專利名稱：：基于pcr的合成核酸分子的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及合成核酸分子的PCR法。
背景技術：
：從頭基因合成是一種建立和修飾基因的強大分子工具。從頭基因合成具有廣泛用途，包括蛋白質(zhì)工程改造(1，2)、人工基因網(wǎng)絡的開發(fā)(3)、以及合成基因組(4-6)的建立。分子生物學技術例如基因克隆，常常牽涉到產(chǎn)生所需基因的PCR步驟，因此需要DNA模板(12)。然而，天然存在的模板DNA出于許多原因并不總是可得的，包括缺乏相關生物來源、有限的環(huán)境或考古學樣本以及DNA樣本的降解或與天然來源生物有關的危害(4)。由于實驗室從頭合成基因的實現(xiàn)，科學家不再依賴于天然DNA的可用性和可得性。從頭基因合成也實現(xiàn)了基因的精確操作。通過詳細限定核苷酸序列，科學家能輕易引入突變、摻入克隆目的的限制性位點、或改變密碼子用法以使其與宿主細胞系統(tǒng)的已知密碼子偏好匹配(9，13)。這種操作與使用含有天然存在的基因序列的模板相比，能促進基因功能、結構和表達的研究，和改善蛋白質(zhì)的表達、定位、檢測和純化(10，16)?；虻幕瘜W合成可通過多個寡核苷酸的裝配實現(xiàn)?？赏ㄟ^各種方法將寡核苷酸庫裝配成較大的DNA分子來構建更大的DNA分子，包括基于從頭聚合酶鏈式反應(PCR)(6,7)或連接酶鏈式反應(LCR)(4,8)的合成方法。在各類方法中，基于PCR的方法似乎是最高效和經(jīng)濟的(16)。報道最多的合成長DNA分子方法是基于PCR的方法，其依靠使用重疊寡核苷酸來構建基因。已提出了各種方法來嘗試優(yōu)化長DNA序列的PCR法和提高裝配準確度。這些方法包括熱力學里外平衡(TBIO)法(9)、連續(xù)PCR(IO)、雙重不對稱PCR(DA-PCR)(11)、重疊延伸PCR(OE-PCR)(12，13)、基于PCR的兩步DNA合成(10，14，15)、和一步基因合成(16)?；赑CR的已知基因合成方法通常形成比所需基因產(chǎn)物分子量更大的假產(chǎn)物，從而降低了合成產(chǎn)物的純度(9-12，16-19)。另外，用基于PCR的已知方法不能精確檢測成功的基因合成，因此通常用凝膠電泳驗證所需PCR產(chǎn)物的生成。凝膠電泳涉及在熒光顯像儀的幫助下通過凝膠電泳人工觀察全長PCR產(chǎn)物。該方法涉及了額外的設備，是單調(diào)乏味的工作，而且與用于開發(fā)自動化基因合成的芯片實驗室方法并不能良好相容。另外，凝膠電泳只能提供DNA擴增的終點分析，即只能用來觀察存在于PCR方法終點的DNA產(chǎn)物。DNA產(chǎn)物的PCR擴增首先是隨機的，其次是呈指數(shù)上升，最后停滯(28)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了合成雙鏈DNA的單一反應方法，包括用化學方法實際上不能合成的較長DNA分子。該方法涉及通過裝配重疊寡核苷酸和PCR擴增裝配的產(chǎn)物來合成基因或核酸分子，該PCR是使用不同寡核苷酸和退火溫度進行PCR裝配和擴增過程的單一PCR反應。通過使用一組平均解鏈溫度比用于擴增所需基因或核酸分子的外部擴增引物平均解鏈溫度高的裝配寡核苷酸，本發(fā)明的方法減少了PCR裝配和PCR擴增過程之間的競爭，這種競爭可能在常規(guī)的基因合成的一步PCR裝配法中發(fā)生，因此能提供更有效準確的方法用于合成長雙鏈基因。另外，本發(fā)明提供了一種通過實時PCR(RT-PCR)裝配全長核酸分子的方法，其可能有利于優(yōu)化有效和準確合成所需基因產(chǎn)物的反應條件，且可實現(xiàn)能與自動化基因合成系統(tǒng)整合的基因產(chǎn)物的自動驗證和定性。在一方面，提供了一種合成核酸分子的方法，該方法包括通過PCR在PCR反應混合物中裝配全長模板核酸分子，該PCR反應混合物含有一組具有第一平均解鏈溫度的裝配寡核苷酸，和一組具有低于第一平均解鏈溫度的第二平均解鏈溫度的外部擴增引物，其中所述裝配包括使PCR反應混合物經(jīng)歷高于第二平均解鏈溫度的第一退火溫度；通過PCR在PCR反應混合物中擴增全長模板核酸分子，其中所述擴增包含使PCR反應混合物經(jīng)歷第二退火溫度，該溫度允許外部擴增引物對全長模板核酸分子退火。在一個實施方式中，第二退火溫度低于或相當于第二平均解鏈溫度。在多個實施方式中，第一平均解鏈溫度比第二平均解鏈溫度高不少于5°C，或第一平均解鏈溫度比所述第二平均解鏈溫度高約5-25°C。在多個實施方式中，PCR反應混合物包含一組濃度為約5nm到約80nm或約10到約60nM的裝配寡核苷酸。在多個實施方式中，PCR反應混合物包含一組濃度為約120nm到約1μm或約200到約800nM的外部擴增引物。在多個實施方式中，裝配包括用第一退火溫度進行約5-30輪PCR；裝配可包括用第二退火溫度進行約10到約35輪PCR。在一些實施方式中，全長模板約長750個堿基對，所述裝配包括在退火階段用第一退火溫度進行約15輪PCR，所述擴增包括用第二退火溫度進行約15輪PCR。PCR反應混合物包含濃度約IOnm的一組裝配寡核苷酸，可包含濃度約400nm的一組外部擴增引物。在多個實施方式中，PCR是實時PCR，PCR反應混合物包含熒光探針，其中熒光強度的增加與全長模板核酸分子的量成線性比例。熒光探針是LCGreenI。該方法還包括根據(jù)所檢測到的熒光強度優(yōu)化所述裝配。例如，優(yōu)化包括調(diào)節(jié)以下之一或更多(i)變性、退火或延伸的時間或溫度；(ii)裝配寡核苷酸組或外部擴增引物組的濃度；和(iii)PCR輪數(shù)。方法是自動化的。在另一方面，提供了一種試劑盒，其包含一組可退火形成相鄰寡核苷酸對之間具有缺口的長雙鏈DNA的裝配寡核苷酸和一組外部擴增引物；其中所述裝配寡核苷酸組的平均解鏈溫度比外部擴增引物組的平均解鏈溫度高。在另一方面，提供了一種合成核酸分子的方法，包括在包含一組裝配寡核苷酸的PCR反應混合物中通過實時PCR裝配全長模板核酸分子。如上所述，PCR反應混合物包含熒光探針，其中熒光強度的增加與全長模板核酸分子的量成線性比例。熒光探針是LCGreenI。該方法還包括根據(jù)所檢測到的熒光強度優(yōu)化所述裝配。例如，優(yōu)化包括調(diào)節(jié)以下之一或更多(i)變性、退火或延伸的時間或溫度；(ii)裝配寡核苷酸組的濃度；和(iii)PCR輪數(shù)。方法是自動化的。本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明下面特定實施方式的描述以及附圖將會明白本發(fā)明的其它方面和特征。附圖簡要說明在圖中，僅以舉例方式說明了本發(fā)明的實施方式圖1。用寡核苷酸解鏈溫度變化的基于PCR方法的基因合成示意圖(“自頂至下一步基因合成”)本方法一個實施方式的示意圖，稱作自頂至下(TD)—步基因合成，在一個反應內(nèi)聯(lián)合PCR裝配和擴增與設計用于裝配和擴增的不同退火溫度。在該實施方式中，設計裝配寡核苷酸和外部擴增引物的解鏈溫度差大于15°C，以盡可能消除PCR過程中的可能干擾。圖2。一步(共30輪裝配/擴增)、TD—步(40輪，20輪裝配然后是20輪擴增)和兩步(PCA30輪，PCR30輪)基因合成的瓊脂糖凝膠電泳結果。TD—步法涉及在67V的退火溫度下進行的20輪PCR裝配，然后是在49°C的退火溫度下進行的20輪PCR擴增，都在同一反應混合物中進行。裝配寡核苷酸和外部擴增引物的濃度分別為IOnM和400nM。