專利名稱：用固-液相結(jié)合法進(jìn)行單聚乙二醇化胸腺五肽的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用液相和固相相結(jié)合的合成技術(shù)進(jìn)行聚乙二醇化的胸腺五肽的合 成。
背景技術(shù)：
胸腺五肽(Thymopentin，TP5)是一種由5個(gè)氨基酸殘基的人工合成小分子肽，與 內(nèi)源性的胸腺生成素II具有相同的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡的生物活性。對于多種免疫功能紊 亂或低下，TP5都能通過促進(jìn)或抑制的雙向調(diào)節(jié)作用使免疫功能趨于正常。目前，其已廣泛 應(yīng)用于臨床，可用于治療⑴惡性腫瘤；⑵慢性肝炎；⑶手術(shù)及嚴(yán)重感染；⑷糖尿??； (5)自身免疫性疾??；(6)更年期綜合癥；(7)衰老體弱等。但是TP5注射于人體后很快由 蛋白酶和氨肽酶降解，藥物原型的半衰期僅為30秒。然而，TP5治療的疾病一般都需要長 期用藥，而目前可供臨床應(yīng)用的又僅有凍干粉針劑和溶液型注射劑。所以，TP5只能采取頻 繁注射或靜脈滴注的方式給藥，給患者帶來了很大的痛苦和精神壓力。急需要研制新的長 效制劑產(chǎn)品。藥物的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾，即 PEG 化(pegylaytion)是 將活化的聚乙二醇通過化學(xué)方法偶聯(lián)到蛋白質(zhì)、多肽、小分子有機(jī)藥物和脂質(zhì)體上，從而改 進(jìn)藥物的性質(zhì)。使目的藥物在輸送、療效和體內(nèi)半衰期等方面都有顯著改善，從而提高其 臨床價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。1977年Abuchowski等首先應(yīng)用聚乙二醇修飾藥物蛋白(J.Biol. Chem. 252，3582-3586.)，結(jié)果修飾后的蛋白質(zhì)療效優(yōu)于未修飾的原型藥物，其生物半衰期 明顯得到延長。此后，聚乙二醇修飾技術(shù)得到了迅速的發(fā)展并成功地開發(fā)出許多聚乙二醇 修飾的蛋白質(zhì)藥物(或多肽藥物)。

發(fā)明內(nèi)容
胸腺五肽作為一種具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用的藥物，應(yīng)用非常廣泛，具有進(jìn)一步開 發(fā)利用的價(jià)值和研究背景。為了改善其體內(nèi)生物降解速度快，生物半衰期短的問題，本發(fā)明 提供一種采用固相和液相結(jié)合方法合成聚乙二醇化胸腺五肽新技術(shù)。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)a.采用液相合成方法將單甲氧基聚乙二醇修飾物(mPEG-SCM)連接到α氨基保護(hù) 的賴氨酸的側(cè)鏈氨基(ε -NH2)上；反應(yīng)物芴甲氧羰基保護(hù)的賴氨酸鹽酸鹽(Fmoc-lys-OH. HCl)和單甲氧基聚乙二醇修飾物(mPEG-SCM)摩爾比為7 1，反應(yīng)體系為氯仿和二氧六 環(huán)，體積比為1 4 ；，常溫下滴加二異丙基乙胺(N，N' -Diisopropylsilane，簡稱DIEA)， 使PH保持9. 0，磁力攪拌下，反應(yīng)過夜；反應(yīng)體系減壓旋轉(zhuǎn)抽干，反應(yīng)物加水溶解，過濾掉水 不溶物，用透析袋(MW，3500)透析48小時(shí)，冷凍干燥得白色粉末(Fmoc-Iys(PEG)-OH)；反應(yīng)方程式如下 b.采用固相合成法合成聚乙二醇化的胸腺五肽，具體步驟如下①Fmoc-Tyr (tBu) -Wang樹脂加入到二氯甲烷(DCM))浸泡30分鐘，真空泵抽干， 二甲基甲酰胺(DMF)洗滌，洗三次，每次三分鐘；用含20%哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液 機(jī)械攪拌0. 5小時(shí)，脫Fmoc保護(hù)基；二甲基甲酰胺(DMF)溶液洗三次，每次三分鐘；加入5% 茚三酮醇溶液茚檢試劑，沸水中加熱三分鐘，顯藍(lán)色；②將Fmoc保護(hù)的纈氨酸(Fmoc-Val-OH)、苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六 氟磷酸酯(HBTU)U-羥基苯并三唑(HoBt)分別溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，加二異丙基乙 胺(DIEA)啟動活化酯；反應(yīng)常溫下進(jìn)行，體系用氬氣保護(hù)，F(xiàn)moc-Arg(OtBu)-OH使用量為 Fmoc-Tyr (tBu)-Wang樹脂的2. 