專利名稱：一種雜合抗菌肽ca-ma及其重組表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜合抗菌肽CA-MA及其重組表達(dá)方法，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antibacterial p印tides)是宿主產(chǎn)生的一類抵抗外界病原 體感染的小分子陽(yáng)離子肽(Milner"s丄，1996 ; Bals e"丄，1999)，
廣泛存在于昆蟲、植物、動(dòng)物及人體內(nèi)，除有非特異性抗細(xì)菌、真菌、 病毒等病原體作用外(Bellm et a丄，2000; Hancock " s丄，2000)，還 有抗腫瘤細(xì)胞作用，因此又稱為肽抗生素(p印tide antibiotics)。抗 菌肽抗菌譜廣，對(duì)多重耐藥菌、腫瘤細(xì)胞、艾滋病毒有殺傷作用，甚至 還可能有抗重癥急性呼吸綜合征(severe acute kespimtory syndrome, SARS)病毒的作用，抗菌肽獨(dú)特的殺菌機(jī)制，使其成為一類具有巨大發(fā) 展?jié)摿Φ男滦涂咕幬?。但天然抗菌肽在昆蟲組織中的含量很少，直接 從昆蟲血淋巴中純化抗菌肽成本太高，得率低，工序繁瑣，并且在應(yīng)用 中表現(xiàn)出單一天然抗菌肽抗菌活力低和抗菌譜窄等缺陷。這些都不利于 抗菌肽的廣泛應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者都借助于基因工程的手段，根據(jù)抗 菌肽構(gòu)效和功能的關(guān)系，將己知的抗菌肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造(Andreu W a厶1985; Fink W W， 1989)或?qū)⒓褐δ艿目咕幕钚圆课浑s合(Song， 2000)，在體外進(jìn)行高效表達(dá)，希望獲得抗菌活力更強(qiáng)，抗菌譜更廣的 抗菌肽(黃音等，2001;周霞等，2003;黃亞東等，2003a， b)。然后 對(duì)獲得的抗菌肽在體外進(jìn)行高效表達(dá)，以期達(dá)到應(yīng)用的目的(邱定紅等， 2002;朱嘉明等，2002;陳海旭等，2001;葉玉坤等，1994;韓萬(wàn)江等， 1998;陳海旭等，2002)。
但抗菌肽的應(yīng)用，需要大量的、高活性的抗菌肽做基礎(chǔ)，而抗菌肽 在天然組織中含量少，直接從天然組織中分離純化抗菌肽成本太高，得率低，工序繁瑣，這些都不利于抗菌肽的廣泛應(yīng)用。基因工程生產(chǎn)抗菌 肽是一個(gè)較為理想的選擇，但是由于抗菌肽分子小，容易被蛋白酶降解， 同時(shí)由于其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌有害，因此不能在原核系統(tǒng)中直接表達(dá)，
一般采用真核表達(dá)或融合表達(dá)的形式(Bryksa " s丄，2005)。至今， 抗菌肽已在原核表達(dá)系統(tǒng)(Skosyrev " ai. ， 2003)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系 統(tǒng)(Yamada " a7. ， 1990)、酵母表達(dá)系統(tǒng)得到表達(dá)(Aly " s丄，1999; Li "a義，2005; Almeida " a丄，2001; Cabral " a丄，2003;金 豐良等，2005; Jin W s丄，2006)。但是在表達(dá)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的 抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞有毒性，而且對(duì)宿主本身的蛋白酶非常敏感導(dǎo)致降 解，這些都降低了抗菌肽的表達(dá)量。近幾年來(lái)，在原核細(xì)胞中采用融合 的形式表達(dá)抗菌肽已經(jīng)成為研究者的熱點(diǎn)(Smith Wa丄，1988; Pryor "a丄，1997; Guan " a丄，1988; LaVallie " a丄，1993,1995; Termo d s丄，2004)。大腸桿菌的遺傳背景清楚，體外操作容易，可 大規(guī)模、高密度發(fā)酵且培養(yǎng)基成分要求簡(jiǎn)單， 一直是基因工程多肽類藥 物生產(chǎn)研究中的首選表達(dá)宿主細(xì)胞(Harris W s丄，1983)。將抗菌肽 和分子伴侶在細(xì)菌中融合表達(dá)，分子伴侶不僅降低了抗菌肽對(duì)宿主菌的 毒性，而且保護(hù)了抗菌肽不被蛋白酶所降解?？咕募航?jīng)和麥芽糖結(jié)合 蛋白(maltose-binding protein, MBP)(陳海旭等，2001; Hara a丄，1996)、谷胱胺肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)
(Skosyrev " a丄，2003;王來(lái)城等，2005; Feng eta丄，2006)、綠 色熒光蛋白(Green-fluorescent protein, GFP)(盧強(qiáng)等，2002)在大 腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)。研究中發(fā)現(xiàn)，大部分的融合蛋白多呈包 涵體的形式存在，增加了抗菌肽的純化難度(盧強(qiáng)等，2002;王來(lái)城等， 2005; Li s丄，2006)，而且融合蛋白在外源蛋白酶切割時(shí)，往往出 現(xiàn)切割不完全或增加了抗菌肽N端多余的氨基酸(Wu W al., 1999; Liang eta丄，2006)，這些都降低了抗菌肽的產(chǎn)量和活性。而且外源 蛋白酶的使用，使抗菌肽的純化變得不經(jīng)濟(jì)。
