專利名稱：多肽類藍萼甲素衍生物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藍萼甲素(GLA)衍生物，特別涉及具有多肽取代基的藍萼甲素衍生 物。本發(fā)明還涉及所述多肽類藍萼甲素衍生物的制備方法及其在治療癌癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
唇形科香茶菜屬植物。在亞洲東部和非洲西部廣為分布，全世界約有150種，我國 約有90種25個變種。其中約有30種民間作為藥用，作為清熱解毒、抗癌消炎、健脾、活血、 杭菌藥來使用。人們對該屬植物的-菇類成分作了研究，已從中提取了百余種藥類成分。經(jīng) 藥理篩選發(fā)現(xiàn)許多二萜化合物具有細胞毒、抗腫瘤、杭炎活性作用。藍萼香茶菜是唇形科香茶菜屬植物，分布在我國的東北、華北，朝鮮.日本，原蘇 聯(lián)遠東地區(qū)，吉林省資源尤其豐富。藍萼香茶菜具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎和抗癌 活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒發(fā)熱、乳腺炎、關(guān)節(jié)痛等疾病。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)全草對心血管 有一定的作用，而其中的有效成分對血小板聚集及癌癥有一定的影響。1981年許云龍等人從藍萼香茶菜中提取出藍萼甲素(glaucocalyxinA)和藍萼乙 素(glaucocalyxinB)，從光譜中推斷藍萼甲素具有香茶菜屬二萜典型的巧一氧_16 —貝殼 杉烯(ent-15-OXO-16-kaurene)骨架，而藍萼乙素是藍萼甲素的14 一乙?；铮褍烧叻?別乙?；?，得到相同的乙?；铮瑥亩C實了兩者的相互關(guān)系。隨后趙全成也從吉林產(chǎn)藍萼 香茶菜中分得這兩種二萜。1988年劉晨江等從北京地區(qū)產(chǎn)藍萼香茶菜中分得甲素和乙素外，還分得藍萼丙素 (glaucocalyxinC)，結(jié)構(gòu)為對映 _7p，14a, 15a-三羥基-16-貝殼杉-3-酮。Dongsa kimls, 除了從中分出藍萼甲素、藍萼乙素和藍萼丙素，還分出了兩種新二萜glaucocalyxinD和 glaucocalyxinE并列出了這五種化合物的結(jié)構(gòu)紅外紫外吸收值、最主要的IH—核磁共振、 13C 一核磁共振化學(xué)位移值及質(zhì)譜數(shù)據(jù)值。金永日等從藍萼香茶菜根中分得了藍萼甲素，另外王先榮等從安徽產(chǎn)王棗子〔 Isodonamethystoides(Benth)CyffuetHsuan)中也分得藍萼甲素。王慧芬等人用反相高效 液相色譜法外標(biāo)法對不同部位及不同采集期的藍萼香茶菜中藍萼甲素的含量進行了測定， 結(jié)果表明葉中藍萼甲素遠高于根、莖。不同采集期以7-8月份含量高，9月末含量下降。張 元桐等也采用反相HPLC測定藍萼甲素含量，測得藍萼甲素含量為1.03%，平均回收率為 99. 2%。從藍萼甲素體內(nèi)外實驗結(jié)果來看，其具有較強的抗腫瘤作用，且抗瘤譜較廣，能抑 制Lewis肺癌、5180實體型以及HCA實體型等實體瘤的生長，明顯增加荷腹水型5180腹水 型和荷HCA腹水型小鼠的生命延長率，其抗腫瘤作用的強弱呈劑量依賴性?？蒲腥藛T用MTT法對從毛葉香茶菜葉中分離鑒定的14個已知對映-貝殼杉烯類 二萜化合物進行了人早幼粒白血病細胞、人卵巢癌細胞和人肺癌細胞的抗癌活性研究，其 中具有α _亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)的化合物對上述3種腫瘤細胞株均表現(xiàn)出不同程度的抑制 活性。從藍萼香茶菜葉分離的化合物如藍尊香茶菜甲素(GLA)和乙素(GLB)結(jié)構(gòu)中具有α -亞甲基環(huán)戊酮，因而顯示出較強的生物活性。對若干天然及化學(xué)修飾后的貝克杉烯類化合物進行了系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性篩 選及構(gòu)效關(guān)系研究表明，應(yīng)用化學(xué)手段破壞分子中α-亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)單元，會顯著降 低貝克杉烯類化合物的抗腫瘤活性。由于藍萼甲素為對映-貝殼杉烯類二萜化合物，其化合物極性小，易溶于氯仿等 非極性溶劑，在水中不溶，因此不適合直接作為藥物進行給藥；藍萼甲素體外具有明顯的抗 癌作用，但在體內(nèi)需大劑量長時間用藥才能產(chǎn)生藥效。