5 3倍，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和1-羥基苯并 三唑(HoBt)為氨基酸的2倍，二異丙基乙胺(DIEA)為氨基酸的2倍，啟動后將體系加入到 已加入處理好樹脂的固相合成儀中，機(jī)械攪拌45分鐘，用二甲基甲酰胺(DMF)沖掉壁上的 樹脂，再攪拌15分鐘后抽；二甲基甲酰胺(DMF)溶液洗三次，每次三分鐘；茚檢試劑檢測無 色，至此一個(gè)循環(huán)完成；③再分別以Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Lys (PEG) -OH,和 Fmoc-Arg (pbf) -OH 為 氨基酸原料，重復(fù)以上①、②步驟，順次完成mPEG-TP5的合成，得產(chǎn)物，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為 H-Arg-Lys(mPEG)-Asp-Val-Tyr-OH ；④按上述b①脫Fmoc保護(hù)，茚檢試劑檢測呈藍(lán)色，體系用二氯甲烷(DCM)先洗2 次，甲醇(MeOH)洗一次，每次三分鐘；再用二氯甲烷(DCM)洗1次，MeOH洗2次，每次三分 鐘；移開攪拌器，用膠塞密封合成儀上端，用循環(huán)水式多用真空泵(SHB-III)抽2小時(shí)，加入 切割試劑，反應(yīng)3小時(shí)，每隔15分鐘機(jī)械攪拌1分鐘，收集切割劑，再用三氟乙酸(TFA)洗 滌2次，合并切割劑與三氟乙酸(TFA)，體系在40°C下，減壓旋轉(zhuǎn)抽干，加20%冰醋酸的水溶 液溶解，凍干；用雙蒸水將凍干粉溶解，過濾掉水不溶物，透析48小時(shí)(透析袋，MW, 3500)， 凍干；反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)進(jìn)行進(jìn)一步純化，洗脫液為含有0. 1% TFA的乙腈和 水。反應(yīng)方程式如下 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和產(chǎn)生的有益效果1、本發(fā)明先采用液相合成技術(shù)將修飾化的聚乙二醇(mPEG-SCM)連接到氨基保護(hù) 的賴氨酸側(cè)鏈氨基上；再采用固相合成技術(shù)合成mPEG-TP5。通過透析、高效液相進(jìn)行分析 和純化，合成具有潛在長效作用的聚乙二醇化的胸腺五肽。該復(fù)合物結(jié)構(gòu)上不易被體內(nèi)蛋白酶水解，由于分子量大，可降低腎清除率，大大延 長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，從而達(dá)到顯著延長半衰期、提高生物利用度的目的。
2、本發(fā)明提供的一種采用固相和液相相結(jié)合的方法，合成具有潛在長效作用的 mPEG-TP5。目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確，合成路線成熟，穩(wěn)定。本發(fā)明提供的合成和分析純化方法操 作相對簡單，所需成本低。有較好的大規(guī)模生產(chǎn)基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明合成產(chǎn)物的MALDI-T0F質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式一種用固-液相法合成聚乙二醇化胸腺五肽的方法，其步驟分為a.采用液相合成方法將單甲氧基聚乙二醇修飾物(mPEG-SCM)連接到a氨基保護(hù) 的賴氨酸的側(cè)鏈氨基(￡ "NH2)上；400mg芴甲氧羰基保護(hù)的賴氨酸鹽酸鹽(Fmoc-lys-OH. HC1)與700mg單甲氧基聚乙二醇修飾物(mPEG-SCM)反應(yīng)，反應(yīng)體系為6ml氯仿和24ml 二 氧六環(huán)；，常溫下滴加二異丙基乙胺(N，N-Diisopropylsilane，簡稱DIEA)800iil，使PH保 持9. 0，磁力攪拌，反應(yīng)過夜；反應(yīng)體系減壓旋轉(zhuǎn)抽干，反應(yīng)物加40mL水溶解，過濾掉水不溶 物，用透析袋(麗，3500)透析48小時(shí)，冷凍干燥得白色粉末600mg (Fmoc-lys (PEG) -OH)，產(chǎn) 率 78. 5%。產(chǎn)物核磁數(shù)據(jù)如下1H-NMR(DMS0) 7. 