圖3。用IxLCGreenI連續(xù)熒光監(jiān)測實時PCR基因合成。在67°C的退火溫度下進行首先的20輪PCR裝配，然后在49°C的退火溫度下再進行20輪PCR擴增。裝配寡核苷酸和外部擴增引物的濃度分別為IOnM和400nM。圖4。在成功的基因合成中裝配寡核苷酸濃度是關鍵。合成S100A4(752bp)，用5nM-80nM的各種裝配寡核苷酸濃度，前20輪退火溫度為67°C，后20輪退火溫度為49°C。(a)5nM(O)、7nM(□)、10nM(Δ)、13nM(+)、17nM(X)、20nM(〇)、40nM(·)、64nM(▲)和80nM(^)的寡核苷酸濃度下作為PCR輪數(shù)函數(shù)的熒光。在早期循環(huán)和第21到約33輪中熒光強度的斜率分別表示裝配和擴增過程的效率。(b)對應瓊脂糖凝膠電泳結果。圖5。用60nM到ΙμΜ的不同外部擴增引物濃度成功合成了S100A4(752bp)。(a)60nM(O)、120nM(□)、200ηΜ(Δ)、300nM(X)、400nM(+)和1μΜ(O)的外部引物濃度下作為PCR輪數(shù)函數(shù)的熒光。插圖表示前20輪的熒光信號。(b)對應瓊脂糖凝膠電泳結果。所需長度的清晰狹窄凝膠條帶表明了S100A4的成功合成。圖6。用不同裝配輪數(shù)(6-20輪)和之后另20輪擴增來合成S100A4。瓊脂糖凝膠電泳表明在11輪內(nèi)實現(xiàn)了全長裝配。圖7。用58_70°C的前20輪不同裝配退火溫度和49°C的后20輪退火溫度合成了S100A4(752bp)。(a)58°C(O)>60°C(□)、62°C(A)、65°C(X)、67V(+)和70°C(〇)的退火溫度下作為PCR輪數(shù)函數(shù)的熒光。插圖顯示了中間的15輪(13-27)。(b)對應瓊脂糖凝膠電泳結果。用嚴格裝配退火溫度(>67°C)獲得了較高的合成產(chǎn)率。圖8。SYBRGreenI禾ΠLCGreenI對S100A4的TD—步實時基因合成的濃度效果(a)0.25x-5xSYBRGreenI。在該圖中也包括了IxLCGreenI的熒光強度作為比較。SYBRGreenI的熒光曲線對PCR輪數(shù)不敏感，不能指示基因合成過程中的DNA長度延伸。(b)0.25x-5xLCGreenI。裝配和擴增的退火溫度分別是58°C和49°C。裝配寡核苷酸和外部擴增引物的濃度分別為64nM和400ηΜ。圖9。MgSO4濃度對于成功基因合成是關鍵。(a)不同MgSO4濃度下IxLCGreenI的熒光作為PCR輪次的函數(shù)1·5mM()、2.5mM(□)、3.0mM(Δ)、3·5mM(X)、4·0mM(·)和5.OmM(O)0(b)對應瓊脂糖凝膠電泳結果。通過分別用于裝配和擴增的58°C和49°C退火溫度、ImM各dNTP、IOnM裝配寡核苷酸和400nM外部擴增引物進行TD—步基因合成。用4mMMgSO4的基因合成提供了最佳全長產(chǎn)物得率。圖10。用RT-PCR基因合成產(chǎn)物的分析和解鏈峰分析。(a)來自一步和兩步合成的S100A4的裝配產(chǎn)物的解鏈峰分析；對每組寡核苷酸進行兩次測試。用羅氏光循環(huán)儀1.5實時熱循環(huán)機獲得裝配基因的解鏈曲線分析結果，其中勻變?yōu)?2-99°C，0.05°C/秒。(b)裝配產(chǎn)物的對應瓊脂糖凝膠電泳結果。表1.裝配寡核苷酸數(shù)據(jù)表2.—步、兩步和TD—步基因合成的PCR條件。表3.—些報道的最佳基因合成條件。表4.為S100A4設計的寡核苷酸組。發(fā)明詳述在基因合成的基于PCR的裝配方法中，將短寡核苷酸庫合并在一起。每個寡核苷酸含有所需核酸序列的有義或反義鏈的一部分序列。在混合物中，具有重疊互補序列的寡核苷酸退火形成具有雙鏈退火區(qū)段和在雙鏈區(qū)段一端或兩端的單鏈重疊區(qū)段。雙鏈區(qū)段的鏈末端作為延伸引物，而單鏈區(qū)段作為聚合酶反應的模板，產(chǎn)生延伸的雙鏈DNA分子。然后，延伸的DNA分子解鏈并再次退火，形成新的雙/單鏈DNA分子，然后其又作為新引物/模板，可與其它延伸的互補模板DNA退火，在下一輪PCR循環(huán)中形成較長的DNA分子。通過重復該過程，DNA長度逐漸增加，逐步產(chǎn)生所需序列的全長模板。然后通過PCR擴增步驟提高裝配的全長模板核酸DNA量。該基因裝配PCR法可作為一步法，其在一個反應混合物中使用一組PCR循環(huán)來聯(lián)合PCR裝配和PCR擴增，或作為兩步法，其涉及裝配和擴增階段的單獨反應和PCR循環(huán)。一步基因合成法簡單快速，因其只需要一次PCR反應，但在同一PCR反應中包含外部擴增寡核苷酸和裝配寡核苷酸常常導致低產(chǎn)率，有時還不能生成所需產(chǎn)物。兩步法提供了更好的所需產(chǎn)物的產(chǎn)率，但是這類方法需要兩次不同的PCR反應，需要介入試劑加入和分離步驟。如上所述。在前述基因合成的基于PCR的一步裝配法中，外部擴增引物與裝配寡核苷酸一起混合在同一PCR反應混合物中。一般設計裝配寡核苷酸和擴增引物具有一致的解鏈溫度，以隨著PCR進程平衡在反應混合中的PCR裝配和擴增過程。結果，過量存在的外部擴增引物傾向于與已經(jīng)被裝配過程延伸、但還不是全長模板的寡核苷酸退火，導致相當大部分的外部擴增引物參與最初基因裝配過程，從而耗竭了能夠在裝配后擴增全長模板的外部引物供應。此外，脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)的供應也會被耗竭，PCR反應就在未成熟前就已停滯(17，21)。另外，僅能以正常5’-3’方向延伸的內(nèi)部裝配寡核苷酸也會在擴增PCR中抑制全長基因產(chǎn)物的擴增(13)。裝配寡核苷酸和外部擴增引物之間的競爭效應降低了全長基因產(chǎn)物的產(chǎn)率，并導致假產(chǎn)物的形成。這種競爭效應對于具有高GC含量或長度的DNA更關鍵(9，10)，而且在兩步PCR法中消除，因為擴增和裝配分別進行，但是維持PCR混合物新鮮以及介入試劑加入和分離步驟會產(chǎn)生額外的花費和消耗額外的精力。本方法部分基于發(fā)現(xiàn)解鏈溫度變動可用于控制基于PCR的基因合成單反應法中寡核苷酸裝配和全長模板擴增過程的效率。利用設計成在PCR(其包括至少兩個不同退火溫度)法中具有不同平均解鏈溫度的裝配寡核苷酸和外部擴增引物，從時間上分開裝配和擴增過程，從而減少了PCR裝配和擴增過程在單一基因合成反應中的相互影響。因此，本發(fā)明提供了一種基于PCR的單一基因合成反應，其結合了已知一步法的簡單節(jié)約和已知二步法中分別裝配和擴增的效力。本方法涉及在單一反應混合物中進行聚合酶鏈式反應(PCR)，該反應混合物含有一組裝配寡核苷酸和一組外部擴增引物，所述裝配寡核苷酸組比所述外部寡核苷酸引物組具有更高的平均解鏈溫度。PCR反應在至少兩個階段中進行，第一階段使用的第一退火溫度比外部擴增引物組的平均解鏈溫度高且有利于裝配寡核苷酸到模板核酸序列。第二階段使用的第二退火溫度能使外部擴增引物對模板核酸序列退火并擴增全長模板核酸序列。通過裝配寡核苷酸和外部擴增引物的策略設計以及相較外部擴增引物選擇適合裝配寡核苷酸的不同平均解鏈溫度，能進行本方法所述的基于PCR的基因合成裝配法。因此，在一方面，提供了一種合成核酸分子的方法，該方法包括通過PCR在PCR反應混合物中裝配全長模板核酸分子，該PCR反應混合物含有一組具有第一平均解鏈溫度的裝配寡核苷酸，和一組具有低于第一平均解鏈溫度的第二平均解鏈溫度的外部擴增引物，其中所述裝配包括使PCR反應混合物經(jīng)歷高于第二平均解鏈溫度的第一退火溫度；通過PCR在PCR反應混合物中擴增全長模板核酸分子，其中所述擴增包含使PCR反應混合物經(jīng)歷第二退火溫度，該溫度可使外部擴增引物對全長模板核酸分子退火。