專利名稱：具有抑制hiv活性的2-羥基苯乙酸類衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從豆科榼藤屬植物榼藤中分離制備得到的一類2-羥基苯乙酸類衍生物，其制 備，含它們的藥物組合物及其在抗HIV藥物組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病的醫(yī)學(xué)全名為"獲得性免疫缺陷綜合征"(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)，由人類免疫缺陷病毒(HIV，又稱艾滋病病毒)引起。自1981年美國研究人員發(fā)現(xiàn) 世界首例艾滋病病例后，艾滋病在全球范圍內(nèi)迅速蔓延，逐漸成為全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生 事件和社會熱點問題。由于至今尚缺乏高效低毒的抗艾滋病藥物，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在防治艾滋病上 又陷入了僵局，因此，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)防治艾滋病就自然而然地成為人類關(guān)注的一個焦點，從自然 界尤其是具有傳統(tǒng)藥用價值的植物中尋找高效低毒的抗HIV活性成分成為研究開發(fā)抗HIV藥 物的方向之一。
榼藤子為豆科榼藤屬植物榼藤C&2tod";^a^o/oWMfZjMerr.)的種子，又名眼鏡豆、象 豆，為傣族常用藥。榼藤子味澀甘，平，可治療便血、血痢、黃疸、脫肛、喉痹等病癥。榼 藤子是傣藥名方"七味榼藤子丸"的主要組成之一，該方傣名"雅沙里門挪"，為萬應(yīng)小藥丸 之意，由7種藥物(榼藤子仁、黑種草子、胡椒、毛葉巴豆、蔓荊子、阿魏、墨旱蓮草汁)組 成，具有消暑和中、解痙止痛、除滿止瀉的作用，是我國藥典收載的僅有的兩個傣藥成方之 一，臨床上用于吐瀉腹痛、胸悶、脅痛、頭痛發(fā)熱等病癥。
榼藤子的化學(xué)研究始于20世紀(jì)50年代，但由于條件限制，至1991年止，種仁分離的化 合物確定結(jié)構(gòu)的僅7個，其中2個化合物貝.有抗炎活性，2個化合物具有抗腫瘤活性。德國 學(xué)者研究顯示，榼藤子是具有潛在食用價值的中藥，鑒于榼藤子在我國南方及東南亞、南亞 一帶廣泛分布，其資源豐富，具有一定的開發(fā)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一類2-羥基苯乙酸類衍牛物，提供了 2-羥基苯乙酸類衍生物從豆科榼藤屬植 物榼藤中分離制備的方法，以及該類衍生物在制備抗HIV藥物中的應(yīng)用。
2-羥基苯乙酸類衍生物具有以下通式的結(jié)構(gòu)，其中R,和R2可以相同或不同，分別選自氫 原子，含1 8個碳原子的含環(huán)或不含環(huán)垸烴、含烯或不含烯鍵垸烴，C3 6取代或未取代的環(huán)
3院基；取代或未取代的C1 6的?；? 6個碳原子的取代或未取代的糖基(包括糖醛酸化， 氨基化糖基，糖基數(shù)量為1 3個，糖鏈可為直鏈或支鏈)，取代或未取代的五元或六元脂環(huán)， 取代或未取代的五元或六元芳香環(huán)。
2-羥基苯乙酸類衍生物的制備方法使用榼藤屬植物為原料，將榼藤屬植物榼藤了的種子 粉碎后先用石油醚加熱回流提取除￡-油脂；再用一定濃度乙醇加熱回流提取，將提取液濃縮 后得到浸膏，將濃縮浸膏懸浮于水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正」醇萃取，濃縮后得到各 萃取部位，以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、水等常用溶劑以單一或不同組 合配比作為洗脫劑，以一次或多次使用硅膠、聚酰胺、ODS、 Sephadex-LH20等常用填料作 為固定相，以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、水等常用溶劑以單一或不同組 合配比作為重結(jié)晶溶劑重結(jié)晶，分離并純化制備得到2-羥基苯乙酸類衍生物。
