專利名稱：一種以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過氧化氫酶和輔酶a丙酮粉的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過氧化氫酶和輔酶A丙酮粉的 工藝，屬生物活性物質(zhì)的分離提取技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
過氧化氫酶(Catalase， CAT),是一種高效、安全、環(huán)保、節(jié)能的生物催化 劑，可迅速的將過氧化氫分解為水和氧，在紡織、食品等工業(yè)中具有廣泛的用 途。目前市售的過氧化氫酶主要來源有三個(gè)從豬、牛等動(dòng)物肝臟中提取純化 而得；由變種黑曲霉在通風(fēng)攪拌等條件下培養(yǎng)而得；由纖維蛋白小球菌經(jīng)深層 發(fā)酵提取精致而得。2004年后，國內(nèi)從豬、牛等動(dòng)物肝臟中提取生產(chǎn)過氧化氫 酶的關(guān)鍵技術(shù)有了很大突破。因?yàn)槌杀竞蛢r(jià)格上的優(yōu)勢，發(fā)展很快。目前，用 該方法生產(chǎn)的過氧化氫酶因?yàn)閮r(jià)格上的優(yōu)勢，在紡織印染行業(yè)占領(lǐng)了大部分的 市場份額。
在紡織行業(yè)中，CAT應(yīng)用于紡織品氧漂后的生物脫氧凈化工藝，能在大幅度 節(jié)約水和能源的情況下，清除氧漂后織物和水浴中對后續(xù)活性染料染色可能產(chǎn) 生染料分解或染色疵病的殘留過氧化氫，縮短工序時(shí)間，提高染色質(zhì)量，減少 印染廢水排放。該酶也適用于賓館、醫(yī)院、洗衣房等使用過氧化氫進(jìn)行漂白或 消毒的紡織品，以防止由于織物中殘留過氧化氫的存在而造成使用者皮膚過敏、 引發(fā)炎癥等不良后果，減少有害廢水的排放，可避免織物氧化脆損，從而延長 使用期限
在食品工業(yè)中，CAT能迅速有效地分解食品加工后殘留過氧化氫(雙氧水)， 適用于在食品加工過程中使用過氧化氫(雙氧水)作為漂白劑、氧化劑、淀粉變 性劑、防腐劑的食品除氧，可用于紙塑無菌包裝材料殺菌后在包裝之前的除氧； 以及用于消除牛奶、蛋制品、干酪等生產(chǎn)中因紫外線照射產(chǎn)生過氧化氫而造成 的特異臭味，是一種用于食品加工的新型除氧酶；產(chǎn)品也可用作烘焙食品的膨 松劑；具有保護(hù)食品營養(yǎng)物質(zhì)不被過氧化氫破壞，避免因過氧化氫隨食品進(jìn)入 人體內(nèi)造成對人體傷害的作用。
目前，CAT已經(jīng)得到廣泛的普及應(yīng)用，國內(nèi)市場需求量在紡織行業(yè)已經(jīng)達(dá)到 每年1萬噸以上；在食品行業(yè)也已達(dá)到近千噸的需求量，且隨著對食品安全嚴(yán) 格要求和過氧化氫酶應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓寬，這個(gè)量還在成倍地增長。CAT酶為節(jié) 能減排，減少紡織、食品行業(yè)的環(huán)境污染做出了積極的貢獻(xiàn)。隨著我國產(chǎn)業(yè)調(diào) 整的力度不斷加大，環(huán)境保護(hù)政策的落實(shí)到位，作為紡織行業(yè)和食品行業(yè)實(shí)現(xiàn) 清潔生產(chǎn)的必需產(chǎn)品之一，CAT的市場需求量將進(jìn)一步加大。事實(shí)上提取CAT時(shí)所用原料---動(dòng)物的肝臟中，除了CAT之外，還有輔酶A、 促肝細(xì)胞生長素、肝肽、人體必需氨基酸、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等許多可供開發(fā)利用的 附加值極高的生物活性因子。
輔酶A是廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物組織細(xì)胞的一種天然生化物質(zhì)。 輔酶A在動(dòng)物的肝臟中的含量最高，心臟、腎上腺次之。它是體內(nèi)乙酰化酶的 輔酶，起著傳遞乙?；淖饔?，對糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的代謝起重要作用。20世 紀(jì)50年代其化學(xué)結(jié)構(gòu)得到闡明，60年代由基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)引入臨床醫(yī)學(xué)研究。目前輔 酶A及其前體物質(zhì)泛酸、泛硫乙胺的臨床應(yīng)用及營養(yǎng)保健作用已得到廣泛重視 和使用。
