專利名稱：一種殘殺威人工抗原及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種殘殺威人工抗原及其合成方法，屬于有機(jī)化學(xué)及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。 本發(fā)明合成的殘殺烕人工抗原用于制備特異性識別化學(xué)農(nóng)藥殘殺烕的抗體和研 制高效快速檢測殘殺威含量的免疫速測試劑盒。
背景技術(shù)：
殘殺威(Propoxur)屬于氨基甲酸酯類化學(xué)殺蟲劑，是世界衛(wèi)生組織(WHO) 批準(zhǔn)并推薦的家庭衛(wèi)生害蟲防治的四個(gè)氨基甲酸酯類殺蟲劑之一。由德國拜耳 公司首先開發(fā)成功，國家"七五"引進(jìn)品種。殘殺威制劑主要用于經(jīng)濟(jì)作物害 蟲防治(如棉蚜、菜蚜等)，以及消滅家庭及公共場所的各種衛(wèi)生害蟲(蚊、蠅、 蟑螂等)，具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，擊倒快，持效期長，且殺蟲譜廣、殘效 長、殺死率高等特點(diǎn)。目前國內(nèi)已有廠家進(jìn)行原藥和制劑的大規(guī)模生產(chǎn)并得到 很好的推廣。
國內(nèi)外對殘殺威檢測方法進(jìn)行了眾多研究。文獻(xiàn)報(bào)道的對殘殺威有效成分 檢測方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層層析法等，但是這些傳統(tǒng)的檢 測方法需要昂貴的設(shè)備、專門的操作人員、樣品處理復(fù)雜、成本高、時(shí)間長， 不能滿足快速簡便的現(xiàn)場檢測要求和大面積推廣使用。而酶聯(lián)免疫分析方法 (ELISA)由于具有特異、敏感、簡單、快速、費(fèi)用低及樣品純化要求低等優(yōu)點(diǎn)， 在農(nóng)藥殘留分析中顯示了廣闊的應(yīng)用前景。
由于大多數(shù)農(nóng)藥為小分子物質(zhì)(分子量小于1000)，本身不具有免疫原性(稱 為半抗原)，必須與大分子載體偶聯(lián)制備人工抗原，才能誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生。 為此，必須設(shè)法先將農(nóng)藥小分子與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備出農(nóng)藥人工抗原。然而 殘殺威分子不能直接通過雙功能交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)，需要先通過化學(xué)反 應(yīng)在農(nóng)藥分子上引入活性功能團(tuán)，以此作為半抗原，再使之與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。因 此半抗原的設(shè)計(jì)、合成是建立殘殺威酶聯(lián)免疫分析方法的關(guān)鍵所在。
關(guān)于殘殺威半抗原的合成，目前只有Maria J. Moreno (J . Agric . Food Chem. 2001， 49， 72-78)等人在2001年報(bào)道的一種合成方法，他們用鄰-異丙氧基苯 酚與劇毒品光氣反應(yīng)制備鄰-異丙氧苯氧甲酰氯，進(jìn)而與Y-丁胺酸反應(yīng)制備半抗 原，反應(yīng)式如下該半抗原合成方法中使用到劇毒性物質(zhì)光氣，而且反應(yīng)條件較為苛刻，這 將成為殘殺威試劑盒的研制與大批量生產(chǎn)難以突破的瓶頸。再者殘殺威苯環(huán)上 N-甲基氨基甲酸酯鍵作為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的特征結(jié)構(gòu)，而上述半抗原的合成
恰恰是從該特征結(jié)構(gòu)一端引入活性基團(tuán)羧基，這勢必將會給后期的ELISA分析
中帶來一定的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的殘殺威人工抗原及其合成方法，為進(jìn)一步研 究殘殺威的酶聯(lián)免疫殘留分析法提供了試驗(yàn)手段。
