專利名稱：：一種新型prrs病毒受體及該受體的阻斷抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)一個新型PRRS病毒細(xì)胞受體以及利用受體蛋白和多肽及其衍生物進(jìn)行對PRRS病毒感染的防治，屬于生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)又名藍(lán)耳病，是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一種豬的急性傳染病。PRRSV侵入宿主細(xì)胞首先通過與細(xì)胞膜表面上的特異性受體結(jié)合。利用細(xì)胞內(nèi)吞作用而感染易感細(xì)胞(Na冊ynck，HJ,DuanX,FavoreelHW，etc.J.Gen.Virol.1999,80:297-305)，如MA-104和PAM。到目前為止已報道的四個獨(dú)立但功能相關(guān)的PRRSV細(xì)胞受體,它們是唾液酸粘附素(Sialoadhesin)(VanderheijdenN,DelputtePL,FavoreelHW，etc.J.Virol.2003,77:8207-8215)，似肝磷脂蛋白(Heparinlike)(DelputtePL,VanderheijdenN,Nauwynck，HJ，etc.J.Virol.2002,76:4312-4321)，波形蛋白(Vimentin)(KimJK，F(xiàn)ahadAM,ShanmukhappaK，etc.J,Virol.2006,80:689-696)，清道夫受體(CD163)蛋白(CalvertJG，SladeDE，ShieldsSL，etc.J.Virol.20D7.81:7371-7379)。但是還存在有其他的PRRSV細(xì)胞受體，這些受體均可結(jié)合或參與結(jié)合PRRSV感染易感細(xì)胞，從而引起藍(lán)耳病。因此，通過對PRRSV的研究，依然會不斷的有新的病毒受體出現(xiàn)，從而擴(kuò)大研究的范圍。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一個新型PRRSV的細(xì)胞受體，同時提供了一種利用純化的NMHCn-A蛋白和人工合成的多肽及其blebbistatin作為受體阻斷劑，抑制PRRSV感染細(xì)胞的方法，同時可以作為受體阻斷劑的還有利用麗HCII-A蛋白和多肽免疫小鼠所得的抗體。上述的各種阻斷劑都對PRRSV感染細(xì)胞有抑制活性，可開發(fā)成防治PRRSV感染的藥物。申請人利用模擬PRRSV的GP5膜抗原的單克隆抗獨(dú)特型抗體首先從非洲綠猴腎細(xì)胞系(MA-104)和豬肺巨噬細(xì)胞(PAM)上分離和提純出一個可溶性蛋白(ZhouEM,XiaoYH，ShiYF，etc.J.Virol.Methods.2008，149:300—308)。利用這個模擬PRRSVGP5抗原的單克隆抗獨(dú)特性抗體，申請人發(fā)現(xiàn)了一個新的PRRSV細(xì)胞受體，經(jīng)過分析其氨基酸序列所得該受體為即非肌肉肌球蛋白II型重連A(nonmusclemyosinheavychainII-A,酬CII-A)蛋白，其蛋白的羧基端的氨基酸序列為SeqIDNo:1所示。同時發(fā)現(xiàn)了該受體阻斷和抑制劑，它們是NMHCII-A蛋白、NMHCII-A多肽、抗NMHCII-A蛋白和多肽抗體，以及非肌肉肌球蛋白II型(nonmusclemyosinn，NMM-n)抑制劑，即(+)-blebbistatin:是N廳-II的選擇性抑制劑[(土)-或(-)-blebbistatin]的無活性的對映異構(gòu)體。其中(a)畫HCII-A蛋白，蛋白的羧基端的氨基酸序列為SeqIDNo:1所示；(b)麵CII-A人工多肽，其氨基酸序列為SeqIDNo:2所示;(c)匿II-A人工多肽，其氨基酸序列為SeqIDNo:3所示;(d)NMHCII-A人工多肽，其氨基酸序列為SeqIDNo:4所示;上述病毒受體及受體阻斷和抑制劑，所針對的PRRSV主要包括經(jīng)典美洲株(代表毒株為VR-2332),中國分離株(代表毒株為Ch-la)，以及高致病性毒株(代表毒株為JXA-1)。