藥物在體內(nèi)消除很快，半衰期短，尚 不能直接作為藥物使用。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于藍萼甲素(GLA)特別是其α -亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)對腫瘤細胞株活性具有良好 的抑制作用，然而由于其極性小、半衰期短等特點，其不適于直接作為藥物進行給藥，故現(xiàn) 在需要以藍萼甲素(GLA)為先導(dǎo)化合物，通過對先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造，來獲得藍萼甲素 的衍生物，從而使其按照已知的代謝途徑失活或不代謝，而由原形排出體外，從而提高藥物 的安全性，增加藥效。本發(fā)明的目的之一在于提供具有對腫瘤細胞株良好的抑制作用的、結(jié)構(gòu)改良的多 肽類藍萼甲素(GLA)衍生物，從而解決GLA極性小、不易溶于水、半衰期短、在體內(nèi)消除過快 等缺陷，從而作為治療癌癥的藥物使用。本發(fā)明的目的之二在于提供所述多肽類藍萼甲素衍生物的制備方法，避免單純的 采用有機合成所帶來的毒副作用較大的缺陷，并且避免單純的采用原料提純多帶來的藥效 較低、無法針對性治療某一特定癌癥的缺陷。本發(fā)明所公開的多肽類藍萼甲素衍生物是一種貝殼杉烷型四環(huán)二萜類物質(zhì)，具有 貝殼杉烷型結(jié)構(gòu)、羰基、羥基和多肽結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)的通式如下
權(quán)利要求
一種多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，是一種貝殼杉烷型四環(huán)二萜類物質(zhì)，具有貝殼杉烷型結(jié)構(gòu)、羰基、羥基和多肽結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)的通式如下其中，R1、R2為 OH或其中，R3為直鏈多肽取代基。F2009100564624C00011.tif,F2009100564624C00012.tif
2.如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，所述Rl和R2中有一個 為-0H。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3為三肽取代基或 四肽取代基。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3為三肽 Arg-Gly-Asp-OH的取代基Arg-Gly-Asp-，所述三肽的分子式為C12H22N606 ；或者，所述R3為四肽Arg-Gly-Asp-Val-OH的取代基Arg-Gly-Asp-Val-，所述四肽的分 子式為 C17H31N707 ；或者所述R3為四肽Arg-Gly-Asp-Ser-OH的取代基Arg-Gly-Asp-Ser-，所述四肽的分 子式為 C15H27N708。
5.如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3為三肽取代基 Arg-Gly-Asp-,所述Rl為
6.如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3為三肽取代基 Arg-Gly-Asp-,所述R2為
7.如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3為四肽取代基
8.如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3為四肽取代基
9.如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3為四肽取代基
10.如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3為四肽取代Arg-Gly-Asp-Ser-，所述R2為
