專利名稱：一種新的載脂蛋白c-ⅰ的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的生產(chǎn)、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達重 組人載脂蛋白C-I(rhApoC-I)，以及優(yōu)化的大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)重組人載脂蛋白C-I的 方法。
背景技術(shù)：
載脂蛋白C-I主要分布在乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白 中(HDL)，在血漿中的濃度為 0. 06 0. 07g/L(Polz E, Kotite L, Havel RJ, et a 1. Human apolipoprotein C_I-concentration in blood serum and lipoproteins[J]. Biochem Med, 1980, 24 (3) 229-237) 0人ApoC_I為含57個氨基酸殘基的單鏈多肽，相對分子質(zhì)量為 6. 6kD，不含半胱氨酸、組氨酸和酪氨酸。二級結(jié)構(gòu)中有55% a-螺旋結(jié)構(gòu)，極易與磷脂結(jié)合。 ApoC-I基因位于第19號染色體上長約48kb的載脂蛋白E/C-I/C-II基因簇內(nèi)，ApoE基因下 游，長約4. 7kb，主要在肝臟中表達，也有少量在肺、皮膚、睪丸和脾臟中表達。人ApoC-I和 ApoE基因處于同一個轉(zhuǎn)錄區(qū)。ApoE基因下游約18kb，即ApoC-I基因下游約9kb處有一長約 764bp的順式作用元件，其功能區(qū)長319bp，可調(diào)控肝臟ApoC-I和ApoE基因的表達，稱之為 肝臟調(diào)控域1。在ApoE/C-1/C-II基因簇ApoE基因下游27kb，即肝臟調(diào)控域1下游約10kb 處確定了第二個肝臟調(diào)控域，即肝臟調(diào)控域2。核酸序列分析表明，肝臟調(diào)控域2與肝臟調(diào) 控域1功能區(qū)的同源性高達85%。最近的研究發(fā)現(xiàn)，所有肝臟調(diào)控域均可單獨調(diào)節(jié)載脂蛋 白E/C-I/C-II基因簇所含基因的表達，而且只要有一個肝臟調(diào)控域存在，就可調(diào)控上述任 一基因在月干臟的表達(Allan CM, Walker D, Taylor JM. Evolutionary duplication of a hepatic control region in the human apolipoprotein E gene locus. Identification of a second region that confers high level and liver-specific expression of the human apolipoprotein E gene in transgenic mice[J]. J Biol Chem,1995,270(44) 26278-26281)。載脂蛋白C-I具有多種生理功能①抑制肝臟脂蛋白受體對富含TG脂蛋白的攝 取ApoC-I通過置換0-VLDL中的ApoE或掩蓋、改變ApoE結(jié)構(gòu)而抑制ApoE介導(dǎo)的0-VLDL 與LDL受體及LDL受體相關(guān)蛋白的結(jié)合，使富含TG的脂蛋白延時清除(Kowal RC,Herz J, Weisgraber KH，et al. Opposing effects of apolipoproteins E and C on lipoprotein binding to low density lipoprotein receptor-related protein[J]. J Biol Chem, 1990,265(18) :10771-10779)。②激活卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)，促進膽固醇酯化。 ApoA-I是LCAT最強的激活劑，ApoC-I亦可激活LCAT，激活能力約為ApoA_I的78% (Knott TJ, Robertson ME, Priestley LM. Characterisation of mRNAs encoding the precursor for human apolipoprotein C-I [J]. Nucleic Acids Res，1984，12 (9) :3909_3915)。③抑制 膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)。體外實驗表明，按ApoC-I N-末端的38個氨基酸序列合成的多 肽能抑制CETP 的活性(Gautier T，Masson D，de Barros JP，et al. Human apolipoprotein C~I accounts for the ability of plasma high density lipoproteins to inhibit the cholesteryl ester transfer protein activity[J]. J Biol Chem，2000，275 (48)37504-37509)。因此，ApoC_I在脂質(zhì)代謝調(diào)控中起著十分重要的作用。目前，ApoC_I多是 從血漿中分離并純化得到的，成本高而產(chǎn)量低。因此，有必要建立和發(fā)展重組表達和純化 ApoC-I的方法，以便滿足實驗室研究的需求。甲基營養(yǎng)酵母，特別是巴斯德畢赤酵母是已被深入研究的真核表達系統(tǒng)，并已被 用于表達許多有用的蛋白質(zhì)。