專利名稱：苯丙素衍生物及其制備方法和在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有生物活性的有機(jī)化合物領(lǐng)域，具體涉及一種苯丙素衍生物 及其制備方法和在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
苯丙素類(phenylpropanoids)是一類含有一個或幾個C6—C3單位的天然 成分。這類成分有單獨(dú)存在的，也有以2個、3個、4個甚至多個單位聚合存 在的，包括苯丙稀、苯丙醇、苯丙酸及其縮酯、香豆素、木脂素、黃酮和木質(zhì) 素等。從生源合成途徑來看，苯丙素類多數(shù)由莽草酸，通過苯丙氨酸和酪氨酸， 再經(jīng)脫氨、羥基化、偶合等反應(yīng)形成最終產(chǎn)物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的苯丙素衍生物 骨架結(jié)構(gòu)以苯丙酸類、香豆素類、木脂素類和黃酮類為代表。
苯丙素類化合物很多具有很好的生物活性，如從日本蛇菰中得到的松柏苷 和咖啡酸葡萄糖酸苷具有抗組胺釋放的活性；中藥秦皮治痢疾的有效成分是七 葉內(nèi)酯及其苷；小檗科鬼臼等多種植物中所含的鬼臼毒素及其衍生物具抗腫瘤 的活性；五味子素能降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶而用于治療肝炎；蘆丁、槲皮素、葛根素 等有明顯的擴(kuò)張冠狀動脈的作用。厚樸酚具肌肉松弛作用；牛蒡子甙對風(fēng)熱感 冒有效等。
紅樹植物是一種海洋高等植物，是海洋藥物開發(fā)和新藥研究的主要藥源之 一。目前進(jìn)入臨床及臨床前研究的抗腫瘤海洋藥物主要有膜海鞘素、海兔素肽、 苔蘚蟲素等脂類、多肽或萜類化合物，這些抗腫瘤藥物以往大多從海洋動物中 提取，從紅樹植物中提取的鮮有報道。但紅樹植物同樣擁有良好的抗腫瘤的海洋先導(dǎo)化合物，如海蓮樹皮提取物
能有效的抑制兩種類型的腫瘤肉瘤180和劉易斯肺癌(KokpolU. Chemistry of natural products from mangrove plants, UNDP/UNESCO, Training course on life history of selected species of flora and fauna in mangroce ecosystem[J]. Thailand, 1985, 159-169);海漆中的二萜化合物具有抗艾滋病和抗腫瘤的作用 (Konoshima T, Konishi T, Takasaki M, et al. Antitumor畫promoting activity of diterpenes from五xcoeca"'a agtt〃0c/7fl II [J]. Bio Pharm Bull, 2001, 24 (12): 1440-1442);老鼠簕的乙醇提取物能有效抑制腫瘤的生長和致癌物誘導(dǎo)的老鼠 皮層瘤的生產(chǎn)等(Babu B H, Shylesh B S, Padikkala J, et al. Tumour reducing and anticarcinogenic activity of Jc朋//^ ///cz》/^ in mice [J]. Journal of Ethnopha腿cology, 2002, 79 (1): 27-33)。
近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，紅樹林資源是尋找生物活性物質(zhì)尤其是新骨架結(jié)構(gòu)的 藥物先導(dǎo)化合物的重要來源，如吳軍等人從木果楝中分到了兩個高度氧化的 8, 9, 30-phargmalin orthoester化合物Xyloccensins O和P (Wu J， et al. Xyloccensins O and P， Unique 8,9,3 0-phragmalin orthoesters from々/ocar戸s gra"W"m [J]. Organic Letters, 2004, 6 (11): 1841-1844);郭躍偉等人從木欖中得 到一個新骨架結(jié)構(gòu)的大環(huán)聚二硫化合物(Sun Y Q, Guo Y W. Gymnorrhizol, an unusual macrocyclic polydisulfide from the Chinese mangrove 5ragw/era gym"wr/2/za [J]. Tetrahedron