使用的適宜的緩沖液為生理學(xué)上可接受的緩沖液，例如可安全給予 到肺的緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽或組氨酸緩沖液。pH范圍在一個實施方案中，所述緩沖液的pH優(yōu)選在約4至約8的范圍內(nèi)，例如 約7至約7. 5，或者約5至約6。在某些實施方案中，緩沖液的粘度優(yōu)選約等于約2%至約10% PEG 1000在含 1.2% (重量/體積)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度。粘度可以使用本領(lǐng)域已 知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測，例如錐板法或磁珠微流變儀法。組合物中存在的液滴的大小可以使用用于檢測粒徑的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測，例如使用 Malvern激光掃描裝置或者例如使用多級沖擊采樣器，例如Dekatie沖擊采樣器裝置或 Malple沖擊采樣器裝置?？蓪⒗缣砑觿┘尤胫辆彌_液，以改變粘度，有用的添加劑可為例如聚乙二醇 (PEG)，例如PEG 1000，或糖，例如蔗糖、甘露糖，其它添加劑可以包含例如穩(wěn)定劑，例如洗滌 劑，例如吐溫。用于如本文所述的直接肺部傳遞的制劑的多肽，例如dAb，可以有用地為例如抗 TNFRl結(jié)合劑，例如結(jié)合抗TNFRl的dAb，例如，其可以為顯著拮抗性的抗TNFRl dAb，例如WO 2007/049017(其內(nèi)容和講述具體地通過引用結(jié)合到本文中)中公開的拮抗性抗TNFRldAb， 例如其可以具有如在WO 2007/049017的SEQ ID 1_650的任一個中描述的編碼序列，所有 這些序列都具體地通過引用結(jié)合到本文中。這樣的抗TNFRl dAb組合物可以為治療呼吸道 疾病例如COPD和哮喘的有效治療劑。對組合物的多肽例如dAb還可能有利的是具有高解鏈溫度(Tm)。例如已經(jīng)表明， 具有較高解鏈溫度(Tm)的dAb更加抗剪切力、升高的溫度和長期儲存穩(wěn)定性誘導(dǎo)的聚集。 剪切力和熱應(yīng)力在霧化過程中對誘導(dǎo)聚集形成起顯著作用，所以選擇具有高Tm的dAb是有 利的。實現(xiàn)此目標(biāo)的一種方法應(yīng)是產(chǎn)生dAb的噬菌體展示文庫，并使用蛋白酶(例如胰蛋 白酶)選擇和鑒定抗所述酶的作用的分子。通過該方法產(chǎn)生的蛋白酶抗性dAb具有較高的 解鏈溫度，這已經(jīng)歸因于增加蛋白的核心穩(wěn)定性的dAb序列的改變，使得所述分子的肽骨 架不大容易被所述酶水解。蛋白酶抗性域抗體和選擇它們的方法例如進(jìn)一步描述于USSN60/933，632(其教 導(dǎo)通過引用結(jié)合到本文中)。
dAb的Tm的升高還可以例如通過在選擇過程中加熱dAb實現(xiàn)。因此，當(dāng)本發(fā)明的 組合物包含域抗體時，dAb具有約例如55°C至約例如90°C (例如約80°C至約例如90°C )的 Tm可能是理想的。Tm可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如差異掃描量熱法(DFC)來確定。可用于本文所述組合物的多肽濃度(例如dAb)可以在約lmg/ml直至約40mg/ml 的范圍內(nèi)。例如dAb的較高濃度，例如約20mg/ml至約40mg/ml，對于改善向肺的傳遞可能 是有益的。在以下的實施例中，僅通過舉例來進(jìn)一步描述本發(fā)明 實施例以下詳述了針對人TNFRl的域抗體的前導(dǎo)分子的選擇和表征產(chǎn)生的域抗體來源于Domantis的噬菌體文庫。對被動吸附的人TNFRl的可溶性 選擇和淘選按照相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)Domantis方法進(jìn)行。人TNFRl作為可溶性重組蛋白由R&D系 統(tǒng)(目錄號636-R1-025/CF)或P印rotech(目錄號310-07)購買，或者直接使用(在被動 選擇的情況下)，或者在使用經(jīng)伯胺的偶聯(lián)生物素化之后，繼之以生物測定質(zhì)控其活性，并 通過質(zhì)譜分析其分子量和生物素化程度。通常，利用降低之后每一輪的抗原水平進(jìn)行3輪 選擇。通過噬菌體ELISA篩選關(guān)于抗TNFRl結(jié)合克隆的存在情況的選擇輸出。DNA分離 自這些噬菌體選擇，并亞克隆入表達(dá)載體，用于表達(dá)可溶性dAb片段?？扇苄詃Ab片段在96 孔板中表達(dá)，使用采用抗c-myc檢測的直接結(jié)合ELISA，或者使用鏈霉抗生物素蛋白/生物 素化TNFRl BIAcore 芯片的BIAcore ，使用上清液篩選抗TNFRl結(jié)合dAb的存在情況，并 按照解離速率排列。下述的前導(dǎo)分子來源于親代dAb，稱為DOMlh-131。該分子在使用60nM生物素化 抗原進(jìn)行3輪選擇后選自噬菌體展示文庫。鏈霉抗生物素蛋白或中性鏈親和素包被的Dyna 珠交替作為每輪選擇的捕獲試劑，以防止選擇針對鏈霉抗生物素蛋白或中性鏈親和素的結(jié) 合劑。據(jù)MRC-5成纖維細(xì)胞/IL-8釋放細(xì)胞測定檢測，前導(dǎo)分子DOMlh-131在該階段的效 力在低ymol范圍內(nèi)。