專利名稱：一種制備短裸甲藻毒素單克隆抗體的方法
一種制備短裸甲藻毒素單克隆抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫安全檢測技術(shù)中單克隆抗體的制備，進(jìn)一步講涉及可 應(yīng)用于水環(huán)境及水產(chǎn)品中短裸甲藻毒素單克隆抗體的制備。 [背景技術(shù)]
水體富營養(yǎng)化致使藻類異常增殖，并釋放生物毒素——藻毒素(Algae Toxin)，這些次級代謝產(chǎn)物嚴(yán)重危害了人類的用水安全和其他水生生物的 安全。其中導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)麻痹的短裸甲藻毒素(Brevetoxins， BTX) 是毒 性較強(qiáng)，危害很大的一種藻類毒素。毒素通過食物鏈毒化魚、貝等水生動 物，人類因攝食這些動物而發(fā)生中毒。
BTX是由短裸甲藻屬的雙鞭甲藻(dinoflagellate)產(chǎn)生的具有獨特藥理 功能的梯型聚醚類化合物。BTX屬神經(jīng)性貝毒，與鈉通道受體靶部位VI結(jié) 合。BTX為低熔點耐熱固體，酯溶性，能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、 乙醚、苯等有機(jī)溶劑和NaOH溶液，不易溶于中性和酸性水溶液。通常會 導(dǎo)致魚群的大量死亡，其它動物攝食該藻類或被污染的魚類后即可引起中 毒。中毒后會產(chǎn)生腸胃不適及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀如惡心、嘔吐、腹瀉、神經(jīng)麻 木及冷熱知覺的顛倒等，嚴(yán)重時會心律失常、窒息。該毒素除了通過食物 鏈引起中毒外，也可通過海洋中的氣溶膠造成呼吸道急性中毒，中毒癥狀 為暈眩、瞳孔放大、氣喘、干咳、流鼻涕及眼角膜炎等。BTX有10余種類 似物，由醚環(huán)串聯(lián)而成。I型毒素是短裸甲藻產(chǎn)生的主要毒素。分子式為 C5()H7()014，分子量約為894。歐美等一些發(fā)達(dá)國家對冷藏鮮貝肉中的該毒素最高允許限量為0.8唯/g。目前，我國還沒有BTX檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)，這不 僅影響到消費者的健康和生命安全，還會影響到水產(chǎn)品的出口。
有關(guān)BTX的檢測方法主要有(1)色譜分析法包括薄層色譜法(TLC) 和高效液相色譜(HPLC)法。TLC法主要用于BTX的分離和純化。HPLC 法由于共流出物背景干擾，采用紫外檢測在靈敏度和選擇性方面較差，而 采用質(zhì)譜(MS)檢測，可提高選擇性和靈敏度，檢測限為0.9ng;采用高效液 相色譜/四極桿飛行時間質(zhì)譜(HPLC/Q TOFMS)聯(lián)用技術(shù)檢測限可達(dá)到 0.5ng。缺點是樣品預(yù)處理要求高；缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)備龐大、昂貴；需專業(yè) 人員。(2)組織培養(yǎng)法其基本原理是利用小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系易被毒素阻 斷Na+通道這一特性檢測毒素。當(dāng)加入通道活化劑后，Na+離子過度內(nèi)流， 造成細(xì)胞腫脹，甚至死亡。但加入了拮抗劑毒素，可使細(xì)胞存活，從而可 確定毒素的存在進(jìn)而確定毒素的量。該方法的特點是靈敏、廉價、不需要 大量動物。缺點是缺乏特異性；對樣品的處理要求高；要具有組織培養(yǎng)技 術(shù)和設(shè)備。
免疫學(xué)檢測法以其檢測的穩(wěn)定性、高靈敏性和速度快等優(yōu)點在一些藻 類毒素檢測中得以廣泛應(yīng)用。
單克隆抗體的制備是建立免疫學(xué)檢測方法的關(guān)鍵歩驟之一。但由于 BTX標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴、難以獲得，至今國內(nèi)外尚未見BTX單克隆抗體制備
的報道。