而上述的非肌肉肌球蛋白II型(nonmusclemyosinII,N畫-II)抑制劑(+)-blebbistatin與N固-II反應(yīng)而阻斷PRRSV經(jīng)典美洲株、中國分離株，以及高致病性毒株感染細(xì)胞。與(士)-或(-)-blebbistatin不同的是，(+)-blebbistatin不抑制細(xì)胞依賴NMM-II的細(xì)胞分裂和增殖(StraightAF,CheungA,LimouzeJ,etc.Science.2003，299:1743-1747)。而(士)-blebbistatin—直是脊推動物細(xì)胞上醒-IIATP酶活性的選擇性抑制劑，而由于發(fā)明人將NMHCII-A蛋白作為了PRRSV受體，同時經(jīng)發(fā)明人的長期試驗，發(fā)現(xiàn)(+)-blebbistatin是可以作為阻斷PRRSV感染細(xì)胞的受體阻斷劑，這在之前的研究中也一直未見應(yīng)用。其病毒受體非肌肉肌球蛋白II型重連A(nonmusclemyosinheavychainII-A，NMHCII-A)蛋白的具體分離及鑒定過程為利用模擬PRRSVGP5膜抗原的單克隆抗體獨(dú)特型抗體從MA-104和PAM細(xì)胞中提純出一個可溶性蛋白(ZhouEM,XiaoYH，ShiYF，etal.J.Virol.Methods,2008,149:300-308);50jug上述可溶性蛋白用7.5%SDS-PAGE分離,分離出的蛋白用胃蛋白酶水解，水解片段經(jīng)微毛細(xì)管高壓液相層析分離，將分離片段用納米電噴射離子化，經(jīng)離子捕獲質(zhì)譜儀分析。將獲得的水解片段序列與GenBank氨基酸序列庫對比獲得受體蛋白為非肌肉肌球蛋白II型重連A(NMHCII-A)。上述(b)或(c)或(d)人工多肽的合成，具體方法是根據(jù)NMHCII-A重連的氨基酸序列，用DMStar軟件分析序列的抗原表位，設(shè)計出20個多肽序列，通過固相多肽合成方法合成多肽，合成的多肽通過MBS或戊二醛方法與載體蛋白匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin，KLH)偶聯(lián)。同時利用上述合成的人工多肽通過PRRSV阻斷試驗，證明了NMHCII-A羧基端內(nèi)的23個氨基酸為PRRSV結(jié)合區(qū)域，因此羧基端具有與序列表中SeqIDNo:1—致的蛋白，可以作為病毒的受體并作為相應(yīng)的阻斷劑。NMHCII-A蛋白和多肽-KLH偶聯(lián)產(chǎn)物與鋁佐劑混合免疫小鼠產(chǎn)生抗NMHCII-A蛋白和多肽抗體，可采用腹腔免疫小鼠的方法制得，也可采用其他的抗體制備方法制得該血清抗體。如與其它佐劑混合，采用肌肉或皮下免疫方法制得。具體的免疫方法可采用現(xiàn)有生物學(xué)中的免疫方法。綜上所述，由于發(fā)明人將羧基端具有與序列表中SeqIDNo:l—致的蛋白，特別是非肌肉肌球蛋白II型重連A(nonmusclemyosinheavychainII-A,NMHCII-A膝白作為了PRRSV受體，因此與之相關(guān)的上述的各種物質(zhì)，均可以都對PRRSV4感染細(xì)胞有抑制活性，可開發(fā)成防治PRRSV感染的藥物。從而為PRRS的研究和防治提供了一個全新的思路，擴(kuò)大了研究的范圍，對于實(shí)際生產(chǎn)有著極為重要的意義。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1新型PRRSV細(xì)胞受體的發(fā)現(xiàn)和鑒定利用模擬PRRSVGP5膜抗原的單克隆抗體獨(dú)特型抗體從MA-104和PAM細(xì)胞中提純出一個可溶性蛋白(ZhouEM，XiaoYH,ShiYF，etal.J.Virol.Methods,2008,149:300-308):50jug可溶性蛋白用7.5%SDS-PAGE分離，分離出的蛋白用胃蛋白酶水解，水解片段經(jīng)微毛細(xì)管高壓液相層析分離，將分離片段用納米電噴射離子化，經(jīng)離子捕獲質(zhì)譜儀分析。