專利名稱：一種具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡功能的多肽的制作方法
一種具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡功能的多肽
本發(fā)明涉及一種多肽，具體來說涉及一種具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞 凋亡功能的多肽。
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、 發(fā)展過程受多種因素影響。主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖失控、分化受阻、 凋亡紊亂等特征。大量研究表明誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡在腫瘤 發(fā)生、發(fā)展及其治療中起重要作用。
誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物研究也已成為近幾年的抗腫瘤藥 物研究熱點(diǎn)之一 ，研發(fā)各種有效提高細(xì)胞凋亡能力的藥物即細(xì)胞 凋亡誘導(dǎo)劑可能是最有前途的治療癌癥策略[1]。現(xiàn)已研發(fā)出多種
通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗癌藥["]。包括類黃酮及其衍生物如黃 酮、異黃酮和黃烷酮，其中一些物質(zhì)已祐義現(xiàn)具有抗肺瘤和抗炎 癥等活性，如漢黃茶素1和非瑟酮2是其中最有效的細(xì)胞凋亡誘 導(dǎo)劑。香豆素類化合物類4, 6,或7-苯乙烯基香豆素類化合物， 對其進(jìn)行體外抗癌活性篩選，發(fā)現(xiàn)6-苯乙烯基香豆素類化合物6 及7-苯乙烯基香豆素類化合物7對L-1210， HL-60, Hcr-8, KB 和Bel-7402細(xì)胞有效，4-苯乙烯基香豆素類化合物對KB細(xì)胞有效，顯示了一定的抗癌活性，且發(fā)現(xiàn)6-或7-位衍生物的活性較 4-位衍生物活性高。黃樟素氧化物及其衍生物如黃樟素氧化物 12對血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的生長和凋亡有重要作用。吲哚類衍生 物及其藥物學(xué)上可接受的鹽14,可作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。多環(huán) 化合物類被取代的2-芳基-4-(芳氨基)嘧咬及其類似物16可在 各種不同的臨床條件下誘導(dǎo)生長和擴(kuò)散失控的細(xì)胞凋亡，該類化 合物是caspase活化劑和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。大環(huán)內(nèi)酯化合物如布 雷菲德菌素A及其書f生物，Ammoeidin。不含雜環(huán)的化合物如蒽 醌衍生物大黃素、茚酮衍生物Indanocine、類維生素TINPB衍生 物。辟類化合物及多環(huán)化合物毛蘭素(Erianin, Eri)顯著抑制人 類白血病HL-60細(xì)胞的生長。此外，糖類的多糖31,它可作為 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑用于腫瘤、自身免疫性疾病和炎癥等的治療。而 新近設(shè)計(jì)的多肽R9-KLAKLAKKLAKLAK序列也可以通過干擾 線粒體的膜電位而具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能[5]。
發(fā)明人設(shè)計(jì)了 一種含18個(gè)精氨酸(R)的多肽，其兩端分別包 括9個(gè)精氨基殘基，中間插入6-15個(gè)氨基酸的插入序列，發(fā)現(xiàn) 此類多肽具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的功能。
此類多肽的體外半數(shù)抑制濃度IC50低于已報(bào)道的具有類似 功能的多肽序列R9-KLAKLAKKLAKLAK，顯示有更好的生物 學(xué)活性。此外，此類多肽中的插入序列可以調(diào)節(jié)，可根據(jù)不同的作用 靶位要求進(jìn)行序列設(shè)計(jì)，從而增加該多肽作用的特異性。
本發(fā)明的優(yōu)選方案是一種含18個(gè)精氨酸(R)的多肽，其兩端 分別包括9個(gè)精氨基，中間插入10個(gè)氨基酸的插入序列。
多肽中間插入序列為序列GSLLGRMKGA。多肽序列確定 后可以按照本領(lǐng)域各種公知的方法合成，也可交生物:忮術(shù)7>司 (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，上海市松江區(qū)車墩工業(yè) 區(qū)香閔路698號)合成。干粉以蒸餾水溶解在-80度保存。
