專利名稱：抗伸展的Ⅰ型鞘糖脂抗體、其衍生物以及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗伸展的I型鞘糖脂抗體(anti-extended type-Iglycosphingolipid antibody)及其在改善、治療或預(yù)防哺乳動物包括人類中由伸展的I型鞘糖脂不適當(dāng)?shù)幕钚曰虼x所引起的疾病或失調(diào)中的用途；在導(dǎo)致、引起或與所述伸展的I型鞘糖脂不適當(dāng)?shù)幕钚曰虼x相關(guān)的疾病或失調(diào)中的用途或在改善、治療或預(yù)防所述伸展的I型鞘糖脂不適當(dāng)?shù)幕钚曰虼x中的用途，例如在癌癥如結(jié)腸直腸癌或其它病理學(xué)中的用途。感興趣的抗體可用于治療目的或診斷目的。因此，還公開了包含感興趣的所述抗體及其衍生物的預(yù)防性、免疫治療性和診斷性組合物以及它們在預(yù)防或治療、或診斷哺乳動物包括人的疾病的方法中的用途，所述疾病由伸展的I型鞘糖脂(type-I glycosphingolipid)在細胞中和細胞上(如某些惡性細胞)不適宜的代謝和/或表達所引起的。
背景技術(shù)：
伸展的I型鞘糖脂是可能與例如某些惡性狀態(tài)相關(guān)的細胞表面分子。異常的糖基化已被注意到是許多癌癥類型的共同特征，Hakomori, PNAS 99 10231-10233,2002。一些用于人類癌癥的診斷的碳水化合物抗原攜有多聚乳糖胺結(jié)構(gòu)。多聚乳糖胺根據(jù)單元結(jié)構(gòu)通常被分為兩個類別。具有Gal β 1 — 3GlcNAc結(jié)構(gòu)的多聚乳糖胺被稱為I型鏈，具有Gal β 1 — 4GlcNAc結(jié)構(gòu)的被稱為II型鏈。在一些人類癌癥中發(fā)現(xiàn)的最常見的腫瘤相關(guān)抗原具有乳糖系列(lacto-series) II型鏈結(jié)構(gòu)，其通常是唾液酸化和/ 或巖藻糖基化的。I型鏈抗原在正常細胞和組織中大量存在，并偶爾與癌癥相關(guān)，Stroud et al.，JBC 266 :8439_8446，1991。例如，2 — 3唾液酸化的Lea抗原(由N 19-9抗體所定義的 CA 19-9抗原)是癌癥相關(guān)I型鏈抗原。然而，基于檢測那些I型抗原的癌癥診斷方法受到了高假陽性和/或高假陰性發(fā)生率的妨礙，參見例如美國專利號6，083，929和6，294, 523。針對伸展的I型鏈抗原產(chǎn)生了兩種小鼠單克隆抗體，NCC-ST421和IMH2。 NCC-ST421特異于Lea-Lea。所述NCC-ST421抗體使用人外周血白細胞作為效應(yīng)物強烈誘導(dǎo)針對多種人腫瘤細胞的抗體依賴性細胞胞毒性(ADCC)以及誘導(dǎo)具有人補體來源的補體依賴性胞毒性(CDC) ,Watanabe et al.，Cancer Res. 51 :2199_2204，1991。所述 1^3_1^3抗原被發(fā)現(xiàn)在人結(jié)腸癌細胞系Colo205中高表達。IMH2也是針對伸展的I型鏈而建立的?；?H-NMRa FAB-MS和酶降解研究，IMH2 結(jié)合 Leb-Lea, Ley-Le\ Leb 禾口 Ley, Stroud et al.，Eur. J. Biochem. 203 :577-586,1992。 IMH2在體外顯示出強淋巴細胞激活性以及補體依賴性殺傷Colo205細胞，以及在體內(nèi)抑制 Colo205 生長。IMH2與源自結(jié)腸、胰腺、肝和子宮內(nèi)膜的癌組織反應(yīng)。然而，正常的結(jié)腸顯示出與 IMH2無反應(yīng)性。正常的肝和胰腺在正常的肝細胞和胰島細胞中顯示出弱或高度受限的反應(yīng)性。免疫化學(xué)染色強度在子宮內(nèi)膜癌中要比在正常子宮內(nèi)膜中強得多，Ito et al. ,Cancer Res. 52 :3739-3745,1992。接種表達所述伸展的I型鏈抗原的人腫瘤細胞后，NCC-ST421和IMH2在裸鼠中均展現(xiàn)出對腫瘤生長的抑制，但是在不表達伸展的I型鏈抗原的腫瘤細胞中未發(fā)生生長的抑制。由于正常細胞上I型結(jié)構(gòu)的高豐度，迄今為止使用I型抗體用于診斷和/或治療目的是不可能的。常規(guī)的癌癥治療如化療和放療已經(jīng)在各種癌癥患者中顯示出一些優(yōu)勢。盡管常規(guī)療法中有抗腫瘤活性的益處，然而治療誘導(dǎo)的對正常組織的毒性可大大地降低癌癥患者的生活質(zhì)量。用于更好的抗腫瘤活性的劑量增強也受到限制。單克隆抗體使得能產(chǎn)生集中于腫瘤組織而非正常組織的靶向胞毒性的希望?？砷_發(fā)出對腫瘤細胞上表達的抗原具有高特異性的單克隆抗體(mAb)，其可以引發(fā)期望的抗腫瘤活性。產(chǎn)生完全人mAb的小鼠的開發(fā)更促進了 mAb的希望。一種此工具是 KM 小鼠，美國專利號 7，041，870 和 iTomizuka et al. ,Nat. Genet. 16:133-143,1997。在 KM 小鼠中，編碼免疫球蛋白的小鼠基因被失活并用人抗體基因置換。因此，KM小鼠表達完全人抗體。使用KM小鼠已經(jīng)成功開發(fā)了若干完全人抗體。例如，Motoki et al.開發(fā)了人IgG(KMTR2)，其引起TRAIL-R2的抗體依賴性寡聚化并啟動了有效凋亡信號傳導(dǎo)以及不依賴于宿主效應(yīng)物功能的腫瘤退化(Clin. Cancer Res. 11(8) :31洸_3135，2005 ；及見美國專利號 7，115，717 和 Imakire et al.， Int. J. Cancer 108 =564-570,2004) 特異于人白細胞抗原DR(HLA-DR)的完全人單克隆抗體HD8在體外產(chǎn)生抗體依賴性細胞胞毒性(ADCC)和補體依賴性胞毒性(CDC)并且延長了接種非霍奇金淋巴瘤細胞系的無免疫應(yīng)答小鼠的壽命，Tawara et al. , Cancer Sci.98 (6)921-928,2007ο另外，也報道了在KM小鼠中產(chǎn)生的針對碳水化合物抗原的兩種人IgM。HMMC-I 特異性識別新的0-聚糖結(jié)構(gòu)，與苗勒氏管(Mullerian duct)相關(guān)癌陽性反應(yīng)并對人子宮內(nèi)膜癌細胞系SNG-S顯示補體依賴性胞毒性，Nozawa et al.，Clin Cancer Res. 10 7071-7078,2004。另一種識別位于細胞膜上糖蛋白的人單克隆IgM HM0CC-1與卵巢癌反應(yīng) (Suzuki et al.，Gynecol. Oncol. 95 :290-298, 2004)。由于那兩種抗體是 IgM，那些抗體在癌癥治療中的應(yīng)用會受到分子大小和生產(chǎn)中局限的限制。發(fā)明概述本發(fā)明提供了特異性結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的新型人抗體以及其片段和衍生物。本發(fā)明包括所述抗體的可變重鏈和輕鏈的氨基酸序列以及它們相應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明的另一個實施方案包括感興趣抗體的互補性決定區(qū)(CDR)序列以獲得結(jié)合分子，所述結(jié)合分子包含一或多個CDR區(qū)或者CDR衍生區(qū)，保留了所述CDR所得自的親代分子(parent molecule)結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的能力。本發(fā)明的另一個實施方案包括載有本發(fā)明抗體序列的細胞系和載體。本發(fā)明的另一個實施方案涉及所述抗體在制備治療與伸展的I型鞘糖脂功能、代謝和表達相關(guān)的疾病和失調(diào)的藥物或組合物中的用途。本發(fā)明的另一個實施方案涉及所述抗體在診斷與非典型或不正常的伸展的I型鞘糖脂生物學(xué)和表達相關(guān)的失調(diào)中的用途。在針對伸展的I型鏈碳水化合物抗原的人單克隆抗體的開發(fā)中滿足了那些以及其它目的。例如，mAb GNX-8是源自KM小鼠的人IgGl。GNX-8對若干人結(jié)腸直腸癌細胞系顯示了⑶C和ADCC活性并在體內(nèi)抑制Colo205和DLD-I腫瘤生長。GNX-8與原發(fā)和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、胰腺癌以及肺癌反應(yīng)，但不與正常人組織和血細胞反應(yīng)。另外的特征和優(yōu)勢在本文中描述，并將通過下面的發(fā)明詳述而變清楚。發(fā)明詳述本發(fā)明不限于本文所描述的特定方法學(xué)、方案、多肽、多核苷酸、細胞系、載體或試劑，因為在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下可發(fā)生或者使用變化。此外，本文所使用的術(shù)語僅用于對特定的技術(shù)方案進行示例的目的而并非意圖限制本發(fā)明的范圍。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語以及任何首字母縮寫詞均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的相同含義。類似或等價于本文所述的那些的任何方法和材料均可用于實施本發(fā)明，而本文僅描述示例性的方法、裝置和材料。本文所提及的所有專利和出版物通過描述和揭示其中所報道的可用于本發(fā)明的蛋白、酶、載體、宿主細胞和方法學(xué)而以全文援引加入本文。然而，本文沒有內(nèi)容可被解釋為認(rèn)可前述發(fā)明的公開在本發(fā)明之前?！吧煺沟腎型鞘糖脂疾病”是一種病態(tài)(malady)、失調(diào)(disorder)、疾病、病理學(xué)、 病癥(condition)、異常(abnormality)等等，其特征在于與下述相關(guān)或由下述所引起伸展的I型鞘糖脂例如在細胞表面的不正常代謝、過表達或增加的水平。關(guān)于抗體多肽序列的措辭“基本上一致”可理解為抗體鏈與參考多肽序列展現(xiàn)出至少70%、80%、90(%、95(%或更高的序列相同性。關(guān)于核酸序列的所述術(shù)語可理解為核苷酸序列與參考核酸序列展現(xiàn)出至少約85%、90%、95%、97%或更高的序列相同性。術(shù)語“相同性，，或“同源性”可以是指候選序列中與其所對比的相應(yīng)序列的殘基相同的核苷酸堿基或氨基酸殘基的百分比，如果必要，在比對序列并引入缺口(gap)后以達成整個序列最大百分比相同性，且不將任何保守取代看做序列相同性的部分。N-端或者 C-端延伸或插入均不會被理解為降低相同性或同源性。用于序列比對的方法和計算機程序是可得的并且是本領(lǐng)域中熟知的。序列相同性可以用序列分析軟件來測量。短語和術(shù)語抗體、核酸或抗原的“功能性片段、變體、衍生物或類似物”和類似以及其形式是指與感興趣的全長抗體或抗原具有同樣性質(zhì)的生物學(xué)活性的化合物或分子。例如，抗伸展的I型鞘糖脂抗體的功能性片段或類似物是能夠結(jié)合伸展的I型鞘糖脂分子的一種，或者是結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的激動性(agonistic)或拮抗性抗體。一個例子是scFv 分子。對于伸展的I型鞘糖脂，其變體或衍生物是與天然產(chǎn)生的伸展的I型鞘糖脂不相同然而卻可以用于本發(fā)明目的的分子，如雖然與野生型伸展的I型鞘糖脂不相同但卻可以用作例如免疫原以產(chǎn)生選擇性結(jié)合野生型伸展的I型鞘糖脂的抗體?！叭〈弊凅w是在天然序列中具有至少一個氨基酸殘基被移除并用插入到同樣位置上的不同氨基酸置換的那些。取代可以是單一的，其中所述分子中僅有一個氨基酸被取代，或者可以是多重的，其中在同一分子中兩或多個氨基酸被取代。多個取代可以在連續(xù)的位點。一個氨基酸也可以被多個殘基置換，這種情況下此變體包含取代和插入?！安迦搿弊凅w是在天然序列中緊接著特定位置上的氨基酸插入一或多個氨基酸的那些。緊接著氨基酸是指連接到所述氨基酸的α-羧基或α-氨基官能團。“缺失”變體是在天然氨基酸序列中有一或多個氨基酸被移除的那些。通常，缺失變體會在分子的特定區(qū)域中有一或多個氨基酸被缺失。
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術(shù)語取代、插入和缺失變體也類似地用于核酸。適應(yīng)性免疫應(yīng)答有兩種主要的手段T淋巴細胞的細胞免疫應(yīng)答和分泌抗體的B 淋巴細胞的體液免疫應(yīng)答。B細胞表位可以是線性、連續(xù)的氨基酸，或者可以是構(gòu)象性的 (Protein Science (2005) 14, 246) 0相反，T細胞表位是裂解自抗原蛋白的短線性肽，所述抗原蛋白出現(xiàn)于主要組織相容性復(fù)合物(MHC)蛋白中，或者在人的情況中在人白細胞抗原 (HLA) I類或II類分子中。表位呈遞依賴于MHC-肽結(jié)合以及T細胞受體(TCR)相互作用。 MHC蛋白是高度多態(tài)性的，并且每個結(jié)合有限的一組肽。因此，宿主中存在的MHC等位基因的特定組合限制了感染過程中所識別的潛在表位的范圍。T細胞兩種基本類型通過⑶8和⑶4蛋白的表達區(qū)分，其分別決定了 T細胞是否識別由I類或II類分子呈遞的表位。CD4+T表位在包囊后由抗原遞呈細胞在膜結(jié)合囊泡(vesicle)中加工，在該處所述抗原由蛋白酶降解成肽片段，所述片段結(jié)合MHC II類蛋白。相反，CD8+T細胞一般識別從細胞內(nèi)表達的病毒或自體抗原，在細胞質(zhì)中由免疫蛋白酶體(immimoproteasome)裂解成短肽的蛋白。在裂解后，肽被與抗原加工關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)運蛋白 (TAP)轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)用于裝載到HLA I抗原上。⑶4+T (輔助性)細胞表位在推動對蛋白抗原的T細胞依賴性免疫應(yīng)答中至關(guān)重要。術(shù)語“抗體”以最寬的意義來使用，包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段或者攜帶一或多個CDR或CDR衍生序列的合成多肽，只要所述多肽展現(xiàn)出所期望的生物學(xué)活性?？贵w(Ab)和免疫球蛋白(Ig) 是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。一般來說，抗體被看作是具有給定的或已識別的特異性的 Ig0因此，抗體展現(xiàn)出對特異靶的結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏靶特異性的抗體樣分子。本發(fā)明的抗體可以是任何類的(例如IgG, IgE, IgM, IgD, IgA等)或者亞類(例如^‘^‘^‘、^‘^‘^、、化^等)(“型”和“類”和“亞型”和“亞類”在本文可互換使用)。天然或野生型(即得自群體的非人工操縱的成員)抗體和免疫球蛋白及多聚抗體的單體如IgA和IgM通常是大約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕 (L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成。每個重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，其后為數(shù)個恒定結(jié)構(gòu)域。每個輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域并在另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域?！胺侨斯げ倏v的”是指未經(jīng)過非自然手段如免疫或轉(zhuǎn)化處理以含有或表達外源抗原結(jié)合分子。野生型可以是指群體中所發(fā)現(xiàn)的最普遍的等位基因或物種或者是指得自非人工操縱的動物的抗體以及是指天然產(chǎn)生的等位基因或多態(tài)性，其天然出現(xiàn)且可在群體中保持，或者通過天然方式出現(xiàn)的變體或衍生物，如惡性腫瘤(與通過操縱形式如誘變、使用重組方法等以改變抗原結(jié)合分子的氨基酸獲得的相比)。該術(shù)語的使用是技術(shù)人員在語句、段落、概念、想法、主意等(該術(shù)語可在其中找到、或使用等)的背景下容易推斷及理解的。如本文所用，“抗伸展的I型鞘糖脂抗體”意指特異性結(jié)合人伸展的I型鞘糖脂的抗體或衍生多肽。術(shù)語“可變”在抗體可變結(jié)構(gòu)域上下文中是指相關(guān)分子的某部分，其在抗體之間在序列上具有廣泛差異并且在特定抗體對特定靶的特異性識別和結(jié)合中可以是完整的。然而，可變性并不均勻分布于抗體可變結(jié)構(gòu)域。所述可變性在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中均集中于3個稱作互補性決定區(qū)(CDR ；即CDR1、CDR2和CDR3)的區(qū)段，其也稱作高變區(qū)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域更加高度保守的部分稱作構(gòu)架(FR)區(qū)或序列。天然輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域每個均包含四個FR區(qū)，主要為β折疊構(gòu)型，通過三個CDR連接，其形成環(huán)連接所述β折疊結(jié)構(gòu)(在一些情況下形成部分的所述β 折疊結(jié)構(gòu))。每個鏈中的CDR保持在一起，經(jīng)常很接近，通過所述FR區(qū)以及與來自其它鏈的⑶R—起用于形成抗體的靶(表位或決定簇)結(jié)合位點(參見Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987))。一個⑶R如重鏈的⑶R3可單獨攜有特異性結(jié)合同族(cognate)表位的能力。除非另外指明，本文所用的免疫球蛋白氨基酸殘基的編號根據(jù)Kabat et al.的免疫球蛋白氨基酸殘基編號系統(tǒng)進行。術(shù)語“抗體片段”是指抗體的完整或全長鏈的部分，一般是靶結(jié)合或可變區(qū)。抗體片段的例子包括但不限于Fab、Fab,，F(xiàn)(ab, )2和Fv片段?！肮δ苄云巍被颉翱股煺沟腎型鞘糖脂抗體的類似物”是可以結(jié)合同族抗原的一種。如本文所用，功能性片段一般與“抗體片段”同義，并且對于抗體而言，可以指能結(jié)合同族抗原的片段如Fv、Fab、F(ab, )2等?！癋/’片段由一個重鏈和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以非共價締合的二聚體組成(VH-\二聚體)。每個可變結(jié)構(gòu)域的三個CDR的構(gòu)型相互作用以限定出所述二聚體在完整抗體中的靶結(jié)合位點?？傮w上，所述六個CDR賦予了完整抗體上的靶結(jié)合特異性。然而，即使單一可變結(jié)構(gòu)域(或者僅包含三個特異于靶的CDR的半個Fv)也可具有識別和結(jié)合靶的能力?！皢捂淔v”、“sFv”或“scAb”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)構(gòu)域存在于單一多肽鏈中。一般而言，所述Fv多肽進一步包含在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，一般為柔性分子如寡肽，其可以得自天然產(chǎn)生的分子、源于天然產(chǎn)生的分子、是人工序列如多聚甘氨酸等，其使得所述sFv能形成用于靶結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。一些分子可包括一或多個恒定結(jié)構(gòu)域或其部分。術(shù)語“雙抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段構(gòu)建體，所述片段可包含在相同多肽鏈中連接輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)。通過使用太短以至于不能允許在同一個鏈上的所述兩個可變結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，雙抗體結(jié)構(gòu)域被迫與另一個鏈的結(jié)合結(jié)構(gòu)域配對以產(chǎn)生抗原結(jié)合位點。所述Fab片段含有輕鏈的可變和恒定結(jié)構(gòu)域以及重鏈的可變和第一個恒定結(jié)構(gòu)域 (Cm)0Fab,片段通過在Chi結(jié)構(gòu)域的羧基端添加幾個殘基以包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一或多個半胱氨酸而與Fab片段不同。Faiy片段可通過裂解位于F(ab, )2胃蛋白酶消化產(chǎn)物的鉸鏈半胱氨酸的二硫鍵而產(chǎn)生?？贵w的另外酶處理和化學(xué)處理可產(chǎn)生其它感興趣的功能性片段。如本文所用術(shù)語“單克隆抗體”(mAb或MAb)是指得自基本上同質(zhì)抗體群的抗體， 即所述包含單個抗體的群是相同的(除了可能少量存在的天然產(chǎn)生的突變)。本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類(型或亞型)的抗體的相應(yīng)序列相同或者同源，而所述鏈的其余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或者同源，以及包括此種抗體的片段，只要所述嵌合抗體展現(xiàn)出所期望的結(jié)合伸展的I型鞘糖脂或者影響伸展的I型鞘糖脂活性或代謝的生物學(xué)活性(美國專利號4，816，567 ；和Morrison et al.， Proc Natl Acad Sci USA 81 :6851 (1984))。因此，來自一類抗體的CDR可以嫁接到不同類或亞類的抗體的FR中。單克隆抗體是特異性的，針對單一靶位點、表位或決定簇。另外，與通常包括針對抗原不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物相反，每個單克隆抗體針對靶上單一的決定簇。除其特異性之外，單克隆抗體由宿主細胞合成、未被其它免疫球蛋白污染因而具有優(yōu)勢，并用于克隆編碼其抗體鏈的相關(guān)基因和mRNA。修飾詞“單克隆”表明所述抗體的特點是得自基本上同質(zhì)的抗體群，而不應(yīng)被理解為要求通過特定方法來生產(chǎn)所述抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可以使用熟知技術(shù)分離自噬菌體抗體文庫或者可以從多克隆制備物中純化。依照本發(fā)明使用的親代單克隆抗體可以通過Kohler et al., Nature 256 =495(1975)中描述的雜交瘤方法制備或者可以通過本領(lǐng)域熟知的重組方法制備。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈或者片段(如Fv、Fab、Fab,，F(xiàn)(ab, )2或抗體的其它靶結(jié)合亞序列)，其與人抗體相比含有源自非人免疫球蛋白的序列。通常，人源化抗體將基本上包含全部一個、通常兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或者基本上全部的CDR區(qū)對應(yīng)非人免疫球蛋白的那些并且全部或者基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白模板序列的那些。所述人源化抗體還可以包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(F。)，通常是所選人免疫球蛋白模板的那個。一般而言，目標(biāo)是得到在人中免疫原性最小化的具有某特異性的抗體分子。因此，可以將一或多個CDR中的一或多個氨基酸換成對人宿主免疫原性較低的氨基酸，而基本上不會最小化所述一或多個CDR對伸展的I型鞘糖脂的特異性結(jié)合功能?；蛘?，所述FR可以為非人的但是那些最具免疫原性的氨基酸被置換為較小免疫原性的那些。但是，如上所述的CDR嫁接并非獲得人源化抗體的僅有方法。例如，僅修飾CDR 區(qū)可能不足以優(yōu)化抗體，這是由于構(gòu)架殘基在決定CDR環(huán)的整體三維結(jié)構(gòu)以及決定抗體對配體的整體親和性中具有作用并非是不尋常的。因此，可施行任何方法來降低抗體免疫原性從而將非人親代抗體分子修飾為對人有較低免疫原性，而與人抗體的整體序列相同性并不總是必須的。因此，人源化也可通過例如僅取代幾個殘基、特別是暴露于抗體分子表面而不是埋在分子內(nèi)、從而對宿主免疫系統(tǒng)而言不易于接近的那些而實現(xiàn)。本文教導(dǎo)了關(guān)于取代例如抗體分子上帶電的或某些其它殘基的此種方法，目的是降低或阻抑所得分子的免疫原性而不損害所述抗體對同族表位或決定簇的特異性。參見例如 Mudnicka et al.，Prot Eng 7(6)805-814,1994 ；Mol Imm 44 1986-1988，2007 ；Sims et al.，J Immunol 151 :2296(1993) ；Chothia et al.，J MoI Biol 196 :901(1987) ；Carter et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 89 :4285(1992) ；Presta et al. , J Immunol 151 :2623 (1993)，WO 2006/042333 和美國專利號 5，869，619。用于對抗體表面重整(resurfacing)的策略和方法以及其它用于降低抗體在不同宿主中免疫原性的方法在例如美國專利號5，639，641中公開。簡言之，在優(yōu)選的方法中， (1)進行抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)集合的位置比對以產(chǎn)生重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)架表面暴露位置，其中對于所有可變區(qū)的比對位置至少大約98%相同；(2)對非人如嚙齒類抗體(或其片段)定義出一組重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)架表面暴露氨基酸殘基；C3)鑒定出與該組嚙齒類表面暴露氨基酸殘基最緊密相同的一組重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)架表面暴露氨基酸殘基；以及 (4)將步驟O)中定義的那組重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)架表面暴露氨基酸殘基用步驟(3)中定義的那組重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)架表面暴露氨基酸殘基取代，除了那些在例如嚙齒類抗體的 CDR的任何殘基的任何原子約5A之內(nèi)的那些氨基酸殘基之外，以產(chǎn)生人源化的例如保留結(jié)合特異性的嚙齒類抗體。