將獲得的水解片段序列與GenBank氨基酸序列庫對比獲得受體蛋白為非肌肉肌球蛋白II型重連A(NMHCII-A)。實(shí)施例2NMHCII-A人工多肽合成根據(jù)NMHCII-A重連羧基端序列制定的多肽序列通過固相多肽合成方法合成多肽，具體方法是將2-ChlorotritylChlorideResin樹脂與DMF混合振蕩30-60min進(jìn)行樹脂溶漲；通過沙芯抽濾掉DMF，加入3倍摩爾過量C端第一個氨基酸與樹脂連接，再加入10倍摩爾過量的DIEA，最后加入DMF溶解，振蕩30-60min;去掉DMF，加20。P底嚏DMF溶液，反應(yīng)5-15rain;取十幾粒樹脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105。C-11(TC加熱5min對反應(yīng)物進(jìn)行檢測。依次用DMF、甲醇和DMF洗滌兩次。通過下列方法之一對連接產(chǎn)物進(jìn)行縮合。方法a:加入三倍過量的溶于DMF的保護(hù)氨基酸(FOMC-Asp-OH)和HBTU，再加入十倍過量的NMM，反應(yīng)30-60min;方法b:加入三倍過量的溶于DMF的保護(hù)氨基酸(FOMC-Asp-OH)和HOBt，再加入三倍過量的DIC,反應(yīng)30-60min。之后依次用DMF、甲醇和DMF洗滌兩次。重復(fù)以上步驟，依次連接序列中的氨基酸。最后一個氨基酸連接后，依次用DMF、甲醇、DMF和DCM洗滌兩次，抽干10-20min。用切割液(TFA94.5%,水2.5%,EDT2.5%,TIS1%)切割120min將多肽從樹脂上切割出來，用氮?dú)獯蹈桑靡颐严戳?，常溫?fù)]干。粗制的多肽用純水或者加少量乙腈溶解,按照下列條件用HPLC純化多肽。層析柱為VenusiMRC-ODSC18,30x250隱;A泵溶液為0.1%的Trifluoroacetic溶于100%的純水；B泵溶液為0.1%的trifluoroacetic溶于畫的acetonitrile。最后將純化后的多肽凍干保存-20度保存?；蛲ㄟ^其它方法也可合成多肽，如利用/^r卜butoxy-carbonyl或9-fluorenylmethoxycarbonyl的固相合成方法(MerrifieldRB.J,AM.Chem.Soc.,1963,85:2149—2154;ChangCDandMerenhoferJ.Int.J.Pept.ProteinRes.1978，11:246-249)。實(shí)施列3多肽與載體蛋白匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KeyholeLimpetH函cyanin,KLH)偶聯(lián)每個多肽通過下列方法之一與KLH偶聯(lián)(1)MBS(M-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide)偶聯(lián)劑偶聯(lián)5mgKLH用lmLPBS(0.1M,pH6.0)溶解，加入50uLDMS0(含lmgMBS)反應(yīng)1小時，反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC分離，加入5ing多肽，反應(yīng)3小時，真空冷凍干燥制得。(2)戊二醛偶聯(lián)5mgKLH溶于去離子水，加入一定量的戊二醛以及5mg多肽，反應(yīng)5-6小時，用碳酸氫鈉和碳酸鈉緩沖液透析24小時，真空冷凍干燥制得。實(shí)施例4抗NMHCII-A蛋白和人工多肽抗體的制備蛋白和多肽-鋁佐劑制備NMHC1I-A蛋白或多肽-KLH偶聯(lián)產(chǎn)物溶于0.005MPBS，pH6.2(終容積10mL),緩慢加入溶于0.005MPBS(pH6.2)的硫酸鉀鍋(比例為50mg蛋白/0.4mg鋁)，調(diào)升pH至6.8-7.3,攪拌2小時，離心800g10分鐘，蛋白-鋁佐劑沉淀用生理鹽水洗滌一次，用0.1M的PBS溶解制得。