目前，單克隆抗體的制備多采用腹腔及皮下注射免疫方案。待被免疫 小鼠血清效價達(dá)4乂104以上后，取小鼠脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞融合，有限稀釋 法克隆，ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，小鼠腹水制備單克隆抗體。該方法已經(jīng)是一項非常成熟的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品及 環(huán)境免疫安全檢測技術(shù)中單克隆抗體的制備。但是，傳統(tǒng)方法制備單克隆
抗體至少需要4次以上的免疫后才能進(jìn)行細(xì)胞融合，至少需3.5個月以上的 時間才能生產(chǎn)出單克隆抗體；同時傳統(tǒng)方法對抗原的需求量大， 一般需 200-475 pg/鼠。這大大地增加了單克隆抗體制備的成本，特別是對BTX等 價格昂貴的海洋生物毒素，制備一株單克隆抗體需要數(shù)萬元人民幣。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種制備短裸甲藻毒素單克隆抗體 的方法，具有速度快，所需抗原量少的特點，從而有效降低單克隆抗體制 備的成本。
本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的方案采用如下步驟 1.完全抗原的制備
免疫抗原(BTX-IgG)和檢測抗原(BTX-BSA)具體制備方法如下
(1)混合液的制備取0.5mgBTX、 0.08mgN-羥丁二酰亞胺、0.15mg N, N雙環(huán)乙烷碳二亞胺于0.5 mL DMF中混均，在10-30。C條件下孵育2h 制成混合液，并將混合液平均分成兩等份；(2)載體蛋白反應(yīng)液的制備 取0.4mg IgG溶于0.5 mL O.lmol/L NaHC03緩沖液中,混勻后做為載體蛋白 反應(yīng)液；(3)將步驟(2)制備的載體蛋白反應(yīng)液加入步驟(1)制備的混 合液中，在10-3(TC條件下孵育2h，所得產(chǎn)物為免疫抗原(BTX-IgG)，超濾 離心去除未反應(yīng)的物質(zhì)，分裝后-2(TC保存?zhèn)溆茫?4)取0.4mgBSA，溶 于0.5 mL O.lmol/LNaHC03緩沖液中，混勻后做為載體蛋白反應(yīng)液；(5)將步驟(4)制備的載體蛋白反應(yīng)液加入步驟(1)制備的混合液中，在
10-30。C條件下孵育2h，所得產(chǎn)物為檢測抗原(BTX-BSA)，超濾離心去除 未反應(yīng)的物質(zhì)，分裝后-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 2. 動物免疫
(1) 免疫動物為8周齡雄性BALB/C小鼠，免疫前斷尾采血作為陰 性血清；
(2) 配制免疫抗原標(biāo)準(zhǔn)液2yg/iaL。首次免疫使用弗氏完全佐劑乳 化免疫抗原，抗原佐劑比l: 1，腹腔注射100uL/鼠。(3) 18天后采用脾 內(nèi)注射法注射，具體方法如下將小鼠禁食禁水24小時，使用2%戊巴比 妥鈉每只l()OuL將小鼠麻醉，待眨眼反射消失后，將小鼠俯臥固定于簡 易操作臺上，對背部皮毛消毒，在背部中線左側(cè)0.5cm最后肋骨0.1cm處， 沿體中軸向下剪開lcm長切口，用手輕輕按壓兩側(cè)腹壁，使脾臟暴露出腹 腔，使用lmL注射器，注射10 UL全抗原標(biāo)準(zhǔn)液，邊注射邊退針盡量使 其均勻注入脾內(nèi)，小心將脾臟放回腹腔，逐層縫合腹腔及皮膚，首免21 天后斷尾取血檢測效價。
3、 取血清效價大于104的被免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按 常規(guī)方法融合，制備單克隆抗體。
采用本免疫方法所制備的單克隆抗體腹水效價可達(dá)2.4X105,親和常 數(shù)達(dá)0.6X109 M人腹水抗體效價和親和常數(shù)不低于傳統(tǒng)免疫方法所得抗 體。本方案與傳統(tǒng)方法相比，具有免疫速度快，至少節(jié)省30天的時間； 所需抗原量少(僅需要120pg/鼠)。從而有效地降低單克隆抗體制備的成本。
具體實施方式