圖1是本發(fā)明單次反應裝配和擴增PCR法的一個實施方式的示意性描述。PCR方法、條件和試劑在本領域已知(參見例如美國專利號4，683，195,4,683，202和4，965，188)。一般，PCR擴增在PCR反應混合物中進行，該混合物含有編碼要擴增序列的模板核酸分子，設計與模板上具體互補靶位點退火的引物、脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)和DNA聚合酶，全部混合在適當緩沖液中，使得引物對模板退火，并提供DNA聚合酶延伸引物得到新DNA產(chǎn)物所需的條件和任何輔助因子或離子。簡要地，PCR包括使PCR反應混合物經(jīng)歷至少一輪溫度變化和預定時間的循環(huán)，實現(xiàn)變性、退火和延伸階段。通常PCR循環(huán)的變性、退火和延伸階段各自在不同的特定溫度下進行，本領域已知在熱循環(huán)儀中進行PCR以獲得PCR循環(huán)各步驟所需溫度。通常在最高溫度下進行變性，以解鏈任何雙鏈DNA(模板或先前循環(huán)中的擴增產(chǎn)物)，例如在95°C，使用熱抗性DNA聚合酶，如Taq聚合酶。退火階段在寡核苷酸能夠與互補DNA鏈特異性退火的溫度下進行，通常選擇能促進特異性退火但減少非特異性堿基配對的溫度。應理解，選擇精確退火溫度取決于PCR反應混合物中所包含的寡核苷酸序列。延伸階段在適合所用特定DNA聚合酶的溫度下進行，使DNA聚合酶合成擴增產(chǎn)物。在涉及基因裝配的基于PCR的基因合成法中，通常在PCR開始前PCR混合物中不提供模板核酸分子。相反，在PCR裝配階段中模板形成是通過重疊裝配核苷酸庫退火和DNA聚合酶重疊延伸，逐漸合成所需模板的較長片段，最終在多次PCR循環(huán)后產(chǎn)生全長不間斷的模板，PCR循環(huán)次數(shù)至少部分依賴于全長模板的長度和用于裝配模板的重疊寡核苷酸的數(shù)目。因此，在本方法中，應理解PCR反應混合物包括進行PCR的必需成分(包括dNTP、DNA聚合酶和緩沖液)，在起始反應混合物中提供的模板和引物分別作為裝配寡核苷酸組和外部擴增引物組，如下所述。還應理解本文所述的PCR裝配和擴增都包括變性、退火和延伸步驟。應理解，術語“寡核苷酸”指包含至少兩個核苷酸的單鏈核酸分子。用于PCR的寡核苷酸的合適長度已知或能夠容易確定。在不同的實施方式中，長度可以是約10-約100個核苷酸。本領域技術人員應理解，可購買或用已知標準程序化學合成寡核苷酸。本PCR法涉及在單一PCR反應混合物中使用兩類寡核苷酸裝配寡核苷酸和外部擴增引物。裝配寡核苷酸組是任意重疊寡核苷酸組，當一起退火時，產(chǎn)生所需核酸序列或基因的全長模板，但沿模板在交替鏈上有斷裂或缺口，斷裂或缺口是在一個核苷酸停止和下一個編碼相同鏈序列的寡核苷酸起始處之間。因此，一般設計裝配寡核苷酸組覆蓋至少一條雙鏈DNA模板兩條鏈長度，從而當一組完整的裝配寡核苷酸都在一起退火時，形成退火的雙鏈斷裂模板。每一個裝配寡核苷酸與一部分所需核酸序列或基因的有義鏈或反義鏈互補，每一個裝配寡核苷酸與至少另一個裝配寡核苷酸部分雜交，從而在PCR裝配階段組裝重疊的裝配寡核苷酸，形成所需核酸序列或基因的全長模板。裝配寡核苷酸組可設計成產(chǎn)生具有天然存在基因序列的模板，或者設計成在最終模板中引入突變或限制性位點，或改變密碼子以適合模板DNA最終要表達的生物中的密碼子使用。同樣，裝配寡核苷酸組可設計成產(chǎn)生新的DNA序列例如編碼新融合蛋白的DNA或者插入標記或DNA靶序列或編碼蛋白質(zhì)標記的序列到模板DNA中。外部擴增引物組是至少兩條寡核苷酸組，其作為引物與裝配寡核苷酸組組裝的全長完整模板的任一鏈退火。外部擴增引物組在本方法的擴增階段促進全部或部分全長模板的PCR擴增。在外部擴增引物組中，至少一個引物與雙鏈全長模板的編碼(或上方)鏈的3’末端區(qū)域互補，至少一個外部擴增引物與雙鏈全長模板的互補(或下方)鏈的3’末端區(qū)域互補。當在PCR中與全長模板雜交時，外部擴增引物可促進所需核酸序列或基因的所選部分或全部的PCR擴增?！捌骄怄湝囟取敝敢唤M寡核苷酸內(nèi)寡核苷酸(裝配寡核苷酸或外部擴增引物)的解鏈溫度的算術平均數(shù)，平均解鏈溫度應用于所述寡核苷酸。因此，通過平均所有裝配寡核苷酸的解鏈溫度確定裝配寡核苷酸的平均解鏈溫度，而通過平均所有外部擴增引物的解鏈溫度確定外部擴增引物的平均解鏈溫度。本領域技術人員應理解寡核苷酸的解鏈溫度是在該溫度下50%相同寡核苷酸群會形成穩(wěn)定雙鏈螺旋，而另50%將分解成單鏈分子。設計裝配寡核苷酸和外部擴增引物，使得裝配寡核苷酸的平均解鏈溫度比外部擴增引物的平均解鏈溫度高，平均解鏈溫度之間的差異足以在單次基于PCR的基因合成反應中減少PCR裝配和PCR擴增之間的競爭。寡核苷酸的解鏈溫度取決于許多因素，包括寡核苷酸長度、寡核苷酸的特定核酸序列，如此各裝配寡核苷酸的解鏈溫度應該不同且各外部擴增引物的解鏈溫度也應不同。然而，可設計寡核苷酸以最小化裝配寡核苷酸的解鏈溫度偏差以及外部擴增弓I物的解鏈溫度偏差?？捎靡阎墓胶鸵阎绦虬ㄊ惺圮浖?，計算任何給定寡核苷酸的解鏈溫度。使用計算機軟件設計寡核苷酸在本領域已知(參見例如美國專利申請出版號2008/0182296,19)。寡核苷酸可設計優(yōu)化用于提高基因表達，并盡可能減少發(fā)夾形成和相似解鏈溫度(9，19)。例如，為了設計各寡核苷酸解鏈溫度之間偏差最小的裝配寡核苷酸組，可用一種計算機程序，先將所需核酸序列用標記分成大致相等長度的寡核苷酸，然后用配有SantaLucia的熱力學參數(shù)(23)的最近鄰模型計算重疊區(qū)域中解鏈溫度的平均值和偏差，并用鹽和寡核苷酸濃度進行校正。然后，可通過移動標記位置來調(diào)節(jié)寡核苷酸長度，以使得解鏈溫度的偏差最小化。不受任何特定理論限制，裝配寡核苷酸的平均解鏈溫度和外部擴增引物的平均解鏈溫度的差異似乎防止外部擴增引物和裝配寡核苷酸中的錯配，而且當使用比外部擴增引物平均解鏈溫度高的退火溫度時，有效促進模板裝配。平均解鏈溫度中的差異不應太小，否則會消除任何不同平均解鏈溫度帶來的益處，同時，如果差異過大，裝配效率可能會降低。在設計引物時，為了增強特異性，設計外部擴增引物的平均解鏈溫度高于約50°C具有優(yōu)勢。在一些實施方式中，裝配寡核苷酸的平均解鏈溫度與外部擴增引物的平均解鏈溫度之間的差異不小于約5°C，不小于約6°C，不小于約7。C，不小于約8°C，不小于約9°C，不小于約10°C，不小于約11°C，不小于約12°C，不小于約13°C，不小于約14°C，不小于約15°C，不小于約16°C，不小于約17°C，不小于約18°C，不小于約19°C，不小于約20°C，不小于約21°C，不小于約22°C，不小于約23°C，不小于約或不小于約25°C。在特定實施方式中，裝配寡核苷酸的平均解鏈溫度和外部擴增引物的平均解鏈溫度之間的差異為約5-約25°C，約7-約190Cο本領域技術人員將理解，使用本方法，成功基因合成所需裝配寡核苷酸與外部擴增引物之間平均解鏈溫度的差異大小變化取決于退火條件例如PCR混合物的pH和鹽濃度，以及特定寡核苷酸。例如，減少非特異性寡核苷酸退火可能性的嚴格退火條件使得解鏈溫度的差異更小。PCR如上所述分兩階段進行。第一階段是裝配階段，包括一個或多個變性、退火和延伸的循環(huán)，使用的設計退火溫度可組裝裝配寡核苷酸組，但減少外部擴增引物對任何可能存在的可得互補核酸分子退火。