letters, 2004, 45 (28): 5533-5535 );吳軍等人還發(fā)現(xiàn) 木果楝中的Xylogranatins F, G and R在lmg/mL的濃度下對Mythimna separata 的幼蟲有顯著的拒食活性(Wu J, Zhang S, Bruhn T, et al. Xylogranatins F隱R: Antifeedants from the Chinese mangrove,々/oca;791^ gra"a&w, a new biogeneticpathway to tetranorttiterpenoids [J]. Chemistry-A European Journal, 2008, 14 (4): 1129-1144)。
目前世界醫(yī)學(xué)人員致力于"艾滋病、癌癥和老年病"等疑難病癥的研究， 海洋藥物在這方面發(fā)揮了獨(dú)特的作用。而我國的藥物研究極少有來源于海洋生 物活性先導(dǎo)化合物的原創(chuàng)性研究和專利，開發(fā)海洋藥物，對紅樹植物等海洋生 物的化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行研究，尋找新藥的先導(dǎo)化合物已迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從紅樹植物中提取出 的，具有細(xì)胞毒活性的且具有新骨架結(jié)構(gòu)的苯丙素衍生物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供上述苯丙素衍生物的制備方法。 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述苯丙素衍生物在制備抗乳腺癌藥物中 的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明的苯丙素衍生物是從紅樹植物山石榴中分離得到的，其結(jié)構(gòu)式如式 (I )或式(II)所示。
〇CH3 OCH
(I) (n)
通過對上述兩種化合物進(jìn)行質(zhì)譜、核磁共振譜包括二維相關(guān)譜等分析發(fā) 現(xiàn)，式(I)和式(II)所示化合物為一對差向異構(gòu)體，且和現(xiàn)有的苯丙素類 化合物相比，式(i)和式(n)所示化合物具有3個相互駢合的氧環(huán)結(jié)構(gòu)，其中包括兩個縮醛結(jié)構(gòu)片斷，是天然產(chǎn)物中的一類新骨架結(jié)構(gòu)的苯丙素衍生
物。本發(fā)明人將式(I )所示化合物命名為Catunaregin，將式(II)所示化 合物所示化合物命名為Epicatunaregin。
本發(fā)明的苯丙素衍生物，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員從植物中分離獲得某活性成 分時常用的提取、萃取和柱層析及薄層層析相結(jié)合進(jìn)行分離的方法，其制備方 法包括如下步驟
(1) 將紅樹植物山石榴用95%工業(yè)酒精浸泡提取，將提取液減壓濃縮得 粗提物，粗提物再用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯層；
(2) 將上述乙酸乙酯層進(jìn)行硅膠柱層析，梯度洗脫后再由薄層層析分析得 到粗品，將粗品進(jìn)行純化后即可得到本發(fā)明的苯丙素衍生物。
上述步驟(1)中，用95體積％工業(yè)酒精浸泡提取山石榴，其浸泡提取的 次數(shù)以及時間優(yōu)選浸泡4次，每次7天。
上述步驟(1)中，乙酸乙酯萃取前，還可以先用石油醚萃取一下粗提物， 從而除去粗提物中的油脂性物質(zhì)，減少乙酸乙酯層的雜質(zhì)。
上述步驟(2)中，對乙酸乙酯層進(jìn)行硅膠柱層析梯度洗脫，通過薄層層 析分析后硅膠柱和凝膠柱純化得到目的產(chǎn)物，其原理和操作均為本領(lǐng)域技術(shù)人 員所共知的，具體操作時可優(yōu)選如下方案
a. 將步驟(1)得到的乙酸乙酯層進(jìn)行硅膠柱層析梯度洗脫，洗脫劑可選 擇氯仿-甲醇混合液，該混合液濃度采用氯仿甲醇=100: 0 50: 50的一系列 體積比，洗脫后采用薄層層析(TLC)進(jìn)行追蹤，合并相同的組分；所述硅膠 柱層析以及TLC的操作均參考教科書上的常規(guī)操作；
