專利名稱：一種蚯蚓活性蛋白及其提取方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蚯弼l活性蛋白及其提取方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蚯蚓，亦稱地龍、曲蟮，環(huán)節(jié)動物門寡毛綱陸生動物，體內(nèi)含有大量脂肪酸、核酸及其 衍生物、游離氨基酸、各種微量元素以及多種維生素，其中蛋白質(zhì)含量尤為豐富。新鮮蚯躬l 含蛋白質(zhì)20%以上(干制品高達(dá)70%)，含有人體必需的18種氨基酸。蚯蚓是傳統(tǒng)中藥，其 味咸性寒，具有清熱、平肝、定驚、止喘、通絡(luò)、利尿之功效，可用來治療慢性支氣管炎和 支氣管哮喘、中風(fēng)偏癱、高血壓、神經(jīng)分裂癥、癌癥、消化道潰瘍、下肢潰瘍、流行性腮腺 炎、帶狀疙疹、濕疹、蕁麻疹、燒傷燙傷、膀膚結(jié)石、小便不暢和癌癥等癥。
利用現(xiàn)代生物技術(shù)，從蚯蚓中提取出具有藥理活性的的生物蛋白或大分子物質(zhì)，是當(dāng)前 的熱門之一。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種蚯蚓活性蛋白，以及其提取方法和在治療燙傷中 的應(yīng)用。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種蚯頓活性蛋白，是通過以下方法提取的，包括以下步驟
1) 取鮮活蚯蚓，清洗其表面泥土后，在自然條件下過夜吐泥；
2) 用蒸餾水清洗吐泥后的蚯蚓，去除水分，稱重；
3) 按1: l的比例加入雙蒸水，用組織勻漿機(jī)在冰浴條件下高速勻漿；
4) 將勻漿液靜置4小時，10000rpm/min高速離心后收集上清；
5) 冰浴條件下，采用鹽析法或有機(jī)溶劑沉淀法或多聚陽離子沉淀法沉淀蛋白；
6) 離心收集上述沉淀后的蛋白，用2倍體積0.1M磷酸鹽緩沖液重溶；
7) 將重溶后的溶液用0.45pm的微孔濾膜過濾后，采用凝膠過濾層析法進(jìn)行蛋白分離， 流速為0.5ml/min,紫外檢測波長為280nm;
8) 收集洗脫峰，脫鹽；
9) 將脫鹽后的洗脫液干燥，即得蚯蚓活性蛋白。
所述步驟5)具體為冰浴條件下，向上清液中加入硫酸銨進(jìn)行鹽析。
所述步驟7)中，采用Superdex75凝膠柱進(jìn)行層析分離，還可采用其他凝膠填料的層析柱進(jìn)行層析分離。
所述步驟8)中，采用SephadexG-25凝膠柱進(jìn)行脫鹽，亦可采用其他脫鹽層析柱及透析 等方式進(jìn)行脫鹽。
所述步驟9)具體為將脫鹽后的洗脫液冷凍千燥，得凍干粉，即為蚯蚓活性蛋白；亦 可采用其他可保持蛋白活性的干燥方法進(jìn)行干燥。
所述蚯躬l活性蛋白具有較高藥用價值，所具有的藥理活性包括抗癌、溶栓、抗菌、治療 燒燙傷等，因此，可以將其單獨(dú)或與其他藥物混合，制備成各種劑型，應(yīng)用于燒燙傷的治療， 也可以應(yīng)用于創(chuàng)傷愈合或開放傷口的炎癥治療，或應(yīng)用于其他各種疾病反應(yīng)的治療或輔助治 療。
本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代生化分離技術(shù)從鮮活蚯蚓中提取出具有藥理活性的蛋白， 一方面提高了 其藥理活性，另一方面可以有效的去除蚯蚓體內(nèi)的其它各種雜質(zhì)，避免了這些雜質(zhì)引起的不 良反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明
實(shí)施例l:從鮮活蚯蚓中提取活性蛋白，步驟如下
1) 取鮮活蚯蚓，清洗其表面泥土后，在自然條件下過夜吐泥；
2) 用蒸餾水清洗吐泥后的蚯蚓，去除水分，稱重；
3) 按l: l的比例加入雙蒸水，用組織勻漿機(jī)在冰浴條件下高速勻漿；
4) 將勻漿液靜置過夜，10000rpm/min高速離心后收集上清；
5) 冰浴條件下，將研細(xì)的硫酸銨加入上述上清液進(jìn)行鹽析；
6) 離心收集鹽析后沉淀，用2倍體積Tris-HCl緩沖液重溶；
7) 將重溶后的溶液用0.45pm的微孔濾膜過濾后，上Superdex 75凝膠柱進(jìn)行層析，流速 為0.5ml/min,紫外檢測波長為280nm:
8) 收集洗脫峰，用Sephadex G-25凝膠柱脫鹽；
9) 將脫鹽后的洗脫液進(jìn)行冷凍干燥，所得凍干粉即獲得蚯蚓活性蛋白。