蛋白和多肽也可與其它佐劑使用，如福氏佐劑。免疫程序每只小鼠經(jīng)腹腔免疫50"gNMHCII-A齊白或人工多肽，共免疫三次，采集小鼠血清檢測和鑒定抗體。抗NMHCII-A蛋白或人工多肽的抗體也可使用其它動物(如家兔，山羊等)以及釆用其它途徑免疫(如肌肉或皮下)。產(chǎn)生抗體的小鼠也可利用其脾臟通過細(xì)胞融合制備單克隆抗體。實(shí)施例5NMHCII-A蛋白、人工合成多肽及抗體的鑒定間接ELISA法首先，NMHCII-A蛋白及各個多肽用PBS(0.01M,pH7.2)包被ELISA板，每孔200ng,4C過夜。ELISA板用PBS-T(PBS含O.5%體積的Tween-20)洗滌3次后，用封閉液(2.5%濃度的脫脂奶粉溶于PBS-T，200n1/孔)封閉1小時，洗滌3次，每孔加入稀釋的小鼠血清反應(yīng)l小時，洗滌3次，每孔加入辣根過氧化物酶(服P)標(biāo)記的羊抗鼠IgG反應(yīng)1小時，洗滌3次，每孔加入100m1肌P底物(TMB)反應(yīng)15分鐘，每孔加入50jal1M硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm下讀取每孔的OD值。檢測結(jié)果見表1和表2。小鼠免疫之前的血清作為陰性對照血清，免疫后小鼠血清的0D值大于陰性對照的3倍則為陽性。由表1結(jié)果證實(shí)NMHCII-A蛋白具有免疫原性，血清抗體具有與NMHCII-A蛋白結(jié)合特性，其抗體效價可以達(dá)到1:100000。同時，這些血清抗體可以與人工合成多肽結(jié)合，其抗體效價可以達(dá)到1:10000。由表2結(jié)果證實(shí)人工合成的3個多肽所免疫的小鼠不但可以結(jié)合免疫用的多肽，還可以結(jié)合NMHCII-A蛋白，其抗體效價可以達(dá)到l:10000。表l.抗NMHCII-A血清抗體的鑒定結(jié)果不同稀釋度的血清結(jié)合抗原的OD值"抗原陰性對照血清3次免疫后的血j~~10—2~~i3~~IF~~IF~"~~iF~~~~I1"蘭CII-A蛋白^~^~^~^~~^~~0.46多肽(SeqIDNo:2)0.150.140.110.100.780.530.380.16多膚(SeqIDNo:3)0.170.160.130.110.690.480.330.11多肽(SeqIDNo:4)0.160.120.100.080.750.510.390.17表2-1.抗人工多肽(SeqIDNo:2)血清抗體的鑒定結(jié)果不同稀釋度血清結(jié)合抗原的OD值抗原陰性對照血清3次免疫后的血清lo—2~~TF5~~~~IFIF~~IF~~i^~~I1"多肽(SeqIDNo:2)^~~^TTI~~~171^~~^~OI~OINMHCII-A蛋白0.130.100.100.081.170.680.350.19表2-2.抗人工多肽(SeqIDNo:3)血清抗體的鑒定結(jié)果不同稀釋度血清結(jié)合抗原的OD值抗原陰性對照血清3次免疫后的血清10310"l(T5l(T210310"l(T5多肽(SeqIDNo:3)0.110.130.090.081.160.750.430.22NMHCII-A蛋白0.120.110.80.071.050.650.320.177表2-3.<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例6NMM-II抑制劑(blebbistatin)對細(xì)胞的作用(±)-blebbistatin是脊推動物細(xì)胞上薩-IIATP酶活性的選擇性抑制劑，它抑制細(xì)胞卵裂溝的收縮，快速和可逆阻斷細(xì)胞起泡，阻斷細(xì)胞遷移以及胞質(zhì)分裂(StraightAF，CheungA，LimouzeJ，etc.Science.2003，299:1743-1747)。(-)-blebbistatin是(土)-blebbistatin的活性對映異構(gòu)體，(+)-blebbistatin是(士)-blebbistatin的無活性對映異構(gòu)體。