尤其是在裝配階段中，退火溫度比外部擴增引物的解鏈溫度高，使得裝配寡核苷酸可組裝到所需核酸序列的全長模板中，同時減少外部擴增引物在該階段的退火。如本文所用，術語“退火溫度”指PCR過程中使用的溫度，使寡核苷酸與DNA互補鏈形成特定堿基對。通常選擇特定寡核苷酸組的退火溫度比平均解鏈溫度稍低，例如低約1°C、約2°C、約3°C或約5°C，雖然在一些情況下可能等于或稍高于特定寡核苷酸組的平均解鏈溫度。例如，可選擇基因合成裝配階段的退火溫度比外部擴增引物組的平均解鏈溫度高不小于約5°C，不小于約6°C，不小于約7°C，不小于約8°C，不小于約9°C，不小于約10°C，不小于約1TC，不小于約12°C，不小于約13°C，不小于約14°C，不小于約15°C，不小于約160C，不小于約17°C，不小于約18°C，不小于約19°C，不小于約20°C，不小于約21°C，不小于約22°C，不小于約23°C，不小于約或不小于約25°C。基因合成的裝配階段的退火溫度可以比裝配寡核苷酸的平均解鏈溫度稍高。設置裝配退火溫度高于裝配寡核苷酸組的平均解鏈溫度能提供多種優(yōu)勢，包括？(i)減少裝配和擴增反應之間的可能競爭；(ii)減少截短的寡核苷酸參與裝配過程的可能性和產(chǎn)生的錯誤，(iii)提供了一種選擇性更高的退火條件，以減少形成二級結構的可能性，和(iv)提高寡核苷酸雜交的特異性，這些所有都防止錯誤序列的產(chǎn)生，尤其是在高GC含量的基因情況下。應理解一些DNA聚合酶的延伸效力在72°C最高，將本方法中的裝配退火溫度設置為高于72°C，可能會降低取決于所用DNA聚合酶的裝配寡核苷酸組裝效率。用允許外部擴增引物對裝配的全長模板退火的擴增退火溫度進行PCR擴增階段，從而擴增部分或所有全長模板，這取決于外部擴增引物設計與模板的何處退火。一般，相較裝配寡核苷酸的平均解鏈溫度，擴增退火溫度更接近外部擴增引物的平均解鏈溫度。例如，擴增退火溫度可小于或等于外部擴增引物組的平均解鏈溫度。如上所述，PCR條件在本領域公知。應理解成功PCR所需的反應條件包括例如寡核苷酸濃度、dNTP濃度、循環(huán)中各步驟的時間，PCR循環(huán)次數(shù)、DNA聚合酶類型、PCR混合物的PH和鹽濃度，根據(jù)反應所用特定寡核苷酸和聚合酶而不同(參見例如美國專利申請公開號2008/0182296)。因此，應理解用本方法實現(xiàn)成功基因合成所需的條件會根據(jù)所用的特定裝配寡核苷酸和外部擴增引物而不同，而且需要對特定反應進行優(yōu)化。適合PCR的DNA聚合酶在本領域已知(2，16，41-43)，包括例如TaqDNA聚合酶、PFUDNA聚合酶、熱起動DNA聚合酶和ftxwfStartDNA聚合酶。在一個特定實施方式中，本方法的PCR使用KOD熱起始DNA聚合酶(2，16，41)。在一些實施方式中，成功基因合成所需的PCR反應混合物中裝配寡核苷酸組的濃度為約5nM到約80nM，約5nM，約7nM，約ΙΟηΜ，約13nM，約15nM，約17nM，約20nM，約30nM，約40nM，約50nM，約60nM或約80nM。在一些實施方式中，PCR混合物中外部擴增引物組的濃度為約120nM到約1μM，約120ηΜ,約300ηΜ，約400ηΜ，約500ηΜ，約750ηΜ或約1μΜ。PCR裝配階段所需的循環(huán)數(shù)至少部分取決于寡核苷酸數(shù)量、要裝配的模板長度和庫中寡核苷酸的均一性。為了從均一寡核苷酸長度(η)和重疊大小(s)構建長度(L)的dsDNA分子，所需循環(huán)的最小理論次數(shù)(χ)如下給出2xn-(2x-l)s>L在一些實施方式中，組裝裝配寡核苷酸的PCR循環(huán)次數(shù)為從約5到約30輪，不少于約5輪，不少于約6輪，不少于約10輪，不少于約11輪，不少于約15輪，不少于約16輪，不少于約20輪，不少于約25輪，或不少于約30輪。在一些實施方式中，擴增全長模板的擴增階段中PCR循環(huán)次數(shù)為從約10到約35輪，不少于約10輪，不少于約15輪，不少于約20輪，不少于約25輪，不少于約30輪，或不少于約35輪。如需要，PCR法可從“熱啟動”開始，意味著一些試劑未被加入反應混合物，然后在高溫下例如95°C短時間孵育，然后加入缺失的試劑。熱啟動法通過限制DNA聚合酶活性減少PCR最初設定階段的非特異性擴增，直到寡核苷酸樣品被加熱至或高于寡核苷酸解鏈溫度。同樣，如需要，最后可在72°C延長孵育來結束PCR法(參見例如美國專利申請公開號2008/0182296)。在本發(fā)明的一個實施方式中，PCR法包括在PCR反應中提供IOnM平均解鏈溫度為約65°C的裝配寡核苷酸、400nM平均解鏈溫度為約50-約55°C的外部擴增引物，溫度設定如下95°C初始變性2分鐘；然后是15輪的95°C5秒，67_70°C30秒，72°C30秒；然后是15輪的95°C5秒，50-55°C30秒，72°C30秒；最后72°C延伸10分鐘。在另一個實施方式中，在PCR反應的裝配階段提供了90秒退火步驟，從而該PCR反應包括95°C初始變性2分鐘；然后是15輪的95°C5秒，67_70°C90秒，72°C30秒；然后是15輪的95°C5秒，50-55°C30秒，72°C30秒，最后72°C延伸10分鐘。本方法可用于合成所需核酸分子或基因，包括長和短基因以及編碼部分基因序列的核苷酸分子。用本方法產(chǎn)生的核酸分子可用于各種目的，包括但不限于構建重組DNA、優(yōu)化密碼子以提高特定宿主中的基因表達，突變啟動子或轉錄終止子，以及產(chǎn)生用于無細胞或體外蛋白質(zhì)合成的DNA。本方法合成的核酸分子可用于表達所合成核酸分子編碼的多肽或蛋白質(zhì)。例如，本方法合成的核酸序列可用于重組蛋白質(zhì)表達、構建融合蛋白和體外誘變。蛋白質(zhì)在多種領域具有廣泛有價值的應用，包括醫(yī)學、藥學、研究和工業(yè)。體外蛋白表達的標準方法在本領域已知。例如，一種方法是涉及使用表達載體如質(zhì)?；虿《据d體的重組蛋白質(zhì)表達，其含有合成的核酸序列以在合適宿主細胞中實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達。如上所述，實現(xiàn)基因合成的優(yōu)化條件隨著寡核苷酸不同而不同。因素如退火溫度、寡核苷酸濃度和PCR循環(huán)數(shù)可以影響PCR法的成功，因此需要檢測和定量合成產(chǎn)物以優(yōu)化條件。迄今，還沒有方法能準確預測用特定寡核苷酸組基于PCR法實現(xiàn)成功基因裝配的條件。驗證基于PCR法的基因裝配一般是通過凝膠電泳觀察最終PCR產(chǎn)物。使用該方法，基因裝配的驗證被延遲到了PCR終點，不能在各PCR循環(huán)后定量測定基因合成的效率。實時PCR(RT-PCR)是一種已知的技術，涉及在每一輪PCR后使用熒光定量DNA擴增，從而可連續(xù)監(jiān)測整個PCR過程中的PCR產(chǎn)物。().通常對于RT-PCR，通過在PCR混合物中加入熒光標記進行PCR反應。每一輪PCR循環(huán)后，測定混合物中的熒光水平以定量生成的DNA雙鏈產(chǎn)物量。用于RT-PCR的熒光標記在本領域已知，包括序列特異性RNA或DNA熒光探針以及雙鏈DNA特異性染料08)。通常用RT-PCR監(jiān)測模板DNA的基因擴增，例如用于疾病診斷(7-8)。然而迄今為止，RT-PCR尚未用于基因裝配。