例如，美國專利5，324，639公開了在甲基營養(yǎng)酵母特別是巴 斯德畢赤酵母細胞中生產(chǎn)胰島素樣生長因子1的方法；美國專利5，330，901公開了使用 巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達人血清白蛋白的方法；美國專利5，965，389提供了在甲基營養(yǎng) 酵母中表達L-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的DNA構(gòu)建體以及由之制備純的GAD65的方法；美 國專利公開了在巴斯德畢赤酵母中表達血小板衍生的細胞因子(PDGF)的方法；美國專利 6，780，615描述了使用重組巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)應(yīng)樂果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未見關(guān) 于使用巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)人ApoC-I的報道。發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供一種使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)重組人載脂蛋白 C-I (rhApoC-I)多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營養(yǎng) 酵母，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的 (1)甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子；(2)編碼載脂蛋白C-I的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和⑷ 可選擇標志，從而以至少80mg/L培養(yǎng)基的濃度產(chǎn)生載脂蛋白C-I多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且所說的甲基可誘導(dǎo)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。本發(fā)明的另一個目的是提供用于表達重組人載脂蛋白C-I的甲基營養(yǎng)酵母，該酵 母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長，并且是被包括甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子、編碼載 脂蛋白c-l的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標志的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且甲基可誘導(dǎo)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。本發(fā)明的再一個目的是提供用于在巴斯德畢赤酵母中表達重組人載脂蛋白c-i 多肽的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子、編碼載 脂蛋白C-I的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標志。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且所說的甲基可誘導(dǎo)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。本發(fā)明的再一個目的是提供使用巴斯德畢赤酵母大規(guī)模生產(chǎn)重組人載脂蛋白C-I 多肽的優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件，特征在于其中發(fā)酵溫度維持在28°C 30°C、所使用的pH值為 5. 8 6.0，并且培養(yǎng)基中添加有0.5% (W/V)的蛋白胨。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)生產(chǎn)、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達載脂 蛋白C-I的方法。巴斯德畢赤酵母(P. Pastoris)是20世紀80-90年代發(fā)展起來的極具潛力的酵母 表達系統(tǒng)，由于其在蛋白質(zhì)表達方面具有其它系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)點而得到越來越廣泛的應(yīng)用。
作為真核表達系統(tǒng)，巴斯德畢赤酵母具有許多其它蛋白表達系統(tǒng)所不具備的優(yōu) 點①屬于單細胞生物，故保留了易于操作和生長速度快的特點；②營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成 分簡單，生產(chǎn)成本低，特別適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；③通過同源重組，可將表達載體穩(wěn)定 地整合到宿主染色體中，連續(xù)傳代中不易丟失；④具有強有力的乙醇氧化酶基因(A0X)啟 動子，可嚴格調(diào)控外源基因的表達；⑤表達量高，許多蛋白的產(chǎn)率可達到每升克以上水平； ⑥表達的蛋白質(zhì)既可存在于胞內(nèi)又可分泌至胞外，巴斯德畢赤酵母自身蛋白質(zhì)的分泌量很 低，十分有利于目的產(chǎn)物純化；⑦作為真核表達系統(tǒng)，可對表達的蛋白進行翻譯后的正確加 工和修飾；⑧糖基化程度低。畢赤酵母表達系統(tǒng)由一個外源基因表達框和A0X1啟動子、多克隆位點(MCS)和 一個從A0X1基因上拷貝下來的終止序列(TT)組成。