依據(jù)BIAcore 測定的結(jié)合動力學(xué)通常展示出快速結(jié)合/快速解離 速率。作為C-末端myc標(biāo)記的單體的該DOMlh-131前導(dǎo)分子的大腸桿菌(E. coli)表達(dá)水 平在8mg/l的區(qū)域內(nèi)。前導(dǎo)分子的親和成熟將DOMlh-131進(jìn)行進(jìn)一步的親和成熟，以產(chǎn)生具有較高效力和改善的生物物理特 征的突變體(參見圖1的DOMlh-131衍生的前導(dǎo)分子的氨基酸序列)。在使用錯配PCR 聚合酶(Genemorph II，Stratagene)產(chǎn)生錯配文庫(每個dAb序列的氨基酸改變數(shù)平均 為1，文庫大小為8X107)后，利用這些錯配文庫進(jìn)行7輪選擇。該策略使得分離出克隆 D0Mlh-131-8，依據(jù)MRC-5測定檢測，該分子中的4個氨基酸改變(1個在構(gòu)架1 (FRl)中，1 個在⑶Rl中，1個在⑶R3中，1個在FR4中)產(chǎn)生了約100倍的效力改善(約^M)。為了進(jìn)一步改善效力，單個氨基酸位置通過寡聚物引導(dǎo)的誘變在由錯配前導(dǎo)分 子共有信息提示的關(guān)鍵位置多樣化。在該過程中，通過BIAcore 篩選分離改進(jìn)形式的 D0Mlh-131-8克隆D0Mlh-131-24(在修正之前最初命名為D0Mlh_131-8_2)，其具有單個 K94R氨基酸突變(按照Kabat進(jìn)行氨基酸編碼)和200_300ρΜ的RBA效力。
基于該前導(dǎo)分子和由其獲得的NNS文庫產(chǎn)生進(jìn)一步的錯配文庫，并使用熱處理對 其進(jìn)行3輪噬菌體選擇(關(guān)于方法參見Jespers L等人，Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004 年 9 月；22(9) :1161-5)。在該選擇過程中，合并文庫，來源于第二輪選擇的克隆產(chǎn)生dAb，例 如D0Mlh-131-53，其熱穩(wěn)定性更好。推測這些克隆應(yīng)具有更好的生物物理特征。將克隆 D0Mlh-131-53中的某些構(gòu)架突變種系化，獲得克隆D0Mlh-131-83。以該克隆為基礎(chǔ)使用 如上所述的噬菌體展示選擇或使用采用乳濁液的體外區(qū)室化技術(shù)，經(jīng)由寡聚物引導(dǎo)的單個 ⑶R誘變進(jìn)一步多樣化。噬菌體展示策略產(chǎn)生前導(dǎo)分子DOMlh-131-117和DOMlh-131-151。 體外區(qū)室化技術(shù)產(chǎn)生DOMlh-131-511。在該階段，以生物物理測定和生物學(xué)測定比較這3個前導(dǎo)分子，DOMlh-131-511為 具有最佳特性的分子。此外，在胰蛋白酶或溶菌酶存在下，測試這些分子對蛋白酶剪切的抗 性。溶菌酶(leucozyme)由囊性纖維化患者的合并痰液組成，其含有高水平的彈性蛋白酶 和其它蛋白酶，用其代表肺病的體內(nèi)狀況。該數(shù)據(jù)表明，所有3種前導(dǎo)分子DOMlh-131-117、 DOMlh-131-151和DOMlh-131-511在胰蛋白酶或溶菌酶存在下都快速降解。該發(fā)現(xiàn)使人們 對DOMlh-131-511在患者體內(nèi)持續(xù)存在更為擔(dān)心，并開發(fā)了選擇提高對胰蛋白酶抗性的策 略。推測這樣改善的胰蛋白酶抗性，對所述分子的其它生物物理特性可能具有有益作用。 從根本上修改標(biāo)準(zhǔn)噬菌體的選擇方法，以允許在抗原選擇之前在蛋白酶存在下選擇。為此 工程改造新的噬菌體載體，其中缺失c-myc標(biāo)簽，以允許在胰蛋白酶存在下選擇，而不切割 離開噬菌體的展示的dAb。產(chǎn)生基于DOMlh-131-511的錯配文庫，并克隆入新的pD0M33載 體中。由該文庫產(chǎn)生的噬菌體母液用胰蛋白酶預(yù)處理，隨后加入蛋白酶抑制劑，以封閉胰 蛋白酶活性，然后在相關(guān)抗原上選擇。進(jìn)行4輪選擇。使用BIAcore 評價可溶性表達(dá)的 TNFRl結(jié)合dAb對TNFRl的結(jié)合能力(在有或沒有蛋白酶存在下)。這使得分離出兩種前 導(dǎo)分子D0Mlh-131-202和D0Mlh-131-206，由BIAcore 抗原結(jié)合實驗證實，它們的蛋白酶抗 性提高。值得指出的是，D0Mlh-131-202相比于DOMlh-131-511在CDR2中僅包含1個突變 (V53D，所有的氨基酸編碼都依據(jù)Kabat)，而D0Mlh-131_206僅包含兩個突變第一個突變 與D0Mlh-131-202相同(在CDR2中的V53D突變)，第二個突變?yōu)镕R3中的Y91H突變(參 見圖1)。FR3中的該Y91H突變確實出現(xiàn)在3-20人種系基因中，表明該殘基存在于人抗體 中。3個克隆DOMlh-131-511、D0Mlh-131-202和D0Mlh-131-206具有如圖1所示的氨基酸 序列。如下測定所述分子的活性D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和 D0M1H-131-206 結(jié)合人 TNFRl 的 BIAcore 結(jié) 合親和性評價。