專利名稱：細(xì)胞松弛素類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑，具體的說是一種細(xì)胞松弛素類化合物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
海洋生物因其所處的高鹽、高壓、低溫、低營(yíng)養(yǎng)等特殊的生活環(huán)境而
產(chǎn)生和積累了許多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，成為研究發(fā)現(xiàn)新型海洋藥物的重要資源。而海洋微生物因其可常年人工大規(guī)模培養(yǎng)并且代謝過程可被人工調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，相對(duì)于其他海洋生物資源而言，又避免了生長(zhǎng)季節(jié)及自然生物量的限制，不致引起生態(tài)破壞，相對(duì)易于解決藥源問題，因此在生物活性物質(zhì)研究及后續(xù)開發(fā)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
內(nèi)生真菌(Endophytic fungus)是指內(nèi)共生在宿主體內(nèi)、但不引起宿主明顯致病癥狀的一類真菌。內(nèi)生真菌與宿主之間存在著相互依賴的互惠共生關(guān)系，在與宿主協(xié)同進(jìn)化的過程中可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次生代謝產(chǎn)物，已成為天然活性物質(zhì)的重要來源。最近幾年，隨著全世界對(duì)海洋生物資源研究的不斷深入，海洋真菌由于其資源優(yōu)勢(shì)和新穎的次生代謝產(chǎn)物，成為海洋天然產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種細(xì)胞松弛素類化合物及其制備方法和用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為-.細(xì)胞松弛素類化合物，如圖(I)中化合物1或2所示
2
(I)
制備方法
1 )將球毛殼菌(Ow"wm'Mm^^o "m)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，而后將發(fā)酵液經(jīng)用有機(jī)溶液提取2-5次，合并提取液進(jìn)行濃縮，獲得發(fā)酵物；
2)將步驟1)中的發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯和氯仿-
甲醇分別進(jìn)行梯度洗脫，洗脫下的每個(gè)組分經(jīng)薄層層析檢測(cè)；
所述石油醚-乙酸乙酯梯度范圍為100: 0-0: 100、；氯仿-甲醇梯度范圍為100: 10-0: 100;
3 )將步驟2 )中經(jīng)經(jīng)薄層層析檢測(cè)Rf 0. 3-0. 5的洗脫組分進(jìn)行硅膠柱層析、凝膠柱層析，再經(jīng)反相柱層析分離純化，而后以甲醇-水80: 20洗脫，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測(cè)，展開劑為氯仿甲醇=10: 1, Rf為O. 38并經(jīng)HPLC分析(甲醇水=55: 45 )保留時(shí)間為24. 86分鐘即圖(I )中化合物1;薄層層析檢測(cè)展開劑為氯仿甲醇=10: 1, Rf為0. 42并經(jīng)HPLC分析(甲醇水=55: 45 )保留時(shí)間為29. 61分鐘為圖(I )中化合物2。
步驟1)中所得的發(fā)酵培養(yǎng)物為菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液用有機(jī)溶劑乙酸乙酯萃取，菌絲體用可用甲醇、丙酮-水(80-20 )、乙醇或氯仿-甲醇l:1中一種或幾種萃取，萃取后得到的菌絲體和發(fā)酵液合并得發(fā)酵物。
所述球毛殼菌(C/w"om/ww g/o6oswm)酵培養(yǎng)，首先將在瓊脂-麥芽膏培養(yǎng)基中保存的球毛殼菌接種到PDA平板上，在28。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，其次在平板上取大小為4cm2的菌絲體放入已滅菌盛有300ml液體培養(yǎng)基上靜置室溫培養(yǎng)30天。所述液體培養(yǎng)基為土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L, pH 6.5。
細(xì)胞松弛素類化合物的應(yīng)用，可作為細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑中應(yīng)用。同時(shí)可作為抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物或抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)
1. 本發(fā)明所得的化合物釆用MTT法測(cè)試對(duì)于A-549細(xì)胞株的抗腫瘤活性，試驗(yàn)證明，本發(fā)明所得的化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞有增殖抑制作用；其用作細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑。