31-7. 77 (8H, Fmoc-aromatics)，0. 85 (2H, _0CH2CH2_)， 3. 60(3H，-0CH3)。HPLC檢測mPEG_SCM (紫外下沒有吸收)，F(xiàn)moc-lys_0H 'HCKt^ 17. 06)， 產(chǎn)物(tK = 20. 35)。通過核磁和HPLC的判斷，可知產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為FmOC-Lys(PEG)-0H。b.采用固相合成法合成聚乙二醇化的胸腺五肽，具體步驟如下①Fmoc-Tyr (tBu) -Wang樹脂0. 2g用二氯甲烷10ml (DCM))浸泡30分鐘，然后用 真空泵抽干，用二甲基甲酰胺(DMF)5ml洗滌，共三次，每次三分鐘；用含20%哌啶的DMF溶 液15ml機(jī)械攪拌0. 5小時(shí)，脫Fmoc保護(hù)基；5mlDMF溶液洗三次，每次三分鐘；加入4滴5% 茚三酮醇溶液(茚檢試劑)，沸水中加熱三分鐘，顯藍(lán)色。②將Fmoc-Val-0H 75. 34mg、苯并三氮唑_N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸 酯(HBTU) 84. 14mg、1-羥基苯并三唑(HoBt) 30mg分別溶解于DMF，加二異丙基乙胺 73.4ul(DIEA)啟動活化酯；反應(yīng)常溫下進(jìn)行，體系用氬氣保護(hù)，啟動后將體系加入到已加 入處理好樹脂的固相合成儀中，機(jī)械攪拌45分鐘，用二甲基甲酰胺(DMF) 2ml沖掉壁上的樹 脂，再攪拌15分鐘后抽；二甲基甲酰胺(DMF)溶液5ml洗三次，每次三分鐘；茚檢試劑檢測 無色，至此一個(gè)循環(huán)完成。③分別以Fmoc-Asp (OtBu) -OH 91. 35mg, Fmoc-Lys (PEG) -OH 588mg(l. 5 倍過量)， Fmoc-Arg(pbf)-0H 144mg為氨基酸原料，重復(fù)以上步驟，順次完成mPEG_TP5的合成，得目 標(biāo)產(chǎn)物。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為H-Arg-Lys(mPEG)-Asp-Val-Tyr-OH。④按上述b(l)脫Fmoc保護(hù)，茚檢試劑檢測呈藍(lán)色，體系用二氯甲烷(DCM) 5ml先 洗2次，甲醇(Me0H)5ml洗一次，每次三分鐘；再用二氯甲烷(DCM) 5ml洗1次，Me0H5ml洗 2次，每次三分鐘；移開攪拌器，用膠塞密封合成儀上端，用循環(huán)水式多用真空泵(SHB-III) 抽2小時(shí)，加入切割試劑10ml。切割試劑配比為三氟乙酸(TFA)雙蒸水三異丙基硅 烷=95 2.5 2. 5，反應(yīng)3小時(shí)，每隔15分鐘機(jī)械攪拌1分鐘，收集切割劑，再用三氟乙
7酸(TFA) 5ml洗滌2次，合并切割劑與三氟乙酸(TFA)，體系在40°C下，減壓旋轉(zhuǎn)抽干，加5ml 20%冰醋酸的水溶液溶解，凍干；用雙蒸水5ml將凍干粉溶解，過濾掉水不溶物，透析48小 時(shí)(透析袋，MW，3500)，凍干。反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)進(jìn)行進(jìn)一步純化，洗脫液為 含有0. TFA的乙腈和水。得白色狀粉末8. 2mg，產(chǎn)物總產(chǎn)率2%。合成的目標(biāo)產(chǎn)物經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜測分子量和氨基酸測序儀進(jìn)行測序 (見圖 1、表 1)，判斷產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為 H-Arg-Lys (mPEG)-Asp-Val-Tyr-OH。表1 上?；瞪锛夹g(shù)有限公司出具的氨基酸N端測序結(jié)果如下表 表1說明所測氨基酸數(shù)目及序列(從N端到C端)共5個(gè)，樣品第二個(gè)氨基酸被 修飾。
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權(quán)利要求
