專利名稱：IgE抗原性序列及分支多聚抗原肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫技術(shù)領(lǐng)域的抗原性序列及分支多聚抗原肽的制備方 法，具體是一種IgE抗原性序列及分支多聚抗原肽的制備方法。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白IgE在哮喘、季節(jié)性過敏性鼻炎以及其它過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展 中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。當(dāng)變應(yīng)原初次進(jìn)入機(jī)體后，選擇性誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性B 細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體應(yīng)答，而血清中游離的IgE可在不結(jié)合抗原的情況下通過其Fc 片段與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的高親和力Fc e RI受體片段結(jié)合使機(jī)體處 于致敏狀態(tài)。機(jī)體再次接觸變應(yīng)原后，多價變應(yīng)原與致敏細(xì)胞表面兩個或者兩個 以上相鄰的IgE抗體結(jié)合，使細(xì)胞膜表面的Fc e RI受體片段發(fā)生交聯(lián)，觸發(fā)致敏 細(xì)胞脫顆粒，釋放及合成生物活性介質(zhì)，從而引起局部或者全身過敏反應(yīng)，癥狀 重者可導(dǎo)致過敏性休克，危及生命。臨床上常見的I型超敏反應(yīng)性疾病可分為全 身性過敏反應(yīng)和局部過敏反應(yīng)，前者包括藥物過敏性休克，如青霉素、頭孢菌素、 鏈霉素過敏等，以及血清過敏性休克，如抗血清治療；后者包括呼吸道過敏反應(yīng)、 消化道和皮膚過敏反應(yīng)，如花粉、塵螨、真菌過敏，食物導(dǎo)致的過敏性胃腸炎， 蕁麻疹，特應(yīng)性皮炎等。
目前針對I型超敏反應(yīng)的治療方法主要為脫敏治療和相應(yīng)的生物活性介質(zhì)的 拮抗治療。如采用變應(yīng)原皮膚實(shí)驗(yàn)檢測出機(jī)體對之敏感的變應(yīng)原，然后以此純化 的變應(yīng)原小劑量、長間隔、反復(fù)多次皮下注射脫敏。但可讓機(jī)體致敏的變應(yīng)原種 類較多，變應(yīng)原純化以及使用復(fù)雜，并且在臨床使用上具有一定的危險性，曾有 文獻(xiàn)報導(dǎo)在使用特異性變應(yīng)原進(jìn)行脫敏治療時誘發(fā)出新的過敏發(fā)應(yīng)，甚至引起死 亡。而且脫敏治療周期長，不同實(shí)驗(yàn)室來源的變應(yīng)原難以標(biāo)準(zhǔn)化，査找特異性變 應(yīng)原的檢測費(fèi)用以及接受脫敏治療的治療費(fèi)用較高，繁瑣的皮下注射脫敏治療對 病人會造成一定的痛苦，因而病人對此療法的接受度較低。對于生物活性介質(zhì)的 拮抗治療，使用最普遍的是皮質(zhì)類固醇類藥物，其作用機(jī)理為常規(guī)抗炎和抑制炎性蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，如細(xì)胞因子、酶和黏附分子。然而，皮質(zhì)類固醇類藥物的缺 點(diǎn)是其有全身效應(yīng)。肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的抑制劑如抗組胺和白三烯藥物， 可以封閉它們的特異性受體，也在頻繁使用。另外一個常見藥物是色甘酸鈉，一 種肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑，對干草熱和哮喘有較好的作用。但上述的不依賴于變應(yīng)原的 治療藥物僅僅是減輕過敏癥狀而不會從根本上治愈或療效持久地改善變態(tài)反應(yīng) 疾病。作為變態(tài)反應(yīng)性疾病的關(guān)鍵分子，IgE在正常血清中的含量極少，約為 150ng/ml，在血清中的半衰期約為3天，但如果與肥大細(xì)胞或者嗜堿性粒細(xì)胞表 面的相應(yīng)受體結(jié)合則可維持穩(wěn)定數(shù)周至數(shù)月之久。在變態(tài)反應(yīng)性疾病的患者血清 中，IgE可上升十倍，而在某些寄生蟲感染時或超敏反應(yīng)發(fā)生時則可增加到1000 倍于正常濃度。