專利名稱：：河豚毒素的提取、及河豚毒素用于杜冷丁類藥物依賴的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及河豚毒素的制法，另外還涉及河豚毒素用于杜冷丁等麻醉藥物的原料藥制劑。二
背景技術(shù)：
：河豚毒素(Tetrodotoxin簡稱TTX)是從河豚魚卵巢或肝臟中提取分離的一種非蛋白小分子化合物，其分子式CH17N308,分子量為319.27。河豚毒素是專一性很強(qiáng)的細(xì)胞膜鈉離子通道阻滯劑，可阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)，從而起到鎮(zhèn)痛、戒毒的作用。臨床用于內(nèi)科、外科、皮膚科等領(lǐng)域。河豚毒素的提取分離，最早為日本田原氏于1909年從河豚魚卵巢中提取得到河豚毒素粗品結(jié)晶，并確立了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。1972年日本學(xué)者岸義人小組化學(xué)合成了河豚毒素。我國1982年北京防化院和河北水產(chǎn)研究所，1984年大連海洋漁業(yè)公司、青島、天津等地相繼在河豚毒素提取分離方面獲得成功，目前各種提取方法大都采用平田后騰法，即原液提取一樹脂交換一活性炭吸附一粗品結(jié)晶一苦味酸鹽精制?；钚蕴课搅鞒趟没钚蕴繛閯?dòng)物性活性炭，分散性吸附法。河豚毒素?fù)p耗量很大，而且用化學(xué)法，苦味酸鹽精制，每100kg河豚卵巢河豚毒素收率最多1.0—1.2g。河豚毒素的臨床應(yīng)用，早在30年代日本人能三共株式會(huì)社已經(jīng)將河豚毒素純度為0.2—1.0(g/ml)的粗制品(推算當(dāng)時(shí)商品每支含量為35.7mg/ml)用于鎮(zhèn)痛。鎮(zhèn)痙、鎮(zhèn)靜的治療。日本學(xué)者項(xiàng)乃義將5河豚毒素注射液(粗品)用于鴉片類吸毒者的脫癮治療。阿片類藥依賴是人類在吸食注射毒品后，會(huì)產(chǎn)生一種欣欲、亢奮的感覺。當(dāng)染上"毒癮后會(huì)不惜一切手段尋找毒品，以滿足這種精神和生理上的需要。戒毒是一個(gè)非常痛苦的過程，許多吸毒者之所以最后放棄戒毒，是因?yàn)闊o法忍受停止毒品后出現(xiàn)的戒斷反應(yīng)。目前市場上用于戒毒藥品的主要有美沙酮、LAAM、石丙甲羥二羥、嗎啡酮和鈉洛酮，而目前臨床使用的戒毒藥美沙酮自身具有成癮性，使戒毒者在戒除毒癮后，又不覺的染上了另一種藥癮，河豚毒素注射液作為新研究的戒毒藥，卻不具有成癮性，而且脫癮時(shí)間快速，只需要4一7天實(shí)為可推廣的脫癮藥物。如國際專利WO95/29903提供"氨基氫化喹唑啉化合物及其衍生物戒除藥物依賴的新用途"，將河豚毒素溶于pH4—5醋酸液，制成河豚毒素含量為5—300Ug/ml的注射液。中國專利CN96119454.5提供一種用于戒毒鎮(zhèn)痛藥劑及其制法，河豚毒素溶于PH4—5醋酸溶液中，制成含量為0.5—10.0ug/ml加入0.0125普魯卡因復(fù)方注射針劑。中國專利98102072.0將河豚毒素溶于1%醋酸液中制成河豚毒素含量為0.001—0.45ug/ml注射液針劑。中國專利CN1459286A提供一種"用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素呼吸道給藥制劑"，將原料藥制成氣霧劑、噴霧劑。中國專利CN1353990A提供"用于鎮(zhèn)痛、麻醉或治療藥物依賴性的制劑"河豚毒素含量為5—100ug/ml的注射液針劑。中國專利200410102449.2提供"河豚毒素衍生物的制備和戒毒、鎮(zhèn)痛用途"將河豚毒素溶于酒石酸中，制成含量為l一10ug/ml的注射液。上述發(fā)明對河豚毒素臨床應(yīng)用研究起到積極作用。70年代末期以來，吸扎毒的現(xiàn)行在我國又死灰復(fù)燃，阿片類物質(zhì)依賴己成為嚴(yán)重社會(huì)問題，我們北方地區(qū)主要以杜冷丁依賴比較多，杜冷丁屬于中樞性鎮(zhèn)痛麻醉藥物，較強(qiáng)的成癮性，一旦成癮有較強(qiáng)的心里渴求，獲得歡快振奮感，稱之心里依賴，逐漸發(fā)展軀體依賴。