泛素(ubiquitin)是分子伴侶家族中的一員，可以起到增加翻譯 水平和穩(wěn)定蛋白的作用。泛素特異性蛋白酶(Ubp)廣泛存在于酵母等 真核生物，可以有效的酶解泛素融合蛋白，與其它用于酶解融合蛋白的特異性蛋白酶如FactorX和Thrombin相比，Ubp具有更高的酶活力和更 強(qiáng)的特異性。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，將外源基因與泛素基因融合后，不僅 可以防止表達(dá)產(chǎn)物被降解，極大的提高外源基因的表達(dá)量，而且表達(dá)的 融合蛋白在離體或體內(nèi)條件下，經(jīng)泛素特異性蛋白酶在泛素分子c-末端 切割后，可以釋放出完整而有活性的外源蛋白(孫超等，2001; Einhauer， A.， " W, 2002)。在大腸桿菌系統(tǒng)中簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的表達(dá)可溶性抗菌肽， 是近幾年來(lái)科研者一直致力解決的問題(盧曉風(fēng)等，1999)。為滿足抗 菌肽的生產(chǎn)需要，快速高效表達(dá)和簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)純化的表達(dá)系統(tǒng)是迫在眉睫 的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種雜合抗菌 肽。本發(fā)明的雜合抗菌肽CA-MA (家蠅cecropinA的前8個(gè)氨基酸序列 和非洲爪蟾magainin2的前12個(gè)氨基酸序列)具有高效、廣譜的抗菌 活性，具有潛在的應(yīng)用前景；與家蠅泛素(ubiquitin)融合后，在大 腸桿菌中高效表達(dá)可溶性外源蛋白，為抗菌肽的高效表達(dá)提供了分子平 臺(tái)。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述雜合抗菌肽的重組表達(dá)方法。 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種雜合抗菌肽(CA-MA)，
它具有以下氨基酸序列KKIGKKIEGIGKFLHSAKKF 。 上述雜合抗菌肽的重組表達(dá)方法，包括以下步驟 (1 )選擇家蠅cecropinA前8個(gè)氨基酸序列和非洲爪蟾magainin2
的前12個(gè)氨基酸序列設(shè)計(jì)雜合抗菌肽的cDNA;
(2) 根據(jù)細(xì)菌偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)引物P1和P2，
P1:5'畫AGCCCGC(7GTGGCATGAAATGGAAGATTGGTAAGAAAA TCGGCATTGGTAAGTTCTTA-3'(黑斜體表示引入的酶切位點(diǎn)為Sac 11)，
P2:5'-GGC4L4GCT7TTAGTTGAATTTCTTAGCAGAATGTAAGAA CTTACCAATGCCGA-3'(黑斜體表示引入的酶切位點(diǎn)為歷m/III);
(3) 進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增雜合抗菌肽的cDNA。(4) 構(gòu)建雜合抗菌肽表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA;
(5) 表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA在原核細(xì)胞中進(jìn)行高效融合表達(dá)，得到 融合蛋白UBICAMA;
(6) 融合蛋白UBICAMA的純化將步驟(5)所得的誘導(dǎo)融合蛋白 經(jīng)鎳螯和層析進(jìn)行融合蛋白的純化；
(7) 雜合抗菌肽(重組蛋白)的獲得用家蠅泛素C-末端水解酶 (FUCH)對(duì)步驟(6)所得融合蛋白進(jìn)行酶切，然后依次經(jīng)鎳螯和層析
和超濾法進(jìn)行重組抗菌肽的純化。
所述步驟(3)中常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)的具體步驟如下將混合液 在94。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、 40秒，55°C、 40秒， 72°C、 50秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸7分鐘，擴(kuò)增完畢后置 4"C終止反應(yīng)。
所述混合液組成如下
含20 mM Mg"的10 X PCR緩沖液 5 y 1
濃度為2. 5 mM的dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP組成的dNTP混合物4 u 1 濃度為10tiM的引物Pl 4ul 濃度為10uM的引物P2 4yl 濃度為5U/ ii 1的高保真DNA聚合酶 0. 5 u 1
滅菌水 32. 5 p 1
步驟(4)所述重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA的構(gòu)建包括以下步驟
(a) 原核表達(dá)質(zhì)粒pQEUBI的構(gòu)建設(shè)計(jì)一對(duì)特定引物PUF和PUR， 以原核表達(dá)載體PQE30為模板，利用常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)將家蠅泛素