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在基因裝配過程中使用RT-PCR法能優(yōu)化條件，包括裝配循環(huán)的次數(shù)和長度。因此，在基因合成法中進一步考慮了使用實時PCR(RT-PCR)。因此，本文提供了一種方法，其包括用RT-PCR在PCR混合物中裝配全長模板核酸分子，該混合物含有一組裝配寡核苷酸?？蛇x擇熒光探針，使得基因裝配過程中檢測到的熒光強度與長度以及全長DNA模板分子的數(shù)量成線性關系。該方法能優(yōu)化基于PCR的基因合成法的條件，驗證所需核酸分子的合成，或確定合成產(chǎn)物的性質(zhì)。另外，使用RT-PCR能將這種優(yōu)化、驗證和定性整合入基因合成的自動化方法。因此，通過監(jiān)測RT-PCR基因裝配反應中的熒光強度，可以確定每輪循環(huán)后裝配的全長DNA模板量，并看到調(diào)節(jié)反應循環(huán)中變性、退火、延伸溫度，變性、退火、延伸部分的長度以及進行的循環(huán)輪數(shù)的效果。如此，可制得最佳數(shù)量的已裝配DNA模板。通過提供具有特定性質(zhì)的熒光標記和優(yōu)化這些標記的濃度，RT-PCR可用于監(jiān)測和定量基于PCR的基因裝配合成的產(chǎn)物。在基因合成的RT-PCR中，使用同樣結合短和長雙鏈DNA分子的熒光標記使得整個基因裝配中檢測到的熒光強度與全長裝配的DNA模板分子的長度以及數(shù)量成線性比例。RT-PCR通常用雙鏈DNA特異性染料STORGreenI進行。然而，該染料優(yōu)選結合長DNA片段(25，26)，而且傾向于從短DNA分子重新分布到更長DNA分子。在基于PCR的基因合成的裝配步驟中，PCR混合物含有不同長度的雙鏈DNA分子。因此，在熱循環(huán)過程中，與較短DNA片段結合的STORGreenI染料會轉移到合成出的較長DNA分子上、2)，因此不反映準確的基因裝配法結果。如此，SYBRGreenI在和基于PCR的基因合成法聯(lián)用時，不是RT-PCR的適當熒光染料。盡管合成的DNA分子長度增加，用STORGreenI檢測到的熒光強度在整個裝配步驟的PCR循環(huán)中都保持相對不變。因此，先前基因裝配技術不能使用RT-PCR。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了可選擇RT-PCR的合適熒光標記，其有利于聯(lián)合RT-PCR定量與基因裝配法，以優(yōu)化基因裝配PCR法。用于在基因裝配過程中進行RT-PCR的熒光標記對雙鏈DNA的親和性應高于單鏈DNA，且在熱循環(huán)中不從較短DNA分子重新分布到長DNA分子。用于在基因裝配中進行RT-PCR的特定熒光染料可包括例如LCGreenI(24)0另外，與常規(guī)PCR相比，可優(yōu)化所用熒光標記量以考慮基于PCR的基因合成法中存在的大量起始DNA分子?；赑CR的基因合成法中存在的起始DNA分子數(shù)量可以比常規(guī)PCR擴增法高6個數(shù)量級?？稍黾佑糜谶M行RT-PCR基因合成的熒光染料量，以實現(xiàn)合成DNA分子的檢測。例如，可通過提供熒光染料包括LCGreenI進行基因合成，其濃度是標準PCR擴增法中正常提供濃度的兩倍。通過使用RT-PCR進行基因合成的PCR基因裝配法，提供了優(yōu)化基因合成的方法。在整個裝配和擴增步驟中連續(xù)監(jiān)測PCR產(chǎn)物有助于確定特定寡核苷酸組的基因合成的最佳條件。例如，用RT-PCR進行的基因裝配PCR法可確定完成模板裝配所需的最佳循環(huán)數(shù)，從而能夠縮減PCR法，省去可能導致假產(chǎn)物產(chǎn)生(32)的不必需的額外PCR循環(huán)。在另一個實施例中，基于RT-PCR的基因裝配法可用于確定有效組裝裝配寡核苷酸的最佳退火溫度。另外，RT-PCR基因裝配法能夠在每一輪PCR循環(huán)后驗證基因合成產(chǎn)物，因此驗證不再需要延遲到完成PCR后。另外，當用RT-PCR進行基因合成時，可通過DNA解鏈曲線分析確定合成產(chǎn)物的特征。DNA解鏈曲線分析聯(lián)合RT-PCR和DNA解鏈模擬軟件(31，39)可用于估計PCR產(chǎn)物的純度和數(shù)量。進行DNA解鏈曲線分析的方法在本領域已知(25)，通常涉及檢測熒光水平，同時緩慢加熱PCR產(chǎn)物，以確定解鏈溫度。由于各雙鏈DNA都具有其特定的解鏈溫度，本領域技術人員應理解使用本方法的成功基因合成將得到具有單一清晰的解鏈峰的產(chǎn)物，而不完全合成會產(chǎn)生一條寬解鏈曲線。另外，熒光相對溫度的負導數(shù)中解鏈峰的積分面積可確定所需全長產(chǎn)物的數(shù)量(38)。RT-PCR不再需要用人工觀察凝膠電泳來驗證基因合成和對合成產(chǎn)物定量定性。因此，在基因合成中使用RT-PCR可使用自動化方法來優(yōu)化基因合成和驗證及鑒定合成產(chǎn)物。例如，基因裝配步驟中循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化可以自動化，從而當檢測到指示所需序列的全長核酸分子裝配的熒光水平時，熱循環(huán)儀可自動切換到基因合成的擴增步驟。指示特定核酸分子完整裝配的熒光水平可預先用RT-PCR確定。在另一個實施例中，RT-PCR的使用實現(xiàn)了解鏈曲線分析，其可用自動化方法例如計算機程序進行，從而能將合成產(chǎn)物的自動化鑒定整合入自動化基因合成系統(tǒng)，包括例如，芯片實驗室法(美國臨時申請?zhí)?0/963,673)。如上所述，可在基于PCR的本單反應混合物基因合成法中使用RT-PCR。另外，本文所述的RT-PCR法也可用于其它基于PCR的基因合成法。例如，可用RT-PCR優(yōu)化已知的一步或兩步的基于PCR的基因合成法并使其自動化。還考慮了試劑盒和市售包裝，其如上所述組合了一組擴增核苷酸和一組外部擴增引物，外部擴增引物組的平均解鏈溫度比裝配寡核苷酸組的平均解鏈溫度低。本發(fā)明的方法用以下非限制性實施例進一步舉例說明。實施例材料和方法用于基因合成的寡核苷酸設計選擇人鈣結合蛋白A4的啟動子基因序列(S100A4，75^p，chrl1503312036-1503311284)(22)用于經(jīng)裝配PCR合成。從客戶開發(fā)的程序獲得裝配寡核苷酸，其首先將給定的序列用標記分成大約相等長度的寡核苷酸，用帶SantaLucia的熱力學參數(shù)的最近鄰模型計算重疊區(qū)域中解鏈溫度的平均值和變化，用鹽和寡核苷酸濃度校正。然后，通過移動標記位置調(diào)節(jié)寡核苷酸長度，使得總體重疊解鏈溫度的差異最小。表1顯示了裝配寡核苷酸組的概況，詳細的信息如表4所示。非競爭性一步實時基因合成用羅氏光循環(huán)儀1.5實時熱循環(huán)機進行實時PCR，優(yōu)化非競爭性一步法，其中溫度轉變?yōu)?0°C/s。用20μ1反應混合物進行實時基因合成，該混合物包含IxPCR緩沖液(Novagen)、1μ10.25χ-5χSYBRGreenI(lx=1/20，000稀釋度；Invitrogen)或LCGreenI(IdahoTechnologyInc.)、4mM的MgSO4、ImM各dNTP(Stratagene)、500μg/ml牛血清白蛋白(BSA)、5-80nM裝配寡核苷酸、60ηΜ-1μΜ外部擴增引物和IUKODHotStart(Novagen)用以下條件進行PCR:95°C起始變性2分鐘；20輪的95°C5秒，58-70°C30秒，72°C30秒；然后是20輪的95°C5秒，49°C30秒，72°C30秒；最后72°C延伸10分鐘。