專利名稱：一種穩(wěn)定性同位素¹⁵N標(biāo)記八肽GFL的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定性同位素標(biāo)記化合物，尤其涉及一種穩(wěn)定性同位素"N標(biāo)記八 肽GFL的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著后基因組計(jì)劃的到來，蛋白質(zhì)組研究成為生命科學(xué)的最前沿。在用核磁共 振(NMR)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及定量蛋白質(zhì)組學(xué)方面，穩(wěn)定同位素(2H、 13C、 15N) 標(biāo)記的多肽和蛋白質(zhì)都大有用武之地，此類化合物已成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域不可或缺 的重要工具。
目前，標(biāo)記多肽作為定量蛋白質(zhì)組中的"化學(xué)標(biāo)簽"廣泛應(yīng)用于生物示蹤與生 物檢測等領(lǐng)域。然而，有關(guān)于15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記八肽GFL的制備工藝還未見 相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種工藝合理、產(chǎn) 品純度高的穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL的制備方法。 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
一種穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL (擬生長因子)的制備方法，其特征在于， 該方法采用Fmoc(9-芴甲氧羰?；?固相肽合成法，以Wang-樹脂為載體，以Fmoc 保護(hù)的氨基酸為原料，該原料中至少有一個(gè)氨基酸為穩(wěn)定性同位素"N標(biāo)記的，以 HBTU (2- (lH-苯并三唑)-N， N， N，， N，-四甲基脲六氟磷酸鹽)/HOBt (l-羥基 苯并三唑)/DIEA (N， N-二異丙基乙胺)為縮合試劑，逐一接入氨基酸，氨基酸 接完后經(jīng)剪切、純化制得穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL。
所述的方法具體包括以下步驟 (1) Fmoc-Ile-Wang樹脂的制備1) 將1.5mmol/g取代量的Wang-樹脂放入干燥的多肽合成管中；
2) 用二氯甲烷溶脹10 60min，用水泵抽干溶劑二氯甲垸，換用DMF洗滌5 次，每次用量2 5ml;
3 )取2~10叫HBTU，加2~10eq Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，加5~15eq DIEA， 混勻；
4) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l-2小時(shí)；
5) DMF 5mlx5min洗滌；
6) 用2 10eq苯甲酸酐或醋酸酐加leq吡啶封閉樹脂上未反應(yīng)的羥基，DMF 作反應(yīng)溶劑，反應(yīng)l小時(shí)；
7) 用DMF、 DCM (二氯甲垸)、甲醇或正己垸5mlx5min洗滌，真空干燥， 得到Fmoc-Ile-Wang樹脂；
(2)穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL的制備 采用固相多肽合成的方法，從Fmoc-Ile-Wang樹脂出發(fā)，用多肽合成管制備， 具體如下
1) 將0.1mmolFmoc-Ile-Wang樹脂放入干燥的反應(yīng)器中；
2) 用二氯甲垸溶脹10 60min， DMF洗滌5mlx5min;
3) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2-3倍；
4) DMF洗滌5mlx5min;
5) 取2 5eq HBTU， 2~5叫HOBt， 2~5叫Fmoc-Arg (Pbf)隱OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混勻;
6) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；
7) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min， 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次， 溶液體積為溶脹后樹脂體積的2-3倍；
8) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;
9) 取2 5eq HBTU， 2~5eq HOBt， 2 5叫Fmoc畫Arg (Pbf)誦OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混勻;
10) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；
11) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
12) 30M哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的2-3倍；
13) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;
14) 取2~5eq HBTU， 2 5eq HOBt， 2~5叫Fmoc-Leu國OH，少量DMF溶解， 加4 10eqDIEA，混勻；
15) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；
16) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
17) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2-3倍；
18) 用DMF或DCM或甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;
19) 取2 5叫HBTU， 2 5叫HOBt， 2~5叫Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqD正A，混勻；
20) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；
21) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
22) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2-3倍；
23) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;
24) 取2 5eqHBTU， 2~5叫HOBt， 2~5叫Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqDIEA，混勻；
25) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；
26) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
27) 30n/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2陽3倍；
28) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;
29) 取2 5eqHBTU， 2 5叫HOBt， 2~5eq Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqD正A，混勻；
30) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；
31) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
32) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2-3倍;
33) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;34) 取2 5eqHBTU， 2 5叫HOBt， 2~5eq Fmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混勻；
35) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；
36) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
37) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2-3倍；
38) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;
39) 用甲醇收縮樹脂，加入少許甲醇，反應(yīng)5min，重復(fù)2 5次；
40) 用正己烷洗滌2 5次后，真空干燥；
41) 剪切、純化將干燥后的樹脂置于離心管中，加入剪切液靜置反應(yīng)1~5 小時(shí)，反應(yīng)完過濾，向?yàn)V液中加入5 10倍濾液體積的冷乙醚，沉淀產(chǎn)生，離心， 收集沉淀，烘干得到穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL;
上述步驟(1) 3)的Fmoc-Ile國OH、步驟(2) 5)的Fmoc-Arg (Pbf) -OH、 步驟(2) 9)的Fmoc-Arg (Pbf) -OH、步驟(2) 14)的Fmoc-Leu-OH、步驟(2) 19)的Fmoc-Phe-OH、步驟(2)24)的Fmoc-Gly-OH、步驟(2)29)的Fmoc-Gly-OH、 步驟(2) 34)的Fmoc-Tyr (tbu) -OH中至少有一個(gè)為穩(wěn)定性同位素"N標(biāo)記的氨 基酸。
所述的步驟(2) 1)中的O.lmmolFmoc-Ile-Wang樹脂根據(jù)取代量A計(jì)算稱量， 所述的取代量A的測定如下
(1) 稱量干燥的Fmoc-Ile-Wang樹脂，獲得樹脂質(zhì)量，以mg計(jì)；
(2) 按3mL/1.5mgFmoc-Ile-Wang樹脂加入20Q/。體積比的哌啶-DMF，間歇 搖動(dòng)2-3h;
(3) 以20。/。體積比的哌啶-DMF作參比溶液，測量290nm的吸光度N;
(4) 以下列公式計(jì)算取代量
A-取代量(mmol/g) = (Nxl0) / (質(zhì)量xl.75)。
所述的步驟(2) 41)的剪切液為混合均勻的三氟醋酸，三異丙基硅垸和水， 所述的三氟醋酸的體積比為50~80%，所述的三異丙基硅烷的體積為2~10%。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明工藝合理，操作簡單，節(jié)約成本，解決了現(xiàn)有合成反 應(yīng)中豐度稀釋、純度不高、工藝繁瑣、原料消耗大等問題，獲得的穩(wěn)定性同位素 15N標(biāo)記八肽GFL純度高(可達(dá)99%以上)、豐度高(可達(dá)97%以上)，同時(shí)，本發(fā)明還具有生產(chǎn)周期短、工藝穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明多肽合成管示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面對照附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。 實(shí)施例1
一種穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL Tyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的
制備方法，該方法包括以下步驟
一、 Fmoc-Ile-Wang樹脂制備
(1) 放Wang-樹脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；
(2) 用二氯甲垸溶脹60min,用水泵抽干溶劑二氯甲垸，換用DMF洗滌5 次，每次用量5ml;
(3) 取4eq (即Wang樹脂摩爾量的4倍，下同)HBTU，加4eqFmoc-Ile-OH， 少量DMF溶解，力卩8eq DIEA，混勻；
(4) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(5) DMF 5mlx5min洗滌；
(6) 用5eq苯甲酸酑加leq吡啶封閉樹脂上未反應(yīng)的羥基，DMF作反應(yīng)溶 劑，反應(yīng)l小時(shí)；
(7) 用DMF洗滌5mlx5min，真空干燥樹脂，得到Fmoc-Ile-Wang樹脂。 Fmoc-Ile-Wang樹脂上載量的測定
(1) 稱一份干燥的Fmoc-Ile-Wang樹脂1.5mg;
(2) 力口3mL20M體積比的哌啶(溶于DMF)，間歇搖動(dòng)3h;
(3) 以20%體積比的哌啶(溶于DMF)作參比溶液，測量290nm的吸光度
N;
以下列公式計(jì)算取代量
A=Loading(mmol/g)= (N吸光度xlO)/(質(zhì)量xl.75)K0.1764x10)/( 1.5x1.75) =0.672mmol/g
二、 八肽GFLTyr-Gly承-Gly氣Phe、Leu承-Arg匿Arg隱Ile的制備
10采用固相多肽合成的方法，從Fmoc-Ile-Wang樹脂出發(fā)，用多肽合成管(如圖 l所示)制備，具體如下
(1) 放0.1mmolFmoc-Ile-Wang樹脂(根據(jù)取代量A計(jì)算即150mg)在干燥 的反應(yīng)器中；
(2) 用二氯甲烷溶脹30min， DMF洗滌5mlx5min;
(3) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的
2倍；
(4) DMF洗滌5mlx5min;
(5) 取4eqHBTU， 4eqHOBt, 4叫Fmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加10eqDIEA，混勻；
(6) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(7) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min，重復(fù)(3) 脫Fmoc;
(8) 用DMF或DCM或甲醇或正己垸洗滌5x5min;