抗體的人源化可用許多其它技術(shù)來進行，包括⑶R嫁接(ΕΡ0 0 239400 ；WO 91/09967 ；和美國專利號5，530，101和5，585，089)，飾面法(veneering)或表面重整(ΕΡ0 0 592 106 ；EPO 0 519 596 ；Padlan,1991, Molec Imm 28 (4/5) :489-498 ；Studnicka et al.，1994，Prot Eng 7(6) :805-814 ；和 Roguska et al.，1994，PNAS 91 :969-973)和鏈改組(美國專利號5，565，33 。人抗體可通過多種本領(lǐng)域已知的方法制備，包括但不限于噬菌體展示方法，參見美國專利號4，444，887,4, 716，111,5, 545，806和5，814，318 ；和 WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735 及 WO 91/10741，使用轉(zhuǎn)基因動物如嚙齒類(Amgen，Kirin和Merdarex小鼠)，使用嵌合細胞等等?！翱贵w同系物”或“同系物”是指如本文教導(dǎo)的特異性結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的任何分子。因此，抗體同系物包括修飾的或未經(jīng)修飾的天然或重組抗體、保留感興趣的生物學(xué)性質(zhì)(如結(jié)合伸展的I型鞘糖脂)的抗體的部分如Fab或者Fv分子、單鏈抗體、攜有一或多個CDR區(qū)的多肽等等。所述同系物的氨基酸序列不必與天然產(chǎn)生的抗體相同，而是可以被改變和修飾以攜有取代氨基酸、插入氨基酸、缺失氨基酸、20個蛋白中常見氨基酸之外的氨基酸等等以獲得具有增強的或者其它有益性質(zhì)的多肽。具有同源序列的抗體是那些具有與本發(fā)明的伸展的I型鞘糖脂抗體的氨基酸序列有序列同源性的氨基酸序列的抗體。優(yōu)選地，同源性是與本發(fā)明抗體可變區(qū)的氨基酸序列。在本文用于氨基酸序列的“序列同源性”定義為與另一氨基酸序列具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%或更多序列同源性、更優(yōu)選至少約95 %、96 %、97 %、98 %或 99%序列同源性的序列，通過例如根據(jù)Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85， 2444-2448 (1988)的FASTA搜索方法確定。如上文所教導(dǎo)的嵌合抗體是一種具有源自不同來源的抗體的不同部分的抗體， 如不同的抗體、不同類的抗體、不同的動物物種，例如具有源自鼠單克隆抗體可變區(qū)配有人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體等。因此，人源化抗體是一種嵌合抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的，參見例如 Morrison，1985，Science 229 1202 ；Oi et al.，1986， BioTechniques 4 214 ；Gillies et al. , 1989, J Immunol Methods 125 :191-202 ；和美國專利號 5，807，715,4, 816，567 和 4，816，397。人工抗體包括scFv片段、嵌合抗體、雙抗體、三抗體(triabody)、四抗體 (tetrabody)禾口mru(參見Winter & Milstein, 1991,Nature 349 :293-299禾口Hudson，1999， Curr Opin Imm 11 :548-557的綜述)，每個均具有抗原結(jié)合能力或表位結(jié)合能力。在單鏈 Fv片段(ScFv)中，抗體的V1^nt結(jié)構(gòu)域通過柔性肽連接。通常，接頭是約15個氨基酸的肽。如果接頭小得多，例如5個氨基酸，則形成雙抗體，其是二價scFv 二聚體。如果感興趣抗體的功能性等價物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語“功能性等價物”包括具有同源序列的抗體、抗體同系物、嵌合抗體、抗體變體、抗體衍生物、人工抗體和經(jīng)修飾的抗體，例如其中每個功能性等價物通過結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的能力來定義。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解稱作“抗體片段”的分子的組與稱作“功能性等價物”的組會有重疊。保留結(jié)合伸展的I型鞘糖脂能力的功能性等價物的生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在例如 WO 93/21319,EPO No. 239, 400, WO 89/09622,EPO No. 338，745 和 EPO No. 332，424 中公開。本申請的功能性等價物還包括修飾的抗體，例如通過將任何類型的分子共價附著于抗體而修飾的抗體。例如，修飾的抗體包括已經(jīng)例如通過糖基化、乙?；⒕垡叶蓟?、脫酰胺化、磷酸化、酰胺化、由已知保護/阻斷基團衍生化、蛋白酶解、連接細胞配體、連接毒素或胞毒性部分或其它蛋白等而修飾的抗體。所述共價附著不需產(chǎn)生從生成抗獨特型應(yīng)答免疫的抗體。修飾可由已知的技術(shù)達成，包括但不限于特異的化學(xué)裂解、乙?；?、甲?；?、代謝合成、化學(xué)綴合等。另外，所述修飾的抗體可含有一或多種非典型氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用很多能夠?qū)⒔Y(jié)合親和性優(yōu)化的技術(shù)。通常，所述技術(shù)涉及各種在感興趣位點的氨基酸殘基的取代，隨后篩選分析突變體多肽對同族抗原或表位的結(jié)合親和性。一旦鑒定出并分離出抗體，生成變體抗體或突變體、或突變蛋白通常是有用的，其中改變了一或多個氨基酸殘基，例如在抗體的一或多個高變區(qū)中?；蛘?，或者另外可以在抗體中引入或多個構(gòu)架殘基的改變(例如取代)，其中這些導(dǎo)致抗體突變體對伸展的I型鞘糖脂結(jié)合親和性的改善?？杀恍揎椀臉?gòu)架區(qū)殘基的例子包括那些直接地非共價結(jié)合抗原的殘基(Amit et al. ,Science 233 :747-753(1986))；與CDR構(gòu)象相互作用或影響CDR構(gòu)象的殘基(Chothia et al.，J. MoI. Biol. 196 :901-917(1987))；和 / 或參與 Vl-Vh 界面的殘基(EP 239 400)。 在某些實施方案中，一或多個此種構(gòu)架區(qū)殘基的修飾導(dǎo)致抗體對同族抗原結(jié)合親和性的增強。例如，在本發(fā)明特定的實施方案中可以改變約一至大約五個構(gòu)架殘基。有時，這可足以產(chǎn)生適用于臨床前測試的抗體突變體，即使其中沒有高變區(qū)殘基被改變。然而，通常所述抗體突變體可包含一或多個高變區(qū)改變。也可改變恒定區(qū)以獲得所期望的或者更期望效應(yīng)物性質(zhì)。被改變的高變區(qū)殘基可以隨機變化，特別是當(dāng)親代抗體的起始結(jié)合親和性使得可以輕易地在本文教導(dǎo)的測定法中篩選隨機產(chǎn)生的抗體突變體的改變的結(jié)合。獲得抗體突變體如⑶R突變體的一種方法是“丙氨酸分區(qū)誘變法”(Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085(1989)；和 Cunningham & Wells, Proc Nat. Acad Sci USA 84:6434-6437(1991))。一或多個高變區(qū)殘基被丙氨酸或聚丙氨酸殘基置換。繼而通過在取代位點或者為取代位點引入進一步的或者其它突變來將那些證明了對取代的功能敏感性的高變區(qū)殘基進行優(yōu)化。因此，引入氨基酸序列變化的位點被預(yù)先確定，而突變本身的特性不需要被提前確定?？捎闷渌被釃L試類似的取代，這取決于被掃描的殘基的所需性質(zhì)。鑒定要修飾的氨基酸殘基的更系統(tǒng)的方法包含鑒定涉及結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的高變區(qū)殘基和那些很少或沒有涉及結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的高變區(qū)殘基。進行非結(jié)合高變區(qū)殘基的丙氨酸掃描，測定每個ala突變體結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的增強。在另一個實施方案中，那些顯著涉及結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的殘基被選擇來進行修飾。修飾可涉及殘基的缺失或者臨近感興趣殘基的一或多個殘基的插入。然而，通常修飾涉及殘基被其它氨基酸取代。保守取代可以是第一個取代。如果此取代導(dǎo)致生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和性) 的變化，那么可進行另一個保守取代以確定是否獲得更實質(zhì)的變化。
可通過篩選與正常位于位點上的氨基酸在性質(zhì)上更實質(zhì)不同的氨基酸來獲得在抗體范圍內(nèi)和生物學(xué)性質(zhì)呈遞中甚至更實質(zhì)的修飾。因此，可在保持如下的情況下進行此種取代(a)多肽主鏈在取代區(qū)域的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊或者螺旋構(gòu)象；(b)所述分子在靶位點的電荷或疏水性，或者(c)側(cè)鏈的大小。例如，可根據(jù)共同側(cè)鏈性質(zhì)而將天然產(chǎn)生的氨基酸分成組(1)疏水的甲硫氨酸(M或met)，丙氨酸(A或ala)，纈氨酸(V或val)，亮氨酸(L 或leu)和異亮氨酸(I或ile)；(2)中性親水的半胱氨酸(C或cys)，絲氨酸(S或ser)，蘇氨酸(T或thr)，天冬酰胺(N或asn)和谷氨酰胺(Q或gin)；(3)酸性的天冬氨酸(D或asp)和谷氨酸(E或glu)；(4)堿性的組氨酸(H或his)，賴氨酸(K或Iys)和精氨酸(R或arg)；(5)影響鏈方向的殘基甘氨酸(G或gly)和脯氨酸(P或pro)，以及(6)芳香的色氨酸(W或trp)，酪氨酸(Y或tyr)和苯丙氨酸(F或phe)。非保守取代可使得將氨基酸用來自另一組的氨基酸互換。保守取代可使得將一個氨基酸用組中的另一個互換。優(yōu)選的氨基酸取代可包括例如(1)降低對蛋白水解的易感性的，( 降低對氧化的易感性的，( 改變結(jié)合親和性的和(4)賦予或修飾此種類似物的其它物理化學(xué)或功能性質(zhì)的那些。類似物可包括天然產(chǎn)生的肽序列之外的序列的各種突變蛋白。例如，可以在天然產(chǎn)生的序列中(優(yōu)選在所述多肽形成分子間相互作用的結(jié)構(gòu)域外的部分中)進行單一或者多重氨基酸取代(優(yōu)選保守氨基酸取代)。除了在R基團或側(cè)鏈的大小和構(gòu)象中的變化之外，保守取代不應(yīng)實質(zhì)上改變親代序列的結(jié)構(gòu)特征(例如置換氨基酸不應(yīng)要破壞親代序列中出現(xiàn)的螺旋或者破壞為所述親代序列特征的其它類型的二級結(jié)構(gòu))，Proteins， Structures and Molecular Principles(Creighton, ed. , W.H.Freeman and Company,New York (1984)) ；Introduction to Protein Structure(Branden & Tooze, eds. , Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))；和 Thornton et al. Nature 354:105(1991)。普遍來說，具有改善的生物學(xué)性質(zhì)的抗體突變體將具有這樣的氨基酸序列，其與親代抗人伸展的I型鞘糖脂抗體的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列有至少75%氨基酸序列相同性或相似性、至少80%、至少85%、至少90%和經(jīng)常至少95%相同性。與親代抗體序列的相同性或相似性在本文中定義為候選序列中與親代抗體殘基相同(即同樣的殘基)或相似(即基于如前所述共同側(cè)鏈性質(zhì)的同組的氨基酸殘基)的氨基酸殘基的百分比，如果必要，在比對所述序列并引入缺口后獲得最大百分比序列相同性?；蛘?，可通過系統(tǒng)突變重鏈和輕鏈的FR和⑶R區(qū)、或抗伸展的I型鞘糖脂抗體的 Fc區(qū)生成抗體突變體。另一生成抗體突變體的過程涉及使用利用噬菌體展示的親和力成熟(Hawkins et al. , J MoI Biol 254:889—896(1992)禾口 Lowman et al. , Biochemistry 30(45) 10832-10838(1991))。已知噬菌體外殼蛋白融合(Smith, Science 228 :1315(1985)； Scott & Smith， Science 249 :386(1990) ；Cwirla et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 8 309(1990) ；Devlin et al.Science 249 :404(1990) ；Wells & Lowman, Curr Opin StructBiol 2:597(1992)；和美國專利號5，223，409)可用于將所展示的蛋白或肽的表型與編碼它們的噬菌體顆粒的基因型相聯(lián)系?？贵w的Fab結(jié)構(gòu)域也已經(jīng)在噬菌體上展示(McCafferty et al. , Nature 348 :552(1990) ；Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 88 :7978(1991)； 禾口 Garrard et al. Biotechnol 9:1373(1991))。單價噬菌體展示由如下組成將一組蛋白變體作為噬菌體外殼蛋白的融合物在噬菌體顆粒上展示(Bass et al. ,Proteins 8 :309 (1990))。親和力成熟或者各種蛋白的平衡結(jié)合親和性先前通過順序應(yīng)用誘變、單價噬菌體展示和功能性分析實現(xiàn)(Lowman & ffells， J MoI Biol 234:564578(1993)；和美國專利號5，534，617)以及對抗體Fab結(jié)構(gòu)域使用所述方法(Barbas et al.，Proc Natl Acad Sci USA 91 :3809(1994)；禾口 Yang et al.，J MoI Biol 254 :392(1995))?？稍谑删w顆粒上構(gòu)建許多(例如IO6或更多)蛋白變體(在序列中給定位置不同)的文庫，其每個均含有編碼特定蛋白變體的DNA。因此，將若干高變區(qū)位點例如6-7個位點)突變以生成在每個位點所有可能的氨基酸取代。在親和性層析循環(huán)后，使用固定的抗原分離各個噬菌體克隆，并從DNA推斷出所展示的蛋白的氨基酸序列。在產(chǎn)生抗體突變體后，所述分子相對于親代抗體的生物學(xué)活性可以如本文所教導(dǎo)的那樣確定。如上所述，這可以涉及確定所述抗體的結(jié)合親和性和/或其它生物學(xué)活性或物理特性。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，制備了一組抗體突變體并對篩選其對于抗原的結(jié)合親和性。從該篩選中所選擇的一或多個抗體突變體任選進行一或多個進一步的生物學(xué)活性測定以確認(rèn)所述抗體突變體具有新的或者改善的性質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，抗體突變體保留結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的能力且其結(jié)合親和性類似于或者優(yōu)于/高于親代抗體的?；蛘?，也可使用多價噬菌體(McCaffertyet al. (1990) Nature 348 :552-554 ；禾口 Clackson et al. (1991)Nature 352:624-628)表達隨機點突變(例如使用易錯DNA聚合酶產(chǎn)生的)以生成噬菌體抗體片段文庫，繼而可以將篩選其對于伸展的I型鞘糖脂的親和性，Hawkins et al.，(1992) J MoI Biol 254 :889_896。優(yōu)選地，在親和力成熟法期間，可復(fù)制的表達載體在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的緊密控制之下，并且調(diào)整培養(yǎng)條件使得展示超過1個拷貝融合蛋白的顆粒的量或者數(shù)目少于約1%。還優(yōu)選展示超過1個拷貝融合蛋白的顆粒量少于展示單一拷貝融合蛋白的顆粒量的約10%。 優(yōu)選該量為少于約20%。本文使用的另一等價措辭是抗原結(jié)合部分，其涉及結(jié)合I型鞘糖脂表位的感興趣抗體的部分。本文用來描述可以對原始抗體進行各種改變的所有措辭和術(shù)語均被認(rèn)為落入措辭“抗原結(jié)合部分”的范圍內(nèi)。因此，措辭抗原結(jié)合部分包括了如本文所述的例如抗體片段如Fab分子、Fv、sCAb、mrU、任何此類功能性片段、抗體變體如等位基因或者在其一級氨基酸序列中含有變化的分子、衍生物如嵌合或人源化抗體、類似物等，包括功能性等價物，其包括感興趣抗體的遺傳修飾形式、抗體同系物等等。如此選擇的抗體突變體可以進行進一步修飾，常取決于所述抗體所要的用途。此種修飾可涉及氨基酸序列的進一步改變、與異源多肽的融合和/或共價修飾。例如，不涉及保持抗體突變體的適當(dāng)構(gòu)象的半胱氨酸殘基可以被取代(通常用絲氨酸)以改善所述分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。反過來，可以將半胱氨酸加入抗體中以改善穩(wěn)定性(特別是當(dāng)所述抗體是抗體片段如Fv片段時)。
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另一類的抗體突變體具有改變的糖基化模式。這可以通過將一或多個抗體中發(fā)現(xiàn)的碳水化合物部分添加或缺失和/或通過添加或缺失一或多個所述抗體中未出現(xiàn)的糖基化位點來達成?？贵w的糖基化通常經(jīng)N-連接至Asn或經(jīng)0-連接至Ser或Thr。三肽序列天冬酰胺-χ-絲氨酸和天冬酰胺-χ-蘇氨酸(其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物部分通過酶附著至天冬酰胺側(cè)鏈的共同識別序列。例如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、 巖藻糖或木糖結(jié)合至羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。在原始抗體的序列中添加或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基可增強0-連接糖基化的可能性?？梢云谕麑τ诒景l(fā)明抗體的效應(yīng)物功能進行修飾，從而增強所述抗體的效力。例如，可將半胱氨酸殘基引入到F。區(qū)，由此使得可以在該區(qū)形成鏈間二硫鍵。因此而生成的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)化能力和/或提高的補體介導(dǎo)的細胞殺傷和抗體依賴性細胞胞毒性(ADCC)，參見 Caron et al.，J Exp Med 176 :1191-1195(1992)和 Shopes，Immunol 148 :29184922 (199 。此種抗體衍生物或類似物也可在體內(nèi)對降解更具抗性。或者，抗體可被工程化為具有雙F。區(qū)并可以由此而具有增強的補體裂解和ADCC 能力，參見 Stevenson et al. , Anti-Cancer Drug Design 3:219 230(1989)?？贵w的共價修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果可行，這可通過化學(xué)合成或通過抗體的酶或化學(xué)裂解來進行?？贵w其它類型的共價修飾通過如下方式引入該分子通過將抗體的靶氨基酸殘基與有機衍生劑反應(yīng)，所述衍生劑能夠與選擇的側(cè)鏈或者N-端或C-端殘基反應(yīng)。半胱氨?；鶜埢膳cα -鹵乙酸(α -haloacetate)(以及相應(yīng)的胺)反應(yīng)如氯乙酸或氯乙酰胺以產(chǎn)生羧甲基或羧氨基甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨?；鶜埢部赏ㄟ^與例如如下的物質(zhì)反應(yīng)而衍生化溴三氟丙酮、α -溴- β - (5-咪唑)丙酸、 氯乙?；姿猁}/酯、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對-氯汞基苯甲酸鹽/酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或者氯-7-硝基苯-2-氧雜-1， 3-二唑。組氨?；鶜埢赏ㄟ^在ρΗ 5. 5-7.0與焦碳酸二乙酯反應(yīng)而衍生化。也可使用對-溴苯酰甲基溴，反應(yīng)優(yōu)選在ΡΗ6. 0于0. IM 二甲胂酸鈉中進行。賴氨?；挺聊┒藲埢膳c琥珀酸或其它羧酸酐反應(yīng)以反轉(zhuǎn)該殘基的電荷。其它用于衍生含有α-氨基的殘基的適宜試劑包括亞氨酸酯(imidoester)，如甲基吡啶亞胺甲酯(methyl picolinimidate)，磷酸吡哆醛，吡哆醛，氯氫硼化物，三硝基苯磺酸，0-甲基異脲和2，4-戊二酮，所述氨基酸可以用乙醛酸進行轉(zhuǎn)氨酶催化。精氨酰基殘基可通過與一或若干個常規(guī)試劑如苯甲酰甲醛，2，3- 丁二酮，1，2-環(huán)己二酮和茚三酮反應(yīng)來修飾。精氨酸殘基的衍生化經(jīng)常需要堿性反應(yīng)條件。另外，所述試劑可以與賴氨酸以及精氨酸ε-氨基反應(yīng)。可以用芳香族重氮化合物或四硝基甲烷來對酪氨?；鶜埢M行特異修飾。例如， N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷用于分別形成0-乙?；野彼嵛镔|(zhì)和3-硝基衍生物。酪氨酰基殘基可用125I或131I進行碘化以制備標(biāo)記的蛋白用于放射性免疫測定。羧基側(cè)基團(天冬氨酰基或谷氨?；?可通過與碳二亞胺(R-N = C = C-R')反應(yīng)而修飾，其中R和R'可以是不同的烷基基團。
谷氨酰胺?；於０孵；鶜埢?jīng)常在中性或堿性條件下被分別脫酰胺化成相應(yīng)的谷氨?；吞於滨；鶜埢?。那些殘基的脫酰胺化形式在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化、絲氨?；蛱K氨?；鶜埢u基的磷酸化、 賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(Creighton，Proteins Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co. , San Francisco, pp. 79-86 (1983))、N 端胺的乙?；腿魏蜟端羧基的酰胺化。另一類型的共價修飾涉及將碳水化合物和糖苷化學(xué)偶聯(lián)或酶偶聯(lián)至抗體。這些過程不需要在具有用于N-連接或0-連接糖基化的糖基化能力的宿主中產(chǎn)生抗體。取決于所使用的偶聯(lián)模式，可以將糖附著至(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基；(c)游離巰基，如半胱氨酸的那些；(d)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的那些；(e)芳香族殘基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或(f)谷氨酰胺的酰胺基團。此種方法在WO 87/05330和 ApHn & Wriston，CRC Crit Rev Biochem，pp. 259-306 (1981)中描述。抗體上出現(xiàn)的任何碳水化合物部分的去處可經(jīng)化學(xué)或酶來完成。例如化學(xué)去糖基化可要求抗體暴露于化合物三氟甲磺酸或等價化合物，導(dǎo)致除了連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或所有糖的裂解，而抗體卻保持完整?；瘜W(xué)去糖基化在例如 Hakimuddin et al. ，Arch Biochem Biophys 259 :52(1987)禾口 Edge et al. ，Anal Biochem 118:131(1981)中描述?？贵w上碳水化合物部分的酶裂解可通過多種內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶(例如Thotakura et al.，Meth Enzymol 138 :350(1987)中描述的)中的任何酶來達成。抗體另一種類型的共價修飾包含將抗體以美國專利號4，640，835 ；4，496，689 ； 4，301，144 ；4，670，417 ；4, 791，192或4，179，337中所述方式連接至多種非蛋白質(zhì)樣聚合物的一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化亞烷基(polyoxylalkylene)?？稍跇?gòu)架內(nèi)或者源自多個抗體的組合FR內(nèi)通過互換不同抗體鏈的不同⑶R產(chǎn)生功能性等價物。由此，例如不同類的抗體對于給定組的CDR通過不同重鏈的取代(例如 IgGp4，IgM, IgAp2或IgD)可以產(chǎn)生有區(qū)別的伸展的I型鞘糖脂抗體類型和同種型。類似地，本發(fā)明范圍內(nèi)的人工抗體可以通過在完全合成的構(gòu)架內(nèi)嵌入給定組的CDR來產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體片段和功能性等價物涵蓋那些分子，其具有可檢測程度的對伸展的 I型鞘糖脂的特異結(jié)合?？蓹z測程度的結(jié)合包括感興趣抗體結(jié)合能力的至少10-100%范圍內(nèi)的所有值，優(yōu)選至少50%、60%或70%，更優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。 具有的親和性超過感興趣抗體的100%的等價物也包括在內(nèi)。所述⑶R通常對表位識別和抗體結(jié)合是重要的。然而，可對包含所述⑶R的殘基進行改變而不干擾抗體識別并結(jié)合同族抗原的能力。例如，可以進行不影響表位識別卻提高抗體對表位結(jié)合親和性的改變。