脫鹽寡核苷酸購自ResearchBiolabs(新加坡)和Proligo(新加坡)，不經(jīng)額外純化。一步和兩步基于PCR的基因合成通過PCR進行常規(guī)基因合成，用將PCR裝配和擴增聯(lián)合在單一階段中的一步法，或用裝配和擴增為獨立階段的兩步法。全部PCR反應，不論是裝配或擴增都以0.2ml標準PCR試管進行，使用市售熱循環(huán)儀(DNA引擎PCT-200，Bio-Rad)，使用與非競爭性一步PCR相同的裝配寡核苷酸組和外部擴增引物。用50μ1反應混合物進行一步法，該混合物其包括IxPCR緩沖液(Novagen)、4mMMgSO4,ImM各dNTP(Stratagene),500μg/mlBSA,IOnM裝配寡核苷酸、400nM外部擴增引物和IUKODHotStart(Novagen)用以下條件進行一步PCR95°C起始變性2分鐘；30輪的95°C5秒，58°C30秒，72°C30秒；最后72°C延伸10分鐘。除了寡核苷酸的濃度和退火溫度，兩步法的PCR方案基本與一步法相同。對于PCR裝配，使用IOnM裝配寡核苷酸，不加入擴增引物。對于基因擴增，將2μ1裝配產(chǎn)物稀釋于25μ1擴增反應混合物中，其中外部擴增引物濃度為各400ηΜ，使用49°C的退火溫度。三類基因合成的PCR條件如表2所概括。表3列出了一些報道的最佳基因合成條件。瓊脂糖凝膠電泳通過1.5%瓊脂糖凝膠(NuSieveGTGCambrex公司)分析合成產(chǎn)物，用溴乙錠(Bio-Rad實驗室)或SYBRGreen(Invitrogen)染色，用Typhoon9410可變顯像儀(AmershamBiosciences)觀察。在IOOV下以IOObp梯度(新英格蘭)和5μIDNA樣品進行凝膠電泳45分鐘。結果TD—步基因合成的表現(xiàn)用TD—步法和常規(guī)兩步法成功實現(xiàn)了基因合成，而用常規(guī)一步PCR法未獲得明顯的全長基因產(chǎn)物，如凝膠電泳所示(圖幻。TD—步法用67°C的退火溫度(Tah)(裝配寡核苷酸的平均Tm=66°C)進行前20輪，然后用49°C的退火溫度(外部擴增引物的平均Tm=50.1°C)再進行20輪。連續(xù)熒光監(jiān)測揭示了基因合成過程的效率(圖3)。與PCR擴增的指數(shù)性質(zhì)不同，裝配效率本質(zhì)上更象線性。用實時基因合成的基因合成表現(xiàn)研究了兩種插入熒光染料(STORGreenI和LCGreenI)的實時基因合成(圖8)。LCGreenI(24)更適合研究實時基因合成。LCGreenI的熒光光譜與實時PCR中常用的STORGreenI相似，對大部分實時熱循環(huán)儀兼容。STORGreenI優(yōu)選結合長DNA片段05，沈)，并在熱循環(huán)過程中從短DNA分子重新分布到長DNA分子07)。這使得分析熒光信號較難，因為PCA混合物含有不同長度的dsDNA。如圖8(a)所示，PCR過程中熒光強度保持不變。相反，使用LCGreenI提供了熒光強度曲線，其顯示了隨著裝配反應進行，合成的DNA分子數(shù)量增加長度延伸(見圖8(b))。DNA分子在PCA混合物中的起始數(shù)量比標準PCR擴增(<106個拷貝的模板DNA)大很多(約6pmol；IOnMχ20μ1χ30寡核苷酸)，〉6個數(shù)量級08)。對該因素調(diào)節(jié)了實時PCR條件。研究了LCGreenI的最佳濃度，標準PCR中使用的濃度增加到2倍(圖8)。dNTP濃度從標準PCR的各0.2mM調(diào)節(jié)到各ImM，以防止dNTP耗竭?；赿NTP濃度經(jīng)驗優(yōu)化Mg2+離子(MgSO4)濃度，前者可與Mg2+螯合，并影響聚合酶活性(29,30)0？(圖9)。對于使用0.2mM各dNTP的標準PCR，廠商的推薦Mg2+離子濃度為1.5mM。實時基因合成的分析機械合成基因分幾個階段發(fā)生，如PCR循環(huán)輪數(shù)中的斜率變化所示(圖4)。該現(xiàn)象在裝配寡核苷酸濃度為10-20nM時很明顯。在PCA的早期循環(huán)中，大部分配對寡核苷酸之間的退火形成可延伸二倍體，其可通過聚合酶延伸(階段1，循環(huán)<7)。熒光信號揭示了每一輪DNA長度延伸的線性增加。與mi等(16)和!^擾等報道的相反，裝配效率隨著進一步的PCR循環(huán)(階段2；循環(huán)7-14)增加。我們猜測隨著全長片段出現(xiàn)，裝配過程傾向全長模板擴增，且由過量外部引物促進。然后，PCA反應到達第一個平臺(階段3；循環(huán)15-20)，其中升高的退火條件(Tah-Tm=15°C)限制了外部引物。在第21輪，退火溫度降低到49°C以匹配引物的Tm(階段4，循環(huán)21-29)。指數(shù)擴增增強，導致熒光信號的突然提高。最終，過程到達第二個平臺，這可能是由于外部引物耗盡或非特異性產(chǎn)物退火(階段幻。由于寡核苷酸裝配效率低導致的低寡核苷酸濃度(<7nM)，該平臺階段可能會延遲或完全缺失。對于裝配寡核苷酸大于64nM的基因合成，PCR法在15輪內(nèi)到達平臺。額外的循環(huán)最可能傾向非特異性PCR，導致在凝膠電泳中產(chǎn)生假條帶并形成高分子量的產(chǎn)物(圖4b)，如大部分報道的基因合成結果所示(9-12，16-19)。一致的凝膠結果和實時PCR曲線提示，TD基因合成的最佳裝配寡核苷酸濃度是10-20nM，其與一步(16，17)和兩步(18)法都一致。通過外部擴增引物的濃度從60nM-lμM變化而裝配寡核苷酸濃度維持在IOnM來進一步研究外部擴增引物的效力。用400ηΜ外部擴增引物獲得最高全長數(shù)量(圖5)，這與一步(16)和兩步(18)法中觀察到的一致。由熒光增加的斜率表示的裝配效率在早期循環(huán)中是不變的(<循環(huán)7)，盡管外部擴增引物濃度變了16倍(圖如中的插圖)。這證明了TD法的非干擾性質(zhì)，其中外部擴增引物不影響裝配過程。隨著全長產(chǎn)物的出現(xiàn)，裝配效率在第8輪循環(huán)左右開始偏移，傾向全長模板擴增。與主導裝配反應并對成功基因合成有關鍵影響的裝配寡核苷酸濃度不同，外部擴增引物的濃度并不太關鍵。它可能控制后期擴增過程和所需DNA的數(shù)量。？最佳PCR循環(huán)取決于最初裝配寡核苷酸濃度和靶基因長度。對裝配寡核苷酸濃度的試驗清楚證明了這一點(圖4)。隨著裝配寡核苷酸濃度從20nM增加到80nM,全長條帶逐漸消失，變得越來越寬。重疊裝配是平行過程。完成裝配僅需要相對較少的PCR循環(huán)。為了從均一寡核苷酸長度(η)和重疊大小(s)構建長度為(L)的dsDNA分子，所需循環(huán)的最小理論次數(shù)(χ)如下給出2xn-(2x-l)s>L理論上6輪PCA足以從40聚寡核苷酸(具有20個核苷酸重疊)庫裝配S100A4(752bp)。為了確定過量循環(huán)對基因裝配是否必要，在先前試驗中確定的最佳條件用于6-20輪不同PCA循環(huán)，然后是20輪擴增循環(huán)?；蚝铣上喈斢行?。實際上，在11輪PCA循環(huán)內(nèi)實現(xiàn)了全長裝配(圖6)。如凝膠結果和熒光信號中觀察到的，基因合成對裝配退火溫度(Tah)從58-70°C的變化不明顯(圖7)。熒光強度曲線在裝配階段(起始的13輪循環(huán))對退火溫度不加區(qū)別，僅在第一階段后開始偏離(見圖7a中的插圖)。前13輪循環(huán)中熒光強度不變提示外部擴增引物不影響裝配反應。