Marc-M5細(xì)胞和PAM(l()5個細(xì)胞/ml)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml，硫酸鏈霉素"jug/ml，慶大霉素50]11g/ml，10%小牛血清)中，37°C,5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層。將(土)一blebbistatin，(S)-(-)-blebbistatin和(R)-(+)-blebbistatin(購自美國TocrisCookson公司)溶解于DMS0中，再用PBS倍比稀釋，加入單層細(xì)胞培養(yǎng)板，連續(xù)培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變(CPE)。CPE在普通顯微鏡下觀察所見為細(xì)胞表面粗燥，折光性強(qiáng)，最后細(xì)胞脫落。由表4結(jié)果表明(士)-blebbistatin和(S)-(-)-blebbistatin抑制細(xì)胞增殖并造成CPE。然而，(R)-(+)-Mebbistatin不抑制細(xì)胞增殖，無CPE。因此(+)-blebbistatin可作為PRRSV受體阻斷劑。表4.Blebbistatin對MA-104和PAM細(xì)胞的作用結(jié)果不同濃度(pM)blebbistatin造成細(xì)胞CPE(有或無)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例7PRRSV受體阻斷試驗Marc-145細(xì)胞和PAM(105個細(xì)胞/(111)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml，硫酸鏈霉素50jug/ml，慶大霉素50"g/ml，10%小牛血清)中，37°C，5%(:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層。將采用實(shí)施例l、2、4的方法得到的NMHCII-A蛋白、人工合成的多肽、血清抗體以及(+)-blebbistatin溶于DMEM培養(yǎng)基中，過濾除菌后與固定濃度(103TCID5。/ml)妁不同毒株的PRRSV混合孵育1小時后，加入上述細(xì)胞中，每個稀釋度做8個重復(fù)，37。C吸附l小時后，去掉混合物，加入DMEM培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)，每天觀察CPE。PRRSV感染細(xì)胞所致的CPE表現(xiàn)為細(xì)胞表面粗燥，折光性強(qiáng)，最后細(xì)胞脫落。表5所示結(jié)果為NMHCII-A蛋白、人工合成的多肽、血清抗體以及(+)-blebbistatin在每孔濃度依次為jug、jug、juL和pM時抑制CPE的程度。判斷細(xì)胞CPE的指標(biāo)如下"-，，代表無CPE;"+"代表25%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE;"++"代表50。/。的細(xì)胞出現(xiàn)CPE;"+++"代表75%以上的細(xì)胞出現(xiàn)CPE。由表5結(jié)果表明NMHCn-A蛋白和人工合成多肽(SeqlDNo:2,3,4)在2"g-100Hg/孔、抗NMHCII-A蛋白和抗人工合成多肽的血清在5yL-100"L/孔以及(+)-b1ebbistatin在2iaM-l00jaM/孔都可以完全抑制PRRSV對細(xì)胞造成的CPE;說明NMHCII-A蛋白及其衍生物能夠阻斷PRRSV感染細(xì)胞，可用于開發(fā)防治PRRSV的藥物。