2-羥基苯乙酸類衍生物可在制備抗HIV藥物中應(yīng)用2-羥基苯乙酸類衍生物及其藥學(xué)上 可接受的鹽、酯等的藥用組合物，包括與藥用載體組合，用于制備預(yù)防或治療與HIV感染相 關(guān)疾病的藥物。含2-羥基苯乙酸類衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽、酯等的藥用組合物，包括 與藥用載體組合，用于制備預(yù)防或治療與HIV感染相關(guān)疾病的藥物。2-羥基苯乙酸類衍生物 及其藥學(xué)上可接受的鹽、酯等，或以其作為活性成分組成的藥用組合物可通過口服、非腸道 和局部途徑給藥，給藥劑型可以是片劑、膠囊、溶液、懸浮液、注射液、滴注液、凍干粉等 藥學(xué)上可接受的劑型。
具體實施例方式
以下是本發(fā)明的具體實施方式
，是對本發(fā)明的進一步詳細(xì)說明，并不意味著對本發(fā)明的 任何限制。
實例l: 2， 5-二羥基苯乙酸乙酯(ethyl2，5-dihydroxybenzeneacetate， EP03)的制備
1. 樣品來源
豆科榼藤屬植物榼藤(五"tofop/!氾eofo^MfLJ Merr.)的種仁。
2. 提取分離與純化方法
將榼藤子的種子11.5 kg用鐵錘擊破并將種仁和種殼分離，種仁7.2 kg粉碎后先用石油醚加熱回流提取除去油脂；再用95%乙醇加熱回流提取，將提取液濃縮后得到浸膏700g。將種 仁浸膏懸浮于水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮后得到各萃取部位。其中氯 仿萃取物23.5g，乙酸乙酯萃取23.3g，正丁醇萃取200g，水層約200 g。
取乙酸乙酯層浸膏20g，甲醇溶解，100 200目硅膠拌樣，揮干溶劑，以氯仿與丙酮不
同比例溶劑進行洗脫，收集氯仿丙酮=20 : l洗脫部分，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮蒸干，以
甲醇溶解蒸干部分，通過Sephadex-LH20，以氯仿甲醇=1 :2洗脫，洗脫液析出結(jié)品，乙 醚做反復(fù)重結(jié)品，純化得到化合物EP03。 3.化合物結(jié)構(gòu)鑒定
EP03:白色針晶(乙醚)，C1()H1204，易溶于氯仿、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等溶劑， mpll4 115。C。 EI-MS m/z (%): 196 [M]十(18), 150 (43)， 123 (41), 122 (100)， 94 (38), 77 (8)。以 上數(shù)據(jù)與文獻W報道的2， 5-二羥基苯乙酸乙酯(ethyl 2,5-dihydroxy benzeneacetate) —致。結(jié)
構(gòu)式如下通式所示。
HO
CH2CH3
EP03
實例2: 2， 5-二羥基苯乙酸甲酯(methyl2，5-dihydroxybenzeneacetate， EP04)的制備
1. 樣品來源
豆科榼藤屬植物榼藤(五"m6 aj! /zas'eo/wVfey(X.」Merr.)的禾中仁。
2. 提取分離與純化方法
將榼藤子的種了 11.5 kg用鐵錘擊破并將種仁和種殼分離，種仁7.2 kg粉碎后先用石油醚 加熱回流提取除去油脂；冉用95%乙醇加熱回流提取，將提取液濃縮后得到浸膏700g。將 種仁浸膏懸浮于水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮后得到各萃取部位。其屮 氯仿萃取物23.5g，乙酸乙酯萃取23.3g，正丁醇萃取200 g，水層約200 g。
取乙酸乙酯層浸膏20g，甲醇溶解，100 200目硅膠拌樣，揮干溶劑，以氯仿與丙酮不同
比例溶劑進行洗脫，收集氯仿丙酮=15: l洗脫部分，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮蒸干，以甲