(9) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加4eqD正A，混勻；
(10) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(11) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(12) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2-3倍；
(13) 用DMF洗滌5x5min;
(14) 取4eqHBTU， 4叫HOBt, 4eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，力口 10eqD正A，混勻；
(15) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(16) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(17) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2倍；
(18) 用DMF或DCM或甲醇或正己烷洗滌5x5min;
(19) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加 lOeqDIEA，混勻；
(20) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；(21) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(22) 30n/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2倍；
(23) 用DMF洗滌5x5min;
(24) 取4eqHBTU, 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 10eqDIEA，混勻；
(25) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；
(26) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(27) 30M哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2倍；
(28) 用DMF洗滌5x5min;
(29) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，力口 10eqDIEA，混勻；
(30) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(31) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(32) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積
的2倍；
(33) 用DMF洗滌5x5min;
(34) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eqFmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶解， 加10eqDIEA，混勻；
(35) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(36) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(37) 30n/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2倍；
(38) 用DMF洗滌5x5min;
(39) 用甲醇收縮樹脂，加入少許甲醇，反應(yīng)5min，重復(fù)5次；
(40) 用正己烷洗滌5次后，真空干燥；
(41) 剪切將"N-八肽從WANG樹脂上剪切下；配置剪切溶液將三氟醋 酸，三異丙基硅垸，水按照80: 2: 18的比例混合均勻；將干燥完樹脂置于離心管 中，加入事先配好的剪切液靜置反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)完過濾，向?yàn)V液中加入10倍濾液體積的冷乙醚，沉淀產(chǎn)生，離心，收集沉淀，烘干得到230mg"N八肽GFL，純 度達(dá)99.3%，豐度達(dá)97.5%。
實(shí)施例2
一種穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL Tyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的 制備方法，該方法包括以下步驟
一、 Fmoc-Ile-Wang樹脂制備
(1) 放Wang-樹脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；
(2) 用二氯甲垸溶脹30min，用水泵抽干溶劑二氯甲烷，換用DMF洗滌5 次，每次用量2 5ml;
(3) 取10eqHBTU，加lOeqFmoc陽Ile-OH，少量DMF溶解，加10eqDIEA，
混勻；
(4) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)； (5 ) DMF洗滌5mlx 5min洗滌；
(6) 用10eq醋酸酐加leq吡啶封閉樹脂上未反應(yīng)的羥基；DMF作反應(yīng)溶劑； 反應(yīng)1小時(shí)；
(7) 用DCM洗滌5mlx5min;真空干燥樹脂，得到Fmoc-Ile-Wang樹脂。 Fmoc-Ile-Wang樹脂上載量的測定
(1) 稱一份干燥的Fmoc-Ile-Wang樹脂1.5mg;
(2) 力口3mL20y。體積比的哌啶(溶于DMF)，間歇搖動(dòng)2h;
(3) 以20%體積比的哌啶(溶于DMF)作參比溶液，測量290nm的吸光度
N;
以下列公式計(jì)算取代量
A=Loading (mmol/g) = (N吸光度x10) / (質(zhì)量xl.75) = (0.3x10) / (2.7x1.75) =0.635mmol/g
二、 八肽GFLTyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的制備
釆用固相多肽合成的方法，從Fmoc-Ile-Wang樹脂出發(fā)，用多肽合成管(參見 圖l所示)制備，具體如下
(1)放0.1mmolFmoc-Ile-Wang樹脂(根據(jù)取代量A計(jì)算即157mg)在干燥 的反應(yīng)器中；(2) 用二氯甲烷溶脹60min， DMF洗滌5mlx5min;
(3) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的
3倍；
(4) DMF洗滌5mlx5min;
(5) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加8eqDIEA，混勻;
(6) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(7) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min，重復(fù)(3) 脫Fmoc;
(8) DCM洗滌5x5min;
(9) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加8eqDIEA，混勻；