(ubiquitin， UBI)的C末端堿基f"突變C，使其含有I 、 (Leu73、 Arg74)和歷/7dlI酶切位點(diǎn)，以及家蠅泛素C-末端水解酶(FUCH) 的識(shí)別序列(Gly75-Gly76);然后經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 8%瓊脂糖凝膠電泳回 收，再經(jīng)^z^ I和歷/7dlI酶切雙切后插入到載體pQE30的ife^1 I和歷/K/ m酶切窗口，構(gòu)建成原核表達(dá)質(zhì)粒pQEUBI;
(b) 將雜合抗菌肽的cDNA進(jìn)行Sscn和歷V7dlI雙酶切，膠純化回 收后，與經(jīng)同樣酶切回收的質(zhì)粒pQEUBI體外連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pQEUBICAMA。
7所述的特定引物PUF和PUR是
PUF: 5'-GCGGGATCC ATGCAGATTTTC GTGAAAACC-3'， PUR: 5'—GAAGCTTTTAGCCACCGCGGAGGCGAAGGACC-3'。
步驟(5)所述重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA在原核細(xì)胞中進(jìn)行高效融 合表達(dá)包括以下步驟用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA導(dǎo) 入宿主菌大腸桿菌M15中；用涂布氨芐抗生素和卡那霉素篩選培養(yǎng)基的 方法篩選獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA;用乳糖蛋白胨(LB)培養(yǎng)基誘 導(dǎo)融合蛋白UBICAMA，培養(yǎng)溫度為37"C;加入異丙基-P-D硫代半乳糖 (IPTG)和葡萄糖誘導(dǎo)融合蛋白UBICAMA表達(dá)。其中IPTG的終濃度為 0.4raM，葡萄糖的質(zhì)量濃度為0.2%，誘導(dǎo)溫度為25°C 26°C，誘導(dǎo)時(shí) 間為8 10hr。
步驟(7)所述超濾法是利用截留分子量為10.0kDa的超率裝置進(jìn) 行過(guò)濾。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)雜合
抗菌肽CA-MA (家蠅cecropinA (1-8)和非洲爪蟾magainin2 (1-12) 具有高效、廣譜的抗菌活性，具有潛在的應(yīng)用前景；(2)將雜合抗菌 肽與家蠅泛素融合后，在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性外源蛋白，為抗菌 肽的高效表達(dá)提供了分子平臺(tái)，具有表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)；(3) 本發(fā)明中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA能以融合蛋白的形式高效表達(dá) CA-MA，表達(dá)產(chǎn)物溶解性好，融合蛋白在泛素水解酶下獲得準(zhǔn)確切割， 純化簡(jiǎn)易，且重組雜合抗菌肽具有天然的生物活性，所采取純化穩(wěn)定可 靠，得率高，利于大規(guī)模生產(chǎn)，而且也適用于對(duì)CA-MA功能與構(gòu)象關(guān)系 的研究。


圖l是pQE30物理圖譜圖。
圖2是重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBI的構(gòu)建示意圖。
圖3是雜合抗菌肽CA-MA的PCR結(jié)果圖。
圖4是重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA的表達(dá)框架圖。
圖5是重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA的構(gòu)建示意圖，其中，M為Marcker I， 1， 2為CA-MA為擴(kuò)增片段。
圖6是重組質(zhì)粒的勘/ m和歷"dn雙酶切鑒定圖，
其中，M為MakerII， 1為pQE30載體，2為pQEUBICAMA。 圖7是融合蛋白UBICAMA的SDS-PAGE(A、B)電泳圖和Western blot (C)分析圖，
其中M1， M2:蛋白marker; 1:誘導(dǎo)前；2: IPTG誘導(dǎo)5 h; 3: His Trap HP 5ml column純化后的融合蛋白(l.O Pg/ lane); 4: IPTG誘
導(dǎo)5 h的上清；5: IPTG誘導(dǎo)5 h的沉淀；6:純化后的融合蛋白(1. 0 l^g/
lane)與Ni-NTA conjugate的雜交。
圖8是融合蛋白酶切的Tricine -SDS-PAGE分析圖，
其中，Ml， M2:蛋白marker; 1:純化的重組蛋白CA-MA; 2: FUCH
切割后的樣品；3:純化的融合蛋白。
圖9為雜合抗菌肽CA-MA的RP-HPLC C18 column分析圖，在12. 48
分鐘收集流出液。
圖10為純化后雜合抗菌肽CA-MA的Tricine -SDS-PAGE分析圖， 其中，M:蛋白marker; 1:純化的重組抗菌肽CA-MA。 圖11為雜合抗菌肽CA-MA的激光飛行時(shí)間質(zhì)譜分析圖。 圖12為雜合抗菌肽CA-MA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析圖。 圖13為雜合抗菌肽Mdmcec和雜合抗菌肽CA-MA對(duì)￡ K12D31 (A)和5".朋rews (B)的活性檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的 實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1原核表達(dá)質(zhì)粒pQEUBI的構(gòu)建