本發(fā)明在未破壞殘殺威母體結(jié)構(gòu)情況下，在苯環(huán)上順利地引入活性基團(tuán)氨 基(-NH2)，制備出半抗原Hapten 1，繼而在氨基上延長連接臂引入4個(gè)碳的羧 酸基團(tuán)(-COOH)，制備出半抗原Hapten 2。通過簡單的3步反應(yīng)，制備出了具 有不同的活性基團(tuán)、不同的連接臂長的兩種半抗原，而且反應(yīng)條件溫和，操作
其次，具有不同活性基團(tuán)的半抗原Hapten 1與Hapten 2可以與不同的載體 蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備人工抗原。在本發(fā)明中，選用最為常用且理化性質(zhì)穩(wěn)定、廉價(jià) 易得的牛血清白蛋白(BSA)作為載體蛋白分別與半抗原Hapten 1及Hapten 2 通過重氮法及混合酸酐法成功偶聯(lián)，制備出人工抗原1與人工抗原2。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種殘殺威半抗原，以殘殺威2-(l-異丙氧基)苯基甲基 氨基甲酸酯為原料，依次進(jìn)行硝化反應(yīng)，還原反應(yīng)，制得殘殺威半抗原Hapten 1， 然后對Hapten 1酰化制得殘殺威半抗原Hapten 2;
所述殘殺威半抗原Hapten 1 ，化學(xué)名稱為2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨 基甲酸酯；
及所述殘殺威半抗原Hapten 2，化學(xué)名稱為4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲 酸酯基)苯胺基]-4-羰基丁酸。
一種殘殺威人工抗原，用所述的殘殺威半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)而得的 產(chǎn)物；
殘殺威人工抗原1，其化學(xué)名稱為2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸 酯-牛血清白蛋白，簡稱為抗原Hapten 1-BSA;
及殘殺威人工抗原2，其化學(xué)名稱為4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯基) 苯胺基]-4-羰基丁酸-牛血清白蛋白，簡稱為抗原Hapten 2-BSA。
所述的殘殺威半抗原的制備方法，制備殘殺威半抗原Hapten 1及殘殺威半 抗原Hapten 2:
以殘殺威為原料，依次進(jìn)行硝化反應(yīng)，還原反應(yīng)，制得殘殺威半抗原 Haptenl，然后對Hapten 1酰化制得殘殺威半抗原Hapten 2;其合成路線如下
5A hw' PdyC'H o
CH3
HaC' 、CH3 柳2bU
(1) (2) Hapten1
a) 、 2-異丙氧基-5-硝基苯基-N-甲基氨基甲酸酯的合成在100mL三頸燒瓶 中，加入20.9g殘殺威，40mL的濃硫酸，30mL的濃硝酸，80。C下保溫反應(yīng)3h， 反應(yīng)液倒入冰水中，抽濾，固體用乙醇重結(jié)晶，得到針狀結(jié)晶2-異丙氧基-5-硝 基苯基-N-甲基氨基甲酸酯；
b) 、 2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯Hapten 1的合成稱取2-異丙氧基-5-硝基苯基-N-甲基氨基甲酸酯5.0g溶于50mL甲醇中，攪拌下加入 0.5g Pd/C催化劑[vKPd"10X工業(yè)品]，通入氫氣，室溫反應(yīng)8h，抽濾，減壓蒸 餾，甲醇重結(jié)晶得片狀晶體2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯Hapten 1;
及c)、 4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯基)苯胺基]-4-羰基丁酸Hapten 2 的合成稱取4.48g 2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯Hapten 1， 2.1g 丁二酸酐于反應(yīng)瓶中，無水吡啶lOOmL攪拌溶解，N2保護(hù)，5(TC下反應(yīng)6h，反 應(yīng)液減壓蒸餾，得土灰色粘稠物質(zhì)；