對于杜冷丁依賴患者的治療往往以其他成癮性小的A片類物質(zhì)進(jìn)行遞減替代療法。這種療法以小毒替代大毒的現(xiàn)象。有很大的弊端，如美沙酮。他是中樞嗎啡多體激動(dòng)劑，也易產(chǎn)生依賴性，而且療程時(shí)間較長。因而尋找一種起效快、控制癥狀徹底過度平穩(wěn)，無毒副作用的藥物勢在必行。而河豚毒素注射液，有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，抑制或減輕戒斷癥狀的出現(xiàn)。目前文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)河豚毒素注射液(水針劑)和河豚毒素注射(凍干劑)一般都是由原藥和穩(wěn)定劑組成，穩(wěn)定劑有枸櫞酸鹽或右旋糖酐雙糖類。但上述配方的制劑穩(wěn)定性很差，較長時(shí)間存放后，易產(chǎn)生差向異構(gòu)化，使河豚毒素隨時(shí)間的增長而逐步降低其含量，影響藥效的發(fā)揮，治療效果差。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種河豚毒素的提取，提取方法簡單易操作，收率大大提高。另外提供一種河豚毒素用于杜冷丁類藥物依賴的制劑，穩(wěn)定性最佳，儲(chǔ)存期限長，療效好。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是河豚毒素的提取，包括原液提取、樹脂交換和洗脫步驟，第一步原液提取取菊黃東方豚卵巢，切成l一2cm片狀小塊，用0.1%—0.5%HAC溶液浸泡、攪拌，48小時(shí)后用甩干機(jī)甩干得原液，加熱至沸騰，立即停止加熱，除去凝固蛋白，原液冷卻后用50—80目篩初濾，再經(jīng)白陶土——紙漿過濾，得淺黃色透明原液，卵渣繼續(xù)分次浸泡24小時(shí)，重復(fù)上述步驟收集濾液，共取得原液20L，用氨水調(diào)制PH5—7，加1一5%正丁醇或1—2%甲醛防腐，常溫放置備用；7第二步樹脂交換樹脂為D152陽性大孔丙烯酸弱酸性樹脂，經(jīng)常法處理轉(zhuǎn)NH4型，雙柱兩次交換，A柱為玻璃柱內(nèi)下層裝樹脂，上層裝硅藻土；B柱為玻璃柱內(nèi)下層裝中性氧化鋁，上層裝樹脂；A柱原液上樹脂柱進(jìn)行交換，流速100—120ml/min，樹脂交換后期用小鼠毒性跟蹤，當(dāng)小鼠顯中毒反應(yīng)時(shí)，表明樹脂交換己達(dá)飽和程度，停止原液上柱，用去離子水沖洗至流出液無色，茚三酮試驗(yàn)陰性止，收集有毒餾分流出液；B柱將A柱所收集的有毒餾分，用氨水調(diào)PH值為7，開始上柱，流速30—50ml/min，當(dāng)流出液PH7時(shí)，小鼠毒性跟蹤顯毒性反應(yīng)時(shí)，停止上柱，用去離子水(200L)沖洗柱，收集強(qiáng)毒餾分；第三步洗脫-A柱交換后的A柱用12%的HAC液洗脫，流速30—40ml/min，當(dāng)流出液PH7，小鼠毒性跟蹤顯毒性反應(yīng)時(shí)，分步收集有毒餾分，毒素高峰在PH6.5—4.5之間；B柱將A柱樹脂洗脫所得的有毒餾分，用氨水調(diào)PH6—7，上柱，用10y。HAC洗脫，流速50ml/min，流出液PH7，小鼠跟蹤顯毒性反應(yīng)時(shí)，分步收集強(qiáng)毒餾分，弱毒部分做下次浸泡用，合并交換和洗脫收集的強(qiáng)毒餾分，置于0—5'C冷藏存放備用。所述河豚毒素的提取還包括結(jié)晶步驟，在洗脫后進(jìn)行第四步結(jié)晶將B柱樹脂交換和洗脫的強(qiáng)毒餾分，分次真空減壓濃縮，-IO'C放置24小時(shí)后，取出融化解凍并加8%氨水調(diào)PH8—9，震動(dòng)攪拌，析出白色沉淀物，濾取沉淀物，沉淀物用蒸餾水反復(fù)洗滌3-5次，用2%~~5%HAC液溶解，.濾除不溶物雜質(zhì)，溶液中加8y。NH4水調(diào)PH8一9，0—5度冷藏放置24小時(shí)，取出再進(jìn)行上述重結(jié)晶2-3次，得河豚毒素粗品結(jié)晶。所述第四步結(jié)晶粗品結(jié)晶經(jīng)高效液相色譜分離純化得純品河豚8毒素結(jié)晶，經(jīng)高效相色譜分析，純度為99%。