輔酶A可供應(yīng)能量，是促進(jìn)細(xì)胞代謝的藥物，在許多疾病中作為綜合治療 的一部分。從生化代謝來看，基本上是屬于提高機(jī)體抗病能力的一種積極措施。 輔酶A主要用于治療白細(xì)胞減少癥，原發(fā)性血小板減少性紫癜，功能性低熱等； 對脂肪肝、肝昏迷、各種肝炎、冠狀動(dòng)脈硬化及慢性腎機(jī)能不全引起的急性無 尿、腎病綜合征、尿毒癥等可作為輔助治療藥物；配合ATP、胰島素和細(xì)丙使用 時(shí)對心肌梗塞、新生兒缺氧、糖尿病引起的酸中毒癥等也有一定效果。 一般可 增進(jìn)食欲、增強(qiáng)體質(zhì)、減弱疾病惡化和縮短病程。
目前國內(nèi)外常用的生產(chǎn)輔酶A的方法有動(dòng)物組織提取法和微生物經(jīng)深層液 體發(fā)酵后提取法。從豬肝中提取輔酶A是較成熟的工藝。
本發(fā)明是在提取過氧化氫酶時(shí)，通過分析檢測及摸索發(fā)現(xiàn)工藝中產(chǎn)生的 廢水、廢渣經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚恚梢蕴崛≡S多種對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)。利用豬 肝提取輔酶A工藝成熟。本發(fā)明是將現(xiàn)有的提取過氧化氫酶工藝中產(chǎn)生的廢 水、廢渣加工成生化原料藥，從而聯(lián)產(chǎn)高出附加值的輔酶A丙酮粉。本發(fā)明的 意義在于，分離提取過氧化氫酶的同時(shí)，聯(lián)產(chǎn)其它高附加值產(chǎn)品，不但提高了 原料的利用率，而且在消除廢水和廢渣的同時(shí)實(shí)現(xiàn)企業(yè)的增值和增收，形成可 實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益與資源環(huán)境效益共贏。該新工藝國內(nèi)外尚未見任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明發(fā)明了一種以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過氧化氫酶和輔酶A丙酮粉 的工藝。尤為獨(dú)特的是，它充分考慮了原料的充分利用和"三廢"減排對過氧 化氫酶加工生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展的意義，在不影響過氧化氫酶的得率和品質(zhì)的前 提下，對現(xiàn)有加工工藝所產(chǎn)生的廢水廢渣進(jìn)行了綜合利用，通過聯(lián)產(chǎn)生化藥物 原料，對動(dòng)物肝臟原料進(jìn)行全利用，達(dá)到了既不影響過氧化氫酶的得率和品質(zhì)， 實(shí)現(xiàn)廢渣廢水廢渣零排放的目的，又能形成一套以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過 氧化氫酶和輔酶A丙酮粉的工藝。這對于過氧化氫酶加工制造業(yè)的可持續(xù)發(fā)展
而言是至關(guān)重要的。輔酶A在動(dòng)物的肝臟中的含量最高。動(dòng)物肝臟提取了過氧化氫酶后剩余部 分廢水，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)富含大量的人體必需氨基酸和各種具有保肝作用的肽類活 性因子及輔酶A，按照從豬肝中提取輔酶A的成熟工藝來操作，即可得到目的產(chǎn) 物——輔酶A。
具體來說，本發(fā)明的步驟由以下幾步構(gòu)成
1) 原料的準(zhǔn)備
將檢驗(yàn)合格的原料切碎后經(jīng)膠體磨磨成肝漿；
2) 溶液浸泡
將肝漿與一定比例的純凈水混勻后在一定的溫度下浸泡一定的時(shí)間，使目