免疫抗原(BTX-IgG)和檢測抗原(BTX-BSA)具體制備 (1)混合液的制備取0.5mgBTX、 0.08mgN-羥丁二酰亞胺、0.15mg N, N雙環(huán)乙烷碳二亞胺于0.5 mL DMF中混均，在10-3(TC條件下孵育2h 制成混合液，并將混合液平均分成兩等份；(2)載體蛋白反應(yīng)液的制備 取0.4mg IgG溶于0.5 mL O.lmol/L NaHC03緩沖液中，混勻后做為載體蛋白 反應(yīng)液；(3)將步驟(2)制備的載體蛋白反應(yīng)液加入步驟(1)制備的混 合液中，在10-3(TC條件下孵育2h，所得產(chǎn)物為免疫抗原(BTX-IgG)，超濾 離心去除未反應(yīng)的物質(zhì)，分裝后-2(rC保存?zhèn)溆茫?4)取0.4 mg BSA，溶 于0.5 mL0.1mol/LNaHCO3緩沖液中,混勻后做為載體蛋白反應(yīng)液；(5)將 步驟(4)制備的載體蛋白反應(yīng)液加入歩驟(1)制備的混合液中，在10-30 r條件下孵育2h，所得產(chǎn)物為檢測抗原(BTX-BSA)，超濾離心去除未反應(yīng) 的物質(zhì)，分裝后-20。C保存?zhèn)溆?。試劑來源及SP2/0骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備
BTX為Express Technology Co., Ltd.產(chǎn)品；人IgG為Thermo產(chǎn)品；聚
乙二醇(polythylene glycol-4000, PEG)、 RPMI1640培養(yǎng)基、HAT選擇性
培養(yǎng)基、牛血清白蛋白(BSA)、戊二醛、|3-巰基乙胺、福氏完全佐劑(FCA)、
福氏不完全佐劑(FICA)、鄰苯二胺(OPD) 、 N-羥丁 二酰亞胺
(N-hydroxysuccinimide)、N， N雙環(huán)乙烷碳二亞胺(N,N-dimethyformamide,
DMF)等購自Sigma公司；離心超濾管為MILLPORE產(chǎn)品；辣根過氧化
物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購于鼎國生物技術(shù)有限公司(北京)，甲醇、乙酸、碳
酸鈉、碳酸氫納、ELISA所用化學(xué)試劑等為國產(chǎn)分析純。
在融合前15天復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。取出SP2/0細(xì)胞凍
存管，立即放入裝有40 。C水的保溫桶內(nèi)，輕輕晃動，直至動存液完全溶
解，要在l-2min內(nèi)完成。將動存液移到15mL離心管，加入5mL培養(yǎng)液，
輕輕吹均勻，1000rpm， 5min，棄上清。用巴斯德吸管加入1管培養(yǎng)液，
吹打均勻，移入50mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，再加入2吸管培養(yǎng)液，吹打均勻，分到
2個新的50mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，這樣就將一個凍存管細(xì)胞分到3個50mL培養(yǎng)
瓶內(nèi)。放于37。C含5。/。的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，每瓶4巴斯德管。48h后就可用于融合，在融合前24小時需要換液一次，使細(xì)胞在 融合時正處于對數(shù)分裂期。飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
取12周齡以上，與骨髓瘤同系小鼠l-2只。挖去-只眼球放血，待血 滴不出為止。拉頸處死，將鼠浸在75%酒精5min消毒。無菌條件下用消 毒鑷子和剪刀剪開小鼠腹部外層皮膚(切勿將腹膜剪破而使腹腔內(nèi)液體流 失)。然后向上下兩側(cè)方向拉開小鼠皮膚，暴露腹膜。用消毒注射器抽取 3mL無血清HT1640培養(yǎng)液，用鑷子將腹膜提起，將溶液注入小鼠腹腔內(nèi)。 一只手固定針筒，針頭停留在腹腔內(nèi)，輕輕按摩腹壁l-2min (使巨噬細(xì)胞 游出)，然后用注射器抽回腹腔內(nèi)液體，并進(jìn)行3次沖洗。收集沖洗液， 100()rpm離心5min，棄上清。用HAT培養(yǎng)液稀釋離心沉淀的細(xì)胞，并調(diào) 整細(xì)胞濃度至1Xl()S個/mL。將細(xì)胞懸液按每孔l()O(il (約兩滴)鋪板。放 于37°C含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此細(xì)胞在融合前24h制備。免疫淋巴結(jié)B細(xì)胞懸液的制備