(10) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(11) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(12) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(13) 用DCM洗滌5x5min;
(14) 取5叫HBTU， 5eqHOBt， 5eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，加 8eqDIEA，混勻；
(15) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(16) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(17) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(18) 用DCM洗滌5x5min;
(19) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eq 15N-Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加 8叫DIEA，混勻；
(20) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(21) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(22) 30n/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(23) 用DCM洗滌5x5min
14(24) 取5eqHBTU， 5eqH0Bt， 5eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 8eqDIEA，混勻；
(25) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(26) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(27) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(28) 用DCM洗滌5x5min;
(29) 取5eqHBTU， 5eq HOBt， 5eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 8叫DIEA，混勻；
(30) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(31) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(32) 3(P/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(33) 用DCM洗滌5x5min;
(34) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2eqFmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶解， 加4eqDIEA，混勻；
(35) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(36) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(37) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(38) 用DCM洗滌5x5min;
(39) 用甲醇收縮樹脂，加入少許甲醇，反應(yīng)5min，重復(fù)3次；
(40) 用正己烷洗滌3次后，真空干燥；
(41) 剪切將"N-八肽從WANG樹脂上剪切下；配置剪切溶液將三氟醋 酸，三異丙基硅垸，水按照60:10:30比例混合均勻；將干燥完樹脂置于離心管中， 加入事先配好的剪切液靜置反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)完過濾，向?yàn)V液中加入8倍濾液體積 的冷乙醚，沉淀產(chǎn)生，離心，收集沉淀，烘干得到256mg15N八肽GFL，純度達(dá) 99.5%，豐度達(dá)97.8%。
實(shí)施例3一種穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL Tyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的
制備方法，該方法包括以下步驟
一、 Fmoc-Ile-Wang樹脂制備
(1) 放Wang-樹脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；
(2) 用二氯甲烷溶脹10min，用水泵抽干溶劑二氯甲垸，換用DMF洗滌2 次，每次用量2ml;
(3) 取8eq HBTU，力卩8叫Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，力B 5eq DIEA，混
勻；
(4) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(5) DMF洗滌5mlx5min洗滌；
(6) 用8eq苯甲酸酐加l叫吡啶封閉樹脂上未反應(yīng)的羥基；DMF作反應(yīng)溶 劑；反應(yīng)l小時(shí)；
(7) 用甲醇洗滌5mlx5min;真空干燥樹脂，得到Fmoc-Ile-Wang樹脂。 Fmoc-Ile-Wang樹脂上載量的測定
(1) 稱一份干燥的Fmoc-Ile-Wang樹脂1.5mg;
(2) 力口3mL20。/o體積比的哌啶(溶于DMF)，間歇搖動(dòng)2-3h;
(3) 以20%體積比的哌啶(溶于DMF)作參比溶液，測量290nm的吸光度
N;
以下列公式計(jì)算取代量
A=Loading(mmol/g)= (N吸光度xlO)/(質(zhì)量xl.75)K0.1801x10)/( 1.5x1.75) =0.686mmol/g
二、 八肽GFLTyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的制備 采用固相多肽合成的方法，從Fmoc-Ile-Wang樹脂出發(fā)，用多肽合成管(參見
圖l所示)制備，具體如下
(1) 放O.lmmolFmoc-Ile-Wang樹脂(根據(jù)取代量A計(jì)算即146mg)在干燥 的反應(yīng)器中；
(2) 用二氯甲烷溶脹10min， DMF洗滌5mlx5min;
(3) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的
3倍；
(4) DMF洗滌5mlx5min;(5) 取2eqHBTU, 2eqHOBt， 2eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加4eqDIEA，混勻;
(6) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(7) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min，重復(fù)(3) 脫Fmoc;
(8) 甲醇洗滌5x5min;
(9) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加4叫DIEA，混勻；