所述第二步樹脂交換:B柱中性氧化鋁經(jīng)180度活化處理2小時(shí)，冷卻后濕法上柱，氧化鋁先上柱，然后樹脂上柱，使氧化鋁在柱的下層。本發(fā)明制得的河豚毒素用于杜冷丁類藥物依賴的制劑，lml制劑中含有河豚毒素0.01-0.49yg/ml，含有河豚毒素20-40倍重量份的穩(wěn)定劑硫酸軟骨素。所述lml制劑由下述原料配制而成河豚毒素0.48yg0.5%枸櫞酸0.002ml硫酸軟骨素9.6yg注射用水余量。所述用于杜冷丁類藥物依賴的制劑的制備方法取河豚毒素溶于0.5%枸櫞酸溶液中，硫酸軟骨素溶于注射用水，兩溶液混合后加入注射用水，調(diào)PH值4—6，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?jīng)除菌過濾、超濾，在無菌條件下計(jì)量灌裝入安瓶中，半開塞送冷凍干燥機(jī)-40度預(yù)冷，打開冷井制冷，溫度降至-55度時(shí)啟動(dòng)真空泵，真空泵在5帕以下，維持24小時(shí)，然后升溫在30度維持14小時(shí)壓塞、扎蓋。本發(fā)明河豚毒素提取方法經(jīng)過反復(fù)研究，克服了活性炭仍有部分不可逆的吸附作用的不足問題，不采用活性炭吸附的流程，直接用兩次樹脂交換，兩次樹脂交換的A柱內(nèi)徑大于B柱，高度小于B柱，A柱內(nèi)裝樹脂，在樹脂上層加硅藻土，在原液樹脂交換中往往會(huì)在柱的上部有菌團(tuán)的形成，使原液通過樹脂柱流速減慢，甚至樹脂柱有阻塞現(xiàn)象的發(fā)生，本發(fā)明A柱樹脂上層加硅藻土后，可隨時(shí)分步清除菌團(tuán)，提高了流速。B柱內(nèi)上層裝樹脂，樹脂下層裝中性氧化鋁，中性氧化鋁對生物堿的分離，具有較好的分離作用，提高了河豚毒素的9分離效果，從而提高了產(chǎn)品的收率和純度，減除了活性炭吸附工藝流程，提高了收率5—10%。本發(fā)明河豚毒素用于杜冷丁類藥物依賴的制劑，有效劑量選用合理，配料穩(wěn)定劑硫酸軟骨素，起到穩(wěn)定作用更顯著，與同類產(chǎn)品相比貯藏期限更長，保證產(chǎn)品療效。本發(fā)明制劑用于脫癮治療，具有起效快，控制癥狀徹底，過度平穩(wěn)，易接收等特點(diǎn)，是一種杜冷丁類藥物依賴脫癮治療較理想的藥物。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于具體實(shí)施例。實(shí)施例1河豚毒素的提取，包括原液提取、樹脂交換和洗脫步驟，第一步原液提取取菊黃東方豚卵巢100kg，切成l一2cm片狀小塊，用0.1%—0.5MHAC溶液100L浸泡、攪拌，48小時(shí)后用甩干機(jī)甩干得原液，直火加熱至沸騰，立即停止加熱，除去凝固蛋白，原液冷卻后用50—80目尼龍網(wǎng)初濾，再經(jīng)白陶土——紙漿過濾，得淺黃色透明原液，卵渣繼續(xù)分次浸泡24小時(shí)，重復(fù)上述步驟收集濾液，共取得原液20L，用氨水調(diào)制PH5—7，力口1—5%正丁醇或1—2%甲醛防腐，常溫放置備用；第二步樹脂交換樹脂為D152陽性大孔丙烯酸弱酸性樹脂，經(jīng)常法處理轉(zhuǎn)NH4型，雙柱兩次交換，樹脂交換柱分為A、B兩柱，A柱為玻璃制內(nèi)徑9cm、高100cm,柱內(nèi)下層裝入樹脂5kg，，將0.3—0.5kg硅藻土裝入樹脂上層。B柱為玻璃制內(nèi)徑7cm、高120cm，柱內(nèi)裝樹脂3.5kg，中性氧化鋁750g，中性氧化鋁經(jīng)180度活化2小時(shí)濕法上柱，首先將750g中性氧化鋁上柱，然后裝入樹脂3.5kg使氧化鋁在B柱的下層，樹脂在B柱的上層；10A柱原液上樹脂柱進(jìn)行交換，流速100ml/min，樹脂交換后期用小鼠毒性跟蹤，當(dāng)小鼠顯中毒反應(yīng)時(shí)，表明樹脂交換已達(dá)飽和程度，停止原液上柱，用去離子水沖洗至流出液無色，茚三酮試驗(yàn)陰性止，收集有毒餾分流出液；B柱將A柱所收集的有毒餾分7.5L，用氨水調(diào)PH值為7，開始上柱，流速50ml/min，當(dāng)流出液PH7時(shí)，小鼠毒性跟蹤顯毒性反應(yīng)時(shí)，停止上柱，用去離子水(200L)沖洗柱，收集強(qiáng)毒餾分；第三步洗脫A柱用12Q/。