b. 根據(jù)薄層層析的分析結(jié)果，選擇用氯仿甲醇的體積比為98: 2的氯仿-甲醇混合液洗脫得到的組分，對該組分再進(jìn)行硅膠柱層析，洗脫劑采用石油 醚丙酮的體積比=90: 10 20: 80的一系列石油醚-丙酮混合液進(jìn)行梯度洗脫，
洗脫后采用薄層層析進(jìn)行追蹤合并相同的組分；所述硅膠柱層析以及TLC的 操作均參考教科書上的常規(guī)操作；
C.根據(jù)薄層層析分析結(jié)果，選擇用石油醚丙酮的體積比為4: 1的石油
醚-丙酮混合液洗脫時得到的組分，并對該組分再次進(jìn)行硅膠柱層析，層析后
可選擇石油醚-乙酸乙酯混合液(石油醚乙酸乙酯=3: 1，體積比)進(jìn)行洗 脫，洗脫液進(jìn)行薄層層析分析，收集用石油醚乙酸乙酯的體積比=3: 2的石
油醚-乙酸乙酯混合液作為展開劑時薄層層析上得到的Rf值為0.4和0.6兩點(diǎn)， 即為粗品。
將上述得到的兩份粗品分別進(jìn)行純化處理，所述純化處理可選擇葡聚糖凝 膠柱層析純化(純化時凝膠柱可選擇LH-20填料，甲醇洗脫)，最后分別純化 得到兩份無色透明固體，對這兩份無色透明固體均通過光譜信號(紅外光譜，
紫外光譜，質(zhì)譜和核磁共振光譜)進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)為兩種新物質(zhì) Catunaregin[其結(jié)構(gòu)式如式(I )所示]和Epicatunaregin[其結(jié)構(gòu)式如式(II ) 所示]。
上述步驟(2)中，所用硅膠為本領(lǐng)域進(jìn)行硅膠柱層析時常用的硅膠填料， 優(yōu)選高溫(105i:干燥30min)活化的200~300目硅膠。
本發(fā)明的Catunaregin和Epicatunaregin具有細(xì)胞毒活性，對咸水奸具有明 顯的致死作用，還能誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞株的凋亡，可用于制備抗乳腺癌的藥物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
l.本發(fā)明的苯丙素衍生物與現(xiàn)有苯丙素類化合物相比，具有3個相互駢合的氧環(huán)結(jié)構(gòu)其中包括兩個縮醛結(jié)構(gòu)片斷的新骨架結(jié)構(gòu)，新骨架結(jié)構(gòu)會賦予物質(zhì) 不同于現(xiàn)有物質(zhì)的新的性質(zhì)特點(diǎn)，因此對本發(fā)明苯丙素衍生物的研究將極大地 擴(kuò)充苯丙素的研究領(lǐng)域，目前本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該苯丙素衍生物對咸水蝦和人 乳腺癌細(xì)胞株具有毒殺作用，可將本發(fā)明苯丙素衍生物應(yīng)用于抗腫瘤領(lǐng)域；
2. 本發(fā)明的苯丙素衍生物是來源于海洋生物山石榴的一對差向異構(gòu)體，它 們作為一種新的藥物先導(dǎo)化合物，不但自身在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)
用前景，而且它們的衍生物也將極大地豐富抗腫瘤藥物種類；
3. 本發(fā)明苯丙素衍生物的制備方法采用95%工業(yè)酒精浸泡提取、乙酸乙酯 萃取、柱層析和薄層層析相結(jié)合的方法，步步結(jié)合富集并且定位苯丙素衍生物， 不但結(jié)果準(zhǔn)確而且純度高。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一歩地描述，但具體實(shí)施例并不對本 發(fā)明做任何限定。
實(shí)施例i式(i)和式(n)所示化合物的制備
本實(shí)施例采用本領(lǐng)域技術(shù)人員從植物中分離獲得某活性成分常用的提取、 萃取以及柱層析和薄層層析相結(jié)合的分離方法，從紅樹植物山石榴的莖枝中得 到兩種新物質(zhì)，并對它們進(jìn)行光譜信號分析鑒定，發(fā)現(xiàn)這兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如 式(i)和式(n)所示，這兩個化合物為一對差向異構(gòu)體，屬于苯丙素類化 合物，但是具有不同于現(xiàn)有苯丙素類化合物的新骨架結(jié)構(gòu)。
本實(shí)施例的制備方法，其具體步驟如下