(10) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(11) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(12) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(13) 用甲醇洗滌5x5min;
(14) 取2eqHBTU， 2叫HOBt， 2eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，加 4叫DIEA，混勻；
(15) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(16) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(17) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(18) 用DCM洗滌5x5min;
(19) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2eq 15N-Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加 4叫DIEA，混勻；
(20) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(21) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(22) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(23) 用DCM洗滌5x5min;
(24) 取5eqHBTU， 5叫HOBt， 5eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 8叫DIEA，混勻；
(25) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(26) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
17(27) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(28) 用甲醇洗滌5x5min;
(29) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 4eqDIEA，混勻；
(30) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(31) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(32) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(33) 用DCM洗滌5x5min;
(34) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶解， 加8叫DIEA，混勻；
(35) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(36) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(37) 30M哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(38) 用DCM洗滌5x5min;
(39) 用甲醇收縮樹脂，加入少許甲醇，反應(yīng)5min，重復(fù)2次；
(40) 用正己烷洗滌3次后，真空干燥；
(41) 剪切將"N-八肽從WANG樹脂上剪切下；配置剪切溶液將三氟醋
酸，三異丙基硅烷，水按照70:8:22比例混合均勻；將干燥完樹脂置于離心管中， 加入事先配好的剪切液靜置反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)完過濾，向?yàn)V液中加入8倍濾液體積 的冷乙醚，沉淀產(chǎn)生，離心，收集沉淀，烘干得到260mg15N八肽GFL，純度達(dá) 99.8%，豐度達(dá)98.3%。
實(shí)施例4
一種穩(wěn)定性同4立素15N標(biāo)記八肽GFL Tyr、Gly、Gly、Phe、Leu氣Arg^Arg、Ile承的 制備方法，該方法包括以下步驟
一、Fmoc-Ile-Wang樹脂制備 (1)放Wang-樹脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；(2) 用二氯甲垸溶脹60min，用水泵抽干溶劑二氯甲烷，換用DMF洗滌5 次，每次用量5ml;
(3) 取4叫HBTU,力n 4eq15N-Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，加8eqDIEA，
混勻；
(4) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(5) DMF 5mlx5min洗滌；
(6) 用5eq苯甲酸酐加leq吡啶封閉樹脂上未反應(yīng)的羥基，DMF作反應(yīng)溶 劑，反應(yīng)l小時(shí)；
(7) 用DMF洗滌5mlx5min，真空千燥樹脂，得到15N-Fmoc-Ile-Wang樹脂。 Fmoc-Ile-Wang樹脂上載量的測定
(1) 稱一份干燥的Fmoc-Ile-Wang樹脂1.5mg;
(2) 力口3mL20。/。體積比的哌啶(溶于DMF)，間歇搖動(dòng)3h;
(3) 以20%體積比的哌啶(溶于DMF)作參比溶液，測量290nm的吸光度
N;
以下列公式計(jì)算取代量
A=Loading(mmol/g)= (N吸光度xl0)/(質(zhì)量xl.75X0.1764xl0)/(1.5x1.75) =0.672mmol/g
二、八肽GFLTyr、Gly、Gly、Phe、Leu、Arg、Arg、Ile承的制備 采用固相多肽合成的方法，從"N-Fmoc-Ile-Wang樹脂出發(fā)，用多肽合成管(如 圖l所示)制備，具體如下
(1) 放0.1 mmol15N-Fmoc-Ile-Wang樹脂(根據(jù)取代量A計(jì)算即150mg)在 干燥的反應(yīng)器中；
(2) 用二氯甲烷溶脹30min， DMF洗滌5mlx5min;
(3) 30n/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的
2倍；
(4) DMF洗滌5mlx5min;
(5) 取4eqHBTU， 4叫HOBt， 4叫15N-Fmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶 解，力口 10eqDIEA，混勻；
(6) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(7) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min，重復(fù)(3) 脫Fmoc;(8) 用DMF或DCM或甲醇或正己烷洗滌5x5min;
(9) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶 解，加4叫D正A，混勻；
(10) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(11) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(12) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2-3倍；