人lgE重鏈全長428個氨基酸，含有4個恒定結(jié)構(gòu)域Cel、 Ce2、 Ce3和Ce4。經(jīng)過重組IgE片段、嵌合IgE、位點(diǎn)導(dǎo)向突變IgE、與IgE Fc結(jié)構(gòu)域 相關(guān)的合成肽、以及用這些肽和模擬表位肽誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體等手段所進(jìn)行的抑制實(shí) 驗(yàn)證實(shí)，在人IgE抗體中與髙親和力受體以及低親和力受體結(jié)合的位點(diǎn)位于C e 3 結(jié)構(gòu)域，這個位點(diǎn)具有接觸殘基散布在4個表面環(huán)結(jié)構(gòu)中，而這些環(huán)就不對稱分 布在C e 3、 C e 4構(gòu)型骨架以及C e 2—C e 3連接處。
由于IgE在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)中的重要作用，目前已經(jīng)成為抗 變態(tài)反應(yīng)性疾病治療的一個新的靶點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。大致分為兩個方向， 一是針對 IgE分子的被動免疫策略，另一個方向是與IgE分子C e 3結(jié)構(gòu)域相關(guān)的主動免疫策 略，兩者都取得了較好的效果。前者是采用經(jīng)典的單克隆抗體制備技術(shù)，用人IgE 免疫小鼠，達(dá)到一定抗體滴度后取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生可分泌抗 人IgE單克隆抗體的永生化雜交瘤細(xì)胞。通過去除抗體中可引起人體內(nèi)免疫應(yīng)答 的鼠源部分，然后嫁接這些可以與人IgE抗體特異性結(jié)合的輕鏈殘基到人IgGl骨 架上將這種雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗人IgE單克隆抗體人源化。由于該單克隆抗體 所識別的人IgE部位位于高親和力和低親和力受體結(jié)合區(qū)域，與之結(jié)合所產(chǎn)生的 封閉效應(yīng)可消除人IgE抗體與受體結(jié)合的能力，并由此而有效的下調(diào)嗜堿性粒細(xì) 胞表面Fc e RI受體的表達(dá)和組胺的釋放。治療中度至嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)性哮喘的抗 IgE單克隆抗體omalizumab現(xiàn)已經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，并在臨床使用中取得了較好的療 效，但不足之處在于該進(jìn)口試劑治療費(fèi)用昂貴，大部分患者每個月都需要給藥， 治療效果不持久。與IgE分子C e 3結(jié)構(gòu)域相關(guān)的主動免疫策略則結(jié)合了抗IgE單克隆抗體的特 異性封閉與疫苗治療的持久性兩個優(yōu)點(diǎn)，人工合成或者用基因工程菌表達(dá)人IgE 中C e 3結(jié)構(gòu)域相關(guān)序列免疫機(jī)體，使機(jī)體打破對IgE的免疫耐受，主動產(chǎn)生抗IgE 抗體。對于有些疫苗的研究開發(fā)，相應(yīng)的完整抗原不易獲得或完整抗原具有很大 毒副作用，這時可以考慮開發(fā)亞單位疫苗甚至表位疫苗。進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測可 以幫助研究者盡快找到具有相同或相似抗原特異性與免疫保護(hù)作用，卻不再具有 完整蛋白毒性的抗原片段。Stanworth等人采用Ce4區(qū)域的肽疫苗，Hellman L 通過細(xì)菌表達(dá)C e 2 C e 3區(qū)域的重組蛋白成功地抑制了家兔的皮膚過敏反應(yīng)； F. Kricek等人使用抗人IgE單克隆抗體BSW17，采用噬菌體展示技術(shù)篩選6 15個 氨基酸序列的隨機(jī)肽庫，得到兩個高親和力的配體肽序列，經(jīng)化學(xué)合成后偶聯(lián)到 帽貝鎖眼血藍(lán)質(zhì)上，并以此免疫家兔，能誘導(dǎo)出抗人IgE多克隆抗體。在恒河猴 上的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，該肽誘發(fā)的抗體可以阻斷過敏原引起的皮膚過敏反應(yīng)。 