11. 一種如權(quán)利要求1所述的多肽類藍萼甲素衍生物的制備方法，其特征在于，包含以 下步驟步驟1 提取步驟1. 1 取香茶菜藥材(地上部分)粉碎至20目 50目；步驟1. 2 將所得的粉碎物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5 1 15混合，加 熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時，提取、過濾，得到提取液和剩余物；步驟1. 3 將步驟1. 2所得的剩余物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5 1 15 混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時，提取、過濾，得到提取液和剩余物， 重復(fù)該步驟1 3次；步驟1. 4 合并步驟1. 2和1. 3所得的提取液； 步驟2 溶劑處理步驟2. 1 將步驟1所得的提取液加熱，在55°C 65°C溫度條件下加熱減壓濃縮，回收 乙醇并得到粘稠的初級濃縮物；步驟2.2 將步驟2. 1所得的初級濃縮物與水按照體積比1 8 1 10混合，在室 溫條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌10分鐘，隨后靜置6 12小時，棄去上清液得到 下層固體；步驟2. 3:將步驟2. 2所得的固體與乙酸乙酯(A.R.)按照體積比1 4 1 6混合， 在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時，過濾得到 濾液和不溶物；步驟2. 4 將步驟2. 3所得的不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6混 合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時，過濾得到濾液和不溶物，重復(fù)該步驟1 3次；步驟2. 5 合并步驟2. 3和2. 4所得的濾液；步驟2. 6 將步驟2. 5所得的濾液加熱，在35°C 45°C溫度條件下加熱減壓濃縮，回收 乙酸乙酯(A. R.)，得到固體濃縮物； 步驟3 樹脂處理步驟3. 1 將步驟2所得的固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合溶解，得到溶液；步驟3. 2 將步驟3. 1所得的溶液緩慢加到7號樹脂柱中，起觀察樹脂的顏色，在樹脂 柱有2/3變色時，停止加樣，并采用200ml 400ml的95%乙醇(A. R.)沖洗該樹脂柱，收集 所有流出液，所述樹脂柱的填充物為強堿性陰離子樹脂并用氫氧化鈉飽和至PH值中性；步驟3. 3 將步驟3. 2所得流出液加熱，并在55°C 65°C溫度條件下加熱減壓回流，直 至溶劑干，得到固體殘留物； 步驟4:重結(jié)晶步驟4. 1 將上述殘留物與30°C 40°C的極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 得到初級溶液，加熱，在30°C的 40°C溫度條件下減壓濃縮，在_23°C -13°C溫度條件下 靜置析晶，過濾得到淺黃色針狀結(jié)晶；所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合 溶液；步驟4.2:將步驟4.1所得的結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 在_23°C -13°C溫度條件下反復(fù)重結(jié)晶2 4次，每次12 24小時，得到中間產(chǎn)物藍萼 甲素；所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 4混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合 溶液；步驟5 衍生化在室溫下，將步驟4所得將藍萼甲素溶于四氫呋喃(THF)中，隨后加入丁二酸和4-二 甲氨基吡啶(DMAP)，攪拌反應(yīng)，隨后減壓蒸去四氫呋喃，萃取得藍萼甲素的丁二酸酯，隨后 將其在二氯乙烷(EDC)條件下與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應(yīng)得到作為中間產(chǎn)物的藍萼 甲素的丁二酸酯與NHS的衍生物，在將該中間產(chǎn)物的THF溶液與多肽的磷酸鹽緩沖液(PBS 緩沖液)混合，室溫攪拌10 20分鐘，隨后減壓蒸餾，過濾并合并濾液，將所得濾液冷凍干 燥，得到產(chǎn)物多肽類藍萼甲素衍生物。