粘稠物用質(zhì)量濃度10。/。的NaHC03溶液溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH2，析 出絮狀固體，乙酸乙酯重結(jié)晶，得白色固體4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯 基)苯胺基]-4-羰基丁酸Hapten 2。
所述的殘殺威人工抗原1的制備方法，
按下述化學(xué)反應(yīng)式進(jìn)行殘殺威人工抗原1的合成
Y0、
廣1'人 Me、—
人工抗原l
稱取22.4mg殘殺威半抗原Hapten 1于50rnL的燒瓶中，加入4mL DMF溶 解，再加入0.5M HCl溶液2mL和0.1MNaNO2溶液1.2mL，4。C下攪拌反應(yīng)30min， 燒瓶中加入3.6mg尿素，繼續(xù)攪拌5min，得殘殺威半抗原Hapten 1重氮化組分;
稱取240mg牛血清白蛋白溶解于30mL 0.15M、pH 8.7的硼酸鹽緩沖溶液中， 4'C下，將制備的重氮化組分逐滴加入到牛血清白蛋白溶液中，攪拌12h，之后 將偶聯(lián)液裝入透析袋中，4'C下，于0.01M、 pH7.5的PBS緩沖溶液中攪拌透析，每天換3次透析液，共透析4-6天，透析結(jié)束后將透析袋中乳狀液分裝于 lmL的離心管中，于-2(TC冰箱中存放備用，即為殘殺威人工抗原Hapten 1- BSA。 所述的殘殺威人工抗原2的制備方法，按下述化學(xué)反應(yīng)式進(jìn)行殘殺威人工 抗原2的合成
Hapten2 人工抗療2
稱取17.5mg殘殺威半抗原Hapten 2加入到50rnL燒瓶中，力[]lmL DMF溶 解，接著加入三正丁胺15.39pL，氯甲酸異丁酯8.4pL，室溫下攪拌反應(yīng)lh,得 殘殺威半抗原Hapten 2活性液；
稱取100mg牛血清白蛋白溶于6mL 0.05M、 pH 9.6的碳酸鹽緩沖溶液中， 并將上述的活性液滴加到牛血清白蛋白溶液中，室溫下攪拌2-3h，將偶聯(lián)液裝 入透析袋中，4(TC下于0.01M、 pH 7.5的PBS緩沖溶液中攪拌透析，每天換3 次透析液，共透析4-6天，透析結(jié)束后將透析袋中透明液體分裝于lmL的離心 管中，于-20。C冰箱中存放備用，即為殘殺威人工抗原Hapten 2-BSA。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在
(1) 抗原實(shí)用性強(qiáng)殘殺威的抗原合成與抗體制備技術(shù)具有重要的使用 價(jià)值和實(shí)際意義。用上述方法合成具有活性基團(tuán)(-NH2或-COOH)的殘殺威農(nóng) 藥類似結(jié)構(gòu)，有效制備出具有不同連接臂長的殘殺威兩種人工抗原，為進(jìn)一步 研究殘殺威的酶聯(lián)免疫殘留分析法創(chuàng)造了條件，為殘殺威免疫速測試劑盒的研 制解決了技術(shù)難點(diǎn)，必將推動我國殘殺威免疫速測試劑盒的出現(xiàn)。
(2) 具有可比較性通過不同的連接臂長的兩種半抗原與載體蛋白偶聯(lián)
制備出的人工抗原，從而生產(chǎn)出不同特異性識別殘殺威農(nóng)藥的抗體，可以定性 地分析不同連接臂長的人工抗原對殘殺威酶聯(lián)免疫分析法產(chǎn)生的影響。
(3) 抗原制備技術(shù)簡便可行抗原的整個(gè)制備過程無需特別的設(shè)備、而且
避免了使用劇毒性物質(zhì)光氣，條件溫和，成本低廉，容易工廠化規(guī)模生產(chǎn)。


圖1半抗原Haptenl，載體蛋白BSA，人工抗原1紫外光譜圖。 圖2半抗原Hapten2，載體蛋白BSA，人工抗原2紫外光譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:殘殺威半抗原Hapten 1與半抗原Hapten 2的合成 以殘殺威為原料，依次進(jìn)行硝化反應(yīng)，還原反應(yīng)，制得殘殺威半抗原Haptenl ，然后對Hapten 1酰化得殘殺威半抗原Hapten 2;合成步驟如下
a) 、2-異丙氧基-5-硝基苯基-N-甲基氨基甲酸酯(化合物2)的合成在lOOmL 三頸燒瓶中，加入殘殺威20.9g, 40mL的濃硫酸，30mL的濃硝酸，80'C下保溫 反應(yīng)3h，將反應(yīng)液倒入冰水中，析出淺黃色固體，抽濾，蒸餾水洗滌，固體用 乙醇重結(jié)晶，得到白色透明的針狀結(jié)晶2-異丙氧基-5-硝基苯基-N-甲基氨基甲酸 酯21.8g，收率為86%， m.p. 120-121°C;