的產(chǎn)物自溶于溶液中；
3) 固液分離
用適當(dāng)?shù)姆蛛x方式進(jìn)行固液分離，分別得到液體——提取原液和固體廢渣；
4) 過氧化氫酶的分離提取-
將得到的提取原液通過適當(dāng)?shù)哪し蛛x設(shè)備進(jìn)行提取，并根據(jù)工藝要求濃縮 至適當(dāng)?shù)拿富顔挝?。分別得到膜分離截留液——目的產(chǎn)物之一，過氧化氫酶和 膜透過液；
5) 輔酶A原料液的準(zhǔn)備
將膜分離后的透過液及步驟3得到的固體收集在適當(dāng)?shù)膬?chǔ)罐中，加熱煮沸， 保溫一定時(shí)間后冷卻，固液分離，將液體作為提取輔酶A的原液；
6) 輔酶A濃集液制備
使提取輔酶A的原液以一定的流速流入填裝了 GMA型樹脂的離子交換柱，
并使樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)；再用一定樹脂體積倍數(shù)的鹽酸-氯化鈉溶液，以一定的 流速洗脫輔酶A，直至流出液pH降至2-3，收集洗脫液，得到輔酶A濃集液；
7) 輔酶A精制液制備-
使輔酶A濃集液以一定的流速流入填裝了 LD-601型樹脂的離子交換柱，并 使樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)；先后用PH為3的硝酸液、乙醇氨液洗滌并洗脫，收集洗 脫液，得到輔酶A精制液；
8) 真空濃縮、酸化去雜
將輔酶A精制液濃縮至一定的體積，再用稀硝酸酸化至pH2. 5，靜置過夜后， 去除不溶雜質(zhì)；
9) 輔酶A丙酮粉的獲得
將清液在攪拌下逐漸加入一定體積的PH2. 5-3. 0的酸性丙酮，離心分離得 到沉淀物，將沉淀物用適當(dāng)?shù)姆绞礁稍?，即得目的產(chǎn)物之二——輔酶A丙酮粉。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。
實(shí)例l
1) 原料的準(zhǔn)備
取檢驗(yàn)合格的20kg豬肝去除包膜切碎，用無菌蒸餾水反復(fù)洗滌2-3次，用 膠體磨磨成豬肝槳；
2) 溶液浸泡
向肝漿中加入80kg純凈水混勻后儲(chǔ)于提取罐中，在28-32"的溫度下浸泡 6-9小時(shí)，使目的產(chǎn)物自溶于溶液中；
3) 固液分離
離心分離，得到大約70L液體，26kg固體廢渣；
4) 過氧化氫酶的分離提取
將得到的液體通過40KDa中空纖維膜超濾膜膜進(jìn)行分離提取，并根據(jù)工藝 要求濃縮，得到39L酶活單位為52， 000U/mL的過氧化氫酶液；
5)輔酶A原料液的準(zhǔn)備-
將膜分離后的透過液及固體廢渣收集在儲(chǔ)罐中，加熱煮沸，保溫15-20分 鐘后冷卻，離心分離得到提取清液32L，固體20kg;
6) 輔酶A濃集液制備
使提取清液以2. 5L/分鐘的流速流入填裝了 GMA型樹脂的離子交換柱，并使 樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)；再用100L鹽酸-氯化鈉溶液，以2L/分鐘的流速洗脫輔酶A, 直至流出液降至pH2-3，收集洗脫液，得到輔酶A濃集液94L;
7) 輔酶A精制液制備
使輔酶A濃集液以5%的流速流入填裝了 LD-601型樹脂的離子交換柱，并使 樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)；先用17LpH為3的硝酸液洗滌除鹽，再用50L乙醇氨液洗 脫，收集洗脫液，得到輔酶A精制液42L;
8) 真空濃縮、酸化去雜
將輔酶A精制液濃縮至2. 5L，再用稀硝酸酸化至pH2.5，靜置過夜后，去 除不溶雜質(zhì)；
9) 輔酶A丙酮粉的獲得
將清液在攪拌下逐漸加入25L PH2. 5-3.0的酸性丙酮，離心分離得到沉淀 物，將沉淀物真空干燥，即得目的產(chǎn)物之二——輔酶A丙酮粉562g。實(shí)例2
取5g輔酶A丙酮粉，溶于100mL水中，減壓蒸餾去除丙酮后進(jìn)行檢測試驗(yàn):
1)性狀檢査微黃色粉末，有類似蒜的臭氣，有引濕性，易溶于生理鹽水， 在乙醇、乙醚和丙酮中不溶；
2) 純度測定
按照磷酸轉(zhuǎn)乙?；阜y定(PTA法)，純度達(dá)50 55%;
3) 鑒別