12.如權(quán)利要求11所述的多肽類藍萼甲素衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟5 進一步包含以下步驟步驟5. 1 在室溫下，將9. 06 11. 06g步驟4所得將藍萼甲素溶于25 35ml四氫呋 喃(THF)中，隨后加入0. 857 1. 057g 丁二酸和0. 067 0. 087g4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)， 在室溫條件下攪拌反應(yīng)2 3小時；步驟5. 2 將步驟5. 1的反應(yīng)溶液加熱30°C 40°C減壓濃縮，除去THF，隨后加入25 35ml水稀釋，并采用25 35ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機相并采用飽和食鹽水洗滌、無 水硫酸鈉干燥，隨后將所得溶液加熱至30°C 40°C減壓濃縮至干，得到藍萼甲素的丁二酸 酯的粗產(chǎn)品；步驟5.3 將藍萼甲素的丁二酸酯的粗產(chǎn)品溶于洗脫液中，并采用硅膠柱層析分離，將 所得餾分加熱至30°C 40°C減壓濃縮，除去溶劑，得到藍萼甲素的丁二酸酯的無色晶體；步驟5. 4 將所得藍萼甲素的丁二酸酯溶于15 20ml四氫呋喃(THF)中，在室溫下，加 入0. 5 0. 6g 二氯乙烷(EDC)和0. 2 0. 3gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫攪拌8 10 小時；步驟5. 5 將所得反應(yīng)溶液在30°C 40°C條件下減壓蒸餾，除去THF，隨后采用15 20ml 二氯甲烷洗滌3次，再用飽和食鹽水洗滌有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾并將所得濾液 在30°C 40°C條件下減壓蒸餾，除去溶劑，在室溫條件下干燥，得藍萼甲素的丁二酸酯與 NHS的衍生物的無色晶體；步驟5. 6 將196. 5 216. 5mg所得的藍萼甲素的丁二酸酯與NHS的衍生物溶于2 4mlTHF 中，將 90. 6 110. 6mg 三肽 Arg-Gly-Asp-OH 溶于 4 6mlPBS 緩沖液； 所述三肽Arg-Gly-Asp-OH的分子式為C12H22N606 ；步驟5. 7 室溫條件下，將所得的藍萼甲素的丁二酸酯與NHS的衍生物的THF溶液滴加 到三肽的PBS溶液中，并在室溫條件下攪拌反應(yīng)10 20分鐘，隨后在30°C 40°C條件下 減壓蒸餾除去THF，過濾得到濾液；步驟5. 8 將所得濾液采用1 3ml水洗滌2 4次，合并濾液并在_45°C _35°C條 件下冷凍干燥20 28小時，得到具有三肽取代基Arg-Gly-Asp-的藍萼甲素衍生物。
13.如權(quán)利要求11所述的多肽類藍萼甲素衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟5 進一步包含以下步驟步驟5. 1 在室溫下，將9. 06 11. 06g步驟4所得將藍萼甲素溶于25 35ml四氫呋 喃(THF)中，隨后加入0. 857 1. 057g 丁二酸和0. 067 0. 087g4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)， 在室溫條件下攪拌反應(yīng)2 3小時；步驟5. 2 將步驟5. 1的反應(yīng)溶液加熱30°C 40°C減壓濃縮，除去THF，隨后加入25 35ml水稀釋，并采用25 35ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機相并采用飽和食鹽水洗滌、無 水硫酸鈉干燥，隨后將所得溶液加熱至30°C 40°C減壓濃縮至干，得到藍萼甲素的丁二酸 酯的粗產(chǎn)品；步驟5. 3:將藍萼甲素的丁二酸酯的粗產(chǎn)品溶于洗脫液中，并采用硅膠柱層析分離，將 所得餾分加熱至30°C 40°C減壓濃縮，除去溶劑，得到藍萼甲素的丁二酸酯的無色晶體；步驟5. 4 將所得藍萼甲素的丁二酸酯溶于15 20ml四氫呋喃(THF)中，在室溫下，加 入0. 5 0. 6g 二氯乙烷(EDC)和0. 2 0. 3gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫攪拌8 10 小時；步驟5. 5 將所得反應(yīng)溶液在30°C 40°C條件下減壓蒸餾，除去THF，隨后采用15 20ml 二氯甲烷洗滌3次，再用飽和食鹽水洗滌有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾并將所得濾液 在30°C 40°C條件下減壓蒸餾，除去溶劑，在室溫條件下干燥，得藍萼甲素的丁二酸酯與 NHS的衍生物的無色晶體；步驟5. 6 將196. 5 216. 5mg所得的藍萼甲素的丁二酸酯與NHS的衍生物溶于0. 5 1. 5mlTHF 中，將 100. 1 120. Img 四肽 Arg-Gly-Asp-Val-OH 溶于 4 6mlPBS 緩沖液； 所述四肽 Arg-Gly-Asp-Val-OH 的分子式為 C17H31N707 ；步驟5. 7 室溫條件下，將所得的藍萼甲素的丁二酸酯與NHS的衍生物的THF溶液滴加到四肽的PBS溶液中，并在室溫條件下攪拌反應(yīng)10 20分鐘，隨后在30°C 40°C條件下 減壓蒸餾除去THF，過濾得到濾液；步驟5. 8 將所得濾液采用1 3ml水洗滌2 4次，合并濾液并在_45°C _35°C條 件下冷凍干燥20 28小時，得到具有四肽取代基Arg-Gly-Asp-Val-的藍萼甲素衍生物。