b) 、 2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯(Hapten l)的合成稱取2-異丙氧基-5-硝基苯基-N-甲基氨基甲酸酯5.0g溶于50mL甲醇中，攪拌下加入 0.5g Pd/C催化劑[w(Pd)40X工業(yè)品]，通入氫氣，室溫下攪拌反應(yīng)8h。抽濾， 減壓蒸餾得淺褐色固體，甲醇重結(jié)晶得白色菱形片狀晶體2-異丙氧基-5-氨基苯 基-N-甲基氨基甲酸酯(Haptenl)4.3g，收率為96%, m.p. 102-102.8°C ;
分析數(shù)據(jù)IR(KBr)v: 3432， 1638， 1506， 1453， 1172cm"; 'H-NMR(500MHz， DMSO): 5ppm7.45(s， 1H) ， 6,27 6,74(m， 3H) ， 4.8(s， 2H)， ， 4.15(m， 1H)， 2.63(d， 3H) ,U5(d， 6H) ; MS(m/z): 247(M+Na+)， 224(1VT);元素分析CuH16N203
實(shí)測值(理論值)C 58.89(58.91)， H7.16(7.19)' N12.48(12.49)。
c) 、 4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯基)苯胺基]-4-羰基丁酸(Hapten 2) 的合成稱取4.48g2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯(Haptenl)， 2.1g 丁二酸酐，無水吡啶100mL攪拌溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù)，油浴，5(TC下反應(yīng)6h。反應(yīng) 液減壓蒸餾，得土灰色粘稠物質(zhì)；
粘稠物用10X的NaHCO3溶液溶解，稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液p1^2，溶液中析出絮 狀固體，乙酸乙酯重結(jié)晶，得白色絮狀固體4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯 基)苯胺基]-4-羰基丁酸(Hapten 2) 5.6g，收率為87.5%， m.p. 218-219°C;
分析數(shù)據(jù)IR(KBr)化3434, 1657， 1611， 1453, 1165cm"; iH-NMR(500MHz， DMSO): 5 ppm 9.87 (s， 1H), 7.63-7.49 (m, 1H), 7.36 (d， 2.31 Hz， 1H), 7.24 (d, / =8.87 Hz， 1H), 6.98 (d, / = 9.01 Hz, 1H)， 4.50-4.34 (m， 1H), 2.63 (d， / = 4.39 Hz, 3H) ,2.49 (s, 4H), 1.18 (d, /= 5.99 Hz, 6H); MS(m/z): 347.6(M+Na+)， 325.6(M+l); 元素分析C15H2QN206 %:實(shí)測值(理論值)C 55.68(55.55)， H6.18(6.22)， N8.59(8.64)。
實(shí)施例2 :人工抗原1 (Hapten l-BSA)的合成
具體步驟稱取22.4mg殘殺威半抗原Hapten 1于50mL的燒瓶中，加入4mL DMF溶解，再加入0.5MHC1溶液2mL和0.1MNaN02溶液1.2mL， 4。C下攪拌 反應(yīng)30min，燒瓶中加入3.6mg尿素，繼續(xù)攪拌5min,得殘殺威半抗原Hapten 1 重氮化組分；
稱取240mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于30mL 0.15M的硼酸鹽緩沖溶液 (pH=8.7)中，4'C下，將制備的重氮化組分逐滴加入到蛋白質(zhì)溶液中，攪拌12h，之后將偶聯(lián)液裝入透析袋中，4"C下，于0.01M的PBS緩沖溶液(pH=7.5)中 攪拌透析，每天換3次透析液，共透析4-6天，透析結(jié)束后將透析袋中乳狀液分 裝于lmL的離心管中，于-2(TC冰箱中存放備用；
人工抗原的鑒定人工抗原的鑒定釆用紫外光譜法，將半抗原Haptenl，載 體蛋白BSA，偶聯(lián)物Haptenl-BSA對應(yīng)的不同濃度的紫外光譜圖做對照(圖1)， 偶聯(lián)后的紫外光譜曲線有變化；從光譜數(shù)據(jù)分析偶聯(lián)物Haptenl-BSA在389nm 出現(xiàn)了較強(qiáng)的吸收峰，可以證明半抗原已經(jīng)和載體蛋白偶聯(lián)。