將免疫的BALB/C小鼠摘眼取血致死，收集血液于EP管中，37°C放 置2h后離心分離血清，-20°C貯存?zhèn)溆?。將猝死后小鼠浸?5%酒清中 3min。無菌取胭淋巴結(jié)，放入載有200目銅網(wǎng)的無菌平皿內(nèi)。加2mL基礎(chǔ) 培養(yǎng)基將淋巴結(jié)浸潤，用膠棒將淋巴結(jié)研磨成漿狀。巴斯德吸管吹打分散 細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至50mL玻璃離心管內(nèi)，1000g/min離心5min，重復(fù)洗2次， 并計數(shù)細(xì)胞。最后用適量的RPMI-1640懸浮細(xì)胞，使成5X10々mL，體積 應(yīng)為2mL以上。細(xì)胞融合及融合后細(xì)胞的培養(yǎng)將實施例5所得胭淋巴細(xì)胞與實施例3所得SP2/0細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)之比 為10: 1)移到圓底玻璃離心管中，混均勻，1000rpm離心10min。棄掉上 清后，用手指稍用力彈擊試管底部，使沉淀呈槳糊狀。迅速滴入50%的PEG (約0.7mL)，用吸管輕輕吹吸4-5次，30s后，700rpm離心3min;緩慢 加入20mLRPMI-1640培養(yǎng)基(動作盡量輕柔)，然后使試管底部做劃圓運 動；2min后1000g/min離心5min，棄上清，同法再洗一次；緩慢加入50mL 含HT培養(yǎng)基輕輕混勻后，加入到已準(zhǔn)備好滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上，每孔 加入IOO)liL融合細(xì)胞懸液，置于37°C 5%的C()2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合24 小時后，每孔補(bǔ)加50pL含HAT培養(yǎng)基。并分別于4天、7天和10天， 根據(jù)細(xì)胞生長情況更換或補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，第14、 18、 22、 25天換以20% 小牛血清HT培養(yǎng)基。在培養(yǎng)過程中，采用半量換液法，即每次從每個小 孔中吸出O.lmL培養(yǎng)液，再加入O.lmL新鮮培養(yǎng)液。雜交瘤細(xì)胞的篩選
觀察融合細(xì)胞的生長情況， 一般3天后可見克隆化生長的細(xì)胞，待融 合細(xì)胞集落生長至1/2視野(X100)以上時，就可檢測上清液中的抗體， 篩選出分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆。第一次檢測抗體在第二次換 液的兩天后，即融合后的第10天進(jìn)行。以被測孔的OD值高于瘤細(xì)胞上清 液對照OD值的2倍以上定為陽性。陽性雜交瘤細(xì)胞的再克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)
待陽性孔細(xì)胞接近長滿時，用含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基將 細(xì)胞輕輕吹起，吸到無菌小瓶中，細(xì)胞計數(shù)，稀釋至每10(^1中含有0.5-1
個細(xì)胞密度。然后將稀釋的細(xì)胞懸液滴入實施例4方法準(zhǔn)備的詞養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100pl。將板置入37。C含5。/。C02溫箱培養(yǎng)，每天觀察一次， 3天左右換液一次，觀察每孔有幾個克隆株，對有兩個或沒有細(xì)胞的孔分 別作出標(biāo)記，待克隆細(xì)胞生長至8-l()天時，檢測抗體，標(biāo)出陽性孔，對所 有的克隆細(xì)胞孔換液，換液2天后，再檢測，將兩次檢測OD值高的孔進(jìn) 行對照，對兩次檢測都是陽性的孔再次克隆。直到克隆到所有的克隆細(xì)胞 孔都為陽性，最后選擇OD值高、細(xì)胞活力好的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。 [實施例9]腹水抗體的制備