Chang Yi Wang等人根據(jù)以往的研究和B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果篩選出一條C e 3區(qū)內(nèi) 413 435位氨基酸序列的肽段，通過各種修飾方法，如偶聯(lián)到KLH、 Th細(xì)胞表位 肽以及在肽段兩端加上半胱氨酸而構(gòu)成環(huán)肽模擬IgE分子Fc段的loop結(jié)構(gòu)，并以 此作為免疫原免疫豬、狗和BALB/C小鼠，在免疫期內(nèi)IgE抗體的滴度逐漸下降， 并在免疫后保持著相對較低的水平，并如抗IgE單克隆抗體一樣，有效的減少IgE. 抗體與Fc e RI受體的結(jié)合，IgE抗體致敏細(xì)胞內(nèi)組胺的釋放以及PCA反應(yīng)，并能產(chǎn) 生抗IgE單克隆抗體治療所不能達(dá)到的持久性。盡管將IgEC e相關(guān)肽主動免疫策 略用于治療變態(tài)反應(yīng)性疾病尚有風(fēng)險，如在體內(nèi)誘導(dǎo)致敏抗體的可能性、IgE抗 體減少后機(jī)體內(nèi)該類抗體承擔(dān)的保護(hù)性作用也相應(yīng)減少等等。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，C Y Wang等人在國際專利WO 99/672193 第27頁提及，表位肽由于自身單獨(dú)使用免疫原性極弱或無免疫原性，因此不 能誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答， 一般來說需要與大分子載體蛋白偶聯(lián)形成全抗原來使 用，這就不可避免會有可能誘發(fā)出除了針對該表位以外的其他無關(guān)抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種IgE抗原性序列及分支 多聚抗原肽的制備方法。本發(fā)明得到的分支多聚抗原肽可解決單獨(dú)使用抗原表 位線性肽免疫原性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，可在免疫動物體內(nèi)有效引起針對人IgE重鏈C
5e 3結(jié)構(gòu)域的抗體應(yīng)答。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明涉及一種IgE抗原性序列，該序列具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸 序列。
所述IgE抗原性序列位于IgE重鏈C e 3結(jié)構(gòu)域上。
本發(fā)明還涉及一種分支多聚抗原肽的制備方法，包括步驟如下 步驟一，利用SEQ ID NO. 1所示的多肽序列，采用Fmoc固相肽合成法合成 以賴氨酸為支架的八分支多聚抗原肽，收集凍干后備用； 步驟二，用HPLC法純化步驟一得到的分支多聚抗原肽； 步驟三，對分支多聚抗原肽進(jìn)行免疫原性驗(yàn)證。
步驟一中，所述合成具體為利用賴氨酸有兩個活性一NH2的特性來結(jié)合 另一個氨基酸的-C00H，經(jīng)過四次賴氨酸之間的分枝狀連接得到八分支的賴氨 酸骨架，以此賴氨酸骨架為核心周圍共價連接八個包含SEQ ID NO. 1所示的 多肽序列的線性抗原肽段，進(jìn)而得到分支多聚抗原肽。
本發(fā)明針對目前缺乏高效特異性IgE抗體的現(xiàn)狀，篩選出一段人IgE重鏈 C e 3結(jié)構(gòu)域上的如SEQ ID NO. 1所示的抗原序列；采用Fmoc固相肽合成法合 成了以賴氨酸為支架的包含SEQ ID NO. 1多肽序列的線性抗原肽段的八分支 多聚抗原肽。
本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明得到的分支多聚抗原肽能夠用于IgE 抗體制備，可克服單獨(dú)使用抗原表位線性肽免疫原性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，可在免疫動 物體內(nèi)有效引起針對人IgE重鏈C e 3結(jié)構(gòu)域的抗體應(yīng)答，且抗體特異性強(qiáng)， 不會產(chǎn)生其他無關(guān)抗體。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)例將結(jié)合附圖
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于 下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例