通過BIAcore 分析評價 D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和 D0M1H-131-206 結(jié) 合人重組大腸桿菌表達(dá)的人TNFRl的結(jié)合親和力。使用生物素化人TNFRl進(jìn)行分析。將 1400RU的生物素化TNFRl包被至鏈霉抗生物素蛋白(SA)芯片。使用溫和的酸洗脫條件將 表面再生回基線。使用50μ 1/分鐘的流速于限定的濃度使D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和D0M1H-131-206通過該表面。在BIAcore 3000機(jī)器上進(jìn)行工作，并分析數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)擬 合為結(jié)合的1 1模型。對于所有測試分子結(jié)合數(shù)據(jù)都良好地擬合為1 1模型。所有的 Kd值都由k。n和k。ff速率計算。于25°C實施BIAcore 運行。
以下的數(shù)據(jù)由3個獨立實驗產(chǎn)生。在每個實驗中，結(jié)果都使用kd的最高dAb濃度 和較低的ka濃度通過平均眾多擬合來計算。數(shù)據(jù)以結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(在括號中) 提供(表1)。表1 :D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和 D0M1H-131-206
結(jié)合人 TNFRl 的 BIAcore 數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種包含以下物質(zhì)或由以下物質(zhì)組成的組合物(a)多肽和(b)生理學(xué)上可接受的 緩沖液，其中所述組合物包含液滴，并且所述組合物中存在的液滴中，約40%或以上的液滴 小于約6微米。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物中存在的液滴中，約40%或以上液滴的大小 為約1微米至約6微米。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述組合物中存在的液滴中，約40%或以上的液滴 小于約5微米。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的組合物，其中所述多肽包含多肽結(jié)構(gòu)域或由多肽結(jié)構(gòu)域組 成，所述多肽結(jié)構(gòu)域例如為單體。
5.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述多肽包含免疫球蛋白分子或由免疫球蛋 白分子組成。
6.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述多肽包含至多150個氨基酸或由至多 150個氨基酸組成。
7.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述多肽包含域抗體(dAb)或由域抗體 (dAb)組成。
8.權(quán)利要求1-4中任一項或權(quán)利要求6的組合物，其中所述多肽包含非Ig骨架或由非 Ig骨架組成，所述非Ig骨架例如為親和體。
9.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述多肽例如域抗體具有約55°C至約90°C 的解鏈溫度(TM)。
10.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述緩沖液具有約4至約8的PH范圍。
11.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述緩沖液的粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含1. 2% (重量/體積)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度。
12.一種包含以下物質(zhì)或由以下物質(zhì)組成的組合物(a)多肽和(b)生理學(xué)上可接受的 緩沖液，其中所述緩沖液具有約4至約8的pH范圍，并且其粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含1. 2% (重量/體積)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述多肽包含多肽結(jié)構(gòu)域或由多肽結(jié)構(gòu)域組成，例如 其中所述多肽結(jié)構(gòu)域作為單體存在。
14.權(quán)利要求12或13的組合物，其中所述多肽包含免疫球蛋白分子或由免疫球蛋白分 子組成。
15.權(quán)利要求12-14中任一項的組合物，其中所述多肽包含至多150個氨基酸或由至多 150個氨基酸組成。
16.權(quán)利要求12-15中任一項的組合物，其中所述多肽包含域抗體(dAb)或由域抗體 (dAb)組成。
17.權(quán)利要求12-13或15的組合物，其中所述多肽包含非Ig的骨架或由非Ig骨架組 成，所述非Ig骨架例如為親和體。
18.權(quán)利要求12-17中任一項的組合物，其中所述多肽具有約55°C至約90°C的解鏈溫 度( )。