實(shí)施例2:從鮮活蚯蚓中提取活性蛋白，步驟l)至步驟6)同實(shí)施例l,步驟7)中采 用葡聚糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠填料的層析柱進(jìn)行層析；步驟8)至步驟9)同 實(shí)施例1。
實(shí)施例3:從鮮活蚯蚓中提取活性蛋白，步驟l)至步驟7)同實(shí)施例l,步驟8)中采 用葡聚糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠層析柱及透析方式脫鹽；步驟9)同實(shí)施例l。實(shí)施例4:從鮮活蚯蚓中提取活性蛋白，步驟l)至步驟8)同實(shí)施例l,步驟9)采用
噴霧干燥或真空干燥進(jìn)行干燥。
實(shí)驗(yàn)例l:蚯蚓活性蛋白對燒燙傷的治療
1. 1試驗(yàn)材料
1. 1. 1試劑與耗材
受試品依據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案制備的蚯蚓活性蛋白； 對照品美寶濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司)； 戊巴比妥鈉(上海西唐生物科技公司)；
直徑3cm銅棒(lkg)。
1, 1. 2動物
雄性Wistar大鼠(6 8周，210~280 g) 40只，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格 證編號SCXK(魯)-20030004。 1.2實(shí)驗(yàn)方法
將大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組8只大鼠。 用2.5%戊巴比妥鈉對大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉，然后將大鼠背部兩側(cè)脫毛。用2.5%戊巴比 妥鈉對大鼠進(jìn)行麻醉，將銅棒放于沸水中煮5min，然后把銅棒放于拔完毛后的大鼠背部兩側(cè) 分別燙傷4秒。蚯蚓活性蛋白的低、中、高劑量組分別以5mg/ml、 20mg/ml、 100mg/ml每天 3次對燙傷創(chuàng)面給藥。模型組以生理鹽水給藥，對照組以對照藥物給藥。
1.3結(jié)果與討論
燙傷愈合時間及燙傷修復(fù)后病理切片顯示，蚯蚓活性蛋白對燒燙傷的治療有顯著效果。 其中，蚯頓活性蛋白高劑量組的治療效果超過陽性對照藥物。
2. 1試驗(yàn)材料
2. 1. 1試劑與耗材
受試品依據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案制備的蚯蚓活性蛋白；
DMEM (美國JRH);
胎牛血清(美國GIBCO);
胰蛋白酶(美國GIBCO):
MTT (美國Sigma)。
2. 1.2細(xì)胞
大鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3):中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)。2. 2實(shí)驗(yàn)方法
將NIH3T3細(xì)胞接于含10%胎小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h，加入蚯頓活性蛋白 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，進(jìn)行MTT測定。
另取對數(shù)生長期NIH3T3細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中， 培養(yǎng)48小時后用平口微量滴管在中央垂直劃一均勻痕跡，更換新的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液， 加入蚯蚓活性蛋白溶液，檢測12h, 24h和48h三個時間點(diǎn)的細(xì)胞劃痕間距。
2. 3結(jié)果與討論
上述細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，蚯蚓活性蛋白具顯著的促細(xì)胞 增殖活性，因此，該蛋白對創(chuàng)傷的治療應(yīng)具顯著療效。 實(shí)驗(yàn)例3:蚯蚓活性蛋白對炎癥的治療