基于這個認(rèn)識，若干研究已經(jīng)調(diào)查了在抗體序列不同位置引入一或多個氨基酸改變的作用。由此，可通過改變⑶R1、⑶R2和/或⑶R3中或者在構(gòu)架區(qū)中的重鏈和輕鏈基因的序列來產(chǎn)生感興趣抗體的等價物，所用的方法如例如寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變、盒式誘變、 易錯PCR、DNA改組、氨基酸修飾或大腸桿菌(E. coli)的增變株(Vaughan et al.，1998， Nat Biotech 16 :535-539 ；和 Adey et al.，1996，Chap. 16，pp. 277-291，在 Phage Display of Peptides and Proteins 中，eds. Kay et al. ,Academic Press)。改變初級抗體核酸序列的方法可導(dǎo)致具有改善的親和性的抗體(Gram et al.，1992，Proc Natl Acad Sci USA 89 :3576-3580 ；Boder et al. ,2000, Proc Natl Acad Sci USA 97 :10701-10705 ；Davies & Riechmann,1996, Immunotech 2 :169-179 ；Thompson et al. ,1996, J MoI Biol 256 77-88 ；Short et al. ,2002，J Biol Chem 277 :16365-16370 ；禾口 Furukawa et al. ,2001，J Biol Chem 276 :27622-27628)。重復(fù)循環(huán)“多肽選擇”可用于通過例如對多個氨基酸改變的選擇來選擇較高的親和性結(jié)合，所述對多個氨基酸改變的選擇通過多個選擇循環(huán)來選擇。在第一輪選擇(涉及配體或抗體多肽中氨基酸的第一個選擇區(qū))后，在配體的其它區(qū)或氨基酸中進行另外輪的選擇。重復(fù)選擇循環(huán)直至達到所期望的親和性特性。改善的抗體也包括那些通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的具有改善的特性的抗體，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)為動物免疫、雜交瘤形成及選擇具有特異特性的抗體。“拮抗劑”是指能夠抑制一或多個與伸展的I型鞘糖脂關(guān)聯(lián)的生物學(xué)活性的分子。 拮抗劑可以干擾消耗I型鞘糖脂的細胞的維持和生長。對于本發(fā)明的目的，拮抗劑的所有干預(yù)點均看做是等價的。由此，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是例如中和結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的抗體的拮抗劑。“激動劑”是指激活伸展的I型鞘糖脂或表達其的細胞的一或多種生物學(xué)活性的抗體、抗體片段、綴合物等等。激動劑可以作為表達I型鞘糖脂的細胞的促細胞分裂劑。對于本發(fā)明的目的，激動劑的所有干預(yù)點均被看做是等價的。由此，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是例如結(jié)合伸展的I型鞘糖脂并增強活性如分化的抗體。術(shù)語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”包括其后代。也應(yīng)理解由于主動或非主動突變，所有的后代可能不是精確相同的，如在DNA含量方面。具有相同的感興趣的功能或生物學(xué)性質(zhì)(如在原始細胞中篩選的)的變體后代包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明中使用的“宿主細胞”通常是原核或真核宿主，根據(jù)設(shè)計選擇來進行選擇。用核酸“轉(zhuǎn)化”細胞生物體、細胞、細胞系意指將核酸引入到靶細胞，從而所述核酸可以作為染色體外元件或者通過染色體整合而復(fù)制并任選地表達。用核酸“轉(zhuǎn)染”細胞或生物體是指所述細胞或生物體對核酸例如表達載體的攝取，無論實際上是否有任何編碼序列被表達。術(shù)語“轉(zhuǎn)染的宿主細胞”和“轉(zhuǎn)化的”是指細胞中引入了核酸。典型的原核宿主細胞包括大腸桿菌的各種株。典型的真核宿主細胞是哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢細胞或人源細胞。所述引入的核酸序列可以來自與宿主細胞相同的物種或不同的物種，或者可以是含有一些外源和一些同源核酸的雜合核酸序列。轉(zhuǎn)化也可以通過用病毒來源的元件或運載體(carrier)的轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染來進行。術(shù)語“載體”意指含有核酸、轉(zhuǎn)基因、外源基因或感興趣基因的核酸構(gòu)建體、運載體，其能夠可操縱地連接至適宜的控制序列用于在適宜的宿主中表達所述轉(zhuǎn)基因。此種控制序列包括例如實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子、任選的操縱基因序列以控制所述轉(zhuǎn)錄、編碼適宜的 mRNA核糖體結(jié)合位點的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。所述載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆?；蛘邇H僅是潛在的基因組插入物。一旦轉(zhuǎn)化入適宜宿主，所述載體可以獨立于宿主基因組而復(fù)制和發(fā)揮功能，或者可以在某些情況中整合入宿主細胞基因組或其它核酸。在本說明書中“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是載體的常用形式。然而，本發(fā)明要包括其它形式的載體，其發(fā)揮如本領(lǐng)域所知的等價的運載體功能且其是或者成為本領(lǐng)域所知的，如病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、攜有核酸的合成分子、脂質(zhì)體等。用于治療目的的“哺乳動物”是指任何分類為哺乳動物的動物，包括人、家養(yǎng)和畜牧動物、非人靈長類、以及動物園、運動或?qū)櫸飫游锶绻?、馬、貓、牛等。感興趣的抗體可以在如本文所述的或者如本領(lǐng)域已知的測定中篩選或使用。此種測定經(jīng)常需要可探測的試劑，即例如標(biāo)記的。當(dāng)用于本文時，詞語“標(biāo)已”是指能夠被直接或間接地綴合至分子或蛋白例如抗體的可探測化合物或組合物。所述標(biāo)記可以本身是可探測的(例如放射性同位素標(biāo)記、顆?；驘晒鈽?biāo)記)或者可以是獲得可探測信號的儀器，如在酶標(biāo)記的情況中可以催化底物化合物或組合物的化學(xué)改變從而使其可探測。如本文所用，“固相”是指實體或者分子如本發(fā)明的抗體可以粘附或者結(jié)合的基質(zhì)。固相所涵蓋的例子在本文包括部分或完全由玻璃(例如可控孔度玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、塑料、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮類形成的那些。在某些實施方案中，根據(jù)上下文，固相可以包含測定平板的孔；在其它中可以在純化柱中使用(例如親和層析柱)。由此，固相可以是紙、珠、塑料、芯片等等，可以由多種材料制成，如硝化纖維素、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、硅等，并且可以是多種構(gòu)型。表達伸展的I型鞘糖脂或其聚糖的細胞如細胞膜制備物以及純化的伸展的I型鞘糖脂可用作免疫原來產(chǎn)生感興趣的抗體。所述免疫原可以得自或者分離自天然來源或者可以經(jīng)酶合成或化學(xué)合成制備?？梢允褂谜麄€細胞如表達伸展的I型鞘糖脂的細胞、源自天然來源或者癌癥的細胞如癌細胞系。過表達伸展的I型鞘糖脂的細胞可以用作免疫原來制備感興趣的抗體。還可以如本領(lǐng)域所知的那樣使用攜有伸展的I型鞘糖脂的膜制備物。此種細胞及其部分可在診斷測定中被用作抗原來源?？梢酝ㄟ^多種本領(lǐng)域已知的多種方法制備編碼氨基酸序列突變體的核酸分子。 所述方法包括但不限于先前制備的感興趣分子的突變或非突變形式的寡核苷酸介導(dǎo)(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變(參見例如Kunkel，Natl Acad Sci USA 82: 488(1985))。本發(fā)明的抗體或其片段、衍生物或類似物(例如本發(fā)明抗體的重鏈或輕鏈、本發(fā)明的單鏈抗體或本發(fā)明的抗體突變蛋白)的重組表達包括構(gòu)建表達載體，所述載體含有編碼如本文所述的抗體或抗體片段的多核苷酸。一旦獲得編碼抗體分子的多核苷酸，可以通過如本領(lǐng)域所知的重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生用于生產(chǎn)所述抗體的載體。構(gòu)建了含有抗體編碼序列以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達載體。所述方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。通過常規(guī)技術(shù)將所述表達載體轉(zhuǎn)移至宿主細胞繼而將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或片段。在本發(fā)明的一方面，編碼重鏈和輕鏈二者的載體可以在宿主細胞中共表達以表達整個免疫球蛋白分子，如本文中所詳述?？衫枚喾N宿主/表達載體系統(tǒng)來表達本發(fā)明的抗體分子。此種表達系統(tǒng)代表運載體(vehicle)，通過其可產(chǎn)生并繼而純化感興趣的編碼序列，而此種表達系統(tǒng)也代表細胞，當(dāng)用適當(dāng)?shù)暮塑账峋幋a序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時其可以在原位表達本發(fā)明的抗體分子。細菌細胞如大腸桿菌和真核細胞一般用于表達重組抗體分子，特別是表達整個重組抗體分子。 例如，哺乳動物細胞如CHO細胞與載體一起如攜有來自人巨細胞病毒主要中間體早期基因啟動子元件的載體是有效的抗體表達系統(tǒng)(Foecking et al. , Gene 45:101(1986)；和Cockett et al. , Bio/Technology 8:2(1990))。如本領(lǐng)域所知的那樣，植物和植物細胞培養(yǎng)物、昆蟲細胞等等也可用于制備感興趣的蛋白。此外，選擇宿主細胞，其調(diào)節(jié)插入序列的表達或者以所期望的特異方式修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物的此種修飾(例如糖基化)和加工(例如裂解)可能對蛋白的功能很重要。不同的宿主細胞對所期望的蛋白和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾可具有特定的特性和特異的機制?？蛇x擇適當(dāng)?shù)募毎祷蛩拗飨到y(tǒng)以確保對所表達的感興趣抗體的正確修飾和加工。因此，可以使用具有用于適當(dāng)加工初級轉(zhuǎn)錄物、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物的細胞機制的真核宿主細胞。此種哺乳動物細胞包括但不限于CHO、C0S.293.3T3或骨髓瘤細胞。對于長期、高產(chǎn)量生產(chǎn)重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，可工程化穩(wěn)定表達所述抗體分子的細胞系。與其使用含有病毒復(fù)制起點的表達載體，倒不如可以通過由適當(dāng)?shù)谋磉_控制元件(例如啟動子、增強子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點等)和可選擇標(biāo)記控制的DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞。在引入外源DNA之后，允許經(jīng)工程化的細胞在富集培養(yǎng)基中生長1到2天，并繼而轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的可選擇標(biāo)記賦予了對選擇的抗性并允許細胞穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合到染色體中以及擴展至整個細胞系?；蛘?，在選擇下可將染色體外元件保留在細胞中。此種工程化的細胞系不僅用于抗體生產(chǎn)還用于篩選和評價直接或間接與抗體分子相互作用的化合物?？墒褂脭?shù)個選擇系統(tǒng)，包括但不限于分別在tk、hgprt或aprt細胞中使用單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell 11 :223 (1977))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 48 :202 (1992))、谷氨酸合酶(在存在甲硫氨酸硫酰亞胺的情況下)(Adv Drug Del Rev 58，671，2006以及參見Lonza Group Ltd. 的網(wǎng)頁或文獻)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lo wy et al. , Cell 22 :817(1980))基因。而且，抗代謝物抗性可用作選擇下列基因的基礎(chǔ)dhfr，其賦予對氨甲喋呤的抗性(Wigler et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 77 :357(1980) ；OHare et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 78 :1527(1981)) ；gpt，其賦予對霉酚酸的抗性(Mulligan et al. , Proc Natl Acad Sci USA 78 :2072(1981)) ；neo，其賦予對氨基糖苷 G-418 的抗性(Wu et al.，Biotherapy 3 87(1991))；以及 hygro，其賦予對潮霉素的抗性(Santerre et al. ,Gene 30:147(1984))。 本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)可常規(guī)地用于選擇所期望的重組克隆，并且此種方法在例如 Ausubel et al. , eds. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993) ；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press(1990) ；Dracopoli et al. , eds. , Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994)；和 Colberre-Garapin et al.，J MoI Biol 150 :1(1981)中描述?？贵w分子的表達水平可通過載體擴增來提高(例如參見Belibington et al., 在DNA Cloning中，Vol. 3. Academic Press (1987))。當(dāng)表達抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記是可擴增的時候，培養(yǎng)物中存在的抑制劑水平的提高將提高所述標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。由于擴增區(qū)與抗體基因關(guān)聯(lián)，則抗體的生產(chǎn)將也被提高(Crouse et al. , MoI Cell Biol 3 257(1983))。宿主細胞可以用二或更多個本發(fā)明的表達載體共轉(zhuǎn)染，例如第一個載體編碼源自重鏈的多肽而第二個載體編碼源自輕鏈的多肽。所述兩個載體可含有相同的選擇標(biāo)記，其使得重鏈和輕鏈多肽可以等量表達?；蛘撸墒褂脝我惠d體，其編碼并且能夠表達重鏈和輕鏈多肽二者。在此情況下，可將輕鏈至于重鏈之前以避免過量的毒性游離重鏈(Proudfoot， Nature 322 :52(1986)；和 Kohler，Proc Natl Acad Sci USA 77:2197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。一旦本發(fā)明的抗體分子已由動物產(chǎn)生、經(jīng)化學(xué)合成或經(jīng)重組表達，其可以通過任何本領(lǐng)域已知的用于純化免疫球蛋白分子的方法純化，例如通過層析(例如離子交換層析、親和層析特別是通過對蛋白A之后的伸展的I型鞘糖脂的親和性以及大小排阻層析等等)、離心、差別溶解法(differential solubility)或者通過任何其它標(biāo)準(zhǔn)純化蛋白技術(shù)。另外，可將本發(fā)明的抗體或其片段融合至本文所述或本領(lǐng)域已知的異源多肽序列以輔助純化。本發(fā)明的抗體可通過任何本領(lǐng)域已知的適宜方法來產(chǎn)生。由此，可使用純化的伸展的I型結(jié)構(gòu)作為抗原，任選使用佐劑，完全或不完全弗氏佐劑。本發(fā)明的抗體可包含多克隆抗體，但是由于對抗體的修飾以優(yōu)化在人中的使用以及優(yōu)化抗體本身的使用，優(yōu)選單克隆抗體，這是為了特定蛋白生產(chǎn)和操作的簡便。制備多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(Harlow et al. , Antibodies :a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed. (1988))。例如，可將如本文所示例的免疫原施用于各種宿主動物包括但不限于兔、小鼠、 駱駝科動物、大鼠等以誘導(dǎo)產(chǎn)生含有特異于伸展的I型鞘糖脂的多克隆抗體的血清。所述免疫原的施用可包括一或多次注射免疫劑以及佐劑(如果需要)?？墒褂酶鞣N佐劑以提高免疫學(xué)應(yīng)答，取決于宿主物種，其包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物油、 凝膠、鋁(氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍蛋白(KLH)、二硝基苯酚和潛在有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和短棒狀桿菌 (Corynebacterium parvum)?？墒褂玫淖魟┑牧硗獾睦影∕PL-TDM佐劑(單磷酰脂質(zhì) A、合成海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dicorynomycolate))。免疫方案是本領(lǐng)域所熟知的并且可以通過任何在所選的動物宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法來實行。由此，可在各種時間段內(nèi)使用各種施用途徑作為設(shè)計選擇。通常，通過多次皮下或腹膜內(nèi)、或者肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射來將免疫原(有或無佐劑)注射到哺乳動物內(nèi)。在某些情況下，可使用表達伸展的I型鞘糖脂的整個細胞。根據(jù)免疫原的性質(zhì)(即百分比疏水性、百分比親水性、穩(wěn)定性、凈電荷、等電點等)可對伸展的I 型鞘糖脂或其部分進行修飾或綴合以使其在經(jīng)免疫的動物如哺乳動物中有免疫原性或者更具免疫原性。例如可將伸展的I型鞘糖脂或其部分綴合至運載體。所述綴合包括通過衍生化在免疫原和要被綴合的免疫原性蛋白上均存在或者存在于任何一個上的活性化學(xué)官能團的化學(xué)綴合從而形成共價鍵或包括其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。此種運載體或免疫原性蛋白的例子包括但不限于KLH、卵白蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑和混雜的輔助T細胞肽?？墒褂酶鞣N佐劑以提高上述的免疫學(xué)應(yīng)答。一旦獲得適宜的制備物，可以通過已知的分離技術(shù)如親和層析、淘選(panning)、 吸收等等從多個抗體中分離特定的抗體。以此方式，可獲得單個抗體用于進一步的研究例如測序以獲得一或多個CDR的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體優(yōu)選包含單克隆抗體。單克隆抗體可使用雜交瘤技術(shù)制備， 如 Kohler et al. , Nature 256 :495(1975) ；U. S. Pat. No. 4, 376, 110 ；Harlow et al.,Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed. (1988)；禾口 Hammerling et al. , Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas, Elsevier (1981)所述，重組DNA方法，例如制備和使用轉(zhuǎn)染瘤，或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法?？捎糜谏a(chǎn)單克隆抗體的方法的其它例子包括但不限于人B-細胞雜交瘤技術(shù) (Kosbor et al. , Immunology Today 4 :72(1983)；禾口 Cole et al. , Proc Natl Acad Sci USA 80 :2026(1983))以及 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985))。此種抗體可以是包括 IgG、IgM、IgE、IgA 和IgD在內(nèi)的任何免疫球蛋白類別及其任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤可在體內(nèi)或體外培養(yǎng)。在雜交瘤模型中，對宿主如小鼠、人源化小鼠、具有人免疫系統(tǒng)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠、馬、綿羊、倉鼠、兔、大鼠、駱駝或任何其它適宜的宿主動物進行免疫以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的抗體的淋巴細胞?；蛘?，可在體外對淋巴細胞進行免疫。繼而使用適宜的融合劑如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies principles and Practice, Academic Press, pp.59-103(1986))。通常，在制備產(chǎn)生抗體的雜交瘤時，如果期望人來源的細胞則使用外周血淋巴細胞(“PBL”)或者如果期望非人哺乳動物來源時則使用脾細胞或淋巴結(jié)細胞。永生化的細胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞，尤其是嚙齒動物、?；蛉藖碓吹墓撬枇黾毎Ｍǔ＠么笫蠡蛐∈蠊撬枇黾毎??？蓪⑺鲭s交瘤細胞在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一或多種物質(zhì)抑制未融合的永生細胞的生長或存活。例如，如果親代細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于所述雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括阻止 HGPRT-缺陷型細胞生長的物質(zhì)次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培養(yǎng)基”)。優(yōu)選的永生化細胞系是這樣的細胞系，其有效融合、通過選擇的產(chǎn)抗體細胞來支持穩(wěn)定高水平的抗體生產(chǎn)以及對培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感。在骨髓瘤細胞系例如是鼠骨髓瘤系如源自M0PC-21和MPC-Il小鼠腫瘤的那些(可得自SaIk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif)和 SP2/0，F(xiàn)O 或 X63_Ag8_653 細胞(可得自 American Type Culture Collection，Manassas，VA)。也可使用小鼠骨髓瘤細胞系 NSO(European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK)。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細胞系也被描述用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J Immunol 133 :3001(1984) ；^PBrodeur et al. ,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker，Inc，pp. 51—63 (1987))。另一選擇是使用電融合而不是化學(xué)融合來形成雜交瘤。作為化學(xué)融合的替代， 可使用例如埃巴病毒或另一轉(zhuǎn)化基因來將B細胞永生化，參見例如Zurawaki et al.，在 Monoclonal Antibodies 中，ed. ,Kennett et al. ,Plenum Press,pp. 19-33. (1980)。也可使用表達免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠和移植了人B淋巴細胞的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠。測定雜交瘤細胞在其中生長的培養(yǎng)基中針對伸展的I型鞘糖脂的單克隆抗體的生產(chǎn)。雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克降抗體的結(jié)合特異性可以通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定如放射免疫測定(RIA)、熒光細胞計數(shù)分析(FACQ或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來確定。