19.權(quán)利要求12-18中任一項的組合物，其中在所述組合物中存在的液滴中，約40%或 以上的液滴小于約6微米。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中在所述組合物中存在的液滴中，約40%或以上的液滴 大小為約1微米至約6微米。
21.權(quán)利要求19或20的組合物，其中在所述組合物中存在的液滴中，約40%或以上的 液滴小于約5微米。
22.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖 液、檸檬酸鹽緩沖液或組氨酸緩沖液，并任選地進(jìn)一步包含(a)增加粘度的添加劑和/或 (b)穩(wěn)定劑。
23.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述多肽例如dAb可以結(jié)合靶分子，例如在 肺組織中存在的靶分子。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述靶分子選自TNF受體、TNFRUIL-U IL-1R、 IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、 IL-13Rα 1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、 IL-25、CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、 FcERU TGFb, CCL2、CCL18、CEA, CR8、CTGF, CXCL12 (SDF-I)、凝乳酶、TOF、弗林蛋白酶、內(nèi)皮 素-1、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(例如嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子_2、 嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM-U I COS, IgE、IFNa、1_309、整聯(lián)蛋白、L-選擇 素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMPs、嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X-40、PARC、PD-I、 RANTES, SCF、SDF-I、唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-UTNF, TNFR1、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α 4 β 7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、 ανβ6、ανβ8、οΜΕΤ 禾口 CD8。
25.權(quán)利要求M的組合物，其中所述多肽為抗TNF受體結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述抗TNF受體dAb選自Domlh-131、Domlh_131_8、 Dom lh-131-24、Dom lh-131-53、Domlh-131-70、Dom lh-131-83、Dom lh-131-117、 Dom lh-131-151、Dom lh-131-511、Dom lh_131_202、Dom lh_131_206、Domlh-131-201、 lh-131-203、lh-131-204 和 lh_131_205。
27.權(quán)利要求沈的組合物，其中所述抗-TNF受體dAb包含與D0Mlh-131-206的氨基酸 序列(示于圖1)至少93%相同的氨基酸序列。
28.權(quán)利要求沈的組合物，其中所述抗-TNF受體dAb包含與DOMlh-131-511的氨基酸 序列(示于圖1)至少95%相同的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求M的組合物，其中所述dAb結(jié)合IL-13，并包含例如與圖12b(Dom 10-53-474)或圖12c (Dom 10-275-78)中公開的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者其包 含與在圖12b或圖12c中公開的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列，例如85^^86%、 87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%^； 97%的同一性。
30.權(quán)利要求M的組合物，其中所述dAb結(jié)合IL-1R1，并包含例如與在圖12d(Dom 4-130-202)或圖12e(Dom 4-130-201)中公開的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者其包 含與在圖12d或圖12e中公開的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列，例如85^^86%、 87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%^； 97%的同一性。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述dAb包含與Dom4-130-202的氨基酸序列(示于 圖12d)至少97%相同的氨基酸序列。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中所述dAb包含與Dom4-130-202的氨基酸序列(示于 圖12e)至少98%相同的氨基酸。