(1)將紅樹植物山石榴的莖枝自然涼干粉碎，取粉碎后的材料4.9Kg，用 95體積％的工業(yè)酒精室溫浸泡提取4次，每次7天，合并提取液減壓濃縮后得粗提取物，將該粗提取物加水混懸后得到混合液，先向該混合液中加入等體 積的石油醚，石油醚將混合液中的油脂性雜質(zhì)萃取出來，棄去石油醚萃取層， 重復(fù)萃取3次后，向己經(jīng)除去部分油脂性雜質(zhì)的混合液中加入等體積的乙酸乙 酯，取乙酸乙酯層保留，重復(fù)萃取3次后收集合并乙酸乙酯層，并減壓濃縮；
(2) 將上述減壓濃縮后的乙酸乙酯層進(jìn)行硅膠柱層析(200 300目，800g
硅膠)，用氯仿甲醇的體積比為100: 0~50: 50的一系列氯仿-甲醇混合液為 洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，然后薄層層析分析合并相似組分，最后得到7個組分；
所述硅膠柱層析以及薄層層析的操作均按照本領(lǐng)域的常規(guī)操作；
(3) 根據(jù)薄層層析結(jié)果，在上述7個組分中，選擇用氯仿甲醇的體積比
為98: 2的氯仿-甲醇混合液洗脫得到的組分，可命名為組分F3，將該F3組 分再次進(jìn)行硅膠柱層析(200~300目，300g硅膠)，洗脫劑采用石油醚丙酮 的體積比=90: 10 20: 80的一系列石油醚-丙酮混合液進(jìn)行梯度洗脫，然后薄
層層析分析合并相似組分，最后得到10個組分；所述硅膠柱層析以及薄層層
析的操作均按照本領(lǐng)域的常規(guī)操作；
(4) 根據(jù)薄層層析結(jié)果，在上述10個組分中，選擇用石油醚丙酮的體 積比為4: 1的石油醚-丙酮混合液洗脫時得到的組分，可命名為組分F8，對 該組分F8再次進(jìn)行硅膠柱層析(200-300目，50g硅膠)，層析后選擇石油醚-乙酸乙酯混合液(石油醚乙酸乙酯=3: 1，體積比)進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)行 薄層層析分析，收集用石油醚乙酸乙酯的體積比=3: 2的石油醚-乙酸乙酯
混合液作為展開劑時薄層層析上Rf值為0.4和0.6的兩點(diǎn)，即得到兩份粗品。 將上述兩份粗品分別通過葡聚糖凝膠柱(甲醇為洗脫劑，填料型號為 LH-20)層析純化，最終分別得到9mg和1.7mg的兩份無色透明固體，對所得到的兩份無色透明固體進(jìn)行紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜和核磁共振光譜等光譜 信號分析鑒定。 鑒定結(jié)果
1、 9mg無色透明固體
該化合物是無色的無定型固體，根據(jù)高分辨質(zhì)譜HRESIMS推導(dǎo)它的分子 式為C16H2()05;它的IR譜顯示羥基(3411 cm")，苯環(huán)(1606， 1518和1454 cm"); & NMR譜顯示一個羥基氫[4i 5.59 (1H， s)]， 一套ABX系統(tǒng)的氫[& 6.82 (1H, d,J-1.7 Hz) ,6.89 (1H, (!，《/= 8.1 Hz) ,6.81 (1H, dd, /= 8.1, 1.7 Hz)]，兩個 甲基氫[^ 1.50, 1.61 (3H， s)]， 一個亞甲基氫[& 1.89 (1H, (!(!, /= 3.9, 12.5 Hz) 和2.28 (1H, d, /= 12.5 Hz)]，兩個次甲基氫[^ 2.50 (1H, ddt, /= 10.2, 4.0， 2.1 Hz) ,2.72 (lH,dd,J^ 10.2， 3.8 Hz)]， 一個氧次甲基氫[& 4.96 (1H, d, /=4.0 Hz)]， 一個氧亞甲基氫[&3.77 (2H,d, J=2.0Hz))]， 一個甲氧基氫[& 3.90
(3H,s) ]; 13C (DEPT) NMR譜顯示16個碳信號除了兩個季碳106.0, 115.3)夕卜，其它信號(一個苯環(huán)結(jié)構(gòu)& 146.6、 145.2、 134.5、 118.9、 114.5、 108.7， 一個甲氧基兩個甲基&22.6、 24.8， 一個亞甲基& 33.3， 一個氧亞甲基兩個次甲基& 45.8, 47.9， 一個氧次甲基^85.3)均 與氫譜顯示信息相一致，根據(jù)化學(xué)位移推斷兩個季碳可能是烯碳或是縮酮的 碳。從以上信息可推斷該化合物有3個環(huán)或者是2個環(huán)與一個雙鍵。
結(jié)合HMBC譜和^」H COSY譜可以推出化合物的結(jié)構(gòu)片斷HMBC譜 顯示&4.96 (&85.3)與&47.9, 63.0, 108.7， 118.9, 134.5相關(guān)，推出phenyl-CH