2. 本發(fā)明細(xì)胞松弛素類化合物從球毛殼菌(C/wetom/ww g/o6o^w)內(nèi)生真菌中通過人工發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)分離純化獲得。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明化合物對(duì)人肺癌細(xì)胞株A-549的半數(shù)抑制濃度ICso分別2.55, 2.26 ^M,具有抗腫瘤活性，可作為細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑。
3. 本發(fā)明細(xì)胞松弛素類化合物具有細(xì)胞增殖抑制以及直接殺傷癌細(xì)胞等抗腫瘤活性可用在制備腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
細(xì)胞松弛素類化合物1或2的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別是(結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯?dāng)?shù)字式化學(xué)結(jié)構(gòu)中的碳原子的標(biāo)位)
1 2
H
rNH細(xì)胞松弛素類化合物的制備方法
1) 生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)
菌種培養(yǎng)球毛殼菌(Ozaetom/wm g/o6oszw7)菌種以瓊脂-麥芽膏培養(yǎng)基，4 。C保存。取球毛殼菌(Owetom/wm g/o6仍ww)接種到PDA平板上，在28。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。
瓊脂-麥芽膏培養(yǎng)基為瓊脂12g/L,麥芽膏15g/L，海鹽24.4g/L, PH7. 4-7. 8。
在平板上取大小為4cm2的菌絲體放入已滅菌盛有300ml液體培養(yǎng)基(土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L， pH 6. 5 )的容量為1000mL的錐形瓶中，靜置室溫培養(yǎng)30天。
2) 浸膏的獲得將上述經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的將發(fā)酵液，用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離，將發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3次合并乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾得粗浸膏。菌絲體用甲醇浸泡三次減壓蒸餾并合并菌絲體和發(fā)酵物的浸膏，獲得發(fā)酵物共45g。
3) 化合物的分離精制
發(fā)酵物(45g)進(jìn)行硅膠柱(200-300目)層析，用石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇分別進(jìn)行梯度洗脫，分別收集洗脫液，洗脫液用薄層層析(TLC)檢測(cè)，根據(jù)Rf值來判斷、合并相同或類似部分，薄層層析(TLC)檢測(cè)時(shí)用茴香醛-硫酸作為顯色劑，獲得14個(gè)組分(Fr. l-Fr. 14)。所述石油醚-乙酸乙酯梯度范圍為100: 0-0: 100、；氯仿-甲醇梯度范圍為100: 10-0:100;
以氯仿-甲醇10: l梯度洗脫下的Rf 0. 3-0. 5，組分為Fr. 12經(jīng)硅膠柱層析(氯仿甲醇50: 1、 20: 1和10: 1 )和凝膠(氯仿-甲醇1: 1)柱層析，再經(jīng)反相柱層析，而后以甲醇-水80: 20洗脫，洗脫液經(jīng)硅膠薄層層析檢測(cè)，展開劑為氯仿甲醇=10: 1, Rf值為0.38， HPLC分析條件為甲醇水=55: 45，保留時(shí)間為24. 86分鐘，即圖(I )中化合物1 ( 7. 4mg );硅膠薄層層析檢測(cè)展開劑為氯仿甲醇=10: 1， Rf值為0.42, HPLC分析條件為甲醇水=55: 45,保留時(shí)間為29. 61分鐘，為圖(I)中化合物(3. 0mg) 2。
其結(jié)構(gòu)鑒定為如(I)所示，命名為細(xì)胞松弛素類化合物CytoglobosinB化合物1和CytoglobosinC化合物2。(I)
該化合物具有以下理化和波譜特性
化合物1,白色形粉末，比旋光度[a]g +36° (c 0.02, CH3OH); UV(CH3OH;Umax (log s) 289 (4.29), 261 (3.45), 254 (3.46), 223 (4.18), 206 (3.86)nm;紅外光譜(KBr) ymax 3376, 1692, 1613, 1447 cm—、核磁共振氫譜和碳譜如表I;ESI質(zhì)譜m/z 553 [M + Na]+;569 [M + K]+，高分辨ESI質(zhì)譜m/z553.2659 [M + Na]+, (:321~138]^20^&+計(jì)算值為553.2678。
化合物2，白色形粉末，比旋光度[a]^5 -34°(c0.04,CH3OH);UV(CH3OH) zl腿(log s) 290 (3.30)， 279 (3.39)， 222 (4.17), 203 (4.08) ■;紅外光譜(KBr) ymax 3443, 3403, 1672, 1454, 1427 cm—1;核磁共振氫譜和碳譜如表I;ESI質(zhì)譜m/z 537 [M + Na]+; 553 [M + K]+，高分辨ESI質(zhì)譜m/z 537.2731[M + Na]+， (:3必38!^20^3+計(jì)算值為537.2729。
表I化合物1和2的核磁共振氫譜和碳譜(500 MHz, in DMS0 )數(shù)據(jù)
(5H ( / in Hz)(5H in Hz)