3. 1試驗(yàn)材料
大鼠白介素-6ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)； 大鼠腫瘤壞死因子ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。 3. 2實(shí)驗(yàn)方法
取實(shí)驗(yàn)例1各大鼠的燙傷皮膚，勻漿后分別用大鼠白介素-6ELISA試劑盒及大鼠腫瘤壞 死因子ELISA試劑盒測定其TNF-a和IL-6含量。 3. 3結(jié)果與討論
炎癥因子含量測定結(jié)果顯示，蚯蚓活性蛋白對炎癥因子具有良好的抑制作用，因此，該 蛋白對于炎癥的治療應(yīng)具顯著效果。
由上可見，本發(fā)明所制備的蚯蚓活性蛋白具有顯著藥理學(xué)活性，可以用于治療燒燙傷， 完全可以開發(fā)成為新型藥物。
權(quán)利要求
1.一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，包括以下步驟1)取鮮活蚯蚓，清洗其表面泥土后，在自然條件下過夜吐泥；2)用蒸餾水清洗吐泥后的蚯蚓，去除水分，稱重；3)按1∶1的比例加入雙蒸水，用組織勻漿機(jī)在冰浴條件下高速勻漿；4)將勻漿液靜置4小時，10000rpm/min高速離心后收集上清；5)冰浴條件下，采用鹽析法或有機(jī)溶劑沉淀法或多聚陽離子沉淀法沉淀蛋白；6)離心收集上述沉淀后的蛋白，用2倍體積0.1M磷酸鹽緩沖液重溶；7)將重溶后的溶液用0.45μm的微孔濾膜過濾后，采用凝膠過濾層析法進(jìn)行蛋白分離，流速為0.5ml/min，紫外檢測波長為280nm；8)收集洗脫峰，脫鹽；9)將脫鹽后的洗脫液干燥，即得蚯蚓活性蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特征在于所述歩驟5)具體為冰浴條件下，向上清液中加入硫酸銨進(jìn)行鹽析。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特征在于所述步驟7)中，采 用Superdex 75凝膠柱進(jìn)行層析分離。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特征在于所述步驟8)中，采 用Sephadex G-25凝膠柱進(jìn)行脫鹽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特征在于所述步驟9)具體為 將脫鹽后的洗脫液冷凍干燥，得凍干粉，即為蚯蚓活性蛋白。
6. 用權(quán)利要求1所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法制備的蚯蚓活性蛋白。
7. 權(quán)利要求6所述的蚯蚓活性蛋白在制備治療燙傷藥物中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求6所述的蚯蚓活性蛋白在制備促進(jìn)傷口愈合藥物中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求6所述的蚯蚓活性蛋白在制備具有抗炎癥作用藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蚯蚓活性蛋白，是通過以下方法提取的1)取鮮活蚯蚓，清洗，自然條件下過夜吐泥；2)蒸餾水清洗，去除水分，稱重；3)加入雙蒸水，冰浴條件下高速勻漿；4)將勻漿液靜置4小時，離心收集上清；5)冰浴條件下，采用鹽析法或其它方法沉淀蛋白；6)離心收集蛋白，用0.1M磷酸鹽緩沖液重溶；7)將重溶后的溶液用微孔濾膜過濾后，采用凝膠過濾層析法進(jìn)行蛋白分離；8)收集洗脫峰，脫鹽；9)將脫鹽后的洗脫液干燥，即得蚯蚓活性蛋白。本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代生化分離技術(shù)從鮮活蚯蚓中提取出具有藥理活性的蛋白，一方面提高了其藥理活性，另一方面可以有效的去除蚯蚓體內(nèi)的其它各種雜質(zhì)，避免了這些雜質(zhì)引起的不良反應(yīng)。
文檔編號C07K1/16GK101607990SQ20091001668
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者吉愛國, 宋淑亮, 浩 梁 申請人:山東大學(xué)威海分校