的HAC液洗脫，流速40ml/min，當(dāng)流出液PH7，小鼠毒性跟蹤顯毒性反應(yīng)時(shí)，分步收集有毒餾分100ml/份，毒素高峰在PH6.5—4.5之間，其收集有毒餾分7.5L;B柱將A柱樹脂洗脫所得的有毒餾分，用氨水調(diào)PH6—7，上柱，用10。/。HAC洗脫，流速50ml/min，流出液PH7，小鼠跟蹤顯毒性反應(yīng)時(shí)，分步收集強(qiáng)毒餾分100ml/份，弱毒部分做下次浸泡用，共收集強(qiáng)毒餾分3.2L，置于冰箱0—5'C冷藏存放備用；第四步結(jié)晶將B柱樹脂交換和洗脫的強(qiáng)毒餾分，分次真空減壓濃縮至200ml，-l(TC放置24小時(shí)后，取出融化解凍并加8%NH4水調(diào)PH8—9，震動(dòng)攪拌，析出白色沉淀物，濾取沉淀物，沉淀物用蒸餾水反復(fù)洗滌5次，用2%—5%HAC液溶解，濾除不溶物雜質(zhì)，溶液中加8c/。NH4水調(diào)PH8—9，0—5度冷藏放置24小時(shí)，取出后再進(jìn)行上述重結(jié)晶3次，得河豚毒素粗品結(jié)晶3.82g，粗品結(jié)晶經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分離純化得純品河豚毒素結(jié)晶2.38g，經(jīng)高效相色譜(HPLC)分析，純度為99%。實(shí)施例2采用實(shí)施例1制得的河豚毒素用于杜冷丁類藥物依賴的制劑，由下述原料按重量份比配制而成1000支注射制劑，每支lml:河豚毒素480ug0.5%枸櫞酸2ml硫酸軟骨素960ug注射用水余量。具體制備方法為取河豚毒素溶于0.5%枸櫞酸溶液中，硫酸軟骨素溶于注射用水，兩溶液混合后加入注射用水，調(diào)PH值4—6，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?jīng)除菌過濾、超濾，在無菌條件下計(jì)量灌裝入安瓶中，半開塞送冷凍干燥機(jī)-40度預(yù)冷，打開冷井制冷，溫度將至-55度時(shí)啟動(dòng)真空泵，真空泵在真空度5帕以下，維持24小時(shí)，然后升溫在30度維持14小時(shí)壓塞、扎蓋。表1:不同河豚毒素注射液和河豚毒素凍干劑在常溫下穩(wěn)定性試<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>河豚毒素注射液(水針劑)和河豚毒素凍干劑，在常溫下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，按時(shí)取樣，HPLC檢測河豚毒素含量。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明河豚毒素醋酸液和枸櫞酸液注射液隨著儲(chǔ)藏時(shí)間增長，河豚毒素含量逐漸下降，河豚毒素加硫酸軟骨素作為穩(wěn)定劑，其含量隨時(shí)間增長基本無大變化，因此硫酸軟骨素作為穩(wěn)定劑阻止了河豚毒素差向異構(gòu)化，在常溫條件下保持穩(wěn)定。一、河豚毒素(TTX)急性毒性實(shí)驗(yàn)選取18—22克小白鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。將TTX分別配成濃度為2Ug/ml、1ug/ml、0.78Ug/ml、0.4yg/ml、0.2ug/ml的溶液。每只小白鼠肌肉注射TTX溶液0.4ug/10克，左右后腿各一半，飼養(yǎng)觀察10天，記錄動(dòng)物死亡數(shù)。結(jié)果lug/ml濃度下肌肉注射的小鼠全部死亡，而0.4ug/ml以下濃度肌肉注射小鼠全部未死亡，LD50濃度范圍在1"g/ml至U0.4ug/ml之間。選取18—22克的小白鼠150只，隨機(jī)分為5組，每組30只，雌雄各半。TTX溶液給藥劑量分為20ug/ml、18yg/kg、16.2ug/kg、14.58Pg/kg、12.56ug/kg，小白鼠肌肉注射后，飼養(yǎng)觀察10天，記錄動(dòng)物死亡數(shù)，隨時(shí)挑出死亡動(dòng)物。