此種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的且在技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。如本領(lǐng)域所知，還可使用Biacore 系統(tǒng)。單克隆抗體對伸展的I型鞘糖脂的結(jié)合親和性可例如通過katchard分析來確定 (Munson et al. , Anal Biochem 107:220(1980))。在鑒定出生產(chǎn)所期望特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細胞之后，可以通過有限稀釋過程將所述克隆進行亞克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法生長(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986))。適宜的培養(yǎng)基包括例如 Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium(D-MEM)或者 RPMI-1640。另夕卜， 雜交瘤細胞可作為動物中的腹水性腫瘤在體內(nèi)生長。通過常規(guī)免疫球蛋白純化過程如例如蛋白A瓊脂糖、蛋白G瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠排阻層析、凝膠電泳、透析、或親和層析來將亞克隆所分泌的單克隆抗體適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基中分開或分離。本領(lǐng)域存在多種生產(chǎn)單克隆抗體的方法，因此本發(fā)明不限于它們僅僅在雜交瘤中的生產(chǎn)。例如，單克隆抗體可通過重組DNA方法來制備，如在美國專利號4，816，567中描述的?；蛘?，人抗體可得自轉(zhuǎn)基因動物，如上述的KM小鼠。在這個背景下，術(shù)語“單克隆抗體” 是指源自單一的真核、病毒或原核克隆的抗體。因此，使用已知表達伸展的I型鏈結(jié)構(gòu)的人癌細胞如Colo205細胞、或者含伸展的 I型鏈的化合物如鞘糖脂如Le1VLea作為抗原如本領(lǐng)域已知的那樣對近交或轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫和加強。獲得脾，細胞融合骨髓瘤細胞并且制成及培養(yǎng)雜交瘤細胞。使用例如Leb/ Lea作為捕獲試劑通過ELISA來篩選細胞上清。擴增陽性克隆。IMH2是特異性結(jié)合伸展的 I型鏈結(jié)構(gòu)的小鼠IgG3單克隆抗體的例子。使用轉(zhuǎn)基因小鼠模型，可通過用伸展的I型鏈免疫原免疫轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生人抗體。此種抗體可在付費的基礎(chǔ)上產(chǎn)生，例如通過Medarex，NJ和Amgen，CA。使用所述KM小鼠，選擇GNX-S(IgG1)單克隆抗體用于進一步的鑒別和使用。GNX-8是細胞毒性抗體。在使用Colo205結(jié)腸癌細胞作為靶的測定中，GNX-8裂解癌細胞系細胞并且于至少50 μ g/ml，抗體裂解培養(yǎng)物中所有的細胞。GNX-8不結(jié)合RBC。 所述抗體結(jié)合結(jié)腸癌細胞、乳腺癌細胞和肺癌細胞。與IMH2不同，GNX-8不結(jié)合Ley-Lex或 Ley0使用常規(guī)過程輕易地將編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA分離并測序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈或者來自人、人源化或其它來源的這種鏈的基因的 ^tlifSl^ff") (Innis et al. ^PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications 中，Academic (1990)禾口 Sanger et al. ,Proc Natl Acad Sci 74:5463(1977))。雜交瘤細胞可用作此種DNA的來源。一旦被分離，DNA可以被置入表達載體內(nèi)，其繼而被轉(zhuǎn)染入宿主細胞如不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的大腸桿菌細胞、NSO細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞以獲得單克隆抗體在重組宿主細胞內(nèi)的合成。DNA也可被修飾，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列取代同源鼠序列(美國專利號4，816，567 ；和Morrison et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81 :6851 (1984))或者通過共價接合至免疫球蛋白編碼序列，全部或部分的非免疫球蛋白多肽的編碼序列。此種非免疫球蛋白多肽可被取代為本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者可被取代為本發(fā)明抗體的一個伸展的I型鞘糖脂組合位點的可變結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生嵌合二價抗體?？贵w可以是單價抗體。制備單價抗體的方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾重鏈的重組表達。重鏈一般在F。區(qū)中任意點被截斷從而阻止重鏈交聯(lián)。或者，相關(guān)半胱氨酸殘基被另一種氨基酸殘基取代或者被缺失從而阻止交聯(lián)。識別特定表位的抗體片段可用已知技術(shù)產(chǎn)生。傳統(tǒng)上，那些片段來源于對完整抗體的蛋白醇消化(參見例如 Morimoto et al. ， J Biochem Biophys Methods 24: 107(1992)；和 Brennan et al. ,Science 2 :81 (1985))。例如，本發(fā)明的 Fab 和 F(ab, )2 片段可以通過使用酶如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab, )2片段)對免疫球蛋白分子的蛋白酶裂解而產(chǎn)生。F(ab, )2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈Cm結(jié)構(gòu)域。然而，那些片段可直接通過重組宿主細胞產(chǎn)生。例如，抗體片段可分離自抗體噬菌體文庫。或者，F(xiàn)(ab, )2-SH片段可直接從大腸桿菌移出并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab, )2片段(Carter et al.， Bio/Technology 10 163 (199 。根據(jù)另一方法，F(xiàn)(ab, )2片段可直接分離自重組宿主細胞培養(yǎng)物。用于產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(Fv)，參見例如WO 93/16185。對于一些用途，包括在人體內(nèi)使用抗體和體外檢測測定中，可以優(yōu)選使用嵌合、 人源化或人抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的，參見例如Morrison，Science 229 :1202(1985) ；Oi et al.，BioTechniques 4:214(1986) ；Gillies et al.，J Immunol Methods 125:191(1989)；和美國專利號 5，807，715 ;4，816，567 和 4，816397。人源化抗體源自在非人物種中生成的結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的抗體分子，其中一或多個CDR插入來自人免疫球蛋白分子的FR區(qū)中?？贵w可使用多種本領(lǐng)域已知技術(shù)人源化，包括例如 CDR嫁接(ΕΡ0 239，400 ；WO 91/09967 ；和美國專利號 5，225，539 ；5，530，101 ； 和 5，585，089)、飾面法或表面重整(ΕΡ0 592，106 ；EPO 519，596 ；Padlan, Molecular Immunology 28:489(1991) ；Studnicka et al. , Protein Engineering 7:805(1994)；禾口 Roguska et al.，Proc Natl Acad Sci USA 91 :969 (1994))、以及鏈改組(美國專利號 5，565，332)。人源化抗體具有一或多個來自非人來源的氨基酸殘基。非人氨基酸殘基經(jīng)常被稱作“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域。人源化可基本上按照Winter et al. (Jones et al. ,Nature 321 :522(1986) ；Riechmann et al. ,Nature 332 :323(1988)；禾口Verhoeyen et al. ,Science 239 :1534(1988))等所述方法進行，非人CDR或CDR序列的部分取代為人抗體的相應(yīng)序列。因此，此種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利號4，816，567)，其中基本上少于完整的人可變區(qū)已被來自非人物種的相應(yīng)序列取代。在實踐中，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點取代的人抗體。重鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)可來自任何類或亞類以獲得所期望的效果，如特定的效應(yīng)物功能。人構(gòu)架區(qū)中的構(gòu)架殘基經(jīng)?？捎脕碜訡DR供體抗體的相應(yīng)殘基取代以改變并可能改善抗原結(jié)合。構(gòu)架取代通過本領(lǐng)域已知的方法來鑒定，例如通過對CDR和構(gòu)架殘基相互作用建模來鑒定對抗原結(jié)合重要的構(gòu)架殘基以及通過序列對比來鑒定特定位點的異常構(gòu)架殘基，參見例如美國專利號5，585，089 ；和Riechmann et al.，Nature 332 323(1988)。進一步優(yōu)選的是人源化抗體保留對伸展的I型鞘糖脂的高親和性以及保留或者獲取其它有利的生物學(xué)性質(zhì)。因此，人源化抗體可通過如下方法制備，即通過用親代序列和人源化序列的三維模型來分析親代序列和各種概念上的人源化抗體衍生物。假定的三維免疫球蛋白模型是普遍可得的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。對所選的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)進行說明和展示的計算機程序是可得的。對所述展示的研究使得可以對某些殘基在所述候選免疫球蛋白序列的功能中所可能起到的作用進行分析，即對影響所述免疫球蛋白結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的能力的殘基進行分析。以此方式，可從受體和輸入序列選擇和組合FR殘基從而使所期望的抗體特性如對靶抗原提高的親和性最大化，雖然直接地和最本質(zhì)地影響伸展的I型鞘糖脂結(jié)合的是⑶R殘基。也可將⑶R區(qū)修飾為含有一或多個與從親代抗體(從其中獲得CDR)所獲得的不同的氨基酸以提供增強的或不同的感興趣特性如例如更高親和性或更大親和力的結(jié)合。可對抗體恒定區(qū)的某些部分進行操縱和改變以提供具有與親代抗體中觀察到的不同或更優(yōu)的特性的抗體同系物、衍生物、片段等。由此，例如許多IgG4抗體在鉸鏈區(qū)附近形成鏈間二硫鍵。所述鏈間鍵可使親代二價分子不穩(wěn)，形成包含重鏈及所關(guān)聯(lián)輕鏈的單價分子。此種分子可重新締合，但是在隨機的基礎(chǔ)上。另一組適宜于修飾的氨基酸包括影響抗體功能的鉸鏈區(qū)域內(nèi)的氨基酸，所述抗體功能如對含有重鏈(結(jié)合F。受體)的分子的結(jié)合以及所結(jié)合抗體的內(nèi)化。此種氨基酸包括在 IgGl 分子中從約 233 到約 237(Glu-Leu-Leu-Gly-Gly，SEQ ID NO 1)；從約 252 到約 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr, SEQ ID NO 2)和從約 318 (Glu)到約 331 (Pro)的殘基，包括例如 Lys320, Lys322 禾口 Pro329 O特別需要完全的人抗體以用于治療人類患者。人抗體可通過多種本領(lǐng)域已知的方法制備，包括上述使用源自人免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示方法，參見美國專利號 4,444,887 和 4,716，111 ；以及 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 和 WO 91/10741。Cole et al.和 Boerder et al.的技術(shù)也可用于人單克隆抗體的制備(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985)；禾口 Boemer et al. , J Immunol 147:86(1991))。人抗體也可使用轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生，所述小鼠不能表達功能性內(nèi)源免疫球蛋白，但其也表達某些人免疫球蛋白基因。例如，可將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合物隨機引入或通過同源重組引入到小鼠胚胎干細胞中。或者，除人重鏈和輕鏈基因之外，可將人可變區(qū)、恒定區(qū)和多變區(qū)引入到小鼠胚胎干細胞中。可通過由同源重組引入人免疫球蛋白基因座而對小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因進行處理從而使其分別或同時變成非功能性的。具體來說，JH區(qū)的純合性缺失阻止內(nèi)源抗體產(chǎn)生。將修飾的胚胎干細胞擴展并顯微注射到胚泡中以產(chǎn)生嵌合小鼠。繼而培育嵌合小鼠以產(chǎn)生表達人抗體的純合后代，參見例如 Jakobovitis et al. , Proc Natl Acad Sci USA 90:2551(1993) ；Jakobovitis et al., Nature 362:255(1993) ；Bruggermann et al. ,Year in Immunol 7:33(1993)；禾口Duchosal et al. , Nature 355:258(1992))。以正常方式用伸展的I型鞘糖脂對轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫，例如用伸展的I型鞘糖脂的全部或部分或者用含有其的膜制備物?？墒褂贸Ｒ?guī)雜交瘤技術(shù)從經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得針對伸展的I型鞘糖脂的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠所攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細胞分化期間重排并隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變。因此，使用此技術(shù)可以產(chǎn)生治療上有用的IgG，IgA, IgM和IgE抗體。綜述參見Lonberg et al.，Int Rev Immunol 13:65-93(19%)。產(chǎn)生人抗體和人單克隆抗體的討論和產(chǎn)生此種抗體的方案參見例如 WO 98/24893 ；WO 92/01047 ；WO 96/34096 ；和 WO 96/33735 ；EPO No. 0 598 877 ； 和美國專利號 5，413，923 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，569，825 ；5，661，016 ；5，545，806 ； 5，814，318 ；5，885，793 ；5，916，771 ；和 5，939，598。另外，可在公司如 Amgen (Fremont，CA)， Genpharm(San Jose，CA)和 Medarex，Inc. (Princeton, NJ)中預(yù)定使用類似于上述技術(shù)來提供針對伸展的I型鞘糖脂的人抗體。也可通過免疫移植了人外周血白細胞、脾細胞或骨髓的小鼠而制備人mAb (例如 XTL Biopharmaceuticals, Israel 的三雜交瘤(trioma)技術(shù))。可使用稱作“導(dǎo)向選擇(guided selection)，，的技術(shù)產(chǎn)生識別所選表位的完全人抗體。在此方法中，使用選擇的非人單.克隆抗體例如小鼠抗體來對識別相同表位的完全人抗體的選擇進行導(dǎo)向(Jespers et al. , Bio/Technologyl2 899 (1988)) 當(dāng)使用重組技術(shù)時，抗體變體可在周質(zhì)間隙中于細胞內(nèi)產(chǎn)生或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果所述抗體變體在細胞內(nèi)產(chǎn)生，作為第一步，可通過例如離心或超濾將顆粒性碎片 (宿主細胞或裂解片段)去除。Carter et al. , Bio/Technology 10 =163(1992)描述了用于分離被分泌到大腸桿菌周質(zhì)間隙中的抗體的方法。簡短來說，使細胞團(cell paste)暴露于醋酸鈉(PH 3. 5)和EDTA?？赏ㄟ^離心來去除細胞碎片。當(dāng)抗體變體被分泌到培養(yǎng)基中時，通常首先使用商業(yè)可購的蛋白濃縮濾器對來自此種表達系統(tǒng)的上清進行濃縮，例如使用Amicon或Millipore Pellicon超濾單元?？梢砸氲鞍酌敢种苿┤鏟MSF以抑制蛋白水解并且可包括抗生素以阻止偶發(fā)污染物的生長?？墒褂美缌u基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化從所述細胞中制備的抗體組合物。蛋白A或蛋白G作為親和性配體的適宜性取決于抗體變體中存在的免疫球蛋白F。結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人IgGl，IgG2或IgG4重鏈的抗體(Lindmark et al.，J Immunol Meth 62:1(1983))。蛋白G可用于小鼠同種型和 AlgG3 (Guss et al. , EMBO J 5:1567(1986))。親和性配體所附著的基質(zhì)最常見的是瓊脂糖，但也可使用其它基質(zhì)。機械上穩(wěn)定的基質(zhì)如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基) 苯允許與使用瓊脂糖相比較快的流速和較短的加工時間。當(dāng)抗體變體含有C03結(jié)構(gòu)域時， Bakerbond ABXTM樹脂(JT Baker ；Phillipsburg, NJ)可用于純化。取決于要回收的抗體或變體，也可用其它蛋白純化技術(shù)，如在離子交換柱上的分級分離、乙醇沉淀、反相HPLC、硅膠上的層析、肝素瓊脂糖上的層析陰離子或陽離子樹脂上的層析(如聚天冬氨酸柱)、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。在任何初步純化步驟之后，可以使包含感興趣的抗體或變體以及污染物的混合物經(jīng)受低PH疏水相互作用層析，其中使用pH介于約2. 5-4. 5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度下(例如從約0-0. 25M的鹽)進行。此外，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，本發(fā)明的抗體可依次被用于產(chǎn)生“模擬” 伸展的I型鞘糖脂的抗獨特型抗體。(參見例如Greenspan et al. ,FASEB J 7:437(1989)； ^PNissinoff, J Immunol 147:2429(1991))。例如，結(jié)合伸展的I型鞘糖脂并競爭性抑制配體與伸展的I型鞘糖脂的多聚化和/或結(jié)合的抗體可用于產(chǎn)生“模擬”伸展的I型鞘糖脂的抗獨特型抗體。此種中和性抗獨特型抗體或此種抗獨特型抗體的Fab片段可用于治療或診斷方案。本發(fā)明的抗體可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體可以是單克降抗體，優(yōu)選是人抗體或人源化抗體，是對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的抗體。在本發(fā)明中，結(jié)合特異性之一是針對伸展的I型鞘糖脂，而另一個特異性可以是對任何其它抗原，如細胞表面蛋白、受體、受體亞基、配體、組織特異性抗原、病毒蛋白、病毒編碼的包膜蛋白、藥物活性劑如藥物、細菌來源蛋白、細菌表面蛋白等。制備雙特異性抗體的方法是熟知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達，其中所述兩種重鏈具有不同的特異性(Milstein et al.，Nature 305 :537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機相配，雜交瘤(四瘤 (quadromas))產(chǎn)生約10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有約1種可能具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對正確分子的純化通常通過親和層析步驟完成。類似方法在WO 93/08829 和Traunecker et al.，EMBO J 10:3655(1991)中公開。其它制備雙特異性抗體的方法在例如 Kufer et al. , Trends Biotech 22 :238_244，2004 中提供。具有所期望結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域可被融合至免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。所述融合優(yōu)選與包含至少部分鉸鏈區(qū)、Ch2和Ch3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域進行。 其可以具有第一個重鏈恒定區(qū)(Cm)，其含有在融合體至少一個中存在的輕鏈結(jié)合必需位點。編碼免疫球蛋白重鏈融合體和免疫球蛋白輕鏈(如果需要)的DNA被插入到獨立的表達載體中并被共轉(zhuǎn)化至適宜的宿主生物體內(nèi)。對于生成雙特異性抗體的進一步細節(jié)參見例如 Suresh et al.，Meth Enzym 121 :210 (1986)。本發(fā)明還慮及異源綴合(heteroconjugate)抗體。異源綴合抗體由兩種共價接合的抗體組成。此種抗體已經(jīng)例如被提議為使免疫系統(tǒng)細胞靶向于不希望的細胞(美國專利號4，676，980)。所述抗體被構(gòu)想可使用合成蛋白化學(xué)中已知的方法體外制備，包括使用涉及交聯(lián)劑的那些。例如，可使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫酯鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于此目的的適宜試劑的例子包括亞氨基硫醇鹽/酯(iminothiolate)和甲基_4_巰基丁亞氨酸鹽/酯以及例如在美國專利號4，676，980中公開的那些。另外，可以生成針對伸展的I型鞘糖脂的單結(jié)構(gòu)域抗體。所述技術(shù)的例子已經(jīng)在 W09425591中描述用于源自駱駝科重鏈Ig的抗體以及在US20030130496中描述了來自噬菌體文庫的單結(jié)構(gòu)域完整人抗體的分離?；蛘?，可以進行描述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利號4，946，778;Bird， Science 242:423(1988) ；Huston et al. , Proc Natl Acad Sci USA 85:5879(1988)；和 Ward et al. ,Nature 334:544(1989))。通過將Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段經(jīng)氨基酸橋連接來形成單鏈抗體，產(chǎn)生單鏈多肽。也可使用在大腸桿菌中組裝功能性Fv片段的技術(shù)(Skerra et al. ,Science 242 1038 (1988)) 0單鏈抗體(“scFv")和它們的構(gòu)建方法在例如美國專利號4，946，778中描述。或者，可以用類似方法構(gòu)建和表達Fab。所有完整的或部分的人抗體可以比完整的鼠mAb具有較低的免疫原性，而片段和單鏈抗體也可以有較低的免疫原性。本發(fā)明涵蓋了重組融合至或化學(xué)綴合(包括共價和非共價綴合)至多肽的抗體。 本發(fā)明的融合或綴合抗體可用于簡化純化，參見例如WO 93/21232 ；EP 439, 095 ；Naramura et al. , Immunol Lett 39:91(1994)；美國專利號 5，474，981 ;Gillies et al. ,Proc NatlAcad Sci USA 89:1428(1992)；禾口 Fell et al.，J Immunol 146:2446(1991)?？赏ㄟ^使用識別標(biāo)記或標(biāo)簽來輔助純化。例如，所述標(biāo)記可以是氨基酸序列，如六組氨酸肽，如PQE載體OliagenJnc.，Chatsworth，CA)中提供的標(biāo)簽，例如其很多都是商業(yè)可購的，Gentz et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 86:821(1989)。其它可用于純化的肽標(biāo)簽包括但不限于"HA"標(biāo)簽，其對應(yīng)于源自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson et al., Cell 37 :767(1984))和〃 flag"標(biāo)簽?？贵w或抗體片段可分離自抗體噬菌體文庫，所述文庫使用McCafTerty et al., Nature 348 :552(1990)中描述的技術(shù)產(chǎn)生。Clarkson et al.