6步驟一，利用SEQ ID NO. 1所示的多肽序列，采用Fmoc固相肽合成法合成 以賴氨酸為支架的八分支多聚抗原肽，收集凍干后備用
采用Kolaskar-Tongaonkar的抗原性分析方法和DNA Star軟件包中 的Protean模塊，對人IgE免疫球蛋白重鏈C e 3區(qū)域的柔順性、抗原性、 二級結(jié)構(gòu)、親水區(qū)域、蛋白質(zhì)表面可及性指數(shù)等抗原表位參數(shù)以及抗原 表位指數(shù)進(jìn)行了綜合分析。根據(jù)軟件分析結(jié)果，在人IgE免疫球蛋白重 鏈Ce3氨基酸區(qū)段中抗原指數(shù)》1.0204，親水性指數(shù))O，氨基酸的 表面可能性指數(shù)^1，其內(nèi)部或附近具有柔性結(jié)構(gòu)。我們從符合這些條 件的氨基酸區(qū)段選出靠近羧基端的如SEQ ID NO. l所示的氨基酸 序列，以該序列作為抗原序列。利用SEQIDN0.1所示的多肽序列，采用 Fmoc固相肽合成法合成以賴氨酸為支架的八分支多聚抗原肽，即利用 賴氨酸有兩個活性氨基即a —麗2和e -NH2的特性來結(jié)合另一個氨基酸 的-C00H，經(jīng)過四次賴氨酸之間的分枝狀連接即得到八分支的賴氨酸骨 架，以此賴氨酸骨架為核心周圍共價連接八個包含如SEQ ID NO. l所示的 多肽序列的線性抗原肽段。
固相合成步驟如下
(1) 將替代度為0. 2mraol/g的PAC-PEG-PS樹脂0. 5g采用二甲基甲酰胺浸 泡30分鐘進(jìn)行活化，采用對稱酸酐法將己經(jīng)活化的樹脂進(jìn)行第一個氨基酸的連 接；
(2) 稱取待連接的賴氨酸195mg，加入1.5ml 二氯甲烷和3滴二甲基甲酰 胺使之溶解，加入以氮甲基比鉻烷酮為溶劑的IM的二環(huán)己基碳化二亞胺275ml， 200轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌，25'C下反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)完畢，過濾除去沉淀，然后蒸 發(fā)掉過濾液中的溶劑，得到對稱酐；
(3) 用二甲基甲酰胺滴加于得到的對稱酐中，待對稱酐溶解后，再加入到 活化的樹脂中，搖動1分鐘，然后加入以二甲基甲酰胺為溶劑的 . 1M二甲基氨 基吡啶460ixl，搖動反應(yīng)90min，吹去反應(yīng)液，用10ml 二甲基甲酰胺洗滌三次， 吹干，其余氨基酸的連接采用原位活化法，將連接有賴氨酸的樹脂放入反應(yīng)瓶中， 加入50ml以二甲基甲酰胺為溶劑的體積分?jǐn)?shù)為30 %的哌啶溶液反應(yīng)15分鐘， 以脫去9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)；
7(4) 取2.0mrao1的保護(hù)氨基酸，用以二甲基甲酰胺為溶劑的1M的二異丙基 乙胺5ml溶解，加入以二甲基甲酰胺為溶劑的4.0mrao1的0-苯并三氮唑-N, N， N' ， N'-四甲基脲四氟硼酸酯和4.0mmo1的1-羥基苯并三唑，預(yù)反應(yīng)15分鐘 20分鐘，然后和氨基酸樹脂一起反應(yīng)2小時，吹去反應(yīng)液，使用50ml的二甲基 甲酰胺沖洗三次，吹干，其中，按照上述方法先用賴氨酸連接三次，得到八分支 多聚賴氨酸骨架，將此支架上的賴氨酸作為合成肽的C端第一個氨基酸，依次進(jìn) 行其余氨基酸的偶聯(lián)；
(5) 將已合成好全部氨基酸序列的樹脂放入裂解容器中，按照三氟乙酸 水為95: 5的體積比配制切割試劑，使用時按25ral切割試劑與lg樹脂反應(yīng)的比 例進(jìn)行切割，反應(yīng)時間為2小時；將反應(yīng)液快速倒入150ml乙醚中，收集沉淀， 所用乙醚需預(yù)先放在-2(TC低溫冰箱中冷卻；將沉淀重新加蒸餾水溶解，再轉(zhuǎn)移 到凍干機(jī)中凍干；多抗原肽的脫鹽步驟如下稱取G-25凝膠15g，溶脹后裝柱， 裝好后的柱子先用蒸餾水50ml進(jìn)行平衡，平衡好后，每次上樣3ml -5ml，用蒸 餾水進(jìn)行洗脫，用核酸蛋白檢測儀檢測220nm處紫外吸收，按峰收集組分，將第 一個峰的組分收集，凍干后備用。
步驟二，用HPLC法純化步驟一得到的分支多聚抗原肽
使用Beckman公司半制備HPLC，柱子采用waters公司的徑向加壓色譜柱， 內(nèi)徑X柱長為25mmX100mm，粒徑為15ixm，洗脫系統(tǒng)為A液體積分?jǐn)?shù)為5% 的乙腈溶液，體積比為O. 1%的三氟乙酸作為溶劑；B液體積分?jǐn)?shù)為95%乙腈溶 液，體積比為O. 1%的三氟乙酸作為溶劑。