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2:表2:TTX肌肉注射LD50實(shí)驗(yàn)結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>183010015.43516.2307011.18314.583033.39.75112.56306.676.962求得LD50=15.18+1.085wg/kg二、河豚毒素注射液30天亞急性毒性試驗(yàn)方法和結(jié)果選取健康SD大白鼠120只，隨機(jī)分成四組，每組30只，雌雄各半并分籠詞養(yǎng)，每天定時(shí)給水換飼料，搞好動(dòng)物飼養(yǎng)衛(wèi)生。連續(xù)30天肌肉注射TTX注射液，于四肢肌肉依次注射。TTX注射液高、中、低三個(gè)劑量組劑量分別為5.2"g/kg、3ug/kg、2.2Pg/kg。對照組注射等量鹽水0.2ml/100g，給藥期間，每3天稱動(dòng)物體重一次，觀察記錄動(dòng)物的活動(dòng)狀況及尿液糞便情況。給藥30天后，取血30天后，取血液測試紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血紅蛋白量并進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。測試血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT),谷草轉(zhuǎn)氨酶(SGOT)活性及血液尿素氮(BUN)含量，來評(píng)價(jià)動(dòng)物肝、腎功能的狀況，對動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，稱取心、肝、脾、肺、腎等主要臟器重量，并對心、肝、肺、腎、腦、子宮、睪丸等幾種主要臟器進(jìn)行組織學(xué)切片，光學(xué)顯微鏡觀察。評(píng)價(jià)器官有無病理變化。1、給藥過程中動(dòng)物活動(dòng)狀況及體重變化TTX注射液高、中、低劑量組肌注30天，中、低劑量組動(dòng)物活動(dòng)正常，尿液和糞便與對照組比較無顯著性差異。動(dòng)物體重與對照組比較也無顯著變化；TTX注射液高劑量組在肌注3天，有一只雌性鼠死亡，肌注第7天有一只雄性鼠死亡。觀察死亡癥狀，是屬于毒性致死，主要器官無明顯變化。2、對血液血象的影響TTX注射液高、中、低三個(gè)劑量組連續(xù)給藥30天后動(dòng)物血液紅14細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞及血紅蛋白含量與對照組比較無顯著差異。3、對白細(xì)胞分類的影響TTX注射液三個(gè)劑量組分別連續(xù)給藥30天，對各種類型白細(xì)胞無顯著性影響。4、對血液SGP!ASGOTABUN等生化指標(biāo)的影響TTX注射液高、中、低三個(gè)劑量組連續(xù)給藥30天，血液中SGPT、SGOT、活性和BUN含量與對照組比較，無顯著性差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在現(xiàn)有劑量下，TTX注射液對肝、腎功能無顯著性影響。5、動(dòng)物大體解剖及主要臟器的影響TTX注射液高、中、低三個(gè)劑量組連續(xù)肌注30天后，經(jīng)對動(dòng)物大體解剖觀察，動(dòng)物主要臟器包括心、肝、肺、腎、腦、子宮、睪丸、胃腸，均未見異常癥理現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)證明，TTX注射液肌注30天，在一定劑量范圍內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生慢性毒性反應(yīng)。.三、TTX注射液成癮性試驗(yàn)1、小鼠豎尾試驗(yàn)體重14—16克小鼠40只，隨機(jī)分成四組分別給SC嗎啡15—20mg/kg，TTX0.1—2.6ng/kg。觀察24小時(shí)內(nèi)小鼠活動(dòng)情況，嗎啡組小鼠出現(xiàn)S形豎尾反應(yīng)、興奮、跑動(dòng)，而TTX組小鼠無豎尾反應(yīng)，外觀和未注射前幾乎無區(qū)別。8小時(shí)后重復(fù)以上試驗(yàn)，嗎啡組小鼠豎尾現(xiàn)象更為明顯。