設計外部擴增引物的平均Tm為50.9°C，意味著引物在PCA過程中面臨的退火嚴格為7.1-19.9°C(Tah-Tm)。這表示解鏈溫度窗口(引物和寡核苷酸的ATm)可以減少到7.1°C，確保TD基因合成法的非競爭特性。有趣的是，用比裝配寡核苷酸平均Tm(66°C)高的嚴格退火溫度(>67V)獲得更高產(chǎn)率的所需DNA。合成的DNA分子的解鏈曲線分析對常規(guī)一步和兩步基于PCR的基因合成裝配法中用RT-PCR合成的產(chǎn)物進行解鏈曲線分析(圖10)。成功合成在解鏈曲線中產(chǎn)生單一的尖解鏈峰，其對應二步法在凝膠電泳中的明顯條帶。相反，對于一步法，解鏈曲線較寬，表明產(chǎn)物是具有中間長度的DNA分子混合物，如模糊的凝膠電泳所示。一步產(chǎn)物主要是長度約200-300個堿基對的不完整產(chǎn)物。本說明書引用的所有出版物和專利申請以引用的方式并入本文中，就如各出版物或專利申請?zhí)囟ê蛦为毜匾砸玫姆绞讲⑷氡疚闹?。任何出版物的引用針對提交日之前的公開且不應解釋為承認本發(fā)明通過先前的發(fā)明不具有先于這些出版物的權利。本說明書中以百分比形式提供的濃度，包括重量/重量(w/w)、重量/體積/V)和體積/體積(v/V)。如本說明書和所附權利要求書所用，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復數(shù)指示物，除非上下文中另有明顯表示。如本說明書和所附權利要求書所用，術語“包含”“含有”“包括”以及這些術語的其他形式意味著非限制性包含的意義，即，包括具體引用的元素或成分，但不排除任何其它元素或成分。除非另有說明，本文所用的所有科技術語與本發(fā)明所屬領域普通技術人員所理解的通常含義相同。參考文獻1.Ramachandran,N.,Hainsworth,E.,Bhullar,B.,Eisenstein,S.,Rosen,B.,Lau，A.Y.，Walter,J.C.和Labaer,J.(2004)自裝配蛋白質(zhì)微陣列(Self-assemblingproteinmicroarrays).Science,305,86902.Cox,J.C.，Lape,J.，Sayed,Μ.Α.和Hellinga，H.W.(2007)蛋白質(zhì)制造自動化(Proteinfabricationautomation).ProteinSci,16,379-390.3.D.Sprinzak和Μ.B.Elowitz(2005)遺傳回路的重建(Reconstructionofgeneticcircuits).Nature,438,443448.4.Smith,H.0.，Hutchison,C.Α.，III，Pfannkoch,C.禾口Venter，J.C.(2003)通過全基因組裝配產(chǎn)生合成基因組來自合成寡核苷酸的ΦΧ174噬菌體(GeneratingasyntheticgenomebywholegenomeassemblyΦΧ174bacteriophagefromsyntheticoligonucleotides).Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100，15440-15445.5.Gibson,D.G.,Benders,G.A.,Andrews-Pfannkoch,C.,Denisova,Ε.A.,Baden-Tillson,H.,Zaveri,J.,Stockwel1,Τ.B.,Brownley,A.,Thomas,D.W.,Algire,Μ.A.,Merryman,C.,Young,L.,Noskov,V.N.,Glass,J.I.,Venter,J.e.,Hutchison,c.A.,111，和Smith，H.0.(2008)生殖支原體基因組的完全化學合成，裝配和克隆(Completechemicalsynthesis,assembly,andcloningofaMycoplasmagenitaliumgenome).Science,319，1215-1220.6.Cello,J.,Paul,AV.和Wimmer，E.(2002)脊髓灰質(zhì)炎病毒eDNA的化學合成天然模板缺乏時的感染性病毒產(chǎn)生(ChemicalsynthesisofpolioviruseDNAfenerationofinfectiousvirusintheabsenceofnaturaltemplate).Science,297,1016-1018.7.Kodumal，S.J.，Patel，K.G.，Reid,R.，Menzella，H.G.，Welch,Μ.禾口Santi，D.V.(2004)長DNA序列的總合成連續(xù)321Λ多肽合成酶基因簇的合成(TotalsynthesisoflongDNAsequences:Synthesisofacontiguous32~kbpolypeptidesynthasegenecluster)·Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101，15573-15578.8.Au,L.C.，Yang,F.Y.，Yang,W.J.，Lo,S.H和Kao,C.F.(1998)基于LCR法的基因合成在大腸桿菌中用合成性基因的瘦素-LM的高水平生成(GenesynthesisbyaLCR-basedapproach:High_levelproductionofleptin_L54usingsyntheticgeneinEscherichiacoli).Biochem.Biophys.Res.Commun.，248，200-203.9.Gao,X.，Yo，P.，Keith，A，Ragan,Τ.J.禾口Harris，Τ.K.(2003)基于PCR的熱力學里外平衡(TBIO)基因合成一種新的高保真較長基因序列裝配的引物設計方法(Thermodynamicallybalancedinside-out(TBIO)PCR-basedgenesynthesis:Anovelmethodofprimerdesignforhigh-fidelityassemblyoflongergenesequences).NucleicAcidsRes，31，el43.10.XiongiA-S.,Yao,Q.-H.，Peng，R.—H.，Li，X.,Fan,H.-Q.,Cheng,Z.-M.禾口Li，Y.(2004)一種用于長基因序列的簡單、快速、高保真和經(jīng)濟的基于PCR的兩步DNA合成法(Asimple,rapid,high-fidelityandcost-effectivePCR—basedtwo-stepDNAsynthesismethodforlonggenesequences).NucleicAcidsRes，32，e98.11.Sandhu,G.S，Aleff，R.A.和Kline，B.C.(1992)二重不對稱性PCR:合成基因的一步構建(DualasymmetricPCROne-stepconstructionofsyntheticgenes).Biotechniques，12，14-16.12.Young,L禾口Dong，Q.(2004)兩步全基因合成法(Two-steptotalgenesynthesismethod).NucleicAcidsRes，32，e59.13.Prodromou,C.和Pearl，L(1992)回歸性PCR:—種全基因合成的新穎技術(RecursivePCR:Anoveltechniquefortotalgenesynthesis.)ProteiEng.,5,827-829.14.Stemmer，W.P.