醇溶解蒸干部分，通過Sephadex-LH20，以氯仿甲醇=1 : 2洗脫，洗脫液析出結(jié)晶，乙醚 做反復(fù)重結(jié)晶，純化得到化合物EP04。
3. 化合物結(jié)構(gòu)鑒定
EP04:白色針晶(乙醚)，易溶于氯仿、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等溶劑，mpll6 117。C。EI-MS 182 [M]+ (28), 150 (48). 123 (43), 122 (100)， 94 (57)， 77 (8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21
報道的2， 5-二羥基苯乙酸甲酯(methyl 2， 5-dihydroxy benzeneacetate) —致。結(jié)構(gòu)式如下通式 所示。
EP04
實例3: 2， 5-二羥基苯乙酸正丁酯(butyl2，5-dihydroxy benzeneacetate， EP16)的制備
1. 樣品來源
豆科榼藤屬植物榼藤(￡"/"<ia/7/7flA'ra/oz'tfes'(Z.) Merr.)的種仁。
2. 提取分離與純化方法
將榼藤子的種子11.5 kg用鐵錘擊破并將種仁和種殼分離，種仁7.2 kg粉碎后先用石油醚 加熱回流提取除去油脂；再用95%乙醇加熱回流提取，將提取液濃縮后得到浸膏700g。將 種仁浸膏懸浮于水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮后得到各萃取部位。其中 氯仿萃取物23.5g，乙酸乙酯萃取23.3g，正丁醇萃取200g，水層約200 g。
取乙酸乙酯層浸膏20g，甲醇溶解，100-200目硅膠拌樣，揮干溶劑，以氯仿與丙酮不
同比例溶劑進行洗脫，收集氯仿丙酮=10 : l洗脫部分，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮蒸干，以
甲醇溶解蒸干部分，通過Sephadex-LH20，以氯仿甲醇=1 : 2洗脫，洗脫液析出結(jié)晶，氯 仿甲醇做反復(fù)重結(jié)晶，純化得到化合物EP16。
3. 化合物結(jié)構(gòu)鑒定
EP16:白色晶體(氯仿甲醇)，mp69。C。 EI-MS "A (%): 224 (M+， 10)， 150 (74)， 122 (100)， 94 (49), 56 (30)， 41 (59)，提示該化合物EP16可能具有2, 5-二羥基苯乙酸酯結(jié)構(gòu)。
'H-NMR(見表1.，圖譜見附圖
)中存在苯環(huán)ABX偶合系統(tǒng)相關(guān)的特征信號56.82 (lH,d, ■7=8.5 Hz)， 6.68(1H，dd， J=3.0, 8.5 Hz)， 6.61(1H， d, ■/= 3.0 Hz)，提示化合物EP16中有1' 2， 4-三取代苯環(huán)系統(tǒng)，分別歸屬為3， 4， 6位質(zhì)子信號；53.61 (2H,s)為典型的苯乙酸酯中的亞 甲基質(zhì)子信號，HMBC譜中，該質(zhì)子信號與羰基碳S 174.8 (C8)、連氧芳基碳150.1 (C2)及芳 碳117.1 (C6)有遠程相關(guān)，進一步確證了其具有2， 5-二羥基苯乙酸酯結(jié)構(gòu)骨架。'HNMR譜 中還存在3個亞甲基信號5 4.14 (H， t， 6.5Hz)、 1.64 (2H， m)、.37 (2H, m)和一個甲基信號 5 0.92 (3H,t，/=7.5Hz),參考HMBC譜提示有正丁氧基存在。分析HMBC譜，S4.14 (1H, t. J
6=6.5 Hz)與羰基碳S 174.8相關(guān)，提示正丁氧基與羰基相連，故化合物EP16的結(jié)構(gòu)確定為2， 5-二羥基苯乙酸正丁酯(butyl 2, 5-dihydroxy benzeneacetate)，為一種新化合物。結(jié)構(gòu)式如 下通式所示。
EP16