，Nature 352 :624(1991)和 Marks et al. ,J MoI Biol 222 :581 (1991)分別描述了使用噬菌體文庫對鼠和人抗體的分離。隨后的出版物描述了通過鏈改組產(chǎn)生高親和性(nM范圍)人抗體(Marks et al. ,Bio/ Technology 10 :779(1992))以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse et al.，Nucl Acids Res 21 :2洸5(1993))。因此，所述技術(shù)是對用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代。如本領(lǐng)域所知的那樣，候選抗伸展的I型鞘糖脂抗體可通過酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、FACS、蛋白免疫印記或其它免疫化學(xué)技術(shù)測試。因此，可使用B細胞或表達伸展的 I型鞘糖脂的細胞使用已知技術(shù)檢測結(jié)合其的抗體或者可將含伸展的I型鞘糖脂或其部分的適宜膜制備物、或者純化或分離的伸展的I型鏈結(jié)構(gòu)附著于固相并用作測定中的捕獲元件，如設(shè)計選擇所設(shè)置。為確定特定抗體同系物是否結(jié)合人伸展的I型鞘糖脂，可使用任何常規(guī)的結(jié)合測定?？捎玫纳煺沟腎型鞘糖脂結(jié)合測定包括FACS分析、ELISA測定、放射免疫測定等，其檢測抗體對人伸展的I型鞘糖脂的結(jié)合及從其中所導(dǎo)致的功能。本文教導(dǎo)的人伸展的I型鞘糖脂的全長和可溶形式在此種測定中有用?？赏ㄟ^使用對抗體或其同系物所源自的物種的免疫球蛋白有特異性的第二抗體來方便地檢測所述抗體或同系物對伸展的I型鞘糖脂或其可溶性片段的結(jié)合。所述第二抗體可攜有可檢測標(biāo)記或者被設(shè)置為被檢測?？赏ㄟ^測試抗體或同系物結(jié)合人伸展的I型鞘糖脂+細胞的能力來對所述抗體或同系物結(jié)合人伸展的I型鞘糖脂的能力進行評估。適宜用于確定特定抗體或同系物是否結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的伸展的I型鞘糖脂+細胞是表達伸展的I型鞘糖脂如在細胞表面表達伸展的I型鞘糖脂的可得的哺乳動物組織培養(yǎng)細胞。可通過將細胞染色來檢測抗體或同系物對伸展的I型鞘糖脂+細胞的結(jié)合，所述染色可使用例如熒光標(biāo)記的第二抗體，所述第二抗體對測試的抗體同系物所源自的相同物種的免疫球蛋白有特異性。熒光激活細胞分選儀(“FACS“)可用于檢測和定量任何結(jié)合， 一般參見Shapiro，Practical Flow Cytometry，Alan R. Liss, Inc. ,New York,N. Y. (1985)。為確定特定抗體或同系物是否不引起體內(nèi)循環(huán)的伸展的I型鞘糖脂+細胞數(shù)目的顯著降低，在將所述抗體或同系物施用于具有正常免疫功能的哺乳動物后的M小時內(nèi)，對分離自所述哺乳動物的循環(huán)的伸展的I型鞘糖脂+細胞的數(shù)目進行定量并與施用前的數(shù)目進行對比或者與對照哺乳動物的數(shù)目進行對比，所述對照哺乳動物中施用了不相關(guān)特異性的同種型匹配抗體或同系物來代替本發(fā)明的抗體或同系物。在用伸展的I型鞘糖脂抗體或其功能性部分或衍生物給藥的動物內(nèi)對伸展I型鞘糖脂+細胞的定量可例如通過用結(jié)合抗-伸展的I型鞘糖脂抗體的熒光標(biāo)記的抗體以及標(biāo)記的特異于τ細胞和B細胞的抗體染色所獲得的細胞、隨后通過FACS分析進行。本發(fā)明的抗體可以用所述抗體識別或特異性結(jié)合的表位或伸展的I型鞘糖脂的部分描述或者詳細說明。所述表位可如本文所述的那樣進行詳細說明，例如通過物理方式如質(zhì)譜、糖類的成分分析、糖所結(jié)合的分子、構(gòu)象表位等等。本發(fā)明的抗體還可以用交叉反應(yīng)性進行描述或者詳細說明。與伸展的I型鞘糖脂具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少 60%、至少55%和至少50%相同性(使用本領(lǐng)域已知和本文所述方法計算)的結(jié)合伸展的 I型鞘糖脂的抗體也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的抗體還可以用對感興趣的伸展的I型鞘糖脂的結(jié)合親和性來進行描述或者詳細說明?？?伸展的I型鞘糖脂抗體可以低于約1(ΓΜ、低于約10_6Μ、或低于約10_5Μ 的Kd結(jié)合。感興趣抗體中較高的結(jié)合親和性可以是有益的，如具有如下平衡解離常數(shù)或Kd 的那些從約10_8到約KT15M或更多、從約10_8到約10_12M、從約10_9到約10-"Μ、或從約10_8 到約10_1(ΙΜ。本發(fā)明也提供競爭性抑制抗體對本發(fā)明表位結(jié)合的抗體，這是通過任何本領(lǐng)域已知的確定競爭性結(jié)合的方法來確定的，例如本文所述的免疫測定。在優(yōu)選的實施方案中， 所述抗體競爭性地將對所述表位的結(jié)合抑制至少95 %、至少90 %、至少85 %、至少80 %、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。本發(fā)明還包括包含感興趣抗體的綴合物。所述綴合物包含兩種主要組分，感興趣的抗體和第二種組分，其可以是細胞結(jié)合劑、細胞毒性劑、藥物活性劑、藥物等等。如本文所用，術(shù)語“細胞結(jié)合劑”是指特異識別和結(jié)合細胞表面上分子的物質(zhì)。由此，所述細胞結(jié)合劑可以是結(jié)合CD抗原、病原體抗原如病毒抗原、分化抗原、癌癥抗原、細胞特異抗原、組織特異性抗原、Ig或類Ig分子等等的物質(zhì)。細胞結(jié)合劑可以是任何現(xiàn)在已知的類型、或變得已知的類型，包括肽、非肽、糖類、 核酸、配體、受體等等、或者其組合。所述細胞結(jié)合劑可以是能夠以特異性或非特異性方式結(jié)合細胞的任何化合物。通常，所述結(jié)合劑可以是抗體(特別是單克隆抗體)、淋巴因子、激素、生長因子、維生素、營養(yǎng)轉(zhuǎn)運分子(如轉(zhuǎn)鐵蛋白)、或任何其它細胞結(jié)合分子或物質(zhì)?？墒褂玫募毎Y(jié)合劑的其它例子包括多克隆抗體；單克隆抗體；和抗體的片段如 Fab、Fab, , F(ab, )2 禾口 Fv 片段(Parham, J. Immunol. 131 :2895-2902(1983) ；Spring et al. ，J. Immunol. 113 :470-478(1974)；禾口 Nisonoff et al. ，Arch. Biochem. Biophys. 89 230-244(1960))ο所述第二種組分還可以是細胞毒性劑。如本文所用的術(shù)語“細胞毒性劑”是指降低或阻斷細胞的功能或生長和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。由此，所述細胞毒性劑可以是紫杉醇、美登木素生物堿(maytansinoid)如DMl或DM4、CC-1065或CC-1065類似物、蓖麻毒蛋白、藥物、絲裂毒素C等等。在一些實施方案中，所述細胞毒性劑與本發(fā)明綴合物的任何結(jié)合劑一樣直接或者經(jīng)可裂解或不可裂解的接頭共價附著于感興趣的抗體。適宜的美登木素生物堿的例子包括美登木醇和美登木醇類似物。美登木素生物堿抑制微管形成且對哺乳動物細胞具高度毒性。適宜的美登木醇類似物的例子包括具有修飾的芳香環(huán)的那些和在其它位置有修飾的那些。這種適宜的美登木素生物堿在美國專利號4，424，219 ；4, 256，746 ；4, 294，757 ； 4，307，016 ；4，313，946 ；4，315，929 ；4，331，598 ；4，361，650 ；4，362，663 ；4，364，866 ；4，450，254 ；4，322，348 ；4，371，533 ；6，333，410 ；5，475，092 ；5，585，499 ；和 5，846，545 中描述。具有修飾的芳香環(huán)的適宜的美登木醇類似物的例子包括(1)C-19-脫氯(美國專利號4，256，746)(通過例如安絲菌素(ansamytocin)P2的LAH還原來制備)；羥基 (或C-20-脫甲基)+/-C-19-脫氯(美國專利號4，361，650和4，307，016)(通過例如使用鏈霉菌或放線菌的脫甲基化或者使用氫化鋁鋰(LAH)的脫氯作用來制備)；和(3)C-20-脫
甲氧基，具有其它位置修飾的適宜的美登木醇類似物的例子包括(l)C-9-SH(美國專利號4，424，219)(通過美登木醇與H2S或Pj5的反應(yīng)而制備)；(2) C-14-烷氧甲基(脫甲氧基/CH2OR)(美國專利號4，331，598) ； (3) C-14-羥甲基或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利號4，450，254)(從諾卡菌屬制備)J4)C-15-羥基/酰氧基(美國專利號4，364，866) (通過由鏈霉菌對美登木醇的轉(zhuǎn)化而制備)；(5)C-15-甲氧基(美國專利號4，313，946 和4，315，929)(分離自滑桃樹(Trewia nudiflora)) ； (6)C-18-N-脫甲基(美國專利號 4，362，663和4，322，348)(通過由鏈霉菌對美登木醇的脫甲基化而制備)；和(7) 4，5-脫氧 (美國專利號4，371，533)(通過美登木醇的三氯化鈦/LAH還原而制備)?？赏ㄟ^體外方法來制備胞毒性綴合物。為了將毒性劑、藥物或前體藥物連接至抗體，普遍使用連接基團。適宜的連接基團是本領(lǐng)域已知的且包括二硫化物基團、硫醚基團、 酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團和酯酶不穩(wěn)定基團。例如可通過二硫化物交換反應(yīng)或通過在感興趣的抗體和藥物或前體藥物之間形成硫醚鍵而構(gòu)建綴合物。綴合至感興趣抗體的分子可以是具有藥理活性的分子，如藥物如小分子或生物制劑。因此，所述生物制劑可以例如是細胞因子。所述分子可以是前體藥物，如藥物酯。所述分子可以是放射性核素。如上所述，本發(fā)明提供編碼本文公開的抗體或其功能性變體的分離的核酸序列、 包含編碼本發(fā)明的伸展的I型鞘糖脂結(jié)合多肽的核苷酸序列的載體構(gòu)建體、包含此載體的宿主細胞以及生產(chǎn)結(jié)合伸展的I型鞘糖脂的多肽的重組技術(shù)。所述載體通常含有本領(lǐng)域已知的組分且一般包括但不限于下列的一或多種信號序列、復(fù)制起點、啟動子、PolyA序列、一或多個標(biāo)記或選擇基因、輔助和/或增強翻譯的序列、增強子元件等等。因此，表達載體包括可操縱地連接至此種適宜的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)核苷酸序列(如源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的那些)的核苷酸序列。另外的調(diào)節(jié)序列的例子包括操縱基因、mRNA核糖體結(jié)合位點和/或其它控制轉(zhuǎn)錄和翻譯(如其起始和終止)的適當(dāng)序列。當(dāng)調(diào)節(jié)序列功能性涉及適當(dāng)多肽的核苷酸序列時，則核苷酸序列是“可操縱地連接的”。因此，如果啟動子核苷酸序列控制核苷酸序列(例如抗體重鏈序列)的轉(zhuǎn)錄則所述啟動子核苷酸序列是可操縱地連接于所述抗體重鏈序列的。另外，可在表達載體中摻入并不與抗體重鏈和/或輕鏈序列天然關(guān)聯(lián)的編碼適當(dāng)信號肽的序列。例如，可將信號肽(分泌前導(dǎo)序列)的核苷酸序列于框內(nèi)融合至多肽序列從而使抗體被分泌至周質(zhì)間隙或培養(yǎng)基中。在要使用的宿主細胞內(nèi)有功能的信號肽增強了適當(dāng)抗體或其部分的細胞外分泌。所述信號肽可以在抗體從細胞分泌時從所述多肽裂解。 此種分泌信號的例子是本領(lǐng)域所熟知的，包括例如美國專利號5，698，435 ；5, 698，417 ；和 6，204, 023中描述的那些。
所述載體可以是質(zhì)粒、單鏈或雙鏈病毒載體、單鏈或雙鏈RNA或DNA噬菌體載體、 噬菌粒、粘?；蚋信d趣轉(zhuǎn)基因的任何其它運載體?？梢酝ㄟ^眾所周知的將DNA和RNA引入細胞內(nèi)的技術(shù)來將此種載體作為多核苷酸引入細胞內(nèi)。所述載體在噬菌體和病毒載體的情況中還可以通過眾所周知的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)而作為包裝的或包囊的病毒或病毒樣顆粒而引入細胞內(nèi)。病毒載體可以是可復(fù)制的或者是復(fù)制缺陷的。在后者的情況下，病毒增殖通常將僅在互補宿主細胞并使用攜有產(chǎn)生顆粒所需的各種病毒組分的多個載體時發(fā)生。也可使用無細胞翻譯系統(tǒng)使用源自現(xiàn)有感興趣DNA構(gòu)建體的RNA來產(chǎn)生蛋白(參見例如WO 86/05807 和 WO 89/01036 ；及美國專利號 5，122，464)。本發(fā)明的抗體可從任何事宜的宿主細胞中表達?？捎糜诒景l(fā)明的宿主細胞的例子包括原核、酵母或真核細胞且包括但不限于微生物如細菌(例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯菌屬 (Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia) 和志賀氏菌屬(Shigella)以及芽孢桿菌屬(Bacilli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈霉菌屬)，其轉(zhuǎn)化了含有感興趣抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒 DNA表達載體；酵母(例如酵母菌屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、放線菌 (Actinomycetes)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、 念珠菌屬(Candida)、木霉屬(Trichoderma)、鏈孢霉屬(Neurospora)和絲狀真菌如鏈孢霉屬、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉(Tolypocladium)和曲霉菌屬(Aspergillus))，其轉(zhuǎn)化了含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體；感染了含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體 (例如桿狀病毒)的昆蟲細胞系統(tǒng)；感染了含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV或煙草花葉病毒TMV)或轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒表達載體(例如Ti質(zhì)粒) 的植物細胞系統(tǒng)；或者攜帶含有源自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子或者痘病毒7. 啟動子)的重組表達構(gòu)建體的哺乳動物細胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK,293或3T3細胞)。用于原核宿主細胞的表達載體通常包含一或多種表型可選擇標(biāo)記基因。表型可選擇標(biāo)記基因是例如編碼賦予抗生素抗性或供應(yīng)自養(yǎng)需求的蛋白的基因?？捎糜谠怂拗骷毎谋磉_載體的例子包括那些源自商業(yè)可購質(zhì)粒如pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)> pGEMl(Promega Biotec, Madison, WI)、 pET(Novagen, Madison，WI)和 pRSET (Invitrogen，Carlsbad，CA)系列的載體(Studier，J MoI Biol 219 37(1991) jPkhc^pfer，Gene 124 :83(1993))的那些。普遍用于重組原核宿主細胞表達載體的啟動子序列包括T7 (Rosenberg et al.，Gene 56 :125 (1987))、β -內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖啟動子(Chang et al.，Nature 275 :615(1978)；和Goeddel et al.，Nature 281 544(1979))、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel et al.，Nucl Acids Res 8 :4057(1980)) 禾口 tac 啟(Sambrook et al.，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory(1990))。酵母載體經(jīng)常會含有復(fù)制起點序列，如來自2 μ酵母質(zhì)粒，自主復(fù)制序列(ARS)、 啟動子區(qū)、用于多聚腺苷酸化的序列、用于轉(zhuǎn)錄終止的序列和可選擇標(biāo)記基因。適于酵母載體的啟動子序列包括例如金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman et al.，J Biol Chem 255 :2073(1980))或其它糖酵解酶(Holland et al.，Biochem 17 :4900(1978))如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動子。其它用于酵母表達的適宜載體和啟動子在Fleer et al. , Gene 107 285(1991)中進一步描述。其它用于酵母和酵母轉(zhuǎn)化方案的適宜啟動子和載體是本領(lǐng)域已知的。酵母轉(zhuǎn)化方案是眾所周知的。Hinnen et al.，Proc Natl Acad Sci 75 =1929(1978) 描述了一個此種方案，其在選擇性培養(yǎng)基中選擇Trp+轉(zhuǎn)化體。任何真核細胞培養(yǎng)物均是可行的，無論來自脊椎動物或非脊椎動物。例子包括植物和昆蟲細胞(Luckow et al. , Bio/Technology 6:47(1988) ；Miller et al. , Genetic Engineering,Setlow et al. ,eds. , vol. 8,pp. 277-9,Plenum Publishing(1986)；禾口Maeda et al. , Nature 315:592(1985))。例如，桿狀病毒系統(tǒng)可用于生產(chǎn)異源蛋白。在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)可被用作載體表達外源基因。所述病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中生長?？蓪⒖贵w編碼序列克隆在AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制下。其它已被鑒定的宿主包括伊蚊、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)和家蠶(Bombyx mori)。多種用于轉(zhuǎn)染的病毒株是公共可得的，例如AcNPV 的L-I變體和家蠶NPV的Bm-5株。此外，如本領(lǐng)域所知的，棉花、谷類、馬鈴薯、大豆、牽?；ā⒎?、藻類、浮萍和煙草的植物細胞培養(yǎng)物也可用作宿主。脊椎動物細胞和脊椎動物細胞的繁殖在培養(yǎng)物中(組織培養(yǎng))可以是常規(guī)過程，雖然挑剔的細胞系需要例如具有獨特因子、飼養(yǎng)細胞等的專門培養(yǎng)基，參見Tissue Culture,Kruse et al.，eds. ,Academic Press (1973)。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子有猴腎臟；人胚胎腎臟；幼倉鼠腎臟；中國倉鼠卵巢(CHO, Urlaub et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 77 :4216(1980))；小鼠Sertoli ；人宮頸癌(例如HeLa)；犬腎臟；人肺；人肝臟； 小鼠乳腺腫瘤；和NSO細胞。由用于抗體生產(chǎn)的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有生長因子、維生素、礦物質(zhì)等等以及適于所使用的細胞和載體的誘導(dǎo)物。普遍使用的啟動子序列和增強子序列源自例如多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40 (SV40)和人巨細胞病毒 (CMV)。源自SV40病毒基因組的DNA序列可用于為哺乳動物宿主細胞中結(jié)構(gòu)基因序列的表達提供其它遺傳元件，例如SV40起點、早期和晚期啟動子、增強子、剪接和多聚腺苷酸化位點。病毒早期和晚期啟動子尤其有用，因為二者均易于作為片段而得自病毒基因組，其也可含有病毒復(fù)制起點。用于在哺乳動物宿主細胞中的示例性表達載體是商業(yè)可購的。商業(yè)可購的培養(yǎng)基如Ham' s F10, Minimal Essential Medium(MEM). RPMI-1640 和 Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium(DMEM)適用于培養(yǎng)宿主細胞。另外，在 Ham et al.，Meth Enzymol 58 :44(1979)禾口 Barnes et al.，Anal Biochem 102 :255(1980)以及在美國專利號 4，767，704 ；4，657，866 ；4，560，655 ；5，122，469 ；5，712，163 ；或 6，048，728 中描述的任何培養(yǎng)基均可以用作宿主細胞的培養(yǎng)基。任何這些培養(yǎng)基均可在需要時補加激素和/或其它生長因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化物如氯化鈉、氯化鈣、或氯化鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如腺嘌呤和胸苷)、抗生素、微量元素(其可以被定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)和葡萄糖或等價能量來源。根據(jù)沒計選擇，可以適當(dāng)?shù)臐舛劝ㄈ魏纹渌匾难a充物。培養(yǎng)條件如溫度、PH 等如本領(lǐng)域已知的那樣適宜于細胞并使得轉(zhuǎn)基因能進行期望的表達。
可使用任何本領(lǐng)域已知的方法來獲得感興趣的多核苷酸并確定所述多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，則編碼所述抗體的多核苷酸序列可以由化學(xué)合成的寡核苷酸組裝(例如在Kutmeier et al.，Bio/Techniques 17 :242 (1994)中描述)并繼而通過例如PCR擴增連接的寡核苷酸?；蛘?，編碼抗體的多核苷酸可以從表達其的細胞的核酸而產(chǎn)生。如果沒有含編碼特定抗體的核酸的克降，但是抗體分子的序列已知，則編碼該免疫球蛋白的核酸可得自適當(dāng)來源，如文庫，其可以是特異于產(chǎn)抗體細胞的文庫，所述產(chǎn)抗體細胞如是被選擇用來表達本發(fā)明抗體的雜交瘤細胞?？梢耘渲七m宜的引物用于PCR擴增。由PCR產(chǎn)生的擴增的核酸可繼而用任何本領(lǐng)域已知的方法來克隆到可復(fù)制克隆載體中。一旦確定了核苷酸序列以及相應(yīng)的抗體氨基酸序列，則可以操縱該抗體的核苷酸序列以獲得本文所述感興趣的等價物，使用本領(lǐng)域已知的用于操縱核苷酸序列的方法例如重組DNA技術(shù)、定點誘變、PCR等(參見例如Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory(1990)；禾口 Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998))產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體，例如產(chǎn)生氨基酸取代、缺失和/或插入。可通過眾所周知的方法來檢查重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列以鑒定 CDR的序列，例如通過與其它重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序列的對比來確定序列高變區(qū)。使用常規(guī)重組DNA技術(shù)，可將一或多個所述⑶R插入構(gòu)架區(qū)內(nèi)，例如如前所述插入到人構(gòu)架區(qū)內(nèi)以人源化非人抗體。通過組合所述構(gòu)架區(qū)以及一或多個CDR所產(chǎn)生的感興趣多核苷酸編碼特異性結(jié)合伸展的I型鞘糖脂或者至少由此識別的碳水化合物表位和結(jié)構(gòu)的分子。例如，此方法可用于進行一或多個半胱氨酸殘基(參與鏈內(nèi)二硫鍵)的氨基酸取代或缺失以產(chǎn)生缺乏一或多個鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。本發(fā)明的抗體或抗體片段可用于在體內(nèi)或體外檢測生物樣品中伸展的I型鞘糖脂，及因此可檢測表達伸展的I型鞘糖脂的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗伸展的I 型鞘糖脂抗體用于確定組織中或源自該組織的細胞中伸展的I型鞘糖脂的存在以及水平。 該組織或活組織檢查中伸展的I型鞘糖脂的水平可在例如使用本發(fā)明抗體或抗體片段的免疫測定中確定。其組織或活組織檢查可以是冷凍的或固定的。同樣方法或其它方法可用于確定伸展的I型鞘糖脂的其它特性，如其水平、細胞定位等等。上述方法可用于例如在已知患有或懷疑患有癌癥的對象中診斷癌癥，其中在所述患者中測量的伸展的I型鞘糖脂的水平與正常參照對象或標(biāo)準(zhǔn)進行對比。本發(fā)明還提供被進一步標(biāo)記以用于研究或診斷應(yīng)用的單克隆抗體、人源化抗體和其表位結(jié)合片段。在一些實施方案中，所述標(biāo)記例如是放射性標(biāo)記、熒光團、生色團、顯像劑或金屬離子。還提供了診斷方法，其中將所述標(biāo)記的抗體或其表位結(jié)合片段施用于懷疑患有癌癥、關(guān)節(jié)炎、自身免疫疾病或其它涉及伸展的I型鞘糖脂表達和/或功能或者由伸展的I型鞘糖脂表達和/或功能引起或與伸展的I型鞘糖脂表達和/或功能相關(guān)的疾病的對象，并且對該標(biāo)記在所述對象體內(nèi)的分布進行測量和監(jiān)測。本發(fā)明的抗體及其片段可用作親和性純化劑。在此方法中，使用本領(lǐng)域已知方法將抗體固定于固相上如右旋糖酐或瓊脂糖、樹脂或濾紙。所述固定的抗體與含有樣品接觸