以PUF和PUR為特定引物，利用PCR技術(shù)將家蠅泛素(ubiquitin) 定點(diǎn)突變，使其C末端含有編碼四個(gè)氨基酸(Leu73、 Arg74 、 Gly75、 Gly76) 的序列。家蠅泛素C-末端帶有&cII酶切位點(diǎn)(Leu73、 Arg74)和家蠅泛 素C-末端水解酶(FUCH)的識(shí)別序列(Gly75-Gly76)，融合蛋白經(jīng)家蠅泛 素C-末端水解酶切割后有利于目的蛋白的釋放。Ubiquitin的PCR中含
9有^mHI 、 5"ac II (Leu73、 Arg74)和歷/7dlI酶切位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳回收，再經(jīng)Sa/zH I和歷'/7cin酶切雙切后插入 到原核表達(dá)載體PQE30 (圖1)的及mH I和歷/7dlI酶切窗口 ，構(gòu)建成質(zhì) 粒pQEUBI。質(zhì)粒構(gòu)建的具體過(guò)程如圖2所示為了將家蠅ubiquitin 引進(jìn)載體pQE30中，便于ubiquitin下游基因的裝配和使下游表達(dá)的蛋 白的N端不引入其他任何氨基酸，設(shè)計(jì)一對(duì)引物PUF和PUR。為了便于 克隆，分別在引物PUF和PUR的的5'端引入BaraH I和HindIII酶切位點(diǎn)， 并將家蠅ubiquitin核苷酸序列C末端堿基序列TCGCGG突變?yōu)镃CGCGG (SacII)。以測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD18-UBI為模板，PUF和PUR為引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用BamHI和HindIII雙酶 切，與用BamHI和HindIII雙酶切的pQE30載體連接，得到重組表達(dá)載體 pQEUBI。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、DNA片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化均 按Sambrook等方法進(jìn)行(Sambrook et al. ， 1989)。酶切鑒定后正確的 重組質(zhì)粒經(jīng)送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
實(shí)施例2重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA的構(gòu)建 (1) CA-MA序列的擴(kuò)增
(a) 根據(jù)家蠅cecropinA(1-8)的氨基酸序列和非洲爪蟾magainin2 (1-12)的氨基酸序列設(shè)計(jì)重組抗菌肽的cDNA;
(b) 根據(jù)細(xì)菌偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)引物P1和P2， Pl:5'-AGCra7C(7GTGGCATGAAATGGAAGATTGGTAAGAAAA
TCGGCATTGGTAAGTTCTTA-3'(黑斜體表示引入的酶切位點(diǎn)為Sac 11)，
P2:5'-GGCA4GOTTTAGTTGAATTTCTTAGCAGAATGTAAGAA CTTACCAATGCCGA-3'(黑斜體表示引入的酶切位點(diǎn)為Mm/III);
由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，使用前用ddH20稀釋至10pM。
(c) 進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增重組抗菌肽。
以PI和P2互為模板互為引物，以高保真DNA聚合酶(Pyrobest DNA Polymerase)進(jìn)行PCR， CA-MA的PCR反應(yīng)條件50^1體系中含有 10xPCR buffer (含20 mM Mg2+) 5 (J， dNTP mixtures (各2.5 mM) 4^1，Pl (10pM)4(al ， P2(10pM)爭(zhēng)，高保真DNA聚合酶(5U/pl) 0.5^1， ddH20 32.5^1;將混合液在94。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C 、 40秒，55°C、 40秒，72°C、 50秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72"延伸7 分鐘，擴(kuò)增完畢后置4。C終止反應(yīng)。得到CA-MA cDNA序列 C
CGCC)。 PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，在 90bp附近存在單一的目標(biāo)條帶，結(jié)果如圖3，表明實(shí)驗(yàn)獲得了與預(yù)期相 符的特異DNA片段即重組抗菌肽的cDNA。 所述混合液組成如下
含20 mM Mg"的10XPCR緩沖液 5 u 1
dNTP混合物(濃度為2.5 mM的dATP, dTTP， dCTP, dGTP) 4ul 濃度為10uM的引物Pl 4ul 濃度為10uM的引物P2 4yl 濃度為5U/ u 1的高保真DNA聚合酶 0. 5 u 1
滅菌水 32. 5 u 1
(2)重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA的構(gòu)建
由于抗菌肽N端對(duì)抗菌活性相當(dāng)重要，N端額外添加氨基酸會(huì)導(dǎo)致 抗菌肽活性顯著降低(Cabral et <3丄，2003; Li et a丄，2005)。因 此設(shè)計(jì)重組抗菌肽表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA時(shí)，在擴(kuò)增CA-MA時(shí)，上游引 物P1引入載體ubiquitin的四個(gè)氨基酸(L、 R、 G、 G)編碼序列，使 CA-MA cDNA序列位于ubiquitin下游，插入到載體pQEUBI相應(yīng)的窗口 (SacII和HindIII雙酶切)，CA-MA cDNA序列與載體上的泛素序列 (ubiquitin)及6XHis序列融合。表達(dá)框架如圖4所示。