而TTX組仍無豎尾現(xiàn)象。證明TTX不屬于嗎啡類藥物，無成癮性。另取小鼠40只，隨即分組，分別SC嗎啡和TTX，然后進(jìn)行交叉試驗(yàn)。嗎啡組從20mg/kg逐漸增至25天后的45mg/kg，TTX組從0.1ug/kg增至2.6ug/kg，嗎啡組均有豎尾現(xiàn)象，而TTX組則無。25天后原嗎啡組小鼠改用TTX2.6ug/kg，動(dòng)物無豎尾，而將TTX組改用15嗎啡45mg/kg則小鼠出現(xiàn)豎尾現(xiàn)象。2、小鼠跳躍反應(yīng)試驗(yàn)采用純種小鼠30只，每組10只，A組SC嗎啡2.5mg/kg，B組TTX0.5ug/kg和等體積生理鹽水NS(C組)，第一天注射5次，(注射時(shí)間為9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)第二天注射2次(注射時(shí)間為9:00、11:00)，劑量遞增。在末次給藥2小時(shí)iP烯丙嗎啡50mg/kg，觀察小鼠10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應(yīng)，可見嗎啡組在iP烯丙嗎啡后出現(xiàn)跳躍反應(yīng)。采用純種小鼠體重10—24克，分別分為A、B、C組，每組30只，A組每天皮下注射鹽酸嗎啡劑量為80mg/kg，連續(xù)注射20天，B組每天皮下注射TTX0.5ug/kg，連續(xù)注射20天，C組為生理鹽水對照組，于最后一次給藥后6小時(shí)，給各組小鼠注射烯丙嗎啡50mg/kg，然后將小鼠入塑料筒(25*5cm)觀察小鼠反應(yīng)，并記錄60分鐘內(nèi)小鼠的跳躍反應(yīng)。嗎啡組小鼠(A)在給藥后顯得很興奮，跑動(dòng)頻繁，豎尾現(xiàn)象明顯，注射烯丙嗎啡后，小鼠出現(xiàn)明顯跳躍反應(yīng)。TTX組(B)小鼠給藥后，外觀同時(shí)對照，無豎尾反應(yīng)，在注射烯丙嗎啡后均不見跳躍反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，TTX明顯區(qū)別于鹽酸嗎啡組，說明TTX無藥物依賴性。3、猴成癮試驗(yàn)恒河猴8只體重2.58—4.85kg，取4只每日各注射TTX(皮下)兩次，劑量由0.5ug/kg開始，在50天內(nèi)逐漸增至最大耐受量7.5ug/kg，然后按此劑量分別維持到52天、68天、和第94天，4只猴的累計(jì)注射劑量分別為1:8、4.2、6.1、7.3"g/kg。第64天和93天，分別停止給猴注射TTX，觀察24小時(shí)，結(jié)果猴的外觀行為、食欲與停藥前無異常，在給藥第28天、54天、58天和69天分別停藥，20小時(shí)后皮下注射烯丙嗎啡5—10mg/kg，均未見猴外觀出現(xiàn)戒斷癥狀。另4只猴分別皮下注射嗎啡兩次，始量為6mg/kg，于第2天遞增至28mg/kg，然后按此劑量維持，30天后猴已對嗎啡產(chǎn)生依賴，停止注射嗎啡48小時(shí)后，猴子外觀出現(xiàn)明顯戒斷綜合癥，表現(xiàn)有在籠內(nèi)煩躁不安，翻滾，時(shí)而趴臥籠底，亂抓，嚎叫、嘔吐，全身發(fā)抖等。此時(shí)給猴注射(皮下)烯丙嗎啡，上述癥狀更為明顯，此時(shí)給猴皮下注射TTX0.5—2.5Pg/kg，上述癥狀明顯減弱或消失。這表明TTX具有抵抗嗎啡戒斷綜合癥的藥的作用。四、河豚毒素治療杜冷丁類藥物依賴臨床治療觀察1、對象和方法所有觀察對象是自愿戒毒患者。30例均符合CCMD—2R，DSM—III，精神活性物質(zhì)所致精神障礙一阿片依賴診斷標(biāo)準(zhǔn)。男性20人，女性10人，年齡20—30歲12人、31—40歲16人，40歲以上2人。使用方法肌肉靜注22人，杜冷丁和海洛因混合使用者8人。吸毒時(shí)間1年以下10人，1—2年6人，2年以上14人。癮量1000mg以下8人，1000—3000mg以上19人，3000mg以上3人。詳見表3。河豚毒素注射液每支含量0.48yg/ml。用藥方法根據(jù)扎毒的時(shí)間長短及戒斷癥狀反應(yīng)的輕重，及癮量的大小，采取不同的給藥方法及藥用量。