(13) 用DMF洗滌5x5min;
(14) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，力口 10eqDIEA，混勻；
(15) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(16) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(17) 30W哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2倍；
(18) 用DMF或DCM或甲醇或正己垸洗滌5x5min;
(19) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加 10eqDIEA，混勻；
(20) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(21) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(22) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2倍；
(23) 用DMF洗滌5x5min;
(24) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，力口 10eqDIEA，混勻；
(25) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；
(26) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(27) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2倍；
(28) 用DMF洗滌5x5min;
(29) 取4叫HBTU， 4叫HOBt， 4eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，力口10eqDIEA，混勻；
(30) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(31) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(32) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2倍；
(33) 用DMF洗滌5x5min;
(34) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶 解，加10eqDIEA，混勻；
(35) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；
(36) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(37) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的2倍；
(38) 用DMF洗滌5x5min;
(39) 用甲醇收縮樹脂，加入少許甲醇，反應(yīng)5min，重復(fù)5次；
(40) 用正己垸洗滌5次后，真空干燥；
(41) 剪切將"N-八肽從WANG樹脂上剪切下；配置剪切溶液將三氟醋 酸，三異丙基硅垸，水按照80: 2: 18的比例混合均勻；將干燥完樹脂置于離心管
中，加入事先配好的剪切液靜置反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)完過濾，向?yàn)V液中加入10倍濾 液體積的冷乙醚，沉淀產(chǎn)生，離心，收集沉淀，烘干得到230mg"N八肽GFL。
實(shí)施例5
一種穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFLTyr-Gly-Gly-Phe-Leu*-Arg-Arg-Ile的制備 方法，該方法包括以下步驟
一、Fmoc-Ile-Wang樹脂制備
(1) 放Wang-樹脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；
(2) 用二氯甲垸溶脹30min，用水泵抽干溶劑二氯甲垸，換用DMF洗滌5 次，每次用量2 5ml;
(3) 取10eqHBTU，加10叫Fmoc-Ile國OH，少量DMF溶解，加10eqDIEA，
混勻；
(4) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l小時(shí)；(5) DMF洗滌5mlx5min洗滌；
(6) 用10eq醋酸酐加leq吡啶封閉樹脂上未反應(yīng)的羥基；DMF作反應(yīng)溶劑; 反應(yīng)1小時(shí)；
(7) 用DCM洗滌5mlx5min;真空干燥樹脂，得到Fmoc-Ile-Wang樹脂。 Fmoc-Ile-Wang樹脂上載量的測定
(1) 稱一份干燥的Fmoc-Ile-Wang樹脂1.5mg;
(2) 力口3mL20。/。體積比的哌啶(溶于DMF)，間歇搖動(dòng)2h;
(3) 以20%體積比的哌啶(溶于DMF)作參比溶液，測量2卯nm的吸光度
N;
以下列公式計(jì)算取代量
A=Loading (mmol/g) = (N吸光度x10) / (質(zhì)量xl.75) = (0.3x10) / (2.7x1.75) =0.635mmol/g
二、八肽GFLTyr-Gly-Gly-Phe-Leu*-Arg-Arg-Ile的制備
采用固相多肽合成的方法，從Fmoc-Ile-Wang樹脂出發(fā)，用多肽合成管(參見 圖l所示)制備，具體如下
(1) 放0.1mmolFmoc-Ile-Wang樹脂(根據(jù)取代量A計(jì)算即157mg)在干燥 的反應(yīng)器中；
(2) 用二氯甲烷溶脹60min， DMF洗滌5mlx5min;
(3) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的
3倍；
(4) DMF洗滌5mlx5min;
(5) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加8eqDIEA，混勻；
(6) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(7) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min，重復(fù)(3) 脫Fmoc;
(8) DCM洗滌5x5min;
(9) 取5叫HBTU， 5叫HOBt， 5eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加8eqDIEA，混勻;
(10) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(11) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;(12) 30"/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc, 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(13) 用DCM洗滌5x5min;