將膠純化回收后CA-MA PCR產(chǎn)物即重組抗菌肽的cDNA進(jìn)行Sac II 和HindIII雙酶切，膠純化回收后，與經(jīng)同樣酶切回收的質(zhì)粒pQEUBI體 外連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA。轉(zhuǎn)化E. coli TG1， Amp+篩選 陽(yáng)性克隆子。陽(yáng)性重組質(zhì)粒的提取，酶切和PCR鑒定均按文獻(xiàn)(Sambrook etal.， 1989)進(jìn)行。將酶切和PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海英俊生 物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。 質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程詳見圖5。實(shí)施例3 重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA的酶切鑒定 挑選陽(yáng)性克隆子，抽提質(zhì)粒pQEUBICAMA, feMH、歷/7offl雙酶切，
產(chǎn)物用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)兩條DNA帶，位置與預(yù)測(cè)一致(如
圖6所示)。
實(shí)施例4誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析和免疫印跡分析 將測(cè)序鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌M15 構(gòu)建成工程菌株。挑取工程菌株單菌落接種于LB液體加富培養(yǎng)基(含 100mg/l Amp+、 25mg/l kan+)中，37。C劇烈振蕩培養(yǎng)16hr，作為種子 菌。取種子菌按1 : 50體積比接種于新鮮的LB加富培養(yǎng)基(含100 mg/1 Amp+、 25 mg/1 kan+)中，37。C劇烈振蕩放大培養(yǎng)至OD600 =0.8時(shí)， 加入終濃度為0.4 mM IPTG，同時(shí)加入終濃度為0.2 %的葡萄糖，降低 本底的表達(dá)。在25TH秀導(dǎo)表達(dá)9 hr， 4 °C、 12， 000 r. p. m離心2 min， 得到含有重組質(zhì)粒pQEUBICAMA的表達(dá)菌株，收集菌體備用。SDS-PAGE 電泳及Western印跡分析見圖7。由圖中可以看出，含有pQEUBICAMA 質(zhì)粒的菌株誘導(dǎo)后表達(dá)了一條分子量為12. 6 kDa的蛋白帶，結(jié)果如圖7 (A)，該融合蛋白能被鎳-次氮基三乙酸瓊脂糖樹脂(Ni-NTA-偶聯(lián)物) 特異性的識(shí)別，結(jié)果如圖7 (C)，說(shuō)明融合蛋白的N-端攜帶有6XHis 接頭。
實(shí)施例5表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析
將重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌M15構(gòu)建成工程菌 株，接種于200ml LB中做大量表達(dá)，具體操作挑取工程菌株單菌落 接種于LB液體加富培養(yǎng)基(含lOOmg/1 Amp+、 25mg/l kan+)中，37 。C劇烈振蕩培養(yǎng)16hr，作為種子菌。取種子菌按1 : 50體積比接種于 新鮮的LB加富培養(yǎng)基(含100mg/1 Amp+、 25 mg/1 kan+)中，37。C劇 烈振蕩放大培養(yǎng)至0D600 =0.8時(shí)，加入終濃度為0.4 mM IPTG，同時(shí) 加入終濃度為0. 2 %的葡萄糖，降低本底的表達(dá)。在25"C誘導(dǎo)表達(dá)9 hr， 4°C、 12,000 r.p.m離心2 min，收集菌體備用。離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后 的菌體，稱取濕重。加入超聲裂解液(50mMTris-HC1 (pH8.0)和500mM NaCl混合液)，進(jìn)行超聲破碎。12,000 g離心30min，分別收集上清液和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析融合蛋白的存在形式。結(jié)果如圖7(B)， 表明融合蛋白存在超聲裂解液的上清中。
實(shí)施例6 融合蛋白UBICAMA的純化
由于pQE30載體的N端帶有6XHis純化標(biāo)簽，可以采用組2+螯和層 析進(jìn)行純化融合蛋白。融合蛋白的純化參考Ni2+金屬親和層析HisTr即 HP (5ml)系統(tǒng)的說(shuō)明書進(jìn)行。將超聲裂解的上清經(jīng)過(guò)0.45 pM低吸附 蛋白的過(guò)濾器除去雜質(zhì)，先用平衡緩沖液(20mM Na3P04， 0. 5M NaCl， 5mM咪唑，pH7.4)平衡，進(jìn)蛋白樣品，保持流速1 ml/min。用平衡緩 沖液洗脫至基線后，收集穿過(guò)依次用線性梯度的咪唑濃度(5 mM -500 mM) 的緩沖液(20mM Na3P04， 500 mM NaCl, pH 7.4)洗脫結(jié)合蛋白，分別收 集流出物，每次收集物均取10 pi, SDS-PAGE電泳檢測(cè)，目的蛋白在 0.2 M咪唑濃度下可以被洗脫下來(lái)。因此本發(fā)明中，收集了0.2M咪唑 濃度洗脫下來(lái)的流出物，取出了 lOpl的流出物，進(jìn)行SDS-PAGE分析， 結(jié)果如圖7-B，與預(yù)期的大小一致。