取8周齡BALB/C小鼠，將高壓(113°C， 15min)滅菌的石蠟油注射 到小鼠腹腔，0.5mL/只，8d后腹腔注射實施例8所得雜交瘤細(xì)胞2X1()6/ 只，接種7d后每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹腔明顯鼓起，小鼠行動困 難并且皮膚有緊張感，即用16號針頭采集腹水，將腹水3000rpm離心10 min,取上清，棄去脂肪，收集中間澄清腹水。采用辛酸-飽和硫酸銨法初歩 純化,-20°C分裝凍存?zhèn)溆谩８顾贵w親和力的測定
純化后腹水稀釋至純化前相同體積，同時以SP2/0細(xì)胞接種的腹水同 等稀釋倍數(shù)做對照。采用非競爭性酶免疫法測定抗體親和力。檢測抗原 (BSA-BTX)按l、 0.5、 0.25、 0.125pg/ml包被酶標(biāo)板，100pl/孔，37。C， 2h; 1%的明膠封閉后，將單抗從2000倍開始倍比稀釋。以抗體濃度(mol/L) 的對數(shù)值為橫座標(biāo)，以其對應(yīng)的OD值為縱座標(biāo)，可在一個座標(biāo)系內(nèi)作出 4條S形曲線。找出S曲線的頂部，設(shè)定為ODmax。在曲線中分別找出4 條曲線各自50%ODmax對應(yīng)的抗體濃度。將4個濃度兩兩一組，根據(jù)公 式計算單抗的親和常數(shù)。Ka=(n-1 )/2(n[Ab、 ]t-[Ab]t)
注n為每組中兩個包被濃度的倍數(shù)，[Ab']t和[Ab]t分別為每組中兩 t50。/。ODmax對應(yīng)的抗體濃度(mol/L)， Ka為親和常數(shù)。
權(quán)利要求
1、一種制備短裸甲藻毒素單克隆抗體的方法，其特征在于采用如下步驟完成1)完全抗原的制備免疫抗原(BTX-IgG)和檢測抗原(BTX-BSA)具體制備方法如下(1)混合液的制備取0.5mg BTX、0.08mg N-羥丁二酰亞胺、0.15mg N，N雙環(huán)乙烷碳二亞胺于0.5mL DMF中混均，在10-30℃條件下孵育2h制成混合液，并將混合液平均分成兩等份；(2)載體蛋白反應(yīng)液的制備取0.4mg IgG溶于0.5mL0.1mol/L NaHCO3緩沖液中，混勻后做為載體蛋白反應(yīng)液；(3)將步驟(2)制備的載體蛋白反應(yīng)液加入步驟(1)制備的混合液中，在10-30℃條件下孵育2h，所得產(chǎn)物為免疫抗原(BTX-IgG)，超濾離心去除未反應(yīng)的物質(zhì)，分裝后-20℃保存?zhèn)溆茫?4)取0.4mg BSA，溶于0.5mL0.1mol/L NaHCO3緩沖液中，混勻后做為載體蛋白反應(yīng)液；(5)將步驟(4)制備的載體蛋白反應(yīng)液加入步驟(1)制備的混合液中，在10-30℃條件下孵育2h，所得產(chǎn)物為檢測抗原(BTX-BSA)，超濾離心去除未反應(yīng)的物質(zhì)，分裝后-20℃保存?zhèn)溆茫?)動物免疫(1)免疫動物為8周齡雄性BALB/C小鼠，免疫前斷尾采血作為陰性血清；(2)配制免疫抗原標(biāo)準(zhǔn)液2μg/μL，首次免疫使用弗氏完全佐劑乳化免疫抗原，抗原佐劑比1∶1，腹腔注射100μL/鼠，(3)18天后采用脾內(nèi)注射法注射，首免21天后斷尾取血檢測效價；3)取血清效價大于104的被免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法融合，制備單克隆抗體。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法，其特征在于脾內(nèi)注射方法 如下，將小鼠禁食禁水24小時，使用2%戊巴比妥鈉每只100uL將 小鼠麻醉，待眨眼反射消失后，將小鼠俯臥固定于簡易操作臺上，對 背部皮毛消毒，在背部中線左側(cè)0.5cm最后肋骨0.1cm處，沿體中軸 向下剪開lcm長切口，用手輕輕按壓兩側(cè)腹壁，使脾臟暴露出腹腔， 使用lmL注射器，注射lOuL全抗原標(biāo)準(zhǔn)液，邊注射邊退針盡量使 其均勻注入脾內(nèi)，將脾臟放回腹腔，逐層縫合腹腔及皮膚。