取本品制成每lmL中含輔酶A約10單位的溶液，照分光光度法測定，在 258nm的波長處有最大吸收，在230nm波長處有最小吸收；
4) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
向家兔按每1公斤注射lmL，符合藥典規(guī)定。 以上實(shí)例可以證明用本發(fā)明聯(lián)產(chǎn)的目的產(chǎn)物品質(zhì)良好，有推廣應(yīng)用的前景。
權(quán)利要求
1、一種以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過氧化氫酶和輔酶A丙酮粉的工藝。該工藝組成步驟如下1)對動(dòng)物肝臟進(jìn)行切碎、磨漿、浸泡提取、固液分離，得到料液和料渣；2)將料液進(jìn)行膜分離和濃縮，得到膜濃縮液和膜透過液；3)將膜濃縮液的酶活力單位調(diào)整到規(guī)定要求，即得過氧化氫酶成品；4)將膜透過液和固體廢渣合并，加熱煮沸并保持一定時(shí)間，固液分離后得輔酶A提取原液；5)將輔酶A提取原液以一定的流速流入填裝了GMA型樹脂的離子交換柱，并使樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)；再用一定樹脂體積倍數(shù)的鹽酸-氯化鈉溶液，以一定的流速洗脫輔酶A，直至流出液pH降至2-3，收集洗脫液，得到輔酶A濃集液；6)使輔酶A濃集液以一定的流速流入填裝了LD-601型樹脂的離子交換柱，并使樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)；先后用pH為3的硝酸液、乙醇氨液洗滌并洗脫，收集洗脫液，得到輔酶A精制液；7)將輔酶A精制液濃縮至一定的體積，再用稀硝酸酸化至pH2.5，靜置過夜后，去除不溶雜質(zhì)；8)將清液在攪拌下逐漸加入一定體積的pH2.5-3.0的酸性丙酮，離心分離得到沉淀物，將沉淀物用適當(dāng)?shù)姆绞礁稍铮吹媚康漠a(chǎn)物之二——輔酶A丙酮粉。
2、 ，如權(quán)利要求1所述，其特征是分離提取輔酶A丙酮粉的原料是提取過氧化 氫酶后的廢水和廢渣。
3、 如權(quán)利要求l所述，其特征是原料可以是含過氧化氫酶的各種動(dòng)物肝臟。
4、 如權(quán)利要求l所述，其特征是浸泡提取的溶液可以是水或各種有機(jī)溶劑。
5、 如權(quán)利要求l所述，其特征是固液分離可以是離心分離、過濾分離或他們的 組合。
6、 如權(quán)利要求l所述，其特征是所采用的膜為截留分子量20-60KDa的超濾膜， 膜組件的構(gòu)型是管式膜、巻式膜、平板膜、中空纖維膜或它們的組合。
7、 如權(quán)利要求l所述，其特征是輔酶A丙酮的干燥方式可以是真空干燥、噴霧 干燥、冷凍干燥或是它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明屬生物活性物質(zhì)的分離提取技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種從提取過氧化氫酶后的廢水、廢渣中提取輔酶A丙酮粉的工藝。本工藝適用于以動(dòng)物肝臟為原料，經(jīng)細(xì)胞破碎、溶液浸泡、固液分離，膜分離后得到過氧化氫酶產(chǎn)品；再將廢水、廢渣經(jīng)過加熱、固液分離、離子交換、真空濃縮、酸化去雜、丙酮沉淀、干燥，最后得到輔酶A丙酮粉。本發(fā)明充分利用了原料，不但從中提取了過氧化氫酶，而且聯(lián)產(chǎn)了生化藥的原料-輔酶A丙酮粉。不但拓寬了生化藥物的來源，又增加了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，具有極好的推廣前景。按照本發(fā)明操作，以豬肝為例，每加工1kg豬肝能夠獲得50,000U/mL液體過氧化氫酶2L，同時(shí)獲得純度在50％以上輔酶A丙酮粉28g。
文檔編號C07H19/00GK101560505SQ20091002711
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日
發(fā)明者馮志強(qiáng), 吳保承, 棟 張, 楊春霞 申請人:江蘇省江大綠康生物工程技術(shù)研究有限公司