實(shí)施例7融合蛋白UBICAMA的酶切
將純化的融合蛋白UBICAMA在25。 C家蠅泛素C-末端水解酶(FUCH) 緩沖液中(50 mM N-2-羥乙基哌嗪-主N-2-乙磺酸鈉/NaOH， pH7.8， 0. 5 mM EDTA乙二胺四乙酸四鈉，1 mM二硫蘇糖醇，0. lmg/ml雞卵白蛋 白)進(jìn)行酶切16 hr，酶切產(chǎn)物經(jīng)ddH20透析后，18%三(羥甲基)甲基甘 氨酸十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)電泳分 析，結(jié)果如圖8所示，融合蛋白UBICAMA經(jīng)家蠅泛素C-末端水解酶酶切后， 釋放出與預(yù)期大小一致的泛素(UBI)和CA-MA單體。表明帶有6His標(biāo)簽
的重組家蠅泛素c-末端水解酶能夠特異的識(shí)別泛素c-末端的蛋白，并進(jìn)
行切割，釋放出泛素分子和具有天然N末端目的蛋白。 實(shí)施例8雜合抗菌肽的純化
由于泛素(UBI)、家蠅泛素C-末端水解酶(FUCH)、酶切不完全的 融合蛋白UBICAMA都帶有6 XHis標(biāo)簽，酶切產(chǎn)物經(jīng)兩次HisTrap HP (5ml)柱純化，除去帶有His-tag的酶切污染，收集流出液，進(jìn)一歩用截 留分子量為10.0 kDa的超濾裝置(Amicon)對(duì)重組抗菌肽進(jìn)行純化， 除去10.0 kDa以上的雜蛋白。將純化后的重組抗菌肽用半制備型的 RP-HPLC (reversed-phase HPLC，反相高壓液相色譜)的C18 (250X4.6 mm， 5陶300A)柱進(jìn)行分析表明，純化的重組抗菌肽為單一的峰型，結(jié) 果如圖9。 18°/oTricine-SDS-PAGE電泳對(duì)純化的重組抗菌肽進(jìn)行分析表 明，純化的蛋白為單一蛋白條帶，分子量分別為2.6 kDa，與預(yù)期的結(jié) 果一致，如圖10所示。以上結(jié)果表明經(jīng)重復(fù)鎳螯和層析和超濾后得到 較為純凈的雜合抗菌肽。
實(shí)施例9雜合抗菌肽CA-MA的激光飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè) 用激光飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)純化的CA-MA進(jìn)行分析，結(jié)果如圖ll所示。 由圖11可知，雜合抗菌肽CA-MA的分子量分別2559. 53Da，與通過(guò)氨基酸 序列計(jì)算得到的分子量完全符合。而且雜合抗菌肽CA-MA的質(zhì)譜結(jié)果為 單一的峰，說(shuō)明成分均一，純度很高。
實(shí)施例10雜合抗菌肽CA-MA的圓二色譜分析
雜合抗菌肽CA-MA的圓二色譜測(cè)定使用日本產(chǎn)J 810儀圓二色譜儀， 在室溫測(cè)定遠(yuǎn)紅外190-250nm的光譜。結(jié)果見圖12。圓二色譜的測(cè)定結(jié) 果表明，雜合抗菌肽CA-MA二級(jí)結(jié)構(gòu)為17. 4%a -螺旋結(jié)構(gòu)和82. 6%自由轉(zhuǎn) 曲，沒有P折疊，雜合抗菌肽CA-MA在200-210nm有一處吸收峰，與化學(xué) 合成的CA-MA的二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例11雜合抗菌肽CA-MA的生物活性檢測(cè)
重組蛋白CA-MA的凍干粉用滅菌ddH20溶解成1 pg/ml的溶液，以 A "H和6: ai/2^As為指示菌，采用瓊脂孔穴平板擴(kuò)散法測(cè)定表 達(dá)產(chǎn)物抑菌活性，以l ^g/ml氨芐青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌ddH20作 為陰性對(duì)照，37"C過(guò)夜培養(yǎng)，結(jié)果如圖13。
從圖13中可以看出。雜合抗菌肽CA-MA對(duì)A co力'K』3i和6; 有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)A coij'tU^抑菌圈直徑達(dá)到0.5士0.02cm (抑
14菌圈直徑-內(nèi)徑)，對(duì)6: se^抑菌圈直徑達(dá)到0.45土0.01cm。而滅菌 ddH20未出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，表明融合蛋白在泛素水解酶的作用下可以釋放 出具有生物活性的雜合抗菌肽CA-MA。
實(shí)施例12雜合抗菌肽的殺菌譜測(cè)定
將純化的雜合抗菌肽CA-MA用0. 01%的乙酸和0. 2%牛血清白蛋白 1/2倍梯度稀釋，對(duì)其殺菌的廣譜性及最小抑制濃度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果 如表l。
表l雜合抗菌肽CA-MA對(duì)微生物的最小抑制濃度
CA-MA對(duì)微生物的最小抑制濃度
微生物最小抑制濃度(幽)
革蘭氏陽(yáng)性菌
金黃色葡萄球菌 6S"tep/ j^ococct/51 s"re^5193. 7
枯草芽孢桿菌Macj7hs s"Z^/h'Sy)1. 6
短小芽孢桿菌他cj77ws / 函7"5^3. 1
革蘭氏陰性菌
大腸桿菌^fi^c/ erj'c力ia coZi K12D31J3. 8
豬霍亂沙門氏菌 ^ &^/70/7e^s1. 7
梅氏弧菌fK/力rj'o // etsc力"j'AoyiJ2.98
真菌