對于診斷應(yīng)用，通常會用可檢測部分或標(biāo)記標(biāo)記感興趣的抗體?？捎玫挠性S多標(biāo)記，其通?？煞譃槿缦骂悇e(a)放射性同位素，如siS, 14C, 125L3H和131I (可使用例如 Current Protocols in Immunology,vol. 12,Coligen et al. , ed. ,Wiley-Interscience, New York(1991)中所述技術(shù)來將抗體用放射性同位素標(biāo)記并且可使用閃爍計數(shù)測量放射性)；(b)熒光標(biāo)記，如稀土螯合物(銪螯合物)、熒光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰、麗絲胺、藻紅蛋白和德克薩斯紅，可例如使用前述Current Protocols in Immunology中公開的技術(shù)將熒光標(biāo)記綴合到抗體上，其中可使用熒光計來對熒光進行定量；和(c)可使用各種酶底物標(biāo)記(美國專利號4，275，149提供綜述)，酶通常催化產(chǎn)色底物的化學(xué)改變，可使用各種技術(shù)對其進行測量，例如酶可催化底物的顏色改變，可對其進行分光光度測量，或者酶可以改變底物的熒光或者化學(xué)發(fā)光。對熒光中的變化進行定量的技術(shù)是已知的，例如使用光度計，或者所述標(biāo)記供應(yīng)能量給熒光受體。酶標(biāo)記的例子包括熒光素酶(例如螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶；美國專利號4，737，456)、熒光素、2，3- 二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、 β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖類氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。將酶綴合至抗體的技術(shù)在0' Sullivan et al.，Meth Enz, ed. Langone & Van Vunakis, Academic Press, New York,73(1981)巾ffii$。當(dāng)使用此種標(biāo)記時，有適宜的底物，如(i)對于辣根過氧化物酶有過氧化氫酶作為底物，其中過氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3' ,5,5'-四甲基鹽酸聯(lián)苯胺(TMB)) ； (ii)對于堿性磷酸酶(AP)有對-硝基苯磷酸作為生色底物；和(iii) β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)有生色底物(例如對-硝基苯基-β -D-半乳糖苷酶)或熒光底物如4-甲基傘形基-β -D-半乳糖苷酶。其它酶-底物組合對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可得的。對于一般綜述參見美國專利號 4，275，149 和 4，318，980。有時，所述標(biāo)記間接地綴合抗體。例如，可將生物素綴合至抗體并可將任何前述的報道分子綴合至抗生物素蛋白，或反之。生物素選擇性結(jié)合抗生物素蛋白，因此所述標(biāo)記可以間接方式綴合抗體。各種抗生物素蛋白是本領(lǐng)域已知的?；蛘?，為了實現(xiàn)標(biāo)記的間接綴合，可將抗體與小的半抗原(例如地高辛)綴合并將上述不同類型的標(biāo)記或報道分子中的一種與抗地高辛抗體綴合。因此，使用第二個抗體可實現(xiàn)所述標(biāo)記與抗體或突變蛋白的間接綴合。 在本發(fā)明另一個實施方案中，所述抗體不需要被標(biāo)記，而其存在可用結(jié)合所述抗體的標(biāo)記的抗體(另一種形式的第二抗體)來檢測。本發(fā)明的抗體可用于任何已知的測定方法，如競爭性結(jié)合測定、直接或間接夾心測定和免疫沉淀測定。Zola，Monoclonal Antibodies :A Manual of Techniques (CRC Press,Inc.1987)。競爭性結(jié)合測定依靠標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物與測試樣品競爭結(jié)合有限量抗體的能力。測試樣品中的抗原量與結(jié)合抗體的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為輔助確定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，通常在競爭前或競爭后使所述抗體不溶。結(jié)果，結(jié)合抗體的標(biāo)準(zhǔn)物和測試樣品可以方便地與保持未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和測試樣品分開。
夾心測定涉及使用兩種抗體，每種能夠結(jié)合至待測靶的不同免疫原性部分、決定簇或表位。在夾心測定中，使要分析的測試樣品結(jié)合直接或間接固定于固體支持物的第一抗體，之后將直接或間接標(biāo)記的第二抗體結(jié)合已結(jié)合的測試樣品，由此形成不溶的三部分復(fù)合物，參見例如美國專利號4，376，110。所述第二抗體本身可以用可檢測部分來標(biāo)記(直接夾心測定)或者可以使用標(biāo)記了可檢測部分的抗-免疫球蛋白抗體或其它適宜的結(jié)合對成員(例如抗體/抗原、受體/配體、酶/底物)來測量(間接夾心測定)。例如，一種類型的夾心測定是ELISA測定，在該情況中可檢測部分是酶。對于免疫組織化學(xué)，細胞或組織樣品可以是新鮮的或冷凍的或者可以是包埋入石蠟并用防腐劑如例如福爾馬林固定的。抗體還可以用于體內(nèi)診斷測定。通常，所述抗體或其變體用放射性核素標(biāo)記(如 "^，"!^，噸，巧，力，邛或^^)從而可以使用例如免疫閃爍成像和Y照相機來對表達伸展的I型鞘糖脂的位點定位。本發(fā)明還包括試劑盒，例如包含抗體、其片段、同系物、其衍生物等，如標(biāo)記的或細胞毒性綴合物和使用所述抗體的說明書，用于殺傷或者標(biāo)記特定細胞類型的綴合物等等。 所述說明書可包括對體外、體內(nèi)或離體使用抗體、綴合物等的指導(dǎo)?？贵w可以是以液體形式或作為固體，通常是凍干的。所述試劑盒可含有適宜的其它試劑，如緩沖液、重建溶液 (reconstituting solution)和其它用于所需用途的必要成分。慮及了預(yù)定量試劑包裝的組合，其中有對于其用途的說明書，如用于進行診斷測定的治療用途。當(dāng)抗體被標(biāo)記時，比如使用酶，則所述試劑盒可包括所述酶所需的底物和輔因子(例如提供可檢測生色團或熒光團的底物前體)。另外，可包括其它添加劑如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如阻斷緩沖液或裂解緩沖液)等。各種試劑的相對量可以是變化的以提供試劑溶液的濃縮物，其給用戶提供了靈活性、空間經(jīng)濟性、試劑經(jīng)濟性等等。試劑可以干粉提供，通常是凍干的，包括賦形劑，其溶解后提供了具有適當(dāng)濃度的試劑溶液。本發(fā)明的抗體可用于治療哺乳動物。在一個實施方案中，例如將感興趣的抗體或等價物施用于非人哺乳動物用于獲得臨床前數(shù)據(jù)的目的。示例性的待治療非人哺乳動物包括非人靈長類、狗、貓、嚙齒類和其它進行臨床前研究的哺乳動物。此種哺乳動物可以是要用抗體治療的疾病的已建立的動物模型或者可以用于研究感興趣抗體的毒性。在那些實施方案中的每一個中，可以在哺乳動物中進行劑量放大研究。感興趣的產(chǎn)物也可在那些動物中具有治療用途。有或者沒有第二組分(如綴合至其的治療性部分)的抗體被單獨施用或者與細胞毒性因子組合施用可以用作治療劑。本發(fā)明針對基于抗體的治療，其涉及將本發(fā)明的抗體施用于動物、哺乳動物或人以治療伸展的I型鞘糖脂-介導(dǎo)或相關(guān)的疾病、失調(diào)或病癥。所述動物或?qū)ο罂梢允切枰囟ㄖ委煹牟溉閯游锶缫驯辉\斷為具有特定失調(diào)的哺乳動物，所述失調(diào)例如涉及伸展的I型鞘糖脂或者與異常的伸展的I型鏈結(jié)構(gòu)表達和功能相關(guān)。針對伸展的I型鞘糖脂的抗體可用于例如癌癥和自身免疫失調(diào)的預(yù)防和治療。例如，通過施用治療可接受劑量的本發(fā)明的抗-伸展的I型鞘糖脂抗體、或者多種所述抗體或其等價物的混合物、或者與其它不同來源的抗體的組合、或者與非抗體藥物如消炎藥、細胞毒性劑、抗生素等如鉬藥物、甲氨蝶呤等的組合，經(jīng)治療的哺乳動物特別是人中的疾病癥狀可以被改善或預(yù)防。
本發(fā)明的治療化合物包括但不限于本發(fā)明的抗體(包括如本文所述的其片段、類似物、等價物和衍生物)和如本文所述編碼本發(fā)明抗體的核酸(包括其片段、類似物和衍生物)以及如本文所述的抗獨特型抗體。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制或防止與伸展的 I型鞘糖脂的異常表達和/或活性相關(guān)的疾病、失調(diào)或病癥，包括但不限于本文所述的任何一或多種疾病、失調(diào)或病癥。對與伸展的I型鞘糖脂的異常表達和/或活性相關(guān)的疾病、失調(diào)或病癥的治療和/或預(yù)防包括但不限于減輕至少一種與那些疾病、失調(diào)或病癥相關(guān)的癥狀?？梢匀绫绢I(lǐng)域所知或者如本文所述那樣在藥物可接受的組合物中提供本發(fā)明的抗體。 術(shù)語“生理可接受的”、“藥學(xué)可接受的”、“藥物可接受的”等等意指由聯(lián)邦或州政府管理機構(gòu)許可或者是在美國藥典或其它普遍認(rèn)可的藥典中列出用于動物特別是人?？梢砸匀魏慰山邮艿姆绞綄⒖?伸展的I型鞘糖脂抗體施用于哺乳動物。引入的方法包括但不限于腸胃外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、硬膜外、吸入和口服途徑，以及如果期望用于免疫阻抑治療、病灶內(nèi)施用。腸胃外輸注包括肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。抗體或組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或彈丸注射(bolus injection)、通過上皮或粘膜內(nèi)層吸收(例如口腔粘膜、直腸和小腸粘膜等)以及可以與其它生物學(xué)活性劑一起施用。施用可以是全身或者局部的。另外，可以期望將本發(fā)明的治療性抗體或組合物通過任何適宜途徑引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；腦室內(nèi)注射可通過腦室導(dǎo)管輔助，例如附著至儲液囊(reservoir)，如Ommaya儲液囊。另外，抗體可通過脈沖輸注而適宜地施用，特別是用遞減劑量的抗體。優(yōu)選通過注射來給予藥劑，優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下注射，部分取決于所述施用是簡短的還是慢性的。各種其它輸送系統(tǒng)是已知的并且可用來施用本發(fā)明的抗體，包括例如在脂質(zhì)體、 微粒、微膠囊等中包囊(參見LangerJcience 249 :1527(1990))；感興趣的抗體、其突變蛋白或其抗原結(jié)合部分在脂質(zhì)體、顆粒、膠囊等上的表達以產(chǎn)生靶向運載體，Treat et al., 在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein et al.，eds.，p. 353-365(1989)；和 Lopez-Berestein, ibid.，p. 317-327 中；能夠表達所述化合物的重組細胞，參見例如mi et al.，J Biol Chem 262 :4429(1987)；將核酸構(gòu)建為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體的一部分等等。也可將活性成分陷入微膠囊中，所述微膠囊的制備例如是通過凝聚 (coascervation)技術(shù)或者是通過界面聚合，分別例如是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，陷入膠體藥物輸送系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米粒子和納米膠囊)或者粗乳劑中。此種技術(shù)在Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th edition,A. 0sal,Ed. (1980)中公開。當(dāng)脂質(zhì)體或粒子表達感興趣抗體時， 在脂質(zhì)體中可攜有多種化合物的任一種，如非抗體約物、小分子藥物等。本發(fā)明抗體因而可發(fā)揮靶向功能。也可使用肺施用，例如通過使用吸入器或噴霧器以及有噴霧劑的制劑。所述抗體也可以干粉組合物的形式被施用到患者肺部，參見例如美國專利號6，514，496。在具體的實施方案中，可能期望將本發(fā)明治療性抗體或組合物局部施用到需要治療的區(qū)域；這可以例如而非限制性地通過局部輸注、表面應(yīng)用、通過注射、通過導(dǎo)管、通過栓劑或者通過植入物實現(xiàn)，所述植入物是多孔的、無孔的或凝膠狀材料，包括膜，如sialastic 膜或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)施用本發(fā)明的抗體時，要當(dāng)心對蛋白不吸收或吸收的材料的使用。
在另一個實施方案中，所述抗體可以在控制釋放系統(tǒng)中輸送。在一個實施方案中， 可使用泵(參見Langer,Science 249 :1527(1990) ；Sefton,CRC Crit Ref Biomed Eng 14: 201(1987) ；Buchwald et al.，Surgery 88 :507(1980)；禾口 Saudek et al.，N Engl J Med 321:574(1989))。在另一個實施方案中，可使用聚合材料(參見Medical Applications of Controlled Release, Langer et al. , eds. , CRC Press (1974) ；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen et al. , eds., Wiley (1984) ；Ranger et al. , J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23 :61(1983)；也· 見 Levy et al. ,Science 228 :190(1985) ；During et al. ,Ann Neurol 25:351 (1989)；禾口 Howard et al.，J Neurosurg 71 :105 (1989))。在另一個實施方案中，控制釋放系統(tǒng)被置于治療靶附近。也可制備持續(xù)釋放制備物。持續(xù)釋放制備物的適宜例子包括含有所述抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)是成形物品的形式，例如膜或基質(zhì)。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利號3，773，919)、L-谷氨酸和乙基L-谷氨的共聚物、非降解性乙烯-醋酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物(如由乳酸-乙醇酸共聚物組成的可注射微球體)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得分子的釋放能超過100天，而某些水凝膠在較短的時間段釋放蛋白。根據(jù)所涉及的機制可以設(shè)計用于穩(wěn)定化的合理策略。 例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是通過硫代-二硫化物互換而形成的分子間S-S鍵，可以通過修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制水分含量、使用適當(dāng)添加劑、氨基酸取代和開發(fā)特異聚合物基質(zhì)組合物實現(xiàn)穩(wěn)定化。多肽或抗體的治療性制劑可以制備為凍干制劑或者水溶液儲存，通過將具有所期望純度的多肽與任選的本領(lǐng)域常用的“藥物可接受”運載體、稀釋劑、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，即緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子去污劑、抗氧化劑和其它各種添加劑參見 Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th ed. , Osol, ed. (19S0)。此種添力口齊Ll在所使用的劑量和濃度通常對接受者是非毒性的，因此賦形劑、稀釋劑、運載體等是藥物可接受的?！胺蛛x的”或“純化的”抗體是基本上沒有來自所述蛋白所源自的細胞或組織來源或培養(yǎng)基的細胞材料或者其它污染蛋白，或者當(dāng)經(jīng)化學(xué)合成時基本上沒有化學(xué)前體或其它化學(xué)品。語言“基本上沒有細胞材料”包括抗體的制備物，其中所述多肽/蛋白與其所分離自或者從中重組產(chǎn)生的細胞的細胞組分分開。因此，基本上沒有細胞材料的抗體包括所述抗體的制備物，其具有少于大約30%、20(%、10(%、5(%、2.5(%或1(% (干重)的污染蛋白或者細胞或亞細胞材料。當(dāng)抗體是重組產(chǎn)生時，其還優(yōu)選基本上沒有培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基占蛋白制備物的體積少于約20 %、10 %、5 %、2. 5 %或1 %。當(dāng)抗體是通過化學(xué)合成時，其優(yōu)選基本上沒有化學(xué)前體或其它化學(xué)品或試劑，即感興趣的抗體與在蛋白合成中所涉及的化學(xué)前體或其它化學(xué)品分開。因此，所述抗體的此種制備物具有少于約30^^20^^10^5%或 (干重)的感興趣抗體之外的化學(xué)前體或化合物。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，抗體是分離的或純化的。如本文所用，措辭“低至不可檢測水平的聚集”是指樣品含有不超過5%、不超過 4%,不超過3%、不超過2%、不超過1 %及經(jīng)常不超過0. 5%的抗體或其變體的聚集，即兩或更多個抗體分子或其變體連接或聚結(jié)在一起，這是通過對蛋白稱重得到的，例如通過高效大小排阻層析(HPSEC)測量。如本文所用，術(shù)語“低至不可檢測水平的片段化”是指樣品含有等于或多于總蛋白的80%、85%、90%、95%、98%或99%的完整抗體分子或其變體，例如在通過HPSEC確定的單一峰中或者例如在通過還原毛細管凝膠電泳(rCGE)的兩個O)峰中(重鏈和輕鏈)且不含有其它每個具有超過5%超過4%、超過3%、超過2%、超過％或超過0.5%的總蛋白的單一峰。如本文所用的rCGE是指在還原條件下的毛細管凝膠電泳，其中所述還原條件足以還原抗體或抗體類型或衍生的分子中的二硫鍵。本發(fā)明提供用于制備抗體或其伸展的I型鞘糖脂結(jié)合片段的液體制劑的方法， 所述方法包含將純化的抗體的級分濃縮至終濃度為約15mg/ml、約20mg/ml、約30mg/ml、 約 40mg/ml、約 50mg/ml、約 60mg/ml、約 70mg/ml、約 80mg/ml、約 90mg/ml、約 100mg/ml、約 200mg/ml、約250mg/ml、約300mg/ml或更多，其中濃縮是使用例如具有適當(dāng)分子量(麗)截斷值的半透膜(例如30kD截斷值用于其F(ab, )2片段；以及IOkD截斷值用于Fab片段)以及任選地將濃縮的抗體級分用同樣的膜透濾到配制緩沖液中。另外，本發(fā)明也涵蓋了可在體內(nèi)具有改善的半衰期的感興趣產(chǎn)物的穩(wěn)定液體制劑。因此，感興趣的抗體在對象中優(yōu)選在人中具有超過3天、超過7天、超過10天、超過15 天、超過25天、超過30天、超過35天、超過40天、超過45天、超過2個月、超過3個月、超過4個月、超過5個月或更長的半衰期。如本文所用，在包含伸展的I型鞘糖脂抗體或其結(jié)合片段的液體制劑上下文中， 術(shù)語“穩(wěn)定性”和“穩(wěn)定的”是指制劑中的抗體或其抗原結(jié)合片段在給定的制造、制備、運輸和儲存條件下對于熱和化學(xué)解折疊、聚集、降解或片段化的抗性。本發(fā)明“穩(wěn)定的”制劑在給定的制造、制備、運輸和儲存條件下保留了等于或多于80%、85(%、90(%、95(%、98(%、 99%或99. 5%的生物學(xué)活性。作為設(shè)計選擇，所述抗體制備物的穩(wěn)定性可以在選定的儲存條件下于預(yù)定時間段中通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法由與參照對比的聚集、降解或片段化的程度來進行評估，所述方法包括但不限于rCGE、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)和 HPSEC。本發(fā)明涵蓋了在商業(yè)冰箱或者醫(yī)師辦公室中或?qū)嶒炇抑锌梢姷睦鋬銎髦兴芤姷降臏囟认戮哂蟹€(wěn)定性的液體制劑，例如從約_20°C到約5°C，所述穩(wěn)定性例如通過高效大小排阻層析(HPSEC)評估，對于儲存目的，如大約60天、約120天、約180天、約1年、約2年或更長。本發(fā)明的液體制劑也展示了在室溫下至少幾個小時如在使用前約1小時、約2小時或者約3小時的穩(wěn)定性，通過例如HSPEC評估。術(shù)語“運載體(carrier) ”是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運載體 (vehicle)。此種生理學(xué)運載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物、蔬菜或合成來源的那些，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物經(jīng)靜脈內(nèi)施用時，水是適宜的運載體。鹽溶液和水右旋糖和甘油溶液也可用作液體運載體，特別用于可注射溶液。適宜的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊(chalk)、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、干燥脫脂奶、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要， 所述組合物還可含有少量的濕潤或乳化劑或PH緩沖劑。所述組合物可以采取的形式有溶液、懸液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉末、持續(xù)釋放制劑、儲存物(cbpot)等。所述組合物可用傳統(tǒng)的粘合劑和運載體如甘油三酯來配制為栓劑。口服制劑可包括標(biāo)準(zhǔn)運載體如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等、香料、著色劑、香味劑等等。適宜運載體的例子在〃 Remington' s Pharmaceutical Sciences, “ Martin 中描述。此種組合物將含有有效量地抗體，優(yōu)選為純化的形式，與適宜量地運載體一起，從而提供適當(dāng)施用于患者的形式。如本領(lǐng)域所知，將構(gòu)建所述制劑以適應(yīng)施用的模式。緩沖劑幫助將pH保持在近似生理條件或有益于抗體穩(wěn)定性的條件的范圍內(nèi)。緩沖液優(yōu)選以約2mM到約50mM的濃度范圍存在。適宜用于本發(fā)明的緩沖劑包括有機和無機酸及其鹽，如例如檸檬酸鹽緩沖液(例如檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖液(例如琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、灑石酸鹽緩沖液(例如灑石酸-酒石酸鈉混合物、灑石酸-酒石酸鉀混合物、灑石酸-氫氧化鈉混合物等)、延胡索酸鹽緩沖液(例如延胡索酸-延胡索酸單鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸單鈉-延胡索酸二鈉鹽混合物等)、葡糖酸鹽緩沖液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、 葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和醋酸鹽緩沖液(例如醋酸-醋酸鈉混合物、醋酸-氫氧化鈉混合物等)?？墒褂昧姿猁}緩沖液、碳酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、三甲胺鹽如Tris、HEPES其它此種已知的緩沖液?？商砑臃栏瘎┮匝泳徫⑸锷L，而且能以從約0. 2%到約(w/v)范圍的量來添加。適宜用于本發(fā)明的防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基芐基氯化銨、benzylconium鹵化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯己雙銨、烷基對羥苯甲酸酯如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。等滲劑的存在是確保本發(fā)明的液體組合物的生理學(xué)等滲性且包括多元糖醇 (polhydric sugar alcohol)，如三元或更高的糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、 山梨醇和甘露醇。多元醇可以介于約重量的0. 到約25%之間的量存在，考慮到其它成分的相對量，優(yōu)選約1 %到約5%。穩(wěn)定劑是指廣泛類型的賦形劑，其功能的范圍可以從填充劑到添加劑，其使治療劑可溶或者幫助防止變性或附著于容器壁。典型的穩(wěn)定劑可以是多元糖醇；氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L亮氨酸、2-苯丙氨酸、 谷氨酸、蘇氨酸等；有機糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、阿拉伯糖醇、赤蘚醇、甘露醇、 山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即< 10個殘基)；蛋白質(zhì)，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；疏水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、糖類、單糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖； 二糖，如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖；多糖如右旋糖酐等等。穩(wěn)定劑可以從約0. 1到約10，000w/w每部分活性蛋白的范圍內(nèi)存在。另外各種賦形劑可包括填充劑(例如瓊脂、明膠、淀粉等等)、螯合劑(例如 EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫氨酸或維生素E)和共溶劑。