手動進(jìn)樣，每次進(jìn)樣lml，流速4ml/min，線性梯度，45min內(nèi)，B液從5%升 到50% ，然后5min內(nèi)升到95腿液，做最后洗脫；220nm處檢測紫外吸收，按峰 收集組分，用于質(zhì)譜檢測。將分子量檢測正確的組分收集、凍干，成為需要的純 品，備用。凍干純品采用激光解析質(zhì)譜鑒定多肽，數(shù)據(jù)分析軟件為G2025A Software A. 02. 01，方法嚴(yán)格按照操作手冊進(jìn)行，檢測合成多肽的分子量。
步驟三，對分支多聚抗原肽進(jìn)行免疫原性驗(yàn)證
按照常規(guī)皮下免疫方法對新西蘭大白兔和BALB/C小鼠進(jìn)行了包含該序列抗 原肽的免疫原性的驗(yàn)證。ELISA方法檢測動物免疫血清結(jié)果表明，該肽具有較強(qiáng) 的免疫原性，經(jīng)過該肽免疫的新西蘭大白兔和BALB/C小鼠可以產(chǎn)生針對人IgE的抗體，經(jīng)過ELISA檢測，兩種動物血清中抗人IgE抗體滴度均可達(dá)11600。采 用包含此抗原肽的八分支多聚抗原肽免疫新西蘭大白兔和BALB/C小鼠等動物， 可以用于制備抗人IgE的多克隆抗體和單克隆抗體。本發(fā)明得到的分支多聚抗原 肽可解決單獨(dú)使用抗原表位線性肽免疫原性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，可在免疫動物體內(nèi)有效 引起針對人IgE重鏈C e 3結(jié)構(gòu)域的抗體應(yīng)答。序列表<110>上海交通大學(xué)<120> IgE抗原性序列及分支多聚抗原肽的制備方法 <160> 1 <210〉 1 〈211〉 14 <212〉 PRT<213>智人種(ife歷o幼w'e/2.) <220><221> C—region <222〉 (1)…(14) <400> 1Glu Thr Tyr Gin Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg 1 5 10
權(quán)利要求
1、一種IgE抗原性序列，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的IgE抗原性序列，其特征是，所述IgE抗原性序 列位于IgE重鏈C e 3結(jié)構(gòu)域上。
3、 一種分支多聚抗原肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟一，利用SEQ ID NO. 1所示的多肽序列，采用Fmoc固相肽合成法合成以賴氨酸為支架的八分支多聚抗原肽，收集凍干后備用； 步驟二，用HPLC法純化步驟一得到的分支多聚抗原肽； 步驟三，對分支多聚抗原肽進(jìn)行免疫原性驗(yàn)證。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的分支多聚抗原肽的制備方法，其特征是，步驟 一中，所述合成具體為利用賴氨酸有兩個活性一NH2的特性來結(jié)合另一個氨 基酸的-C00H，經(jīng)過四次賴氨酸之間的分枝狀連接即得到八分支的賴氨酸骨架， 以此賴氨酸骨架為核心周圍共價連接八個包含SEQ ID N0.1所示的多肽序列 的線性抗原肽段，進(jìn)而得到分支多聚抗原肽。
全文摘要
一種免疫技術(shù)領(lǐng)域的IgE抗原性序列及分支多聚抗原肽的制備方法，其中，IgE抗原性序列具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；一種分支多聚抗原肽的制備方法，包括如下步驟利用SEQ ID NO.1所示的多肽序列，采用Fmoc固相肽合成法合成以賴氨酸為支架的八分支多聚抗原肽，收集凍干后備用；用HPLC法純化步驟一得到的分支多聚抗原肽；對分支多聚抗原肽進(jìn)行免疫原性驗(yàn)證。本發(fā)明得到的分支多聚抗原肽可解決單獨(dú)使用抗原表位線性肽免疫原性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，可在免疫動物體內(nèi)有效引起針對人IgE重鏈Cε3結(jié)構(gòu)域的抗體應(yīng)答。
文檔編號C07K14/00GK101503460SQ20091004747
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日
發(fā)明者崔大祥, 浩 楊 申請人:上海交通大學(xué)