(14) 取5eqHBTU， 5eqH0Bt， 5eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，加 8eqDIEA，混勻；
(15) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(16) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(17) 30n/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(18) 用DCM洗滌5x5min;
(19) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eq Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加8eq DIEA，混勻；
(20) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(21) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(22) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(23) 用DCM洗滌5x5min
(24) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加8eq DIEA，混勻；
(25) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(26) 合成完畢，DMF ^先滌5mlx5min;
(27) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(28) 用DCM洗滌5x5min;
(29) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eq Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加8eq DIEA，混勻；
(30) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(31) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(32) 30。/。哌咬-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
23(33) 用DCM洗滌5x5min;
(34) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2叫Fmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶解， 加4eqDIEA，混勻；
(35) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)2小時(shí)；
(36) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;
(37) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積 的3倍；
(38) 用DCM洗滌5x5min;
(39) 用甲醇收縮樹脂，加入少許甲醇，反應(yīng)5min,重復(fù)3次；
(40) 用正己烷洗滌3次后，真空干燥；
(41) 剪切將"N-八肽從WANG樹脂上剪切下；配置剪切溶液將三氟醋
酸，三異丙基硅烷，水按照60:10:30比例混合均勻；將干燥完樹脂置于離心管中， 加入事先配好的剪切液靜置反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)完過濾，向?yàn)V液中加入8倍濾液體積 的冷乙醚，沉淀產(chǎn)生，離心，收集沉淀，烘干得到256mg"N八肽GFL。
權(quán)利要求
1. 一種穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL的制備方法，其特征在于，該方法采用Fmoc固相肽合成法，以Wang-樹脂為載體，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為原料，該原料中至少有一個(gè)氨基酸為穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記的，以HBTU/HOBt/DIEA為縮合試劑，逐一接入氨基酸，氨基酸接完后經(jīng)剪切、純化制得穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定性同位素"N標(biāo)記八肽GFL的制備方法，其特 征在于，所述的方法具體包括以下步驟(1) Fmoc-Ile-Wang樹脂的制備1) 將1.5mmol/g取代量的Wang-樹脂放入干燥的多肽合成管中；2) 用二氯甲烷溶脹10 60min，用水泵抽干溶劑二氯甲垸，換用DMF洗滌5 次，每次用量2 5ml;3)取2~10eq HBTU，加2~10eq Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，加5~15eq DIEA， 混勻；4) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)l-2小時(shí)；5) DMF 5mlx5min洗滌；6) 用2 10eq苯甲酸酐或醋酸酐加leq吡啶封閉樹脂上未反應(yīng)的羥基，DMF 作反應(yīng)溶劑，反應(yīng)l小時(shí)；7) 用DMF、DCM、甲醇或正己烷5mlx5min洗滌，真空干燥，得到Fmoc-Ile-Wang樹脂；(2) 穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL的制備 采用固相多肽合成的方法，從Fmoc-Ile-Wang樹脂出發(fā)，用多肽合成管制備，具體如下1) 將0.1mmolFmoc-Ile-Wang樹脂放入干燥的反應(yīng)器中；2) 用二氯甲烷溶脹10 60min， DMF洗滌5mlx5min;3) 30M哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2國3倍；4) DMF洗滌5mlx5min;5) 取2 5eq HBTU， 2~5eq HOBt， 2~5eq Fmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混勻；6) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；7) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min， 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次， 溶液體積為溶脹后樹脂體積的2-3倍；8) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;9) 取2 5eq HBTU， 2 5叫HOBt， 2 5eq Fmoc-Arg (Pbf)國OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混勻;10) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；11) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;12) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2隱3倍；13) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;14) 