如本文所用，術(shù)語“表面活性劑”是指具有兩親性結(jié)構(gòu)的有機物質(zhì)，即由對抗可溶性傾向的基團(通常是油溶性碳氫鏈)和水溶性離子基團組成。根據(jù)表面活性部分的電荷， 可將表面活性劑分類為陰離子、陽離子和非離子表面活性劑。表面活性劑經(jīng)常作為濕潤劑、 乳化劑和分散劑用于本文所述生物材料的各種藥物組合物和制備物。可添加非離子表面活性劑或去污劑(也稱作“濕潤劑”)以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白防止震蕩誘導(dǎo)的聚集，其還使制劑暴露于剪切表面應(yīng)力(shear surface stress)而不引起蛋白變性。適宜的非離子表面活性劑包括聚山梨酯O0、80等)、 polyoxamers (184,188等)、Pluronic 多元醇和聚乙二醇脫水山梨醇單醚(TWEEN-20 、 TWEEN-80 等)。非離子表面活性劑可以在約0. 05mg/ml至約1. Omg/ml的范圍存在，優(yōu)選約 0. 07mg/ml 至約 0. 2mg/ml。如本文所用，術(shù)語“無機鹽”是指任何不含碳的化合物，其是用金屬或像金屬一樣作用的基團來置換所有或部分的酸氫或酸而得到的，并且經(jīng)常在生物材料的藥物組合物和制備物中被用作張度調(diào)節(jié)化合物。最常見的無機鹽是NaCl、KCl、NaH2PO4等。本發(fā)明提供抗伸展的I型鞘糖脂結(jié)合化合物或其片段的液體制劑，具有的PH范圍從約5. 0到約7. 0、或者約5. 5到6. 5、或者約5. 8到約6. 2、或者約6. 0。若對于所治療的特定適應(yīng)癥而言有必要，本文的制劑還可以含有一種以上的活性化合物，優(yōu)選具有互補活性不會有害地互相影響的那些。例如，可以期望進一步提供免疫抑制劑。此種分子適宜以對于要達到的目的有效的量而組合存在。制劑還可含有另一種藥物、 或小分子、藥物學(xué)藥劑、如抗腫瘤藥物如順鉬。術(shù)語“小分子”和類似術(shù)語包括但不限于肽、假肽、氨基酸、氨基酸類似物、有機化合物、藥物學(xué)活性劑如藥物、多核苷酸、多核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、具有小于約10，000克每摩爾的分子量的有機或無機化合物(即包括雜有機(heterorganic)和/或有機金屬化合物)、具有小于約5，000克每摩爾的分子量的有機或無機化合物、具有小于約 1，000克每摩爾的分子量的有機或無機化合物、具有小于約500克每摩爾的分子量的有機或無機化合物以及此種化合物的鹽、酯和其它藥物可接受形式。因此，在癌癥的情況中，本發(fā)明的抗體可以單獨施用或者與其它類型的癌癥治療組合施用，包括常規(guī)化療劑(紫杉醇、卡鉬、順鉬和阿霉素)、抗-EGFR劑(吉非替尼、埃羅替尼和西妥昔單抗)、抗-血管發(fā)生劑(貝伐單抗和舒尼替尼)以及免疫調(diào)節(jié)劑如干擾素-α 和沙立度胺。如本文所用，術(shù)語“治療劑”是指任何可用于治療、控制或改善與異常的伸展的I 型鞘糖脂表達和通常與代謝以及活性有關(guān)的疾病、失調(diào)、病癥等的物質(zhì)。在治療與異常的伸展的I型鞘糖脂表達、代謝以及活性有關(guān)的病癥等時具有藥物作用的已知化合物也包括在內(nèi)。任選將抗體或變體與當(dāng)前用于預(yù)防或治療所研究病癥的一或多種物質(zhì)一起配制。 此種其它物質(zhì)的有效量取決于制劑中存在的抗體的量、病癥或治療的類型以及上面討論的其它因素。這些通常以前文所用的相同劑量和施用途徑來使用或者迄今為止所用劑量的約 1-99%。用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這可以通過例如經(jīng)無菌濾膜過濾來實現(xiàn)。例如，本發(fā)明的液體制劑可以通過使用0. 2 μ m或0. 22 μ m濾器過濾進行消毒。
另外，可將本發(fā)明的抗體綴合至各種效應(yīng)物分子如異源多肽、藥物、放射性核素或毒素，參見例如 WO 92/08495 ；WO 91/14438 ；WO 89/U624 ;U. S. Pat. No. 5，314，995 ；和 EPO 396，387?？蓪⒖贵w或其片段綴合至治療性部分如細胞毒素(例如細胞抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α發(fā)射體，如例如213Bi)。細胞毒素或細胞毒性劑包括任何對細胞有害的物質(zhì)。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、 絲裂霉素、依托泊甙、替尼泊苷(tenoposide)、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、 1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素以及其類似物或同源物。治療劑包括但不限于抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶和氨烯咪胺)、烷化劑(例如氮芥、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU) 和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C、和順-二氯二氨鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環(huán)類(例如柔紅霉素、道諾霉素和阿霉素)、 抗生素(例如更生霉素、放線菌素、博來霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))、和抗-有絲分裂劑(例如長春新堿和長春堿)。為延長抗體在體內(nèi)的血清循環(huán)，可使用各種技術(shù)。例如，惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)可在具有和不具有多功能性接頭的情況下將PEG位點特異性地綴合至抗體的N-端或C-端或者通過賴氨酸殘基中存在的ε氨基附著至抗體?？墒褂脤?dǎo)致最小生物學(xué)活性損失的線性或者分支聚合物衍生化?？赏ㄟ^SDS-PAGE和質(zhì)譜緊密監(jiān)測綴合程度以確保PEG分子適當(dāng)綴合抗體?？赏ㄟ^大小排阻或通過離子交換層析將未反應(yīng)的PEG與抗體-PEG綴合物分開。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來測試PEG-衍生的抗體的結(jié)合活性以及體內(nèi)有效性，例如通過本文所述的免疫測定進行。也可通過將一或多個氨基酸修飾(即取代、插入或缺失)引入到IgG恒定結(jié)構(gòu)域或其F。R結(jié)合片段(如F。或鉸鏈F。結(jié)構(gòu)域片段)中從而產(chǎn)生在體內(nèi)具有增加的半衰期的抗體，參見例如WO 98/23289 ；WO 97/34631和美國專利號6，277，375。此外，可將抗體綴合至白蛋白以使抗體在體內(nèi)更穩(wěn)定或者在體內(nèi)具有更長的半衰期。所述技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見例如WO 93/15199,WO 93/15200和WO 01/77137 ；和EPO 413622?？贵w也可以被修飾，例如通過糖基化、乙?；⒘姿峄?、酰胺化、用已知保護/阻斷基團衍生化、蛋白酶解裂解、連接細胞配體或其它蛋白等等。將此種治療性部分綴合至抗體的技術(shù)是眾所周知的，參見例如Arnon et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), Alan R.Liss(1985) ；Hellstrom et al. , in Controlled Drug Delivery,2nd ed. , Robinson et al. , eds. , Marcel Dekker(1987) ；Thorpe,in Monoclonal Antibodies ' 84 :Biological And Clinical Applications,Pinchera et al. ,eds. (1985) ；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy,Baldwin et al.,eds. ,Academic Press(1985)；禾口Thorpe et al. , Immunol Rev 62 :119 (1982)?；蛘?，可將抗體綴合至第二抗體以形成抗體異源綴合物(heteroconjugate)，比如雙功能抗體，參見例如美國專利號4，676，980。本發(fā)明的綴合物可用于修飾給定的生物學(xué)應(yīng)答，治療劑或藥物部分不應(yīng)被理解為限于常見的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有所期望的生物學(xué)活性的蛋白或多肽。 此種蛋白可包括例如毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白如腫瘤壞死因子、α-干擾素、干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物、凋亡劑例如 TNF-α、TNF-β、AIM I (WO 97/33899)、AIM II (W097/34911)、 Fas 配體(Takahashi et al.，Int Immunol，6 :1567 (1994))、VEGF(TO 99/23105)；血栓形成劑；抗血管生成劑，例如制管張素或內(nèi)皮抑制素；或生物應(yīng)答修飾劑，如淋巴因子、白細胞介素-1 (IL-I)、白細胞介素-2 (IL-2)、白細胞介素-6 (IL-6)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)或其它生長因子。抗體或不同組合物將以遵從良好醫(yī)療實踐的方式進行配制、給藥和施用。在此背景下要考慮的因素包括所治療的特定失調(diào)、所治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床狀況、 所述失調(diào)的病因、藥劑輸送的位點、施用方法、施用的時間表、以及醫(yī)療從業(yè)者已知的其它因素。要施用的抗體或變體的“治療有效量”將由這些考慮因素來控制，并且可以是預(yù)防、 改善或治療伸展的I型鞘糖脂疾病、病癥或失調(diào)所需的最小量。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指治療(例如預(yù)防性或治療性物質(zhì))的量，其足以降低與伸展的I型鞘糖脂涉及或相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度和/或持續(xù)時間、改善其一或多種癥狀、 防止伸展的I型鞘糖脂涉及或相關(guān)疾病的進展或引起伸展的I型鞘糖脂涉及或相關(guān)疾病的退化或者其足以防止伸展的I型鞘糖脂涉及或相關(guān)疾病或其一或多種癥狀的發(fā)展、復(fù)發(fā)、 發(fā)作、或進展或者增強或改善另一種用于治療伸展的I型鞘糖脂涉及或相關(guān)疾病的治療 (例如另一種治療劑)的預(yù)防性和/或治療性作用。例如，基于基準(zhǔn)或正常水平，感興趣的治療可使癥狀減輕至少約5 %、優(yōu)選至少10 %、至少15 %、至少20 %、至少25 %、至少30 %、 至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、或至少100 %。在一個實施方案中，有效量的治療性或預(yù)防性物質(zhì)使伸展的I型鞘糖脂涉及或相關(guān)疾病如癌癥的癥狀減輕至少約5%、優(yōu)選至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、 至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85%、至少90%、至少95%、或至少100%。也用于本文作為等價含義的術(shù)語是“治療有效量”。在特定失調(diào)或病癥的應(yīng)用或治療中將是有效的治療性多肽、抗體或其片段的量將取決于所述失調(diào)或病癥的性質(zhì)并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。在可能時，可首先在體外獲得本發(fā)明的劑量應(yīng)答曲線和藥物組合物。如果有適宜的動物模型系統(tǒng)，則又可以獲得劑量應(yīng)答曲線并用于推斷出本領(lǐng)域已知的適宜的人劑量實施方法。然而，基于本領(lǐng)域常識，有效促進炎癥效應(yīng)減少的藥物組合物例如可以提供局部治療劑濃度為介于約5至約20ng/ml 之間，優(yōu)選介于約10至約20ng/ml之間。在優(yōu)選的實施方案中，可通過皮下注射來施用治療性多肽、抗體或其片段的水溶液。每個劑量可以在每公斤體重約0. 5mg至約50mg的范圍內(nèi)，或者更優(yōu)選在每公斤體重約 3mg至約30mg。對于特定疾病、患者群、施用方式等，所述劑量可以憑經(jīng)驗確定，實行本領(lǐng)域已知的制藥方法。對于皮下施用的給藥時間表可從每星期一次到每天一次到每天多次之間變化，這取決于數(shù)個臨床因素，包括疾病類型、疾病嚴(yán)重程度以及對象對于治療劑的敏感性。在一個實施方案中，根據(jù)常規(guī)程序?qū)⒔M合物配制為適于靜脈內(nèi)施用于人的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是在無菌等滲水緩沖液中的溶液。在必要時，所述組合物也可包括增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因或其它的"卡因(caine)“麻醉劑以緩解注射位點的疼痛。通常，將所述成分分開供應(yīng)或者混合在一起以單位劑量形式供應(yīng)，例如作為干燥的凍干粉末或者密封容器中的濃縮物如標(biāo)明活性劑數(shù)量的安瓿或袋。當(dāng)所述組合物通過輸注來施用時，其可以用含有無菌藥物級水或鹽水的輸注瓶來分散。當(dāng)通過注射施用所述組合物時，可在例如試劑盒中提供一安瓿用于注射的無菌水或者鹽水，以便可以在施用前將所述成分混合。本發(fā)明也提供了本發(fā)明的液體制劑包裝在密封容器中如標(biāo)明感興趣產(chǎn)品的量的安瓿或袋。本發(fā)明的液體制劑可以在標(biāo)明了抗體或抗體片段的量和濃度的密封容器中。例如本發(fā)明的液體制劑可以在密封容器中供應(yīng)，其具有至少約15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、 40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、lOOmg/ml、150mg/ml、200mg/ml、 250mg/ml、或300mg/ml的伸展的I型鞘糖脂抗體，其量是約lml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、 7ml、8ml、9ml、10ml、15ml 或 20ml。提供了含有可用于治療上述失調(diào)的材料的制品。所述制品包含容器和標(biāo)記。適宜的容器包括例如瓶、小管、注射器和試管。所述容器可以由多種材料如玻璃或塑料形成。所述容器容納可有效用于診斷、預(yù)防或治療伸展的I型鞘糖脂病癥或疾病的組合物并可具有無菌出口(例如所述容器可以是靜脈注射液袋或者具有可用皮下注射針頭刺穿的塞子的小管)。在所述容器上或者與其相關(guān)的標(biāo)記標(biāo)明所述組合物用于治療所選的病癥。所述制品可進一步包含第二個容器，其包含藥物可接受的緩沖液如磷酸緩沖鹽水、Ringer' s溶液和右旋糖溶液。其可進一步包括在商業(yè)和用戶的立場上所期望的其它材料，包括緩沖液、 稀釋劑、濾器、針頭、注射器以及包裝插入物及使用說明書。在本發(fā)明的另一方面，施用包含編碼抗體或其功能性衍生物的序列的核酸以通過基因治療來治療、抑制或預(yù)防與異常的伸展的I型鞘糖脂的表達和/或活性相關(guān)的疾病或失調(diào)。基因治療是指通過給對象施用已表達的或可表達的感興趣的核酸來進行的治療?；蛘撸瑢⒈徊倏v為攜有感興趣基因序列的細胞施用給宿主。在本發(fā)明的實施方案中，核酸在靶宿主細胞中或由靶宿主細胞生產(chǎn)所編碼的介導(dǎo)治療作用的蛋白。任何可用的基因治療方法均可根據(jù)本發(fā)明來使用。對于基因治療方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy 12 :488(1993) ；Wu et al. , Biotherapy 3:87(1991) ；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32 :573(1993) ；Mulligan, Science 260 :926(1993) ；Morgan et al. , Ann Rev Biochem 62:191(1993)；和 May，TIBTECH 11:155(1993)。在一方面，所述化合物包含編碼抗體、或其功能性結(jié)合片段的核酸序列，所述核酸序列是表達載體的一部分，所述表達載體在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_所述抗體或片段或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈。特別地，此種核酸序列具有可操縱地連接至抗體或抗原結(jié)合編碼區(qū)的啟動子，所述啟動子是可誘導(dǎo)的或者是組成型的，且任選是組織特異性的，以及具有其它調(diào)節(jié)序列。在另一個特定的實施方案中，使用了核酸分子，其中抗體編碼序列和任何其它期望的序列兩旁具有促進在基因組中期望位點的同源重組的區(qū)域，由此提供了所述抗體編碼核酸的整合和染色體內(nèi)表達(Koller et al.，Proc Natl Acad Sci USA 86 :8932(1989)； Zijlstra et al. ,Nature 342 :435 (1989))。在特異的實施方案中，所表達的抗體分子是單鏈抗體；或者，所述核酸序列包括編碼所述抗體的重鏈和輕鏈二者或其片段的序列。替代的整合方法包括使用識別特異核酸序列、鋅指結(jié)構(gòu)等的特定轉(zhuǎn)錄因子。
核酸向患者的輸送可以是直接的，在此情況下所述患者直接暴露于所述核酸或攜有核酸的載體，或者所述輸送也可以是間接的，在此情況下首先在體外用所述核酸轉(zhuǎn)化細胞，繼而將細胞移植入患者。 在一個實施方案中，所述核酸序列被直接在體內(nèi)施用并且被表達以產(chǎn)生所編碼的產(chǎn)物。這可通過任何本領(lǐng)域已知的任何方法完成，例如通過將所述抗體編碼序列構(gòu)建為適當(dāng)核酸表達載體的一部分并施用其，從而所述載體變成在細胞內(nèi)，例如通過使用缺陷或減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒載體感染(參見美國專利號4，980，286)、通過直接注射裸 DNA、通過使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic、Dupont)、使用非病毒載體如含有兩親性化合物的合成組合物，所述兩親性化合物結(jié)合親水核酸并具有與細胞融合的能力，因而通常含有用于與膜組合的疏水部分，用脂質(zhì)或細胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，包囊入脂質(zhì)體、 微粒、或微膠囊內(nèi)，通過將所述載體與已知進入細胞核的肽連接而施用，通過將所述載體與經(jīng)受受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體連接而施用(參見例如mi et al. , J Biol Chem 262 44 (1987))(其可用于特異表達該受體的靶細胞類型)等等。在另一個實施方案中，可形成核酸-配體復(fù)合物，其中配體包含融合病毒肽以破壞內(nèi)體，使得核酸避免被溶酶體降解。 在又一個實施方案中，可通過靶向特異受體而將核酸在體內(nèi)靶向于細胞特異性攝取和表達 (參見例如 WO 92/06180 ；WO 92/22635 ；W092/20316 ；W093/14188 和 WO 93/20221)。關(guān)于載體，例如可如本領(lǐng)域所知的那樣使用慢病毒載體。慢病毒載體含有用于包裝病毒基因組并整合入宿主細胞DNA的組件。將編碼用于基因治療的抗體的核酸序列克隆到一或多個載體內(nèi)，其本發(fā)明中也可以使用腺病毒?；谙俨《镜妮斔拖到y(tǒng)的靶包括例如肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞和肌肉。腺病毒感染非分裂細胞，是相對于早期逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)勢。 Kozarsky et al.，Curr Opin Gen Dev 3:499(1993)提供了基于腺病毒的基因治療的綜述。Bout et al. ,Human Gene Therapy 5 :3 (1994)證明了使用腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移到恒河猴的呼吸道上皮細胞。在基因治療中使用腺病毒的其它例子可見于Rosenfeld et al., Science 252:431(1991) ；Rosenfeld et al. ,Cell 68:143(1992) ；Mastrangeli et al. ,J Clin Invest 91:225(1993) ；W094/12649 ；和 Wang et al.，Gene Therapy 2:775(1995)。腺伴隨病毒(AAV)也可用于基因治療(Walshet al.，Proc Soc Exp Biol Med 204 289 (1993)；和美國專利號 5，436，146 ；6，632，670 ；和 6，642，051)?；蛑委煹牧硪环椒ㄉ婕皩⒒蛲ㄟ^方法如電穿孔、脂染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)中的細胞內(nèi)。通常，轉(zhuǎn)移方法包括將可選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)。繼而將細胞置于選擇之下以分離那些已經(jīng)攝取并表達所述轉(zhuǎn)移的基因的細胞。繼而將那些細胞輸送給患者。因此，可將所述核酸引入到細胞內(nèi)之后再將所得的重組細胞體內(nèi)施用。此種引入可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法進行，包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、用含有所述核酸序列的病毒或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等等。本領(lǐng)域已知許多種方法用于將外源基因引入細胞內(nèi)(參見例如 Loeffler et al.，Meth Enzymol 217 :599(1993) ；Cohen et al.，Meth Enzymol 217