1173.2 s173.3 s
28.31 (s)7,83 (s)
33.33 (m)57.5 d3.30 (m)52.9 d
42,74 (br s)47.7 d2.58 (dd, 2,0, 5.8)48.7 d
125.0 s2.36 (m)34.1 d
6134.5 s138.4 s
3.65 (dd, 7.4, 9.4)67.5 d5.30 (s)126.0 d
849.9 d2.77 (brd, 10.5)45.4 d
960.5 s66.1 s
102.72 (m)， 2.47 (m)31.3 t2.69 (dd, 5.6, 14.3), 2.5333.41
(d，d 7.5, 14.3)
111.54 (s)14.5 q0.71(d, 7.2)13.3 q
121,13 Cs)16.7 q1.62 (s)21.3 q
135.84 (dd, 11.4, 15.3)127.1 d6.12 (dd, 10.5, 15.3)128.8 d
145.00 (m)135.0 d5.04 (ddd, 2.6, 9.8, 15,1)132.0 d
152.24 (m)， 1.63 Cm)39.0 t2.17 (m), 1.72 (m)41.2t
162.53 (m)31.7d2.27 (m)31.5 d
174.65 (d, 10.0)131.6d4,72 (d, 8.8)131.8d
18133.9 s136.1 s
194.05 (br s)78.3 d3.97 (dd, 4.0,7.4)75.3 d
204.52 (br s)75.5 d4.30 (dd， 4.3, 7.4)78.1 d
216.83 (dd,3.3' 15.1)147.9 d6.55 (dd,線15.5)145.6 d
226.57 (dd, 1.9， 15.1)122.8 d6.51 Cd, 15.5)125.0 d
23198.3 s198.3 s
16-Me0.89 (d, 6.5)21.2 q0.88 Cd， 6.7)19.3 q
18-Me1.65 (s)13.5 q1.57 (s)12.8 qr10.87 (s)10.8 (s)
l'a136.1 s133.9 s
2'7.36 (d， 0.87)123.2 d7.07 (d， 2.2)123.7 d
3'110.2 s跳6s
3'a125.9 s127,5 s
4'7.41 (d, 7.9)118.3 d7.42 (d, 7.6)118.0d
5'7,00 Cm)118.0 d6.97 (m)118.3 d
6'7.06 (m)120,9 d7.02 (m)120.7 d
7'7.33 (d, 8.1)110.3 d7.30 (d， 8.1)川.3 d
7-OH4.52 (br s)
12-OH
19-OH5.02 (d, 4.5)
20-OH5.10(d, 4.3)
a)本表信號(hào)歸屬基于DEPT、 'H-C0SY、 HSQC及HMBC圖譜解析結(jié)果，碳信號(hào)的多重度利用DEPT方法確定并分別用s (單重峰)、d(雙重峰)、t (三重峰)和q (四重峰)表示。_
~~實(shí)施例2
抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)人肺癌細(xì)胞株A-549可用來評(píng)價(jià)化合物抗腫瘤活性的強(qiáng)弱，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好。實(shí)驗(yàn)方法
四氮唑鹽MTT是一種能接受IT的黃色染料。在活細(xì)胞線粒體呼吸鏈中，琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C可使MTT的四氮唑環(huán)開裂，生成藍(lán)紫色的formazan結(jié)晶，而死細(xì)胞中不含這種脫氫酶。Formazan結(jié)晶的生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，該結(jié)晶的DMSO溶液在570納米處有最大吸收峰，所以，可通過檢測(cè)formazan結(jié)晶的量來評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至2"05個(gè)細(xì)胞/亳升，按每孔200微升接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37。C通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。上述實(shí)施例1所得的化合物1或化合物2樣品分別設(shè)定5個(gè)濃度梯度l(T8， l(T7， l(T6， 10隱5和l(T4 mol/L，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)平行樣，每孔加樣品液或空白液各2微升，培養(yǎng)48小時(shí)，然后每孔加濃度為5亳克/亳升的MTT液10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，除去上清液。每孔加入DMSO各100微升，在微量震蕩器上震蕩10分鐘，至結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔570納米處的吸光值(OD值)。取三孔平均OD值按IR%= ( OD空白對(duì)照-OD樣品)/OD空白對(duì)照xl00。/。式計(jì)算樣品對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率(IR%),并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC5。值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