14.如權(quán)利要求11所述的多肽類藍萼甲素衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟5 進一步包含以下步驟步驟5. 1 在室溫下，將9. 06 11. 06g步驟4所得將藍萼甲素溶于25 35ml四氫呋 喃(THF)中，隨后加入0. 857 1. 057g 丁二酸和0. 067 0. 087g4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)， 在室溫條件下攪拌反應(yīng)2 3小時；步驟5. 2 將步驟5. 1的反應(yīng)溶液加熱30°C 40°C減壓濃縮，除去THF，隨后加入25 35ml水稀釋，并采用25 35ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機相并采用飽和食鹽水洗滌、無 水硫酸鈉干燥，隨后將所得溶液加熱至30°C 40°C減壓濃縮至干，得到藍萼甲素的丁二酸 酯的粗產(chǎn)品；步驟5. 3:將藍萼甲素的丁二酸酯的粗產(chǎn)品溶于洗脫液中，并采用硅膠柱層析分離，將 所得餾分加熱至30°C 40°C減壓濃縮，除去溶劑，得到藍萼甲素的丁二酸酯的無色晶體；步驟5. 4 將所得藍萼甲素的丁二酸酯溶于15 20ml四氫呋喃(THF)中，在室溫下，加 入0. 5 0. 6g 二氯乙烷(EDC)和0. 2 0. 3gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫攪拌8 10 小時；步驟5. 5 將所得反應(yīng)溶液在30°C 40°C條件下減壓蒸餾，除去THF，隨后采用15 20ml 二氯甲烷洗滌3次，再用飽和食鹽水洗滌有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾并將所得濾液 在30°C 40°C條件下減壓蒸餾，除去溶劑，在室溫條件下干燥，得藍萼甲素的丁二酸酯與 NHS的衍生物的無色晶體；步驟5. 6 將196. 5 216. 5mg所得的藍萼甲素的丁二酸酯與NHS的衍生物溶于0. 5 1. 5mlTHF 中，將 99. 7 119. 7mg 四肽 Arg-Gly-Asp-Ser-OH 溶于 4 6mlPBS 緩沖液； 所述四肽 Arg-Gly-Asp-Ser-OH 的分子式為 C15H27N708 ；步驟5. 7 室溫條件下，將所得的藍萼甲素的丁二酸酯與NHS的衍生物的THF溶液滴加 到四肽的PBS溶液中，并在室溫條件下攪拌反應(yīng)10 20分鐘，隨后在30°C 40°C條件下 減壓蒸餾除去THF，過濾得到濾液；步驟5. 6 將步驟5. 5的濾液采用1 3ml水洗滌2 4次，合并濾液并 在-45°C -35°C條件下冷凍干燥20 28小時，得到具有四肽取代基Arg-Gly-Asp-Ser-的 藍萼甲素衍生物。
15.如權(quán)利要求1 10所述的多肽類藍萼甲素衍生物在治療癌癥中的應(yīng)用，特別是在 治療肝癌、胰腺膽管癌、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、腎癌、宮頸癌和結(jié)腸癌 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了多肽類藍萼甲素衍生物的結(jié)構(gòu)、制備方法及其在治療癌癥中的應(yīng)用。所述多肽類藍萼甲素衍生物的分子結(jié)構(gòu)的通式如下其中，R1、R2為-OH或而R3為直鏈多肽取代基。本發(fā)明所公開的制備方法是在四氫呋喃和4-二甲氨基吡啶存在的條件下，將經(jīng)提取處理后的藍萼甲素與丁二酸反應(yīng)，隨后在四氫呋喃和二氯乙烷存在的條件下將得到的藍萼甲素的丁二酸酯與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)得到中間產(chǎn)物，最后在四氫呋喃和磷酸鹽緩沖液存在的條件下，將所得中間產(chǎn)物與直鏈多肽進行衍生化反應(yīng)，從而制備得到本發(fā)明所公開的多肽類藍萼甲素衍生物。
文檔編號C07K5/09GK101993473SQ20091005646
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者李云森, 程萍, 陳子珺, 雷啟福 申請人:上海金昊藥業(yè)開發(fā)有限公司