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于飼養(yǎng)細(xì)胞的制備 是取12周齡以上，與骨髓瘤同系小鼠1-2只，挖去一只眼球放血， 待血滴不出為止，拉頸處死，將鼠浸在75。/。酒精5min消毒，無菌條 件下用消毒鑷子和剪刀剪開小鼠腹部外層皮膚，然后向上下兩側(cè)方向 拉開小鼠皮膚，暴露腹膜，用消毒注射器抽取3mL無血清HT1640 培養(yǎng)液，用鑷子將腹膜提起，將溶液注入小鼠腹腔內(nèi)， 一只手固定針 筒，針頭停留在腹腔內(nèi)，輕輕按摩腹壁l-2min，使巨噬細(xì)胞游出，然 后用注射器抽回腹腔內(nèi)液體，并進(jìn)行3次沖洗，收集沖洗液，1000rpm 離心5min，棄上清，用HAT培養(yǎng)液稀釋離心沉淀的細(xì)胞，并調(diào)整細(xì) 胞濃度至lXl()S個/mL，將細(xì)胞懸液按每孔10(^1鋪板，放于37°C 含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此細(xì)胞在融合前24h制備。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于免疫淋巴結(jié)B細(xì)胞懸液的制備是將免疫的BALB/C小鼠摘眼取血致死，收集血液于 EP管中，37。C放置2h后離心分離血清，-20。C貯存?zhèn)溆?，將猝死?小鼠浸入75%酒清中3min，無菌取胭淋巴結(jié)，放入載有200目銅網(wǎng) 的無菌平皿內(nèi)，加2mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基將淋巴結(jié)浸潤，用膠棒將淋巴結(jié) 研磨成漿狀，巴斯德吸管吹打分散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至50mL玻璃離心管內(nèi)， 1000g/min離心5min，重復(fù)洗2次，并計數(shù)細(xì)胞，最后用適量的 RPMI-1640懸浮細(xì)胞，使成5 X 107/mL，體積為2mL以上。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的方法，其特征在于細(xì)胞融合及 融合后細(xì)胞的培養(yǎng)是將胭淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)之比為10: 1，移到圓底玻璃離心管中，混均勻，1000rpm離心10min，棄掉上 清后，用手指稍用力彈擊試管底部，使沉淀呈槳糊狀，滴入50%的 PEG 0.7mL，用吸管吹吸4-5次，30s后，700rpm離心3min;緩慢 加入20mL RPMI-1640培養(yǎng)基，然后使試管底部做劃圓運動；2min 后1000g/min離心5min，棄上清，同法再洗一次；緩慢加入50mL含 HT培養(yǎng)基輕輕混勻后，加入到已準(zhǔn)備好滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上，每孔 加入IO(VL融合細(xì)胞懸液，置于37°C 5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合 24小時后，每孔補(bǔ)加50pL含HAT培養(yǎng)基，并分別于4天、7天和 10天，根據(jù)細(xì)胞生長情況更換或補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，第14、 18、 22、 25天換以20%小牛血清HT培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中，采用半量換液 法，即每次從每個小孔中吸出O.lmL培養(yǎng)液，再加入O.lmL新鮮培