表l. The 'HNMR(500 MHz)， 13CNMR(125 MHz) and HMBC data of EP16 in CD3 OD
ljciHHMBC
1123.8-H-3，H-7
2150.1-H-3, H-4， H-7
119.16.82 (1H, (!， /= 8.5 Hz)
4116.26.66 (1H, dd,/= 3.0,8.5 Hz)H-6， H-7
151.5-H-3， H-4
6117.16,61 (IH， d, J=8.5Hz)H-4
737.33.61 (2H， s)H-4
8174.8-H-7, H-9
966.14.14 (1H, t, J=6.5Hz)H-10， H-ll
1032.31.64 (2H, m)H-9, H-1I,H-12
1120.61.37(2H, m)H-9, H-10， H-12
1214.50.92 (3H, 1,/= 7.5 Hz)H扁IO, H-ll
實例4.抗HIV活性測試 1.材料和方法
細(xì)胞和化合物HEK 293細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；人胚胎腎細(xì)胞系 (293)、人肺癌細(xì)胞(A549)均購自ATCC公司；齊多夫定(zidovudine, AZT)購自Sigma-Aldrich 公司。去羥基苷(didanosine， DDI)由東北制藥總廠惠贈。
(1)假病毒的制備轉(zhuǎn)染前1天，按細(xì)胞數(shù)2.2X106接種293細(xì)胞到100 mm培養(yǎng)皿中，
7用改良的磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染VSV-G質(zhì)粒3嗎和pNL4-3.1uc.R-E-或pNL4-3.GFP.R-E-(HIV-l 核心基因，單獨轉(zhuǎn)染后可形成HIV-1核心)8pg，轉(zhuǎn)染后16h，用PBS沖洗細(xì)胞并換新鮮的培 養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)32h，收集上清液并經(jīng)0.45pm的濾膜過濾，過濾后的上清液中含有VSVG/HIV 假病毒顆粒。同樣方法，共轉(zhuǎn)染VSV-G質(zhì)粒3嗎、pHIT60質(zhì)粒8叫和pMX-EGFP 8嗎，得 到VSVG/MLV假病毒顆粒。
(2)感染性檢測感染前1天，按細(xì)胞數(shù)6X104孔接種到24孔板上，將VSVG/HIV 和VSVG/MLV病毒顆粒以不同的稀釋比(VSVG/HIV-luc: 1:4， 1:8， 1:16， 1: 32， 1:64，
i : 128; vsvg/hiv-gfp: l:i， l: io， i: ioo; vsvg/mlv-gfp: i : 2)感染相應(yīng)的細(xì)胞。
感染48h后，VSVG/HIV-luc感染的細(xì)胞每孔加入細(xì)胞裂解液(Promega)50(il裂解細(xì)胞，將熒 光素酶底物(Promega)30W與細(xì)胞裂解液20 pl混合后用FB15熒光檢測器(Sirius)測定細(xì)胞熒 光素酶的相對活性；用倒置熒光顯微鏡(Olympus)觀察VSVG/HIV-GFP或VSVG/MLV-GFP 感染的細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀(Beckman)計數(shù)GFP陽性細(xì)胞的百分比。
2. 化合物抑制性;險測
用DMSO溶解AZT及待篩選化合物，感染前15 min加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，以DMSO溶劑 作空白對照。感染時VSVG/HIV-luc病毒顆粒的稀釋度為1:8。
實驗按照操作規(guī)程在生物安全3級(BSL-3)實驗室內(nèi)進行，重復(fù)兩次。計算抑制率和 平-數(shù)抑制濃度。
3. 化合物的抗HIV病毒活性篩選結(jié)果
應(yīng)用重組病毒對從榼藤子中分離得到的6個化合物進行了細(xì)胞水平的藥理活性評價，結(jié) 果見表3.