(&85.3) -CH(&47.9) -CH2- (&63.0)-片斷的存在。在HMBC譜中^b 106.0 與& 1.89 (1H, dd, 3.9， 12.5 Hz) , 2.28 (1H, d, /= 12.5 Hz) , 1.50 (3H, s)相關(guān)，'H」H COSY中^ 1.89 (1H, dd, /= 3.9, 12.5 Hz)與^ 2.72 (lH，dd乂=10.2, 3.8 Hz)相關(guān)，推出CH3 (&24.8) -C 106.0) -CH2 (&33.3)隱CH(^:45.8)-片斷的存在。HMBC譜&1.61 (3H, s)與& 115.3, 45.8相關(guān)推出CH3 (^22.6) -C 115.3) -CH (^45.8)-片斷的存在。iH」HCOSY譜中^2.72 (lH,dd,J^ 10.2, 3.8 Hz)與&2.50 (1H， ddt, /= 10.2， 4.0, 2.1 Hz)相關(guān)推出&45.8與&47.9相連。除此之夕卜，HMBC譜中c5H 3.77 (2H, d,/= 2.0 Hz)和& 106.0的相關(guān)信號說明了醚鍵的存在。結(jié)合以上信息和分子式可推出該化合物的平面結(jié)構(gòu)。
根據(jù)1HNMR的耦合常數(shù)和NOESY可推出化合物的相對構(gòu)型如式(I )所示。H-8和H-10之間的耦合常數(shù)(/二10.2Hz)說明結(jié)構(gòu)中的吡喃環(huán)呈船式構(gòu)型，H-7和H-8之間的小的耦合常數(shù)(《/=4.0HZ)說明H-7和H-8處于反式位置，所以H-7處于^位。在NOESY中，H-7和H-8有弱的相關(guān)信號，H-7和H-10沒有相關(guān)信號，證明了該化合物的相對構(gòu)型。經(jīng)CA檢索式(I )所示化合物為新化合物，屬于苯丙素衍生物，命名為Catunaregin。
其物理常數(shù)為[a產(chǎn)d + 1.4° (c 0.8, MeOH); UV (MeOH) wx (logs) 198(3.16), 218 (3.54), 227 (3.72) 279 (3.19) nm; IR (KBr) d應(yīng)341 1, 2985, 2937, 1606,1518, 1454, 1386,1272, 1238 cm-1; ESIMS: m/z 293 [M + H]+, 315 [M + Na]+, 331[M + K]+, 607 [2M + Na]+, 623 [2M + K]+; HRESIMS: m/z 315.1202 (C16H20O5Na[M + Na]+m/z 315.1203)。
2、 1.7mg無色透明固體
該化合物也是無色的無定型固體，在TLC板上經(jīng)5%硫酸顯色劑顯色與Catunaregin同為紫紅色。經(jīng)高分辨質(zhì)譜HRESIMS推出分子式為C16H2。05。通過比較光譜數(shù)據(jù)可以看出，該化合物和Catunaregin的IR譜和UV譜的相似，^NMR和"CNMR譜中除幾個氫和碳的信號[如H-7 (&5.63)向低場位移了 0.67ppm;H-13a和H-13b在& 2.04處重疊；C-IO( & 38.0)和C-13(&26.9)分別向高場位移了7.8 ppm和7.3 ppm]外其它信號與Catunaregin信號基本一致。
結(jié)合HSQC、 HMBC和1H-1H COSY譜可以推出該化合物的平面結(jié)構(gòu)與Catunaregin相同。不同的是& NMR譜中耦合常數(shù)(《/7,8 = 7.0 Hz)證明了 H-7和H-8是順式的，因此H-7是oc位。NOESY譜中H-7和H-8之間的強(qiáng)相關(guān)信號也證明了這一推斷，因此該化合物和Catunaregin是一對差向異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)式如式(II)所示，經(jīng)CA檢索式(II)所示化合物為新化合物，屬于苯丙素衍生物，命名為Epicatunaregin 。
其物理常數(shù)為[a]2°D0(c0.1,MeOH); UV (MeOH) >wx (logs) 220 (3.90),223 (3.97), 278 (3.39) ■; IR (KBr) iw 3426, 2984, 2937, 1603, 1516, 1463, 1382:1274, 1237cm"; ESIMS: m/z 293 [M + H]+, 315 [M + Na]+, 331 [M + K]+, 623[2M +K]+; HRESIMS: m/z 315.1205 (C16H20O5Na [M + Na]+ m/z 315.1203).