同時，大多數(shù)載體都包含作為篩選標 記的HIS4基因和為拷貝增殖而存在的序列(如ColEI復(fù)制起始點和抗氨芐青霉素基因)。 另外，還含有使外源基因能以替代或插入方式整合到染色體的A0X1部位的A0X13’非編碼 區(qū)序列。本發(fā)明所使用的載體是由啟動子、終止子、選擇標記、報告基因、復(fù)制起點等元件構(gòu) 成。另外分泌型載體還需要有信號序列。最常用的啟動子是A' 0X1啟動子，它的甲醇誘導(dǎo)性很強，因而它控制下的外源基 因能得到較高的表達。細胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶活力是由A0X1提供的。當在以葡萄糖 或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時，A0X1轉(zhuǎn)錄受到抑制；而在以甲醇為唯一生長碳源時，則 可誘導(dǎo)A0X1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達。選擇標記(HIS4) —般是對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型受體的 野生型基因。巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白質(zhì)很少，所以分泌表達是一種理想的表達方式。 同時，胞外表達更有利于蛋白質(zhì)的提取和純化。本發(fā)明優(yōu)選的信號肽是a因子(aMF)。a因 子信號序列由87個氨基酸組成，來自于啤酒酵母(S. cerevsia)的a性成熟因子前導(dǎo)序列， 并且已將這段序列編碼的信號肽插人到巴斯德畢赤酵母的表達載體中。本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母表達載體可以是胞內(nèi)表達的，也可以是分泌表達的。這 些載體都包括一個由0.9kb的5' A0X1序列片段和約0.3kb的轉(zhuǎn)錄終止基因的3'序列組 成的表達盒。分泌型表達載體可以是pPIC9、pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6E6等；胞 內(nèi)表達的載體可以是 pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHW010E121、pGAPZ、pGAPZa 等。本 發(fā)明優(yōu)選的是pPICZa。一般用于外源基因表達的巴斯德畢赤酵母菌株包括Y-l 1430、M-6100-3、GS115、 KM7USMD1168等，本發(fā)明優(yōu)選的是巴斯德畢赤酵母X-33菌株。得到攜帶ApoC-I基因的重組表達載體后，可使用鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)球法和 電穿孔法等方法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主細胞。其中，本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法是電穿孔 法(Sambrook，ed. Molecular Cloning :A Laboratory Manul(2nd. ed.), Vols. 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory,1998)。導(dǎo)入酵母體內(nèi)的重組表達載體只有與酵母染色體上的同源區(qū)發(fā)生重組，整合到染 色體上，外源基因才能夠穩(wěn)定存在并得以表達。本發(fā)明中，為了穩(wěn)定地表達目的基因，可以 在His或5' A0X1的單酶切位點將質(zhì)粒載體線性化(Sac I)，使之通過單交換整合到酵母 細胞染色體中，從而得到表型為Mut+并具有高甲醇利用能力的轉(zhuǎn)化子。用于本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母含有典型高等真核生物的許多翻譯后修飾功能。這些功能包括信號肽的加工、蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵的形成、0-及N-型糖基化和?；?等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白質(zhì)的糖基化鏈參與細胞識別、激素受 體結(jié)合、蛋白質(zhì)定位及宿主一微生物間相互作用。糖基化過程是經(jīng)一系列剪接并產(chǎn)生由 Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)組成的寡核糖的反應(yīng)。巴斯德畢赤酵母能夠?qū)⑻妓衔?連接到分泌表達的外源蛋白質(zhì)上。巴斯德畢赤酵母修飾糖鏈的平均長度為8 14甘露糖， 而且外鏈不含a_l，3甘露糖，所以其表達的糖蛋白特別適于治療應(yīng)用。由于本發(fā)明中充分優(yōu)化了發(fā)酵pH值、攪拌速率、營養(yǎng)補給等培養(yǎng)條件，所以可使 酵母菌高密度生長，從而導(dǎo)致產(chǎn)物的高效表達。例如，在5L搖瓶培養(yǎng)條件下，本發(fā)明的重組 人載脂蛋白C-I多肽表達產(chǎn)率可達到80mg/L。絕大多數(shù)情況下，巴斯德畢赤酵母(P. Pastoris)中整合多拷貝外源基因會提高 重組蛋白表達產(chǎn)量，所以本發(fā)明優(yōu)先選擇分泌型、高拷貝標記和易操作的穿梭載體，特別是 pPICZa作為ApoC-I多肽的表達載體。另外，由于在His位點整合時，染色體突變的His位點可與表達盒的HIS4基因位 點之間發(fā)生基因交換會導(dǎo)致表達盒的丟失，故一般優(yōu)先選擇A0X1位點。