以已知能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的多肽R9-KLAKLAKKLAKLAK為 陽性對照多肽。以肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞為研究平臺。適當(dāng)數(shù) 量的HepG2細(xì)胞接種于24孔板和鋪有蓋玻片的6孔板中，貼壁 24小時(shí)后，以0、 10、 20、 40、 80|iM的多肽R9-GSLLGRMKGA-R9 (SEQ No.l ， 乂人左到右以氨基端到羧基端，下同)、 R9-KLAKLAKKLAK LAK (陽性對照，SEQ No.2)及多肽R9 (SEQ No.3)處理HepG2細(xì)胞24h。以苔盼藍(lán)染色方法檢測活細(xì)胞 數(shù)，TUNEL方法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，R9-GSLLGRMKGA-R9和R9-KLAKLAKKLAK LAK均能有效誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效率依 賴于處理濃度。多肽R9-GSLLGRMKGA-R9的半數(shù)有效抑制濃 度IC50為25|iM，而R9-KLAKLAKKLAKLAK序列誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡的IC50為40pM。
HepG2細(xì)胞以0、 5、 10、 20、 40、 80(aM的多肽R9-KLAKLAKKLAKLAK (KLA組)、R9國GSLLGRMKGA國R9 (R18 組)、和R9處理24h后。消4匕貼壁細(xì)力包以苔盼藍(lán)染色方法計(jì)it活 細(xì)胞，以各組的0 ^M亞組的細(xì)胞數(shù)為100%,其余各亞組細(xì)胞 數(shù)與之相比以計(jì)算細(xì)胞存活率。
20 |iM多肽處理24h后HepG2細(xì)胞凋亡檢測，深黑色細(xì)胞 (箭頭)為發(fā)生凋亡的細(xì)胞。A組R9-KLAKLAKKLAKLAK; B組R9-GSLLGRMKGA-R9; C組對照。結(jié)果顯示，圖l所 示細(xì)胞存活率與圖2所示的細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果基本一致，證明本 發(fā)明多肽成功誘導(dǎo)了 HepG2細(xì)胞凋亡。
基于上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人認(rèn)為上述多肽在藥物領(lǐng)域、特別是治 療肝癌的藥物領(lǐng)域有用。可以按照常規(guī)工藝將其制成注射液，通 過靜脈給藥。劑量控制在1.9-6.1mg/Kg,本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以 才艮據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
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〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
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〈223>人工設(shè)計(jì)的序列，具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡功能 〈400> 1
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 〈210〉 2 〈211〉 23 〈212〉 PRT 〈213>人工序列 〈220〉
〈223〉人工設(shè)計(jì)的序列，具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡功能 〈400〉 2
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg ArgLys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys
〈210> 3
<211> 9
〈212〉 PRT
<213>人工序列
〈220〉
<223〉人工設(shè)計(jì)的序列，用作對照 〈400〉 3
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
權(quán)利要求
1、一種多肽，其兩端分別包括9個(gè)精氨基殘基，中間為6-15個(gè)氨基酸的插入序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的插入序列為10 個(gè)氨基酸的插入序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其序列如下 R9-GSLLGRMKGA-R9 (SEQ No.l)。
4、 權(quán)利要求1或2所述多肽在制藥中的應(yīng)用。
5、 權(quán)利要求3所述多肽在制藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含18個(gè)精氨酸(R)的多肽，其兩端分別包括9個(gè)精氨基殘基，中間插入6-15個(gè)氨基酸的插入序列。它具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡功能的多肽，在藥物領(lǐng)域、特別是治療肝癌的藥物領(lǐng)域有用。
文檔編號C07K14/00GK101503461SQ20091000889
公開日2009年8月12日 申請日期2009年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日
發(fā)明者潘孝本, 來 魏 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院