實(shí)施例2 Catunaregin和Epicatunaregin對咸水蝦的致死活性實(shí)驗(yàn)
取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加200|il含10~15個海蝦幼蟲的人工海水液，制成測試培養(yǎng)板。
本實(shí)施例設(shè)空白對照組和樣品組空白對照組是向上述測試培養(yǎng)板中加入5pl溶劑二甲基亞砜(DMSO);樣品組是將實(shí)施例1制備所得Catunaregin用溶劑DMSO溶解后制備得到Catunaregin含量為500pg/mL、 50|ig/mL和5pg/mL三個濃度的樣品液，樣品組分三個組，l組是向上述測試培養(yǎng)板中加入5jLil濃度為500pg/mL的樣品液，2組是向上述測試培養(yǎng)板中加入5pl濃度為50pg/mL的樣品液，3組是向上述測試培養(yǎng)板中加入5pl濃度為5pg/mL的樣品液?？瞻讓φ战M和三個樣品組均各設(shè)3個平行實(shí)驗(yàn)。
將空白對照組和樣品組均在室溫培養(yǎng)24h后，在雙目解剖鏡下檢測計數(shù)海
蟲下死亡個體數(shù)目。
海蟲下生物致死活性用校正死亡率表示，按下列公式計算校正死亡率=(對照組存活率一處理組存活率)/對照組存活率xlOOX。將500pg/mL、 50pg/mL和5pg/mL三個濃度及其對應(yīng)的校正死亡率輸入
計算機(jī)，計算半數(shù)致死濃度LC5Q及其95 %置信區(qū)間，Catunaregin的LC50為
15.15jig/mL。
按照上述方法對Epicatunaregin進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，Epicatunaregin的LC50為45.98 |Lig/mL。
由上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出，Catunaregin和Epicatunaregin具有明顯的咸水蟲下致死活性。
實(shí)施例3 MTT法測定Catunaregin和Epicatunaregin的抗腫瘤活性
本實(shí)施例選擇腫瘤細(xì)胞一人乳腺癌FIO (市售)為研究對象，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員檢測細(xì)胞存活和生長常規(guī)使用的MTT比色法，對Catunaregin和Epicatunaregin進(jìn)行腫瘤細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)。
樣品組將實(shí)施例1制備所得Catunaregin以DMSO溶解后制備Catunaregin含量為O.Ol、 0.1、 1、 IO和10(Hig/mL五個濃度的樣品組。
陽性對照組5 —氟脲嘧啶。
陰性對照組0.5體積Q/。DMSO的細(xì)胞完全培養(yǎng)液(市售)。
14收集對數(shù)生長期的F10細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)為
1.0x105/10(^1，置于5體積％<:02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日去掉培養(yǎng)基，分別加入五個濃度樣品組、陽性對照組和陰性對照組；48小時后，每孔加入MTT10pl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，再每孔加入DMSO10(nil終止反應(yīng)，常溫放置l小時，用酶標(biāo)儀檢測各孔在570nm處的吸光度A值，計算細(xì)胞生長抑制率，計算式如下生長抑制率(％) = [ (A陰性一A實(shí)驗(yàn))/ (A陰性一A空。)]xl00%Catunaregin對F10細(xì)胞生長的半數(shù)抑制率IC5o為5.33|ig/mL。按照上述方法對Epicatunaregin進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，Epicatunaregin對F10細(xì)胞生長的半數(shù)抑制率IC5G為12.76昭/mL。
由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，Catunaregin和Epicatunaregin對人乳腺癌細(xì)胞具有很好的毒殺作用，說明本發(fā)明的Catunaregin和Epicatunaregin具有抗腫瘤活性，可用于制備抗乳腺癌的藥物。