上述獲得的化合物1和2對(duì)人肺癌細(xì)胞株A-549的半數(shù)抑制濃度IC5Q為2.55, 2.26 ;/M (參見表2)。
表2化合物1和2對(duì)P388腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率濃度mol/Llx10-41x10—1x10"
化合物198.161.32.91.51.0
化合物298.373.56.8U2.7
試驗(yàn)證明可知，化合物1和2對(duì)腫瘤細(xì)胞有增殖抑制作用可作為細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑。
并且從化合物1和2的物化性質(zhì)可知其可溶于甲醇，也可溶于二甲亞砜或二甲亞砜的含水溶液加以利用。因此化合物1或化合物2可作為抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞松弛素類化合物，其特征在于如圖(I)中化合物1或2所示
2. —種權(quán)利要求1所述的細(xì)胞松弛素類化合物的制備方法，其特征在于1 )將球毛殼菌(C7 "e/ow/Mwg/oZ)a^w)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，而后將發(fā)酵液經(jīng)用 有機(jī)溶液提取2-5次，合并提取液進(jìn)行濃縮，獲得發(fā)酵物；2)將步驟1)中的發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇分別進(jìn)行梯度洗脫，洗脫下的每個(gè)組分經(jīng)薄層層析檢測(cè)；所述石油醚-乙酸乙酯梯度范圍為100: 0-0: 100、；氯仿-甲醇梯度范 圍為100: 10—0: 100;3 )將步驟2 )中經(jīng)經(jīng)薄層層析檢測(cè)Rf 0. 3-0. 5的洗脫組分進(jìn)行硅膠柱 層析、凝膠柱層析，再經(jīng)反相柱層析分離純化，而后以甲醇-水80: 20洗 脫，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測(cè)，Rf為O. 38時(shí)即圖(I)中化合物l; Rf為 0. 42時(shí)為圖(I)中化合物2。
3. 按權(quán)利要求2所述的細(xì)胞松弛素類化合物的制備方法，其特征在于 步驟l)中所得的發(fā)酵培養(yǎng)物為菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液用有機(jī)溶劑乙酸乙 酯萃取，菌絲體用可用甲醇、丙酮-水(80-20 )、乙醇或氯仿-甲醇l: l中 一種或幾種萃取，萃取后得到的菌絲體和發(fā)酵液合并得發(fā)酵物。
4. 按權(quán)利要求2所述的細(xì)胞松弛素類化合物的制備方法，其特征在于 所述球毛殼菌(C/2aeto脂'wmg/o6oswm)酵培養(yǎng)，首先將在瓊脂-麥芽膏培養(yǎng) 基中保存的球毛殼菌接種到PDA平板上，在28。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，其次 在平板上取大小為4cm2的菌絲體放入已滅菌盛有300ml液體培養(yǎng)基上靜置 室溫培養(yǎng)30天。
5. 按權(quán)利要求4所述的細(xì)胞松弛素類化合物的制備方法，其特征在于 所述液體培養(yǎng)基為土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L, pH 6. 5。
6. —種權(quán)利要求1所述的細(xì)胞松弛素類化合物的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞松弛素類化合物可作為細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑中應(yīng) 用。
7. —種權(quán)利要求l所述的細(xì)胞松弛素類化合物的應(yīng)用，其特征在于 所述細(xì)胞松弛素類化合物可作為抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物或抗腫瘤藥物中應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑，具體地說是一種細(xì)胞松弛素類化合物及其制備方法和用途。具體化合物1或2如圖(I)中所示，具體制備為將球毛殼菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)即得到，其可作為細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。本發(fā)明細(xì)胞松弛素類化合物從球毛殼菌(Chaetomium globosum)內(nèi)生真菌中通過人工發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)分離純化獲得。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明化合物對(duì)人肺癌細(xì)胞株A-549的半數(shù)抑制濃度IC₅₀分別2.55，2.26μM，具有抗腫瘤活性，可作為細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑。
文檔編號(hào)C07D209/00GK101591288SQ20091001696
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者崔傳明, 李曉明, 王斌貴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所