33.權(quán)利要求M的組合物，其中所述dAb結(jié)合VEGF，并包含例如與圖14中公開的氨基 酸序列相同的氨基酸序列，或者其包含與圖14中公開的氨基酸序列具有例如80%同一性 的序列，例如 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%的同一性。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述dAb包含與D0M15-26-593的氨基酸序列(示于圖 14a)至少97%相同的氨基酸序列。
35.權(quán)利要求33的組合物，其中所述dAb包含與D0M15-26-593的氨基酸序列(示于圖 14a)至少97%相同的氨基酸，且所述dAb還包含抗體恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域。
36.權(quán)利要求M的組合物，其中所述dAb結(jié)合IL-13，且包含例如與圖12b(Dom 10-53-474)或圖12c(Dom 10-275-78)中公開的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者所述 dAb包含與圖12b或圖12c中公開的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列，例如85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或 97% 的同一性。
37.權(quán)利要求23的組合物，其中所述多肽例如dAb可以結(jié)合系統(tǒng)靶分子，例如選自以下 的系統(tǒng)靶分子人或動物蛋白、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、用于酶的酶輔因子或DNA結(jié)合蛋 白，例如ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養(yǎng)素_1、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因 子、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-2、EX0dus-2、Ep0R、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞 生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子 _10、FLT3 配體、Fractalkine (CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、 GF-β 1、胰島素、IFN-Y、IGF-I, IGF-I I, IL-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8 (72 個氨基酸)、IL-8 (77 個氨基酸)、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13, IL-15、 IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、ΙΡ-10、角化細(xì)胞生長因子-2 (KGF-2)、 KGF、苗條蛋白、LIF、淋巴細(xì)胞趨化因子、苗勒氏管抑制物、單核細(xì)胞集落抑制因子、單核細(xì) 胞引誘蛋白、M-CSF、MDC (67 個氨基酸)、MDC (69 個氨基酸)、MCP-I (MCAF)、MCP-2、MCP-3、 MCP-4、MDC (67 個氨基酸)、MDC (69 個氨基酸)、MIG、MIP-I α、MIP-I β、ΜΙΡ-3 α、ΜΙΡ-3 β、 ΜΙΡ-4、髓樣祖細(xì)胞抑制因子-1 (MPIF-I)、ΝΑΡ-2、Neurturin、神經(jīng)生長因子、β -NGF, ΝΤ-3、 ΝΤ-4、制癌蛋白 M、PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4、RANTES, SDFl α、SDFl β、SCF、SCGF、 干細(xì)胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β 2、TGF-β 3、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF-α、 TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、GCP-2、GR0/MGSA、GR0-3、GR0-γ、HCC1、1-309、HER UHER 2, HER 3 和 HER 4、毒蜥外泌 肽和GLP-I。
38.權(quán)利要求13的組合物，其中所述dAb可以結(jié)合人白蛋白，且其連接至毒蜥外泌肽或 GLP分子。