一般采取每晚一次性給lml河豚毒素制劑肌肉注射給藥，河豚毒素注射液加50%葡萄糖20ml靜脈注射，個(gè)別的戒斷癥狀重的采取二次/日的給藥方法，或輔助給小劑量的鎮(zhèn)靜藥，如安定和抗焦慮劑多慮平等。2、觀察方法進(jìn)行病史調(diào)查，體格檢查。治療前后各查一次血尿便常規(guī)、肝功、心電圖，尿液毒物檢測，納洛酮促癮試驗(yàn)。戒斷癥狀觀察量表，參考北京藥物依賴研究中心所制定的阿片依賴戒斷反應(yīng)觀察量表。不良反應(yīng)觀察除每日測量體溫，呼吸、心率、血壓外還要觀察治療藥物不良反應(yīng)。納洛酮促癮試驗(yàn)治療前和治療后各做一次。3、觀察結(jié)果治療時(shí)尿液毒物檢測30例全部陽性，給河豚毒素注射液后均轉(zhuǎn)為陰性。治療時(shí)納洛酮促癮試驗(yàn)30例均呈陽性，用河豚毒素注射液治療七天后，經(jīng)復(fù)查均呈陰性。戒斷癥狀變化情況(1)、精神狀態(tài)及行為活動(dòng)方面焦慮不安，好爭吵鬧事，困倦.失眠，消失時(shí)間最短1天，最后6—7天，平均1一9天。(2)軀體癥狀頭痛、肌肉痛、骨痛、消失時(shí)間最短1天，最長3天，平均1一2天。(3)植物神經(jīng)系統(tǒng)癥狀哈欠、出汗、汗毛豎立。交感神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，流涕、流淚，食欲不振、惡心嘔吐、腹瀉、胃腸痛(副交感神經(jīng)系統(tǒng))，消失時(shí)間最短1—2天，最長7—8天，平均4—8天。觀察表明河豚毒素對緩解肌肉痛、骨痛、有明顯的鎮(zhèn)痛作用。輔助鎮(zhèn)靜藥安定片和小劑量的抗焦慮藥，能抑制和縮短焦慮、不安，失眠等癥狀的出現(xiàn)，對其他戒斷癥狀寒戰(zhàn)，乏力、食欲不振、惡心、嘔吐、也有改善的作用。(詳見表4)不良反應(yīng)觀察出有個(gè)別病人在肌肉注河豚毒素注射液后感覺面部疼痛和惡心，改靜脈注射后癥狀小時(shí)。再未見其他不良反應(yīng)。4、討論通過30例杜冷丁依賴患者應(yīng)用河豚毒素制劑注射脫癮治療，收到很好效果。它具有脫癮快、治療時(shí)間短戒斷癮小時(shí)快，病18人無痛苦、無明顯副作用。表3:觀察對象特點(diǎn)與基本數(shù)據(jù)性別男22人女8人用毒方法肌注22人肌注和靜注10人用毒種類杜冷丁23人杜冷丁和海洛因7人年齡20—30歲12人31歲一40歲16人40歲以上2人脫癮年限一年以下ll人1一2年9人2年以上10日癮量1000mg以下9人1000—3000mgl9人3000mg以上2人表4:戒斷癥狀變化情況戒斷癥狀消失時(shí)間平均天數(shù)消失時(shí)間最長天數(shù)消失時(shí)間最短天數(shù)精神癥狀4—9天8天2天植物神經(jīng)癥狀1—8天7天l天軀體癥狀3天6天l天19權(quán)利要求1、河豚毒素的提取，包括原液提取、樹脂交換和洗脫步驟，第一步原液提取取菊黃東方豚卵巢，切成1—2cm片狀小塊，用0.1％—0.5％HAC溶液浸泡、攪拌，48小時(shí)后用甩干機(jī)甩干得原液，加熱至沸騰，立即停止加熱，除去凝固蛋白，原液冷卻后用50—80目篩初濾，再經(jīng)白陶土——紙漿過濾，得淺黃色透明原液，卵渣繼續(xù)分次浸泡24小時(shí)，重復(fù)上述步驟收集濾液，共取得原液20L，用氨水調(diào)制PH5—7，加1—5％正丁醇或1—2％甲醛防腐，常溫放置備用；第二步樹脂交換樹脂為D152陽性大孔丙烯酸弱酸性樹脂，經(jīng)常法處理轉(zhuǎn)NH4型，雙柱兩次交換，A柱為玻璃柱內(nèi)下層裝樹脂，上層裝硅藻土；B柱為玻璃柱內(nèi)下層裝中性氧化鋁，上層裝樹脂；A柱原液上樹脂柱進(jìn)行交換，流速100—120ml/min，樹脂交換后期用小鼠毒性跟蹤，當(dāng)小鼠顯中毒反應(yīng)時(shí)，表明樹脂交換已達(dá)飽和程度，停止原液上柱，用去離子水沖洗至流出液無色，茚三酮試驗(yàn)陰性止，收集有毒餾分流出液；B柱將A柱所收集的有毒餾分，用氨水調(diào)PH值為7，開始上柱，流速30—50ml/min，當(dāng)流出液PH7時(shí)，小鼠毒性跟蹤顯毒性反應(yīng)時(shí)，停止上柱，用去離子水(200L)沖洗柱，收集強(qiáng)毒餾分；第三步洗脫A柱用12