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于雜交瘤細(xì)胞的篩 選是觀察融合細(xì)胞的生長情況，3天后可見克隆化生長的細(xì)胞，待 融合細(xì)胞集落生長至1/2視野以上時，檢測上清液中的抗體，篩選出 分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆，第一次檢測抗體在第二次換液的兩天后，即融合后的第10天進(jìn)行，以被測孔的OD值高于瘤細(xì)胞 上清液對照OD值的2倍以上定為陽性。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于陽性雜交瘤細(xì)胞的再克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)是待陽性孔細(xì)胞接近長滿時，用含20%胎牛血清 的RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞輕輕吹起，吸到無菌小瓶中，細(xì)胞計數(shù)， 稀釋至每IO(VI中含有0.5-1個細(xì)胞密度，然后將稀釋的細(xì)胞懸液滴 入飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔10(^1。將板置入37。C含5。/。C02溫箱培 養(yǎng)，每天觀察一次，3天換液一次，觀察每孔有幾個克隆株，對有兩 個或沒有細(xì)胞的孔分別作出標(biāo)記，待克隆細(xì)胞生長至8-10天時，檢 測抗體，標(biāo)出陽性孔，對所有的克隆細(xì)胞孔換液，換液2天后，再檢 測，將兩次檢測OD值高的孔進(jìn)行對照，對兩次檢測都是陽性的孔再 次克隆，直到克隆到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽性，最后選擇OD值高、 細(xì)胞活力好的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于腹水抗體的制備 是取8周齡BALB/C小鼠，將113°C、 15min條件高壓滅菌的石蠟油 注射到小鼠腹腔，0.5mL/只，8天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞2 X 106/只，接 種7天后每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹腔明顯鼓起，小鼠行動困 難并且皮膚有緊張感，即用16號針頭采集腹水，將腹水3000rpm離心10min,取上清，棄去脂肪，收集中間澄清腹水，采用辛酸-飽和硫酸 銨法初步純化,-20°C分裝凍存?zhèn)溆谩?br> 9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于腹水抗體親和力 的測定是純化后腹水稀釋至純化前相同體積，同時以SP2/0細(xì)胞接種 的腹水同等稀釋倍數(shù)做對照，采用非競爭性酶免疫法測定抗體親和 力，檢測抗原BSA-BTX按1、 0.5、 0.25、 0.125嗎/ml包被酶標(biāo)板， 100M1/ L， 37°C， 2h; 1%的明膠封閉后，將單抗從2000倍開始倍比 稀釋，以抗體濃度mol/L的對數(shù)值為橫座標(biāo)，以其對應(yīng)的OD值為縱 座標(biāo)，在一個座標(biāo)系內(nèi)作出4條S形曲線，找出S曲線的頂部，設(shè)定 為ODmax，在曲線中分別找出4條曲線各自50%ODmax對應(yīng)的抗體 濃度，將4個濃度兩兩-一組，根據(jù)公式計算單抗的親和常數(shù)。
全文摘要
一種制備短裸甲藻毒素單克隆抗體的方法涉及免疫安全檢測技術(shù)中單克隆抗體的制備，采用如下步驟完成，(1)完全抗原的制備，包括免疫抗原(BTX-IgG)和檢測抗原(BTX-BSA)制備，(2)動物免疫，(3)取血清效價大于10⁴的被免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法融合，制備單克隆抗體。用本免疫方法所制備的單克隆抗體腹水效價可達(dá)2.4×10⁵，親和常數(shù)達(dá)0.6×10⁹M^-1，腹水抗體效價和親和常數(shù)不低于傳統(tǒng)免疫方法所得抗體，免疫速度快，從而有效地降低單克隆抗體制備的成本。
文檔編號C07K16/14GK101509031SQ200910066698
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者任洪林, 盧士英, 玉 周, 張媛媛, 李巖松, 柳增善, 潘風(fēng)光 申請人:吉林大學(xué)