表5.PRRSV受體阻斷試驗結(jié)果不同濃度受體阻斷劑抑,對CPE的程度受體阻斷劑100502010521NMHCII-A蛋白—-——-—+多肽(SeqIDNo:2)—---——++多肽(SeqIDNo:3)---—-_++多肽(SeqIDNo:4)————_—++抗NMHCII-A蛋白血清—_-——+++4抗多肽(SeqIDNo:2)血清——--—++++抗多肽(SeqIDNo:3)血清-———-++++抗多肽(SeqIDNo:2)血清—----++++(+)-blebbistatin一_一一一_+10<110〉山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>—種新型PRRS病毒受體及該受體的阻斷抑制劑<160>4<210〉1<211>23<212>PRT<213>Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus<400>1GlyAlaGlyAspGlySerAspGluGluValAspGlyLysAlaAspGly151015AlaGluAlaLysProAlaGlu20<210>2<211>9<212〉PRT<213>人工多肽<400>2GlyAlaGlyAspGlySerAspGluGlu15<210>3<211>14<212>PRT<213>人工多肽<400>3GlyAlaGlyAspGlySerAspGluGluValAspGlyLysAla1510<210>4<211>11<212>PRT<213>人工多肽<400>4LysAlaAspGlyAlaGluAlaLysProAlaGlu15101權(quán)利要求1.一種新型PRRS病毒受體，其特征在于蛋白的羧基端的氨基酸序列為SeqIDNo1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒受體，其特征在于所述的受體為非肌肉肌球蛋白II型重連A(no謂sclemyosinheavychainII-A，NMHCII-A)蛋白。3.—種阻斷PRRS病毒感染細(xì)胞的受體阻斷劑，選自具有如下特征之一的阻斷劑(a)NMHCII-A蛋白，蛋白的羧基端的氨基酸序列為SeqIDNo:1所示；(b)人工多肽，其氨基酸序列為SeqIDNo:2所示；(c)人工多肽，其氨基酸序列為SeqIDNo:3所示；(d)人工多肽，其氨基酸序列為SeqIDNo:4所示；(e)利用(a)或(b)或(c)或(d)制得的血清抗體；(f)非肌肉肌球蛋白II型(no隨sclemyosinII,N固-II)抑制劑，即(+)-blebbistatin。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的阻斷PRRS病毒感染細(xì)胞的受體阻斷劑，其特征在于結(jié)合PRRS病毒或結(jié)合細(xì)胞受體，阻斷PRRS病毒感染MA-l(M和PAM。5.權(quán)利要求3所述的阻斷PRRS病毒感染細(xì)胞的受體阻斷劑，用于開發(fā)成防治PRRS疾病的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及一個新型PRRS病毒的細(xì)胞受體，即非肌肉肌球蛋白II型重連A(nonmusclemyosinheavychainII-A，NMHCII-A)蛋白以及非肌肉肌球蛋白II型(nonmusclemyosinII)的抑制劑-blebbistatin，作為抑制PRRS病毒感染細(xì)胞的藥物。本發(fā)明提供了一種利用純化的NMHCII-A蛋白和人工合成的多肽及其blebbistatin抑制PRRS病毒感染細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了利用NMHCII-A蛋白和多肽產(chǎn)生的抗體。這種通過純化得到的NMHCII-A蛋白或人工合成方法獲得的多肽及其blebbistatin以及抗NMHCII-A蛋白和抗多肽抗體都對PRRS病毒感染細(xì)胞有抑制活性，可開發(fā)成防治PRRS病毒感染的藥物。文檔編號C07K14/705GK101481415SQ20091001368公開日2009年7月15日申請日期2009年2月4日優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日發(fā)明者周恩民申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)