一種用固-液相法合成聚乙二醇化胸腺五肽的方法，其步驟分為a.采用液相合成方法將單甲氧基聚乙二醇修飾物(mPEG-SCM)連接到α氨基保護(hù)的賴氨酸的側(cè)鏈氨基(ε-NH2)上；反應(yīng)物芴甲氧羰基保護(hù)的賴氨酸鹽酸鹽(Fmoc-lys-OH.HCl)和單甲氧基聚乙二醇修飾物(mPEG-SCM)摩爾比為7∶1，反應(yīng)體系為氯仿和二氧六環(huán)，體積比為1∶4；，常溫下滴加二異丙基乙胺(N，N’-Diisopropylsilane，簡稱DIEA)，使PH保持9.0，磁力攪拌下，反應(yīng)過夜；反應(yīng)體系減壓旋轉(zhuǎn)抽干，反應(yīng)物加水溶解，過濾掉水不溶物，透析48小時(shí)，冷凍干燥得白色粉末(Fmoc-lys(PEG)-OH)；b.采用固相合成法合成聚乙二醇化的胸腺五肽，具體步驟如下①Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂加入到二氯甲烷(DCM))浸泡30分鐘，真空泵抽干，二甲基甲酰胺(DMF)洗滌，洗三次，每次三分鐘；用含20％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液機(jī)械攪拌0.5小時(shí)，脫Fmoc保護(hù)基；二甲基甲酰胺(DMF)溶液洗三次，每次三分鐘；加入5％茚三酮醇溶液茚檢試劑，沸水中加熱三分鐘，顯藍(lán)色；②將Fmoc保護(hù)的纈氨酸(Fmoc-Val-OH)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、1-羥基苯并三唑(HoBt)分別溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，加二異丙基乙胺(DIEA)啟動活化酯；反應(yīng)常溫下進(jìn)行，體系用氬氣保護(hù)，F(xiàn)moc-Arg(OtBu)-OH使用量為Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂的2.5～3倍，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和1-羥基苯并三唑(HoBt)為氨基酸的2倍，二異丙基乙胺(DIEA)為氨基酸的2倍，啟動后將體系加入到已加入處理好樹脂的固相合成儀中，機(jī)械攪拌45分鐘，用二甲基甲酰胺(DMF)沖掉壁上的樹脂，再攪拌15分鐘后抽；二甲基甲酰胺(DMF)溶液洗三次，每次三分鐘；茚檢試劑檢測無色，至此一個(gè)循環(huán)完成；③再分別以Fmoc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(PEG)-OH，和Fmoc-Arg(pbf)-OH為氨基酸原料，重復(fù)以上①、②步驟，順次完成mPEG-TP5的合成，得產(chǎn)物，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為H-Arg-Lys(mPEG)-Asp-Val-Tyr-OH；④按上述b①脫Fmoc保護(hù)，茚檢試劑檢測呈藍(lán)色，體系用二氯甲烷(DCM)先洗2次，甲醇(MeOH)洗一次，每次三分鐘；再用二氯甲烷(DCM)洗1次，MeOH洗2次，每次三分鐘；移開攪拌器，用膠塞密封合成儀上端，用循環(huán)水式多用真空泵(SHB-III)抽2小時(shí)，加入切割試劑，反應(yīng)3小時(shí)，每隔15分鐘機(jī)械攪拌1分鐘，收集切割劑，再用三氟乙酸(TFA)洗滌2次，合并切割劑與三氟乙酸(TFA)，體系在40℃下，減壓旋轉(zhuǎn)抽干，加20％冰醋酸的水溶液溶解，凍干；用雙蒸水將凍干粉溶解，過濾掉水不溶物，用透析袋透析48小時(shí)，凍干；反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)進(jìn)行進(jìn)一步純化，洗脫液為含有0.1％TFA的乙腈和水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用固-液相相結(jié)合法合成聚乙二醇化胸腺五肽(mPEG-TP5)的方法。首先采用液相合成技術(shù)將修飾化的聚乙二醇(mPEG-SCM)連接到氨基保護(hù)的賴氨酸側(cè)鏈氨基上；再采用固相合成技術(shù)合成mPEG-TP5。通過透析、高效液相進(jìn)行分析和純化；通過核磁、質(zhì)譜進(jìn)行產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定。本發(fā)明合成的聚乙二醇化胸腺五肽改善了原母體藥物胸腺五肽的生物降解速度快，酶解穩(wěn)定性差，生物半衰期短等缺點(diǎn)，具有很高的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K17/08GK101870732SQ200910022329
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日
發(fā)明者倪京滿, 李倩, 王銳, 王長林 申請人:蘭州大學(xué)