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基可以是BMGY/BMMY，BMG/B匪，MGY/MM等培養(yǎng) 基，但優(yōu)選的是成分中含有緩沖液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培養(yǎng)基。作為唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般為培養(yǎng)體積的0. 5-1. 0% (V/V)。發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可使用已知的方法檢測由被轉(zhuǎn)化細胞分離物所產(chǎn)生的ApoC-I 多肽含量，并從中選擇有高產(chǎn)率的細胞分離物，用于放大生產(chǎn)?？墒褂秒x子交換層析、親合層析、超濾等方法分離并純化所需的ApoC-I多肽。本發(fā)明首次在酵母(畢赤酵母X-33)中高效分泌表達了 hApoC-I，建立了穩(wěn)定的 rhApoC-I畢赤酵母高效表達體系。與在大腸桿菌中的表達相比，本發(fā)明的方法具有如下特 點①表達體系穩(wěn)定，含目的基因的表達盒通過同源重組整合進入酵母的染色體中，菌種穩(wěn) 定，不存在質(zhì)粒丟失的問題；②有效的分泌表達，目的蛋白質(zhì)的表達受醇氧化酶啟動子的嚴 格控制，可在甲醇誘導(dǎo)下啟動表達并將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，而且畢赤酵母本身的蛋 白很少分泌到培養(yǎng)基中，使目的蛋白更易于純化；③表達產(chǎn)量高，rhApoC-I在畢赤酵母中 的搖瓶規(guī)模表達量可高達80mg/L ；④不存在內(nèi)毒素污染問題；⑤大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)成本低。在ApoC-I純化方面，本發(fā)明采用pH4. 0條件下進行陽離子交換層析可很好的避免 核酸和內(nèi)毒素的污染，并且有利于保持rhApoC-I的穩(wěn)定，防止其降解。本發(fā)明建立了在酵母中高效分泌表達hApoC-I的方法，同時建立了聯(lián)合使用陽離 子交換層析、超濾和疏水層析技術(shù)純化hApoC-I產(chǎn)物的方法。使用SDS-PAGE、Western blot 分析，證實按照本發(fā)明方法生產(chǎn)的rhApoC-I具有與天然hApoC-I相同的序列和理化性質(zhì)， 從而為進一步檢測其體內(nèi)外生物學(xué)活性提供了必要條件。結(jié)果顯示，本發(fā)明建立的畢赤酵母工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組人載脂蛋白C-I的 產(chǎn)量約為80mg/L發(fā)酵液，經(jīng)陽離子交換層析、超濾、反向疏水層析純化后產(chǎn)物回收率約為 65.6%，純度高達95.6%。本發(fā)明的這些研究結(jié)果無疑將為重組人載脂蛋白C-I的工業(yè)化 生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供必要的基礎(chǔ)。


圖1顯示重組質(zhì)粒pPICZa/hApoC-I轉(zhuǎn)化酵母菌的PCR鑒定電泳圖譜。其中泳道6 是DNA分子量標志物(DL2000)；泳道3是空白質(zhì)粒pPICZa轉(zhuǎn)化的酵母菌基因組DNA的PCR 產(chǎn)物；泳道1 2、4 5和7 11是不同酵母菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物。圖2顯示純化前后rhApoC-I蛋白的SDS-PAGE圖譜(考馬斯亮藍染色)。其中泳 道1是商品化抑肽酶(相對分子質(zhì)量6. 5kD)；泳道2是Takara蛋白質(zhì)分子量標志物；泳道 3是是甲醇誘導(dǎo)表達120h發(fā)酵上清；泳道4是經(jīng)SP Sepharose XL陽離子層析、10kD濾膜 超濾和Source 30疏水層析純化的rhApoC_I。圖3顯示純化的rhApoC-I的Western blot分析結(jié)果。其中泳道1 3是純化的 rhApoC-I ；泳道4是甲醇誘導(dǎo)前發(fā)酵上清。圖4顯示pH對rhApoC-I表達的影響(SDS-PAGE分析)。其中泳道1是甲醇誘 導(dǎo)表達Oh發(fā)酵上清；泳道2 9分別為pH3. 4、3. 8、4. 2、4. 6、5. 0、5. 4、5. 8、6. 2條件下，誘 導(dǎo)表達120h上清；泳道10是Takara蛋白質(zhì)分子量標志物。
具體實施例方式以下借助實施例描述本發(fā)明的最佳實施方式。這些實施例旨在進一步舉例闡明本 發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。實施例1 人載脂蛋白C-I基因(hApo C-I)的克隆和擴增(1)Trizol法從人肝組織中提取總RNA將新鮮分離的人肝組織切成100mg的大小，立即放入液氮中速凍。按下列方法從 組織中提取總RNA。取出冰凍的組織300mg放入盛有液氮的研缽中，將組織碾碎。將碾碎 的組織移入50ml離心管中，加入約5ml Trizol，于室溫用勻漿器高速勻漿15 30s。加 A 1. 0ml氯仿(200 u 1/ml Trizol)，充分振蕩搖勻，室溫下放置5min。4°C離心(12000" min)15min后將上層水相移至另一離心管中。加入等體積異丙醇，振蕩搖勻，室溫沉淀 10min，4°C離心(12000r/min) 15min，棄上清。加入75%乙醇1ml洗滌沉淀2次，4°C離心 (12000r/min) 5min,室溫下空氣蒸發(fā)殘存乙醇。將總RNA沉淀溶于50 u 1 DEPC處理過的水 中，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｈ? ill樣品稀釋100倍后經(jīng)紫外分光光度計測定A260和A280，計算其濃度和純 度，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性。RNA含量按下面公式計算RNA 濃度(ii g/ ii 1) = A260 X 40 X 稀釋倍數(shù) /1000A260/A280 = 1. 8 2. 0 表示純度合格(2)hApoC-I 基因的克隆(RT-PCR 法)RT 反應(yīng)在0. 2ml EP管中加入上述提取的總RNA 1 u g, 1 U 1 OligodT，70°C變性lOmin，冰 浴lmin，然后加入下列反應(yīng)液MgCl24u 110 X RNA PCR 緩沖液2 u 1RNA 酶抑制劑0. 5 ill