表3部分化合物抗HA(Viet)/HIV病毒活性篩選結(jié)果
化合物分子量藥理模型細(xì)胞給藥途徑劑量(mo1/1) ,'(嗎/mg)押制率％
EP23344HA(Viet)/HIV-luc293細(xì)胞感染前加藥1*10-56.5±0.2
EP03196HA(Viet)/HIV-luc293細(xì)胞感染前加藥1*10—562.5 ±16.6
EP04182HA(Viet)/HIV墨luc293細(xì)胞感染前加藥l"0-555.1 ±2.7
EP15258HA(Viet)/HIV-luc293細(xì)胞感染前加藥1*10-53.8±0.5
EP11387VSVG/HlV-]uc293細(xì)胞感染前加藥1"(T51±9
EP16224VSVG/HIV-luc293細(xì)胞感染前加藥1*10-551±2
齊多夫定(AZT)陽VSVG/證-Iuc293細(xì)胞感染前加藥1*10-780±1
性對照VSVG/HIV-1uc293細(xì)胞感染前加藥37 ±10從表3種可以看出，2， 5-二羥基苯乙酸類化合物EP03、 EP04和EP16對HA(Viet)/HIV
病毒顯示抑制活性，進一步的機制研究證實該抑制的作用環(huán)節(jié)為對HIV-1復(fù)制的抑制。其后， 我們考查了 EP03、 EP04的量效關(guān)系，它們抑制HIV-1復(fù)制的半數(shù)抑制濃度分別為9.93 pM 和11.7岸。
參考文獻
1. Jinmi Dai， Leonardus B.S. Kardono, Soet]an Tsauri, Kosasih Padmawinata， John M. Pezzuto， A. Douglas Kinghorn. Phenylacetic acid derivatives and a thioamide glycoside from p/z<zyec /o/<5fey[J]. phytochemistry, 1991,30(11): 3749-3752
2. 吳斌，吳立軍，張磊，金哲史.麻葉千里光抗菌化學(xué)成分的研究(I) [J].沈陽藥科大學(xué)學(xué) 報，2004， 21 (5): 341-34權(quán)利要求
1. 具有以下通式的2-羥基苯乙酸類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其中R1和R2可以相同或不同，分別選自氫原子，含1～8個碳原子的含環(huán)或不含環(huán)烷烴、含烯或不含烯鍵烷烴，C3～6取代或未取代的環(huán)烷基；取代或未取代的C1～6的?；?，含5～6個碳原子的取代或未取代的糖基，取代或未取代的五元或六元脂環(huán)，取代或未取代的五元或六元芳香環(huán)。
2. 權(quán)利要求l的2-羥基苯乙酸類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其中R!為CH3,C2Hs， C3H7， C4H9， C5Hu或C6Hu; R2為葡萄糖基，鼠李糖基，雙葡萄糖基或葡萄糖酸酸基。
3. 權(quán)利要求l或2的2-羥基苯乙酸類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其中R!為CH3，C2Hs， C3H7或QH9; R2為葡萄糖基，葡萄糖醛酸基。
4. 權(quán)利要求l的2-羥基苯乙酸類衍生物的制備方法，其特征在于將榼藤屬植物榼藤了的種子 粉碎后先用石油醚加熱回流提取除去油脂；再用一定濃度乙醇加熱回流提取，將提取液濃縮 后得到浸膏，將濃縮浸膏懸浮于水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮后得到各 萃取部位，以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇和水中之一或不同組合作為洗脫 劑，以一次或多次使用硅膠、聚酰胺、ODS、 Sephadex-LH20作為固定相，以石油醚、氯仿、 乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇和水中之一或不同組合作為重結(jié)晶溶劑重結(jié)晶，分離并純化制 備得到。
5. 權(quán)利要求l 3中任一2-羥基苯乙酸類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯在制備預(yù)防或治療 與HIV感染疾病狀或疾病藥物的用途。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中的藥物劑型是片劑、膠囊、溶液、懸浮液、注射液、凍干粉 或滴注液等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類2-羥基苯乙酸類衍生物，它具有抗HIV活性。本發(fā)明還公開了從豆科榼藤屬植物榼藤中制備該化合物的方法以及該化合物在制備抗HIV藥物的應(yīng)用。
文檔編號C07C69/732GK101486650SQ20091000914
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者勇 張, 張宏武, 鄒忠梅, 穎 郭 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所