稻癟菌 (/^WcWarj'3 orj^aeJ17. 8
灰霉菌(i5btiTti51 c/"eresj14, 0
青霉菌(尸e"icj77i服cr"5^os"歷y)11. 3
黑腐菌(「Wsa16.8
尖孢鐮刀菌(尸iAsari"/z ax7印ar"W8.0
從表l中可以看出，雜合抗菌肽CA-MA具有相類似的抗菌活力和抗 菌譜，都具有廣譜抗菌性，不僅對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌具有廣 譜的抗性，而且對(duì)真菌也有一定的抑制作用。CA-MA對(duì)大腸桿菌豬霍亂沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌的MIC分別為1.7剛和1.6 ,。對(duì)一些真 菌有較強(qiáng)的抑制作用，如稻瘟菌MIC47.8幽)、灰霉菌(MIC44.0幽)、 青霉菌(MIC=11.3幽)、黑腐菌(MIC=16. 8幽)，為雜合抗菌肽CA-MA 在抗病蟲害上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
實(shí)施例13雜合抗菌肽CA-MA的溶血性分析
將用磷酸緩沖鹽溶液(PBS， pH=7.4)配制的不同濃度的CA-MA溶 液，檢測(cè)對(duì)小鼠紅細(xì)胞的溶血性，結(jié)果如表2所示，CA-MA濃度達(dá)到50 ,都沒有出現(xiàn)血細(xì)胞的溶解現(xiàn)象，表明雜合抗菌肽CA-MA對(duì)小鼠紅細(xì)胞 無(wú)溶血性。
表2 CA-MA的溶血性分析
溶血百分比(pg/ml)
蛋白濃度100502512.56.253.1251.56
磷酸緩沖鹽溶液0000000
CA隱MA0000000
曲拉通X-100100100100謂100100100
溶血百分比=[(抗菌肽溶液在414nm處吸收率-PBS緩沖液在414nm處吸收率)/ (0. 1% 曲拉通X-100在414咖處吸收率-PBS緩沖液在414nm處吸收率)]100
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受 上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作 的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在 本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表 '
<110>暨南大學(xué)
<120> —種雜合抗菌肽CA-MA及其重組表達(dá)方法<130> 1<160> 5
< 170> Patentln version 3.5<210> 1<211〉 20<212> PRT<213>人工序列<楊> 1
Lys Lys lie Gly Lys Lys He Glu Gly He Gly Lys Phe Leu His Ser15 10 15
Ala Lys Lys Phe20
<210> 2<211> 58<212> DNA<213>人工序列<400> 2
agcccgcggt ggcatgaaat ggaagattgg taagaaaatc ggcattggta agttctta 58
<210> 3<211> 53<212> DNA<213>人工序列<400> 3
ggcaagcttt tagttgaatt tcttagcaga atgtaagaac ttaccaatgc cga 53
<210> 4<211> 30
17<212> DNA<213>人工序列<400> 4
gcgggatcca tgcagatttt cgtgaaaacc 30
<210> 5<211> 32<212> DNA<213〉 人工序列<400> 5
gaagctttta gccaccgcgg aggcgaagga cc 3權(quán)利要求
1、一種雜合抗菌肽，其特征在于它具有以下氨基酸序列KKIGKKIEGIGKFLHSAKKF。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述雜合抗菌肽的重組表達(dá)方法，其特征在于包括以下步驟(1) 選擇家蠅cecropinA前8個(gè)氨基酸序列和非洲爪蟾magainin2的前12個(gè)氨基酸序列設(shè)計(jì)雜合抗菌肽的cDNA;(2) 根據(jù)細(xì)菌偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)引物P1和P2，P1:5'-AGCCCGCGGTGGCATGAAATGGAAGATTGGTAAGAAAATCGGCATTGGTAAGTTCTTA-3'， CCGC(7G表示引入的酶切位點(diǎn)為5"ac II，P2:5'畫GGC44G"Cr7TTAGTTGAATTTCTTAGCAGAATGTAAGAACTTACCAATGCCGA-3'， A4G"CTr表示引入的酶切位點(diǎn)為77/m/III;(3) 進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增雜合抗菌肽的cDNA;(4) 構(gòu)建雜合抗菌肽表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA;(5) 表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA在原核細(xì)胞中進(jìn)行高效融合表達(dá)，得到融合蛋白UBICAMA;(6) 融合蛋白UBICAMA的純化將步驟(5)所得的融合蛋白UBICAMA經(jīng)鎳螯和層析進(jìn)行融合蛋白的純化；(7) 雜合抗菌肽的獲得用家蠅泛素C-末端水解酶對(duì)步驟(6)所得融合蛋白UBICAMA進(jìn)行酶切，然后依次經(jīng)鎳螯和層析和超濾法進(jìn)行雜合抗菌肽的純化。