41618(1993)；和Cline，Pharm Ther 29 :69(1985))并且其可根據(jù)本發(fā)明而使用，前提是受體細胞的必要發(fā)育和生理功能沒有受到破壞。所述技術(shù)應(yīng)該提供所述核酸到細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)移，從而所述核酸被所述細胞表達，由所述細胞后代繼承并表達。可通過各種本領(lǐng)域已知的方法將所得的重組細胞輸送給患者。重組血細胞(例如造血干細胞或祖細胞)優(yōu)選經(jīng)靜脈內(nèi)施用，例如骨髓移植領(lǐng)域內(nèi)已知的那樣。設(shè)想使用的細胞的量取決于所期望的效果、患者狀態(tài)等，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定?？梢詫⒑怂嵋肫渲杏糜诨蛑委熌康牡募毎w了任何期望的、可用的細胞類型，包括但不限于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞、肌細胞、肝細胞、血細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞和粒細胞、各種干細胞或祖細胞，特別是造血干細胞或祖細胞，例如從骨髓、臍帶血、外周血、胎肝等所獲得。在一個實施方案中，用于基因治療的細胞是患者自體的。將編碼本發(fā)明抗體的核酸序列引入細胞內(nèi)從而使轉(zhuǎn)基因由所述細胞或其后代表達，繼而為了治療作用而將所述重組細胞在體內(nèi)施用。在特異的實施方案中，使用干細胞或祖細胞。能夠被分離且在體外維持的任何干細胞和/或祖細胞可潛在地用于本發(fā)明的實施方案(參見例如WO 94/08598 ； Stemple et al.，Cell 71:973(1992) ；Rheinwald Meth Cell Bio 21A :229 (1980)；和 Pittelkow et al.，Mayo Clinic Proc 61 :771 (1986))。因為伸展的 I 型鞘糖脂在例如 B 細胞上表達，所以血細胞和骨髓細胞是適宜的宿主細胞。然而，本發(fā)明的范圍在關(guān)于干細胞宿主的使用方面并不涉及制備和使用轉(zhuǎn)基因以通過將感興趣的轉(zhuǎn)基因施用于胚胎和/或胚胎干細胞以制備轉(zhuǎn)基因生物體。因此本發(fā)明提供治療、預(yù)防和改善伸展的I型鞘糖脂涉及和相關(guān)疾病或其一或多種癥狀的方法，通過給對象施用有效量的例如本發(fā)明的液體制劑、抗體或其變體進行。所述對象優(yōu)選是哺乳動物，如非靈長類(例如奶牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)和靈長類(例如猴如食蟹猴和人)。在優(yōu)選的實施方案中，所述對象是人。伸展的I型鞘糖脂也在某些癌癥細胞如胰腺、結(jié)腸和膀胱以及在T細胞白血病上表達(Qinping et al.，Oncogene 24 =573-584,2005)且伸展的I型鞘糖脂的刺激與癌細胞的增殖相關(guān)，Meijer et al.，Cane Res 66:9576-9582,2006。因此，感興趣的抗體或其衍生物可用于控制表達伸展的I型鞘糖脂的癌細胞的增殖，其中癌癥是經(jīng)本文教導(dǎo)的診斷測定通過確定伸展的I型鞘糖脂表達的存在而鑒定的。 感興趣的抗體可以降低惡性細胞的浸潤、降低對凋亡的抗性并使增殖最小化。繼而對此種患者施用了癌細胞增殖抑制量的本文提供的感興趣的抗體或其衍生物。如本文所教導(dǎo)，抗體或其抗原結(jié)合部分可以多種方式施用給患者，包括施用多肽、多核苷酸等等。本質(zhì)上任何表達感興趣的I型表位的癌癥均可用感興趣的抗體檢測和/或治療。例如，惡性細胞可以是上皮細胞。上皮細胞可以在任何器官或組織來源的任何惡性細胞中發(fā)現(xiàn)，如結(jié)腸、直腸、 食管、肺、前列腺、乳房、胰腺、口腔、陰道、一般而言的胃腸道、尿道等等。然而，只要所述惡性細胞表達感興趣的I型表位，則所述癌癥并不必限于上皮細胞。本發(fā)明將通過下面的描述了一些實施方案并且實施了本發(fā)明的非限制性實施例來例證本發(fā)明的益處。實施例實施例1 免疫原的產(chǎn)生Colo205 細胞(ATCC) (Semple et al.，Cancer Res 38 1345-1355，1978)在含有 10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長。將收集的細胞用PBS洗滌兩次并儲存于_20°C 待用。用異丙醇-正己烷-水(IHW) (55 25 20)來提取細胞沉淀，隨后R)lch分配、 DEAE S印hadex 層析和 Iatrobead 6RS-8010 柱上進行 HPLC。在 IHW 中從 55 40 5 到 55 25 20對上層相中性級分進行200分鐘的梯度洗脫。根據(jù)HPTLC遷移在氯仿-甲醇-水中(50 40 10)收集和混合級分。伸展的I型鏈鞘糖脂通過制備TLC在Merck HPTLC 平板(Silica Gel 60, Merck, Darmstadt, Germany)上進一步純化，參見美國專利號 6，083，929 ο如本文教導(dǎo)的那樣純化遷移至緊隨二聚Lea抗原下方的陽性條帶(通過用mAb IMH2的免疫染色)。將結(jié)腸直腸腺癌細胞Colo205(ATCC CCL-22W 和 DLD-1 (ATCC CCL-221)在補加了 ImM 丙酮酸鈉 Gnvitrogen Co. , Cat. No. 11360)的 RPMI1640 培養(yǎng)基(Invitrogen Co.， Cat. No. 31800)中培養(yǎng)。將其它結(jié)腸直腸腺癌細胞SWl 116 (ATCC CCL-233)和HT-29 (ATCC HTB-38)以及肺來源的T84細胞(ATCC, CCL-248)分別維持在Leibovitz ‘ s L-15培養(yǎng)基(Invitrogen Co. , Cat. No. 41300) > McCoy ‘ s 5a 培養(yǎng)基(Invitrogen Co. , Cat. No. 12330)和 DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen Co.，Cat. No. 12400)中。將 KATO III 胃癌細胞(ATCCHTB-103)在 IMDM 培養(yǎng)基(Invitrogen Co.，Cat. No. 12200)中培養(yǎng)。本研究中使用的所有培養(yǎng)基均補加了 10%胎牛血清。實施例2 抗伸展的I型鞘糖脂mAb的產(chǎn)生通過雜交育種雙轉(zhuǎn)染色體小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生KM小鼠(Kirin Brewery Co., Ltd.)。KM小鼠具有人染色體片段，所述片段含有完整人免疫球蛋白重鏈基因座和一半的人免疫球蛋白κ輕鏈基因座的YAC轉(zhuǎn)基因。KM小鼠被工程化以使其既不表達內(nèi)源免疫球蛋白重鏈也不表達κ輕鏈。所有動物均根據(jù)本領(lǐng)域所接受的條例和規(guī)則進行維持和操作。每3星期將Colo205細胞經(jīng)腹膜內(nèi)注射到KM小鼠中(5X IO6細胞/注射)，總共注射4次，隨后每星期注射從Colo205細胞分離并吸附在脂多糖(Sigma，L-7011)上的伸展的 I 型鏈鞘糖脂(Young et al.，J. Exp. Med. 150 :1008_1019，1979)，共注射 8 次。 fflELISA M δ Λ κ -HRP(Southern Biotechnology Associates, Cat. No. 9220-05) # 為二抗來監(jiān)測免疫小鼠的抗Colo205中性鞘糖脂效價直至效價達到1 6000。最終注射的3天后，將來自被加強小鼠的脾細胞與P3/NSl/l-Ag4-l(NS-l)小鼠骨髓瘤細胞 (ATCCTIB-18)融合，實施方法是本領(lǐng)域已知的。通過ELISA用包被了 Colo205中性糖脂的 96-孔ELISA平板(Corstar，Cat. No. 2592)篩選雜交瘤。與HRP綴合的小鼠抗人IgG抗體用作二抗(Southern Biotechnology Associates, Cat. No. 9040-05)，四甲基聯(lián)苯胺(TMB) (Kem-Zn-Tec Diagnostics, Cat. No. 4390)用作底物。顯示與Colo205中性糖脂具高反應(yīng)性的雜交瘤上清通過HPTLC免疫染色和通過流式細胞術(shù)進一步確認(rèn)。對伸展的I型鏈糖脂強烈染色并在Colo205細胞表面顯示高度結(jié)合的克隆通過有限稀釋被重復(fù)亞克隆直至建立起穩(wěn)定的克隆。一種穩(wěn)定的克隆是GNX-8。實施例3:GNX_8抗體
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使用蛋白A Sepharose (GE Healthcare 17-129-79-02)以根據(jù)廠商建議過程用 pH 梯度洗脫將單克隆抗體從培養(yǎng)物上清中純化。收集每一級分并用ELISA檢測抗體的存在。 將具有Colo205中性糖脂結(jié)合活性的級分匯集起來并針對PBS(pH 7.4)進行透析。將純化的抗體等分并儲存于-20°C。由 Bio-fcid Protein Assay 試劑盒(Bio-fcid，Cat. No. 500-0006)使用 IgG 作為標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)廠商推薦過程來確定單克隆抗體的濃度。用ELISA來確定GNX-8的同種型。GNX-8是人IgGl且輕鏈?zhǔn)铅?。將純化的GNX-8在2XSDS凝膠上樣緩沖液中具有(還原條件)和不具有 (非還原條件)β-巰基乙醇的情況下煮沸后上樣于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠。使用 Minutesi-PR0TEAN3電泳系統(tǒng)(BIO-RAD)根據(jù)廠商推薦進行電泳。將在還原性SDS-PAGE凝膠上分離的GNX-8轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(NC)膜(Amersham) 并用3% PBS中的脫脂牛奶進行封閉。將膜與二抗一起在室溫溫育1小時。以1 5000 稀釋的HRP-標(biāo)記的山羊抗-人IgG( γ )抗體(Zymed，62-8420)和以1 2000稀釋的 HRP-標(biāo)記的兔抗-人κ鏈IgG抗體(DAK0，P0129)分別用于檢測GNX-8的重鏈和輕鏈。使用 Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer Life Sciences, Cat. No. NEL105)在 BioMax Light FiIm(KODAK, Cat. No. 1788207)上顯示信號。在還原條件下，GNX-8輕鏈和重鏈的分子量如對IgG的預(yù)期一樣。通過分別用山羊抗-人IgG(Y)-HRP和兔抗-人κ鏈-HRP作為二抗進行的蛋白印跡，GNX-8是人單克降抗體。通過ELISA分型GNX-8是人抗體。GNX-8的pi分析通過PhastSystem(Pharmacia)確定。簡短來說，將抗體樣品和 Pl標(biāo)準(zhǔn)物用PhastGel點樣器8/1梳(comb)上樣至IEF PhastGel 3-9并根據(jù)廠商方案進行分離。隨后在PhastSystem Development Unit(Pharmacia)中根據(jù)廠商方案對凝膠進行銀染。pi分析顯示出從pH 8. 15到8. 65范圍內(nèi)的多個條帶表明了抗體翻譯后修飾的可能性。高Pl表明GNX-8在生理pH將是可溶的。為了檢測細胞結(jié)合活性，用PBS洗滌2X IO5細胞并將其與各種濃度的抗體在室溫溫育30分鐘。PBS洗滌后，將1 3000稀釋的FITC-標(biāo)記的山羊抗-人IgG(Fe)抗體 (ICN,Cat no. 55198)添加至每個細胞樣品，于室溫另外再持續(xù)30分鐘。對于⑶C研究，將抗體處理后的細胞用PBS洗滌3次并與1 μ 1的碘化丙啶溶液(Sigma-Aldrich，P4846)溫育 30分鐘。在最終PBS洗滌后，在流式細胞儀(BD，F(xiàn)ACSort)上分析細胞。結(jié)果用CELLQuest 3. 3 (BD)處理。實施例4:細胞毒性測定將人結(jié)腸癌細胞系SW1116、Colo205 和 DLD-I 在 48-孔平板(Corning Costar)中以2 X IO4細胞/孔的密度接種。過夜培養(yǎng)后，將細胞在具有25 %未失活人血清的500 μ 1培養(yǎng)基中于各種抗體濃度溫育air。在PBS洗滌后，通過碘化丙啶(PI)溶液(Sigma-Aldrich， P4846)染色定量余下的活細胞并通過流式細胞術(shù)分析。從正常人血清純化的正常人IgG用作陰性對照。在替代的測定中，通過與大約100 μ 1的51Cr在約37°C溫育約90min來標(biāo)記靶細胞。洗滌(3x)和溫育(于37°C約Ihr)后，將細胞(約1Χ1(Λιι1)懸浮于補加了約25mMHEPES緩沖液和約3%牛血清白蛋白的RPMI-1640中。將大約20 μ 1標(biāo)記細胞、大約100 μ 1 的mAb和25%熱失活的人血清在微量滴定U形底平板(Corning，N. Y.)的孔中混合。非特異性小鼠Ig(Sigma，St. Louis, MO)可用作陰性對照。大約4hr溫育后，在裝配有懸掛平板托架的離心機中將平板離心(500 XgJmin)，每孔中約100 μ 1上清中的放射性用、計數(shù)器測量。每個實驗組可被測試三次。百分比特異性裂解可以根據(jù)下式計算([A-B] X 100)/C， 其中A =裂解的實驗細胞中的cpm ；B =末裂解的靶細胞中的cpm ；以及C =總靶細胞中的 cpm)。自發(fā)釋放優(yōu)選不應(yīng)超過15%的最大可釋放標(biāo)記放射性。通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放測定(Promega，CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)進行ADCC測定，使用從健康的供體用Ficol 1-Paque (GE， 71-7167-00)制備的人外周血單個核細胞(PBMC)作為效應(yīng)細胞。所述測定定量地測量乳酸脫氫酶(LDH)，其是在細胞裂解時釋放的穩(wěn)定的細胞質(zhì)酶。用30分鐘偶聯(lián)酶測定(coupled enzymatic assay)測量培養(yǎng)物上清中釋放的LDH，所述偶聯(lián)酶測定導(dǎo)致四唑鹽(INT)轉(zhuǎn)化成紅色甲腿產(chǎn)物。形成的顏色的量與裂解的細胞的數(shù)目成比例。將用作靶細胞的Colo205細胞分配至96-孔U形底平板中QX IO4細胞/孔)并在各種E/T比率的PBMC的存在下用抗體在37°C溫育4小時。上清中LDH活性用CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay測量。百分比特異性細胞裂解根據(jù)下式計算％特異性裂解=IOOX (E-Se-St)/(M-St)其中E是實驗釋放(來自與抗體和效應(yīng)細胞溫育的靶細胞的上清中的活性)，&是在效應(yīng)細胞存在下的自發(fā)釋放(來自效應(yīng)細胞單獨與培養(yǎng)基的上清中的活性)，&是靶細胞的自發(fā)釋放(來自靶細胞單獨與培養(yǎng)基溫育的上清中的活性)以及M是靶細胞的最大釋放(從使用9% Triton X-100裂解的靶細胞釋放的活性)。GNX-8的體外抗腫瘤活性用⑶C測定評估。在25%人血清存在下用GNX-8處理人結(jié)腸直腸癌細胞SW1116、Colo205和DLD-I導(dǎo)致了劑量依賴方式的實質(zhì)性細胞裂解。結(jié)果表明GNX-8通過補體依賴性細胞裂解殺死靶細胞。在一些實驗中SW1116和Colo205細胞上的CDC效應(yīng)強于DLD-I上的。細胞的生存力與GNX-8抗原的表達水平成反比例。在所述三種結(jié)腸直腸癌細胞系上的GNX-8的CDC 效應(yīng)和GNX-8抗原表達水平證明具有較高GNX-8抗原表達的癌細胞對于細胞毒性更敏感， 而具有較低GNX-8抗原表達的那些具有較高的存活力。結(jié)果導(dǎo)致了這樣的結(jié)論，即GNX-8 的抗腫瘤活性可依賴于GNX-8抗原的表達水平。在腫瘤細胞上具有高GNX-8抗原表達的患者可以單獨用GNX-8治療，而表達低水平GNX-8抗原的腫瘤可以受益于除了 GNX-8抗體之外的一或多種其它癌癥藥物的組合治療。在GNX-8存在下針對人結(jié)腸直腸癌Colo205評估人外周血單個核細胞(PBMC)的 ADCC活性。具有IMH2的ADCC活性用作陽性對照而人IgG用作陰性對照。GNX-8針對Colo205細胞誘導(dǎo)強烈的ADCC活性。細胞毒性作用與E/T比率和GNX-8 濃度均正相關(guān)。在約20/1的E/T觀察到百分之一百的細胞裂解。在約5yg/ml的GNX-8 和約50 μ g/ml的IMH2分別觀察到最大的ADCC效應(yīng)以及對于約50%的裂解所觀察到的趨勢。對照人IgG顯示出無細胞毒性作用，無論E/T比率或IgG濃度是怎樣的。達到50%裂解的GNX-8的劑量少于IMH2所需的1/10。實施例5 :BIAC0RE親和性分析將I型鞘糖脂附著至芯片。繼而根據(jù)廠商推薦將mAb暴露于芯片以進行動力學(xué)測量以及圍繞抗體-抗原結(jié)合反應(yīng)的表位序列分析(GE Healthcare, Pistcataway, NJ)。實施例6:體內(nèi)測定在Colo205異種移植模型中評估GNX-8的抗腫瘤活性。將Colo205細胞用PBS洗滌兩次并以5X 106/100 μ 1的細胞密度在PBS中重建。將6-8周齡的雌性裸小鼠用100 μ 1 的Colo205細胞懸液在側(cè)腹區(qū)s. c.接種。每周用游標(biāo)卡尺對腫瘤大小測量三次并將腫瘤重量(mg)評估為(寬度2X長度)/2。根據(jù)設(shè)計的劑量和時間表將GNX-8或正常人IgG經(jīng) i.p.注射入攜有腫瘤的裸小鼠中。為評估GNX-8的體內(nèi)抗腫瘤效力，將癌細胞(5X IO6細胞/小鼠)注射入裸小鼠內(nèi)并在腫瘤接種M小時后用GNX-8 (處理組，8只小鼠/組)或正常人IgG (對照組，7只小鼠 /組)處理。兩組注射以M小時時間間隔的5次給藥(300 μ g/小鼠)和隨后的以48小時時間間隔的4次給藥(600 μ g/小鼠)。在GNX-8處理的小鼠中腫瘤生長被顯著抑制。在第11天治療組達到大約23%的中位腫瘤重量τ/c(處理/對照)并在該近似水平持續(xù)至研究結(jié)束。在證明抗腫瘤活性方面< 42%的Τ/C測量值被認(rèn)為是顯著的。GNX-8處理組中一半0/8)的小鼠達到了超過50天的長期無腫瘤存活。另一方面，對照組動物的腫瘤大小在研究期間持續(xù)增加。在Colo205異種移植裸小鼠模型中進行了類似研究。GNX-8的第一次給藥在80至 IOOmg的腫瘤大小下進行。GNX-8 (處理組)和正常人IgG (對照組)每天注射一次(300 μ g/ 小鼠)，持續(xù)5天，并在第17和21天有兩次相似給藥。在處理組中也觀察到了顯著的腫瘤抑制，盡管所述處理在僅僅5次給藥后被中止。在第10天后中位腫瘤重量Τ/C(處理/對照)低于42%并持續(xù)至研究結(jié)束。為確定宿主效應(yīng)物功能是否對GNX-8效力有貢獻，攜有Colo205異種移植物的 SCID小鼠用GNX-8或正常人IgG以600 μ g/小鼠每周處理兩次，共三周。每周測量兩次腫瘤大小直至腫瘤大小達到體重的10%，這被認(rèn)為是研究的終點。在處理組中生存性被延長。為探索GNX-8表位在人結(jié)腸直腸癌上的出現(xiàn)，分析了若干人結(jié)腸直腸癌細胞系。例如，GNX-8對DLD-1的體內(nèi)抑制是顯著的。實施例7 :GNX-8抗原對于細胞糖蛋白的分析，將培養(yǎng)的細胞從T-75燒瓶中刮下并用PBS洗滌兩次，隨后用裂解緩沖液洗滌(50mM Tris-HCl pH 7. 5,150mM NaCl，1 % NP-40，0. 5%脫氧膽酸鈉， 0. SDS和ImM PMSF)。將裂解物通過沈號針頭若干次以分散任何大的聚集物。用ftOtein Assay試劑盒(Bio-Rad)確定蛋白濃度。將含有相同量蛋白的裂解物在凝膠上分離并用 GNX-8 作為一抗以及 HRP 標(biāo)記的小鼠抗人 IgG(Fc) (Southern Biotechnology Associates, #9040-05)作為二抗通過蛋白印跡分析。使用 Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, Cat. No. NEL105)在 BioMax Light FiIm (KODAK, Cat. No. 1788207)上顯示信號。將中性糖脂(2 μ 1/樣品)點樣至HPTLC平板上(Merck, 1. 05642，硅膠60F254)并用含比率為50 40 10 (V V V)的氯仿甲醇水的移動相顯色。對于糖脂的聚糖染色，將10% H2SO4中0. 2%的苔黑酚(Sigma，0-1875)噴到HPTLC平板上并在烤箱內(nèi)于110°C溫育10分鐘。對于免疫染色，首先將HPTLC平板用0.5%聚(甲基丙烯酸異丁酯) (Aldrich，181544)在氯仿己烷1 9 (V V)中固定45秒，隨后在3% BSA/PBS中封閉10 分鐘。繼而將平板用PBS洗滌并與一抗在室溫溫育lhr，隨后與生物素化的二抗于室溫lhr。 使用 Avidin-Biotin Complex 試劑盒(Vector Laboratories, Burlingame, CA)擴增來自二抗的信號。將平板在室溫溫育30分鐘，隨后根據(jù)廠商方案用Immunostaining HRP-1000試劑盒(Konica Minolta, 130990)進行顯色。向凍干的樣品中添加20 μ 1的48%氟化氫(HF) (Merck)，并繼而將混合物在4°C溫育48h。在反應(yīng)結(jié)束時，用N2氣去除HF。去巖藻糖基化的糖脂用于GNX-8的特異性研究。Colo205的中性糖脂用HF處理并通過MALDI-TOF MS分析以確認(rèn)巖藻糖的去除。 進行TLC免疫染色以分析在HF處理前和處理后GNX-8對Colo205中性糖脂的特異性。GNX-8識別未被裂解的糖脂而不是去巖藻糖基化的形式，表明GNX-8的表位是碳水化合物部分且?guī)r藻糖是該結(jié)構(gòu)的必要組分。通過對分離自Colo205細胞的中性和單唾液酸糖脂的HPTLC免疫染色進一步鑒別 GNX-8的特異性。收集了 100克的Colo205細胞，并提取了糖脂級分。用苔黑素/H2SO4對經(jīng) TLC分離的Colo205糖脂進行碳水化合物染色。根據(jù)前述的Mroud et al. (1992)鑒定出 Lea，Leb，Lea-Lea和Leb-LeaW位置。唾液酸Lea(SLea)通過用mAb NKH3染色來指明(美國專利號5，240，833)，隨后用MALDI-MS鑒定。用CF4C4(美國專利號5，011，920)(抗-Lea)、 T218 (Abeam, Cambridge, ΜΑ)(抗-Leb)、IMH2 (前述 Stroud et al.，1992)(抗 Leb-Lea)和 GNX-8抗體對相同糖脂級分進行HPTLC免疫染色。結(jié)果表明GNX-8與伸展的I型鏈糖脂強烈反應(yīng)。GNX-8未結(jié)合Lea伸展的I型鏈。 Colo205細胞的單唾液酸糖脂未被GNX-8識別。GNX-8與較高濃度(0. 6 μ g/ml)的Leb顯示非常輕微的交叉反應(yīng)性。不同于IMH2，GNX-8未結(jié)合Lex或Ley。GNX-8結(jié)合含有Leb的伸展鏈。GNX-8結(jié)合Leb-Lea。除TLC免疫染色之外，通過使用合成聚糖Leb、Lea-Le\ Leb-Lex和Lex-Lex作為抑制劑以及Leb-LeVlea-Lea糖脂混合物作為陽性對照的競爭性ELISA來鑒別GNX-8的表位。結(jié)果表明GNX-8與高抑制劑濃度的Leb-Lex輕微地交叉反應(yīng)，但是與其它測試的合成聚糖包括合成Leb聚糖沒有反應(yīng)性。GNX-8對伸展的Leb的結(jié)合活性比對簡單的Leb的高 1000 倍。基于該結(jié)果，GNX-8的表位可能是在具有巖藻糖基化的伸展的I型鏈上的Leb結(jié)構(gòu)，但卻不是簡單的Leb。實施例8 細胞和組織分布從例如US Biomax獲得了福爾馬林固定和石蠟包埋的人正常和癌組織標(biāo)本。將所述正常和惡性人組織福爾馬林固定、石蠟包埋的組織陣列用PBS中的0. 脫脂牛奶封閉30分鐘。在另外10分鐘與3% H2O2溫育后，將該組織陣列用PBS洗滌三次后將樣品與0. BSA/PBS-稀釋的生物素化的GNX-8溫育1小時。繼而使該組織樣品與生物素-鏈霉抗生素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物(ABC試劑盒，Vector，#PK-6100)反應(yīng)30分鐘用于信號放大。使用DAB PLUS Substrate試劑盒(Zymed#00-2020)根據(jù)廠商方案使免疫反應(yīng)染色顯像。用蘇木精進行對比染色。通過光學(xué)顯微鏡顯像來確定結(jié)果。通過流式細胞術(shù)評估GNX-8抗原在人癌細胞上的表達。通過流式細胞術(shù)分別檢驗了數(shù)個人結(jié)腸直腸和胃腫瘤細胞系如Colo205、HT-29、DLD-U SW1116、T84和KATO III的 GNX-8抗原的表達。流式細胞術(shù)分析證明GNX-8展示了對所有測試的癌細胞系的結(jié)合活性。而對 SWl 116、Colo205和DLD-I細胞的結(jié)合顯著強于其它測試的人癌細胞系。另外，在HL60 (早幼粒細胞細胞系)、MCF_7 (乳腺癌細胞系)和PANC-I (胰腺癌細胞系)上以及在小鼠結(jié)腸癌細胞系CD6上測試了 GNX-8抗原表達。GNX-8不結(jié)合這四個細胞系。用蛋白印跡分析兩種結(jié)腸直腸癌細胞系Colo205和SWl 116。這兩種細胞系在流式細胞術(shù)分析中證明了與GNX-8強結(jié)合。結(jié)果顯示在Colo205和SWl 116的糖蛋白上存在分子量從32到> 17^Da范圍的 GNX-8抗原。因此，GNX-8抗原不僅在糖脂中也在糖蛋白中。將來自各種器官包括正常組織和癌組織的多種標(biāo)本分別用GNX-8染色。用染色強度和陽性細胞頻率來評估組織標(biāo)本中的染色模式。以1+(10-20^),2+00-50%)或3+(> 50% )的尺度對染色進行評級，而基于每區(qū)段中陽性細胞的百分比來對頻率進行分類。在原發(fā)和轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌中觀察到GNX-8抗原表達之間的強相關(guān)。對來自結(jié)腸直腸癌患者的一組組織區(qū)段進行免疫組織化學(xué)染色。GNX-8抗原不僅在結(jié)腸直腸癌組織上表達也在相鄰組織上表達。例如，臨近癌癥區(qū)的息肉被GNX-8染色。然而，在遠端正常組織上末觀察到染色。因此，可以得到結(jié)論，GNX-8 在可識別的細胞形態(tài)改變發(fā)生前鑒定出轉(zhuǎn)化的細胞或正在進行轉(zhuǎn)化的細胞。還在各種級別的癌癥上研究了 GNX-8抗原表達。GNX-8抗原在每個癌癥階段中表達。GNX-8不結(jié)合正常的結(jié)腸、直腸、胃、小腸、肝、食管、肺、前列腺或乳房。百分之五十八04/76)的結(jié)腸癌樣品被GNX-8染色；47%的直腸癌樣品；57%的轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌樣品；53%的胃癌樣品；四％的食管癌樣品；22%的肺癌樣品；4%的前列腺癌樣品；17%的乳腺癌樣品；和67%的胰腺樣品被GNX-8染色。GNX-8不結(jié)合小腸、肝和腎癌樣品。表1GNX-8對人正常組織的特異性
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權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合包含伸展的I型鏈的表位的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述伸展的I型鏈包含Leb，其中所述表位在癌細胞上表達，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分不結(jié)合人紅細胞。
2.權(quán)利要求1的抗體，其不結(jié)合Lex。
3.權(quán)利要求1的抗體，其不結(jié)合Le\
4.權(quán)利要求1的抗體，其不結(jié)合Ley_Lex。
5.權(quán)利要求1的抗體，其在ADCC測定中于約20/1的E/T比率以約5μ g/ml的抗體濃度裂解約50%的Colo205細胞。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述癌細胞表達Leb_Lea。
7.權(quán)利要求1的抗體，其中所述癌細胞是上皮細胞。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述上皮細胞包含結(jié)腸、直腸、食管、肺、前列腺、乳房或胰腺。
9.權(quán)利要求1的抗體，其中所述其部分是scFv。
10.權(quán)利要求1的抗體，其包含κ鏈。
11.權(quán)利要求1的抗體，其包含Y鏈。
12.權(quán)利要求1的抗體，其包含從GNX-8獲得的⑶R區(qū)。
13.包含權(quán)利要求1的抗體和藥物學(xué)活性劑的組合物。
14.包含權(quán)利要求1的抗體和可檢測部分的制品。
15.包含權(quán)利要求1的抗體和藥物可接受的運載體、賦形劑或稀釋劑的組合物。
全文摘要
提供了特異性結(jié)合伸展的I型鏈鞘糖脂的人抗體和這些抗體的抗原結(jié)合部分。
文檔編號C07K16/18GK102282172SQ200880131006
公開日2011年12月14日 申請日期2008年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月7日
發(fā)明者丁志岳, 劉亮吟, 張東玄, 張淑燕, 楊玫君, 洪彩霞, 溫兆遠, 箱守仙一郎, 陳瑩蓁, 飯?zhí)锖妥?申請人:臺灣醣聯(lián)生技醫(yī)藥股份有限公司