，Crameri,A,Ha,K.D.，Brennan,Τ.M.禾口Heyneker，H.L.(1995)用大量寡脫氧核糖核苷酸一步裝配基因和全質(zhì)粒(Single-stepassemblyofageneandentireplasmidfromlargenumbersofoligodeoxyribonucleotides).Gene,164.49-53.15.Xiong,A-S.，Yao,Q.-H.，Peng,R.-H.，Duan,H.，Li,X.，F(xiàn)an,H.-Q.，Cheng,Ζ.-Μ.和Li，Y.(2006)長DNA序列的基于PCR的準確合成(PCR-basedaccuratesynthesisoflongDNAsequences).Nat.Protoc.,1,791-797.16.Wu,G.，Wolf,J.B.，Ibrahim,A.F.，Vadasz,S.，Gunasinghe,Μ.禾口Freeland，S.J.(2006)簡化的基因合成基于PCR的基因構建的一步法(Simplifiedgenesynthesis:Aone-stepapproachtoPCR-basedgeneconstruction).J.Biotech,124,496-503.17.17.Kong,D.S.,Carr,P.A,Chen,L.,Zhang,S.和Jacobson，J.Μ·(2007)微流體裝置內(nèi)的平行基因合成(Parallelgenesynthesisinamicrofluidicdevice).NucleicAcidsRes.35,e61.18.Huang,M.C.，Ye,H.，Kuan,Y.K.，Li,Μ.—H.和Ying,J.Y.(2008)微流體裝置內(nèi)的整合二步基因合成(Integratedtwo-stepgenesynthesisinamicrofluidicdevice).LabChip，在￡口·19.Hoover,D.Μ.禾ΠLubkowski,J.(2002)DNAfforks用于設計基于PCR的基@☆)白勺胃ΡSl白勺自云力U力fe(DNAWorks:AnautomatedmethodfordesigningoligonucleotidesforPCR-basedgenesynthesis).NucleicAcidsRes.30,e43.20.Wu,G.，Dress,L.和Freeland,S.J.(2007)合成基因的最佳編碼規(guī)律集群效應白勺需要(Optimalencodingrulesforsyntheticgenes:Theneedforacommunityeffort).Mol.Syst.Biol.，3，1-5.21.Lee,J.Y.，Lim,H.-ff.，Yoo,S.-I.，Zhang,B.-Τ.和Park,Τ.H.(2005)用平行重疊裝配對權重圖問題有效產(chǎn)生原始庫(Efficientinitialpoolgenerationforweightedgraphproblemsusingparalleloverlapassembly).Lect.NotesCamp.ScL,3384,215-223.22.Saleem,M.，Kweon，M._H·,Johnson,J.J.，Adhami，V.M.,Elcheva,I.等(2007)S100A4加速腫瘤生成，和人前列腺癌通過基質(zhì)金屬蛋白酶9的轉錄調(diào)控侵襲(S100A4acceleratestumorigenesisandinvasionofhumanprostatecancerthroughthetranscriptionalregulationofmatrixmetalloproteinase9).Proc.Natl..Acad.Sci.USA,103，14825-14830.23.SantaLucia,J.，Jr.和Hicks，D.(2004)DNA結構基序的熱動力學(ThethermodynamicsofDNAstructuralmotifs).Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,33,415-440.24.Herrmann,M.G.，Durtschi,J.D.，Bromley,L.K.，ffittwer,C.T.禾口Voelkerding,KV.(2006)突變掃描和基因定型的擴增子DNA解鏈分析儀器和染料的跨平臺比罾(AmpliconDNAmeltinganalysisformutationscanningandgenotypingCross-platformcomparisonofinstrumentsanddyes).Clin.Chem.,52,494-503.25.Wittwer,C.T.，Reed,G.H.，Gundry，C.N.，Vandersteen,J.G.禾口Pryor，RJ.(2003)用LCGreen通過擴增子解鏈分析的高解析基因定型。(High-resolutiongenotypingbyampIiconmeltinganalysisusingLCGreen).Clin.Chem.,49,853860.26.Giglio,S.，Monis,P.Τ.和Saint,C.P.(2003)SYBRGreenI與特定DNA片Si^W^SPCR^Wttit^n^Wii^(DemonstrationofpreferentialbindingofSYBRGreenItospecificDNAfragmentsinreal-timemultiplexPCR)NucleicAcidsRes.,31,el36.27.Varga，A和James，D.Q006)用于鑒定李痘病毒株C、EA和W的實時PCR和SYBRGr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性比例。23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述熒光探針是LCGreenI。24.如權利要求21-23中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括根據(jù)所檢測到的熒光強度優(yōu)化所述裝配。25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述優(yōu)化包括調(diào)節(jié)以下之一或更多a.變性、退火或延伸的時間或溫度；b.裝配寡核苷酸組的濃度；和c.PCR輪數(shù)。26.如權利要求21-25中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法是自動化的。全文摘要提供了一種合成核酸分子的方法，在一方面，該方法包括通過PCR在PCR反應混合物中裝配全長模板核酸分子，該PCR反應混合物含有一組具有第一平均解鏈溫度的裝配寡核苷酸，和一組具有低于第一平均解鏈溫度的第二平均解鏈溫度的外部擴增引物，其中所述裝配包括使PCR反應混合物經(jīng)歷高于第二平均解鏈溫度的第一退火溫度；通過PCR在PCR反應混合物中擴增全長模板核酸分子，其中所述擴增包含使PCR反應混合物經(jīng)歷第二退火溫度，該溫度可使外部擴增引物對全長模板核酸分子退火。文檔編號C07H21/00GK102325898SQ200880132837公開日2012年1月18日申請日期2008年12月19日優(yōu)先權日2008年12月19日發(fā)明者J·Y·應,葉紅葉,李孟皇申請人:新加坡科技研究局