％的HAC液洗脫，流速30—40ml/min，當(dāng)流出液PH7，小鼠毒性跟蹤顯毒性反應(yīng)時(shí)，分步收集有毒餾分，毒素高峰在PH6.5—4.5之間；B柱將A柱樹脂洗脫所得的有毒餾分，用氨水調(diào)PH6—7，上柱，用10％HAC洗脫，流速50ml/min，流出液PH7，小鼠跟蹤顯毒性反應(yīng)時(shí)，分步收集強(qiáng)毒餾分，弱毒部分做下次浸泡用，共收集強(qiáng)毒餾分置于0—5℃冷藏存放備用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的河豚毒素的提取，其特征是還包括結(jié)晶步驟，在洗脫后進(jìn)行第四步結(jié)晶將B柱樹脂交換和洗脫的強(qiáng)毒餾分，分次真空減壓濃縮，-10°。放置24小時(shí)后，取出融化解凍并加8M氨水調(diào)PH8—9，震動(dòng)攪拌，析出白色沉淀物，濾取沉淀物，沉淀物用蒸餾水反復(fù)洗滌3-5次，用2°/。一5%HAC液溶解，濾除不溶物雜質(zhì)，溶液中加8。/oNH4水調(diào)PH8—9，0—5度冷藏放置24小時(shí)，取出再進(jìn)行上述重結(jié)晶2-3次，得河豚毒素粗品結(jié)晶。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的河豚毒素的提取，其特征是第四步結(jié)晶粗品結(jié)晶經(jīng)高效液相色譜分離純化得純品河豚毒素結(jié)晶，經(jīng)高效相色譜分析，純度為99%。4、根據(jù)權(quán)利要求.1-3任一所述的河豚毒素的提取，其特征是第二步樹脂交換B柱中性氧化鋁經(jīng)180度活化處理2小時(shí)，冷卻后濕法上柱，氧化鋁先上柱，然后樹脂上柱，使氧化鋁在柱的下層，樹脂在柱的上層。5、根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述河豚毒素的提取制得的河豚毒素用于杜冷丁類藥物依賴的制劑，其特征是lml制劑中含有河豚毒素0.01-0.49Pg/ml，含有河豚毒素20-40倍重量份的穩(wěn)定劑硫酸軟骨素。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的河豚毒素用于杜冷丁類藥物依賴的制劑，其特征是lml制劑由下述原料配制而成河豚毒素0.48iig0.5%枸櫞酸0.002ml硫酸軟骨素9.6ixg注射用水余量。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述河豚毒素用于杜冷丁類藥物依賴的制劑，其特征是用于杜冷丁類藥物依賴的制劑的制備方法取河豚毒素溶于0.5%枸櫞酸溶液中，硫酸軟骨素溶于注射用水，兩溶液混合后加入注射用水，調(diào)PH值4一6，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?jīng)除菌過濾、超濾，在無菌條件下計(jì)量灌裝入安瓶中，半開塞送冷凍干燥機(jī)-40度預(yù)冷，打開冷井制冷，溫度降至-55度時(shí)啟動(dòng)真空泵，真空泵在真空度5帕以下，維持24小時(shí)，然后升溫在30度維持14小時(shí)壓塞、扎蓋。全文摘要本發(fā)明涉及河豚毒素的提取，另外還涉及河豚毒素的制劑。河豚毒素的提取，第一步原液提取取菊黃東方豚卵巢，HAC溶液浸泡取得原液；第二步樹脂交換樹脂為D152陽性大孔丙烯酸弱酸性樹脂，經(jīng)常法處理轉(zhuǎn)NH4型，雙柱兩次交換，A柱為玻璃柱內(nèi)下層裝樹脂，上層裝硅藻土；B柱為玻璃柱內(nèi)下層裝中性氧化鋁，上層裝樹脂；雙柱交換后再進(jìn)行第三步洗脫雙柱洗脫后合并交換和洗脫收集的強(qiáng)毒餾分，結(jié)晶得河豚毒素粗品結(jié)晶。本發(fā)明河豚毒素提取方法提高了產(chǎn)品的收率和純度。制劑貯藏期限更長，用于脫癮治療，具有起效快，控制癥狀徹底，過度平穩(wěn)，易接收等特點(diǎn)。文檔編號(hào)C07D491/00GK101475575SQ20091001030公開日2009年7月8日申請日期2009年2月5日優(yōu)先權(quán)日2009年2月5日發(fā)明者王維國申請人:王維國