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述雜合抗菌肽的重組表達(dá)方法，其特征在于步驟(3)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)的具體步驟如下將混合液在94"C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、 40秒，55°C、 40秒，72°C、 50秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸7分鐘，擴(kuò)增完畢后置4"C終止反應(yīng)。所述混合液組成如下含20 mM Mg"的10XPCR緩沖液 5 u 1濃度為2. 5 mM的dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP組成的dNTP混合物4 u 1濃度為10uM的引物Pl 4 ul濃度為10uM的引物P2 4 Pl濃度為5U/ u 1的高保真DNA聚合酶 0. 5 u 1滅菌水 32.5iil
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述雜合抗菌肽的重組表達(dá)方法，其特征在于步驟(4)所述重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA的構(gòu)建包括以下步驟(a) 原核表達(dá)質(zhì)粒pQEUBI的構(gòu)建設(shè)計(jì)一對(duì)特定引物PUF和PUR，以原核表達(dá)載體PQE30為模板，利用常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)將家蠅泛素的C末端堿基T221突變C，使其含有泡W I 、 II和歷/7dlI酶切位點(diǎn)以及家蠅泛素C-末端水解酶的識(shí)別序列；然后經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 8%瓊脂糖凝膠電泳回收，再經(jīng)^s/^ I和歷/7dlI酶切雙切后插入到載體pQE30的I和歷/ offl酶切窗口，構(gòu)建成原核表達(dá)質(zhì)粒PQEUBI;(b) 將重組抗菌肽的cDNA進(jìn)行5"acII和歷'77dll雙酶切，膠純化回收后，與經(jīng)同樣酶切回收的質(zhì)粒pQEUBI體外連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA;所述的特定引物PUF和PUR是PUF: 5'—GCGGGATCC ATGCAGATTTTC GTGAAAACC國(guó)3'，PUR: 5'—GAAGCTTTTAGCCACCGCGGAGGCGAAGGACC-3'。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述雜合抗菌肽的重組表達(dá)方法，其特征在于步驟(5)所述重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA在原核細(xì)胞中進(jìn)行高效融合表達(dá)包括以下步驟用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA導(dǎo)入宿主菌大腸桿菌M15中；用涂布氨節(jié)抗生素和卡那霉素篩選培養(yǎng)基的方法篩選獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pQEUBICAMA;用乳糖蛋白胨培養(yǎng)基誘導(dǎo)融合蛋白UBICAMA，培養(yǎng)溫度為37°C;加入異丙基-P -D硫代半乳糖和葡萄糖誘導(dǎo)融合蛋白UBICAMA表達(dá)，其中異丙基-P -D硫代半乳糖的終濃度為0. 4mM，葡萄糖的質(zhì)量濃度為0. 2 %，誘導(dǎo)溫度為25°C 26°C，誘導(dǎo)時(shí)間為8 10hr。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述雜合抗菌肽的重組表達(dá)方法，其特征在于步驟(7)所述超濾法是利用截留分子量為10.0 kDa的超率裝置進(jìn)行過(guò)濾。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜合抗菌肽CA-MA及其重組表達(dá)方法。利用家蠅泛素ubiquitin為融合伴侶，構(gòu)建了高效表達(dá)雜合抗菌肽CA-MA的融合表達(dá)載體pQEUBICAMA。該重組抗菌肽具有高效、廣譜的抗菌活性；將重組抗菌肽與家蠅泛素融合后，在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性外源蛋白，為抗菌肽的高效表達(dá)提供了分子平臺(tái)；具有表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。該pQEUBICAMA載體能以融合蛋白的形式高效表達(dá)CA-MA，表達(dá)產(chǎn)物溶解性好，融合蛋白在家蠅泛素水解酶下獲得準(zhǔn)確切割，純化簡(jiǎn)易且重組蛋白具有天然的生物活性，所采取純化穩(wěn)定可靠，得率高，利于大規(guī)模生產(chǎn)，也適用于對(duì)CA-MA功能與構(gòu)象關(guān)系的研究。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101481420SQ20091003690
公開日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2009年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日
發(fā)明者張文慶, 汪延生, 娟 王, 許小霞, 金豐良, 陳宏鑫 申請(qǐng)人:中山大學(xué)