取2 5eqHBTU， 2~5叫HOBt， 2~5叫Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解， 加卜10eqDIEA，混勻；15) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；16) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;17) 30M哌咬-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2-3倍;18) 用DMF或DCM或甲醇或正己垸洗滌5mlx5min;19) 取2 5叫HBTU， 2 5eqHOBt， 2~5eq Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解， 加4 10叫DIEA，混勻；20) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；21) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;22) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2-3倍;23) 用DMF、 DCM、甲醇或正己垸洗漆5mlx5min;24) 取2 5叫HBTU， 2 5eq HOBt， 2 5叫Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqDIEA，混勻；25) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；26) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;27) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2-3倍；28) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;29) 取2 5eqHBTU， 2~5eq HOBt， 2~5eq Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqDIEA，混勻；30) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；31) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;32) 30。/。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2-3倍；33) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;34) 取2 5eqHBTU， 2~5叫HOBt， 2~5eq Fmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混勻；35) 將上述溶液加入樹脂中，反應(yīng)1 2小時(shí)；36) 合成完畢，DMF洗滌5mlx5min;37) 30y。哌啶-DMF溶液脫Fmoc， 5minx2次，溶液體積為溶脹后樹脂體積的 2陽3倍；38) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗滌5mlx5min;39) 用甲醇收縮樹脂，加入少許甲醇，反應(yīng)5min，重復(fù)2 5次；40) 用正己烷洗滌2 5次后，真空干燥；41) 剪切、純化將干燥后的樹脂置于離心管中，加入剪切液靜置反應(yīng)1~5 小時(shí)，反應(yīng)完過濾，向?yàn)V液中加入5 10倍濾液體積的冷乙醚，沉淀產(chǎn)生，離心， 收集沉淀，烘干得到穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL;上述步驟(1) 3)的Fmoc-Ile-OH、步驟(2) 5)的Fmoc-Arg (Pbf) -OH、 步驟(2) 9)的Fmoc-Arg (Pbf) -OH、步驟(2) 14)的Fmoc-Leu-OH、步驟(2) 19)的Fmoc-Phe-OH、步驟(2)24)的Fmoc-Gly-OH、步驟(2)29)的Fmoc-Gly-OH、 步驟(2) 34)的Fmoc-Tyr (tbu) -OH中至少有一個(gè)為穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記的氨 基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定性同位素"N標(biāo)記八肽GFL的制備方法，其特 征在于，所述的步驟(2) 1)中的0.1mmolFmoc-Ile-Wang樹脂根據(jù)取代量A計(jì)算稱量，所述的取代量A的測定如下(1) 稱量干燥的Fmoc-Ile-Wang樹脂，獲得樹脂質(zhì)量，以mg計(jì)；(2) 按3mL/1.5mgFmoc-Ile-Wang樹脂加入20。/。體積比的哌啶-DMF，間歇 搖動(dòng)2-3h;(3) 以20。/。體積比的哌啶-DMF作參比溶液，測量290nm的吸光度N;(4) 以下列公式計(jì)算取代量八=取代量(mmol/g) = (NxlO) / (質(zhì)量xl.75)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定性同位素15N標(biāo)記八肽GFL的制備方法，其特 征在于，所述的步驟(2) 41)的剪切液為混合均勻的三氟醋酸，三異丙基硅烷和 水，所述的三氟醋酸的體積比為50~80%，所述的三異丙基硅垸的體積為2 10%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定性同位素¹⁵N標(biāo)記八肽GFL的制備方法，該方法采用Fmoc固相肽合成法，以Wang-樹脂為載體，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為原料，該原料中至少有一個(gè)氨基酸為穩(wěn)定性同位素¹⁵N標(biāo)記的，以HBTU/HOBt/DIEA為縮合試劑，逐一接入氨基酸，氨基酸接完后經(jīng)剪切、純化制得穩(wěn)定性同位素¹⁵N標(biāo)記八肽GFL。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明工藝合理，操作簡單，節(jié)約成本，解決了現(xiàn)有合成反應(yīng)中豐度稀釋、純度不高、工藝繁瑣、原料消耗大等問題，獲得的穩(wěn)定性同位素¹⁵N標(biāo)記八肽GFL純度高(可達(dá)99％以上)、豐度高(可達(dá)97％以上)，同時(shí)，本發(fā)明還具有生產(chǎn)周期短、工藝穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K7/06GK101475629SQ20091004542
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者宋明鳴, 廖曉全, 亮 張, 李良君, 杜曉寧 申請人:上?；ぱ芯吭?br>