39.權(quán)利要求13的組合物，其中多肽分子包含毒蜥外泌肽4(G4Q3D0M^i-14融合蛋白 (DAT0115)或與dat0115氨基酸序列具有例如80%同一性的任何分子，例如85%,90%, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同一性。
40.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑 或賦形劑。
41.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，所述組合物用于藥物。
42.權(quán)利要求1-40中任一項的組合物，所述組合物用于將多肽例如dAb傳遞至肺，或者 例如用于多肽的系統(tǒng)性傳遞。
43.權(quán)利要求1-40中任一項的組合物，所述組合物用于肺或呼吸道病癥或疾病的治 療、預(yù)防或診斷。
44.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述dAb是格式化dAb，例如其為dAb-Fc融合蛋白ο
45.權(quán)利要求1-40中任一項的組合物在制備用于治療、預(yù)防或診斷肺或呼吸道病癥或 疾病的藥物中的用途。
46.權(quán)利要求12的組合物在制備用于治療、預(yù)防或診斷深肺病癥或疾病的藥物中的用途。
47.權(quán)利要求12的組合物用于傳遞多肽至深肺組織的用途。
48.一種將所需分子傳遞給患者的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-40中任一項的組 合物直接給予到患者的肺。
49.一種治療、預(yù)防或診斷肺病或呼吸道疾病的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-40 中任一項的組合物直接給予到患者的肺組織。
50.權(quán)利要求35或36的方法，其中所述組合物以日劑量約5mg/Kg體重至約0.005mg/ Kg體重給予受治療者。
51.權(quán)利要求48-50中任一項的方法，其中所述組合物使用噴霧器、吸入器或鼻內(nèi)裝置 給予患者。
52.一種噴霧器、吸入器或鼻內(nèi)裝置，所述噴霧器、吸入器或鼻內(nèi)裝置裝有權(quán)利要求 1-40中任一項的組合物。
53.權(quán)利要求39的噴霧器、吸入器或鼻內(nèi)裝置用于將權(quán)利要求1-40的組合物傳遞至患 者的肺組織的用途。
54.一種生產(chǎn)藥物組合物的方法，所述藥物組合物用于例如治療、預(yù)防或診斷肺病癥或 疾病，所述方法包括混合(a)權(quán)利要求1-40中任一項的組合物和(b)藥學(xué)上可接受的載 體、稀釋劑或賦形劑。
55.一種生產(chǎn)多肽組合物的方法，所述多肽組合物用于例如治療、預(yù)防或診斷肺病癥或 疾病，所述方法包括混合(a)多肽和(b)生理學(xué)上可接受的緩沖液，所述緩沖液具有約4至 約8的pH范圍，并且其粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含1.2% (重量/體積)蔗 糖的50mM磷酸緩沖液中的溶液的粘度。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述多肽包含域抗體(dAb)或由域抗體(dAb)組成。
57.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-40的組合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)混合多肽和 生理學(xué)上可接受的緩沖液，然后(b)，使步驟(a)的多肽和緩沖液組合物通過噴霧器、吸入 器或鼻內(nèi)傳遞裝置。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述生理學(xué)上可接受的緩沖液具有約4至約8的pH范 圍，并且其粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含1.2% (重量/體積)蔗糖的50mM磷 酸緩沖液中的溶液的粘度。
59.一種生理學(xué)上可接受的緩沖液的用途，所述緩沖液用于制備多肽組合物，例如肺部 傳遞的多肽組合物，所述緩沖液具有約4至約8的pH范圍，并且其粘度約等于約2%至約10% PEG 1000在含1. 2% (重量/體積)蔗糖的50mM磷酸緩沖液中的溶液的粘度。
60.權(quán)利要求47的用途，其中所述多肽組合物包含域抗體(dAb)或由域抗體(dAb)組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及直接肺部傳遞多肽(例如域抗體)的方法，并涉及適于直接肺部傳遞的特定多肽組合物。本發(fā)明還涉及這樣的組合物在藥物中的用途，所述藥物例如用于治療和診斷肺病，例如用于治療慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
文檔編號C07K16/28GK102131827SQ200880127160
公開日2011年7月20日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日
發(fā)明者A·巴斯蘭, C·A·斯帕克斯, N·D·布魯伊斯 申請人:葛蘭素集團(tuán)有限公司