實(shí)施例3:人工抗原2 (Hapten2-BSA)的合成
具體步驟稱取17.5mg殘殺威半抗原Hapten 2加入到50mL燒瓶中，加lmL DMF溶解，接著加入三正丁胺15.39pL，氯甲酸異丁酯8.4pL，室溫下攪拌反應(yīng) lh，得殘殺威半抗原Hapten 2活性液；
稱取100mg牛血清白蛋白(BSA)溶于6mL 0.05M的碳酸鹽緩沖溶液 (pH=9.6)中，并將上述的活性液滴加BSA溶液中，室溫下攪拌2-3h，將偶聯(lián) 液裝入透析袋中，4'C下于0.01M的PBS緩沖溶液(pH=7.5)中攪拌透析，每 天換3次透析液，共透析4-6天，透析結(jié)束后將透析袋中透明液體分裝于lmL 的離心管中，于-2(TC冰箱中存放備用。
人工抗原的鑒定人工抗原的鑒定采用紫外光譜法，將半抗原Hapten2，載 體蛋白BSA，偶聯(lián)物Hapten2-BSA對應(yīng)的不同濃度的紫外光譜圖做對照(圖2)， 偶聯(lián)后的紫外光譜曲線有明顯的變化，可以證明半抗原己經(jīng)和載體蛋白偶聯(lián)。
9
權(quán)利要求
1、一種殘殺威半抗原，其特征在于以殘殺威2-(1-異丙氧基)苯基甲基氨基甲酸酯為原料，依次進(jìn)行硝化反應(yīng)，還原反應(yīng)，制得殘殺威半抗原Hapten1，然后對Hapten 1?；频脷垰⑼肟乖璈apten 2；所述殘殺威半抗原Hapten 1，化學(xué)名稱為2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯；及所述殘殺威半抗原Hapten 2，化學(xué)名稱為4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯基)苯胺基]-4-羰基丁酸。
2、 一種殘殺威人工抗原，其特征在于用權(quán)利要求1所述的殘殺威半抗原 與牛血清白蛋白偶聯(lián)而得的產(chǎn)物；殘殺威人工抗原1，其化學(xué)名稱為2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸 酯-牛血清白蛋白，簡稱為抗原Hapten 1-BSA;及殘殺威人工抗原2，其化學(xué)名稱為4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯基) 苯胺基]-4-羰基丁酸-牛血清白蛋白，簡稱為抗原Hapten 2-BSA。
3、 權(quán)利要求1所述的殘殺威半抗原的制備方法，其特征在于制備殘殺威半 抗原Hapten 1及殘殺威半抗原Hapten 2:以殘殺威為原料，依次進(jìn)行硝化反應(yīng)，還原反應(yīng)，制得殘殺威半抗原 H叩tenl，然后對Hapten l?；频脷垰⑼肟乖璈apten 2;其合成路線如下(1) (2) Hapteti1 Hapten2a) 、 2-異丙氧基-5-硝基苯基-N-甲基氨基甲酸酯的合成在100mL三頸燒瓶 中，加入20.9g殘殺威，40mL的濃硫酸，30mL的濃硝酸，8(TC下保溫反應(yīng)3h， 反應(yīng)液倒入冰水中，抽濾，固體用乙醇重結(jié)晶，得到針狀結(jié)晶2-異丙氧基-5-硝 基苯基-N-甲基氨基甲酸酯；b) 、 2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯Hapten 1的合成稱取2-異丙氧基-5-硝基苯基-N-甲基氨基甲酸酯5.0g溶于50mL甲醇中，攪拌下加入 0.5g、含Pd質(zhì)量百分10X的工業(yè)品Pd/C催化劑，通入氫氣，室溫反應(yīng)8h，抽 濾，減壓蒸餾，甲醇重結(jié)晶得片狀晶體2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸 酯Hapten 1;及c)、 4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯基)苯胺基]-4-羰基丁酸Hapten 2 的合成稱取4.48g2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯Hapten 1， 2.1g 丁二酸酑于反應(yīng)瓶中，無水吡啶100mL攪拌溶解，N2保護(hù)，5(TC下反應(yīng)6h，反應(yīng)液減壓蒸餾，得土灰色粘稠物質(zhì)；粘稠物用質(zhì)量濃度10。/。的NaHC03溶液溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH2，析出絮狀固體，乙酸乙酯重結(jié)晶，得白色固體4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯基)苯胺基]-4-羰基丁酸Hapten 2。