權(quán)利要求
1、一種苯丙素衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式(I)或式(II)所示。
2、 一種制備權(quán)利要求1所述苯丙素衍生物的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1) 將紅樹植物山石榴用95%工業(yè)酒精浸泡提取，將提取液減壓濃縮得粗 提物，粗提物再用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯層；(2) 將上述乙酸乙酯層進(jìn)行硅膠柱層析，梯度洗脫后再由薄層層析分析得 到粗品，將粗品進(jìn)行純化后即可得到權(quán)利要求1所述苯丙素衍生物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述粗提物 用乙酸乙酯萃取前先用石油醚萃取。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述乙酸乙 酯層進(jìn)行硅膠柱層析，梯度洗脫后再由薄層層析分析得到粗品的具體步驟為(1) 將乙酸乙酯層進(jìn)行硅膠柱層析，用氯仿甲醇的體積比為100: 0~50: 50的一系列氯仿-甲醇混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫；(2) 洗脫后，選擇用氯仿和甲醇的體積比為98: 2的氯仿-甲醇混合液洗脫 吋得到的組分，將該組分進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚和丙酮的體積比為90: 10~20: 80的一系列石油醚-丙酮混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫；(3) 洗脫后，選擇用石油醚丙酮的體積比為4: 1的石油醚-丙酮混合液洗脫得到的組分，將該組分進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚和乙酸乙酯的體積比為 3: 1的石油醚-乙酸乙酯混合液為洗脫劑，洗脫后薄層層析，用石油醚乙酸 乙酯的體積比為3: 2的石油醚-乙酸乙酯混合液作為展開劑，收集該薄層層析上Rf值為0.4和0.6的兩點(diǎn)，即為粗品。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述將粗品 進(jìn)行純化是采用葡聚糖凝膠柱對粗品進(jìn)行純化。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，所述硅膠柱層析的填料 為200-300目硅膠。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，浸泡 次數(shù)為4次，每次7天。
8、 權(quán)利要求1所述苯丙素衍生物在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種苯丙素衍生物及其制備方法和在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用，該苯丙素衍生物為一對差向異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)式如式(I)和式(II)所示。本發(fā)明的苯丙素衍生物是采用95％工業(yè)酒精提取、柱層析和薄層層析相結(jié)合的方法從紅樹植物山石榴中制備而得。本發(fā)明的苯丙素衍生物具有不同于現(xiàn)有苯丙素類化合物的新骨架結(jié)構(gòu)，且該苯丙素衍生物對咸水蝦和人乳腺癌細(xì)胞具有毒殺作用，因此本發(fā)明的苯丙素衍生物可作為藥物先導(dǎo)化合物用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域，如可用于制備抗乳腺癌藥物。
文檔編號C07D493/18GK101538272SQ20091003885
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者浩 尹, 偲 張, 李慶欣, 漆淑華, 羅雄明, 肖志會, 高廣春 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所