4、權(quán)利要求2所述的殘殺威人工抗原1的制備方法，其特征在于按下述化學(xué)反應(yīng)式進(jìn)行殘殺烕人工抗原1的合成<formula>formula see original document page 3</formula>稱取22.4mg殘殺威半抗原Hapten 1于50mL的燒瓶中，加入4mL DMF溶解，再加入0.5M HC1溶液2mL和0.1M NaN02溶液1.2mL ， 4°C下攪拌反應(yīng)30min，燒瓶中加入3.6mg尿素，繼續(xù)攪拌5min，得殘殺威半抗原Hapten 1重氮化組分；稱取240mg牛血清白蛋白溶解于30mL 0.15M、pH 8.7的硼酸鹽緩沖溶液中，4"C下，將制備的重氮化組分逐滴加入到牛血清白蛋白溶液中，攪拌12h，之后將偶聯(lián)液裝入透析袋中，4t:下，于0.01M、 pH7.5的PBS緩沖溶液中攪拌透析，每天換3次透析液，共透析4-6天，透析結(jié)束后將透析袋中乳狀液分裝于lmL的離心管中，于-2(TC冰箱中存放備用，即為殘殺威人工抗原Hapten l-BSA。
5、權(quán)利要求2所述的殘殺威人工抗原2的制備方法，其特征在于按下述化學(xué)反應(yīng)式進(jìn)行殘殺威人工抗原2的合成<formula>formula see original document page 3</formula>稱取17.5mg殘殺威半抗原Hapten 2加入到50rnL燒瓶中，力n lmL DMF溶解，接著加入三正丁胺15.39pL，氯甲酸異丁酯8.4pL，室溫下攪拌反應(yīng)lh，得殘殺威半抗原Hapten 2活性液；稱取100mg牛血清白蛋白溶于6mL 0.05M、 pH 9.6的碳酸鹽緩沖溶液中，并將上述的活性液滴加到牛血清白蛋白溶液中，室溫下攪拌2-3h，將偶聯(lián)液裝入透析袋中，于4"C下O.OIM、 pH 7.5的PBS緩沖溶液中攪拌透析，每天換3次透析液，共透析4-6天，透析結(jié)束后將透析袋中透明液體分裝于lmL的離心管中，于-2(TC冰箱中存放備用，即為殘殺威人工抗原Hapten 2-BSA。
全文摘要
一種殘殺威人工抗原及其合成方法，屬于有機(jī)化學(xué)及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。殘殺威的化學(xué)名為2-(1-異丙氧基)苯基甲基氨基甲酸酯，屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥殺蟲劑。本發(fā)明以殘殺威為原料，依次通過硝化反應(yīng)、還原反應(yīng)、酰化反應(yīng)，成功合成帶有不同活性基團(tuán)-NH₂或-COOH，且不同連接臂長的半抗原Happen 1與Hapten 2。半抗原Hapten 1與半抗原Hapten 2分別通過重氮法與混合酸酐法成功和牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，獲得具有不同連接臂長的人工抗原1(Hapten1-BSA)與人工抗原2(Hapten 2-BSA)，為進(jìn)一步研究殘殺威酶聯(lián)免疫殘留分析法創(chuàng)造了條件。抗原制備技術(shù)簡便可行，抗原制備過程無需特別的設(shè)備，而且避免了使用劇毒性物質(zhì)光氣，條件溫和，成本低廉，容易工廠化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07K14/765GK101519367SQ200910029608
公開日2009年9月2日 申請日期2009年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月28日
發(fā)明者林建國, 桑光明, 王洪勇, 羅世能 申請人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所