dNTP(10mmol/L)2 u 1AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 ii 1無RNA酶滅菌超純水 加至終體積20 u 1于PCR儀上42°C反應(yīng)60min，然后99°C 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA用于下一步 PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)向上述0. 2ml EP管中加入以下反應(yīng)體系10XLA PCR 緩沖液8 u 1LATaq1 U 1上游引物liil下游引物liil滅菌超純水加至終體積100 U 1在PCR儀上進行循環(huán)擴增。擴增程序為①94°C 2min②94°C 30s, 57°C 30s, 72°C lmin, 30 個循環(huán)(3) 72°C lOmin此PCR反應(yīng)引物序列如下上游引物5，-TCCAGCAAGGATTCAGAGTGCC-3，(SEQID NO 1)下游引物5，-TGGGATGTCACCCTTCAGGTC-3，(SEQID NO 2)擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察片段大小是否與預(yù)期結(jié)果吻合，確定是否 得到正確目的基因。(3)克隆載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與擴增回收PCR擴增的hApo C-I基因片段進行瓊脂糖凝膠電泳分析?；厥蘸螅瑢?hApoC-I基因片段與T載體16°C連接30分鐘。連接反應(yīng)體系包括hApoC-I基因片段0. 1 0. 3pmol ；T載體0. 03pmol ；溶液I (含DNA連接酶和連接緩沖液，見Takara公司T載體試劑 盒)5 ill ；滅菌超純水至終體積10 ill。按照常規(guī)方法，從37°C培養(yǎng)16小時的XLi-Blue陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的LB 瓊脂平板)挑取單個菌落(直徑2 3mm)，接種于含有100ml LB培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中，以 制備感受態(tài)大腸桿菌細胞，并于-80°C凍存?zhèn)溆?。取一份凍存的感受態(tài)細胞融化后，加入上述連接產(chǎn)物，進行常規(guī)轉(zhuǎn)化。然后取 200 u 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布于含X-Gal、IPTG( 二者可在涂菌前半小時涂于LB瓊脂平 板表面)和氨芐青霉素(lOOyg/ml)的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 16小時。(4)重組載體的鑒定隨機挑取轉(zhuǎn)化后的白色單菌落(“藍白篩選”)，接種于含氨芐青霉素(lOOyg/ml)的 LB培養(yǎng)基中，37°C強烈震蕩培養(yǎng)過夜，然后常規(guī)提取質(zhì)粒DNA。取1 yl溶解的DNA沉淀物進行 瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定。37°CPst I、EcoR I雙酶消化2小時，瓊脂糖凝膠電 泳后根據(jù)內(nèi)切酶譜鑒定正確克隆。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質(zhì)粒，用于DNA測序。實施例2 :hApoC-I畢赤酵母分泌型表達載體pPICZa/hApoC-I的構(gòu)建和宿主細胞 轉(zhuǎn)化
取上述測序鑒定正確的攜帶hApoC-I基因的質(zhì)粒50ng，按上述比例在0.2ml EP管 中建立PCR反應(yīng)體系。利用上述PCR反應(yīng)體系和條件，借助上游引物5’-ATACTCGAGAAGAGA ACCCCAGACGTCTCCA-3，(SEQ ID NO 3)引入酵母a因子信號肽的部分序列和Xhol位點，并 利用下游引物5，-GCCGAATTCTCATGAGTCAATCTTGAGTTTCTCC-3，(SEQ ID NO 4)引入 EcoRI 位點。PCR引入上述序列和酶切位點后，回收目的片段。用相應(yīng)酶切后，連入用同樣酶切后 的質(zhì)粒pPICZa，構(gòu)建畢赤酵母表達載體pPICZa/hApoC-I，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒并 進行酶切鑒定和DNA序列測定分析。取測序正確的培養(yǎng)菌液，按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA并用瓊脂糖凝膠 電泳法進行定量分析。取10 15ii g pPICZa/hApoC-I重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶消化(線性 化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質(zhì)粒用10 yl超純水溶解后置冰上備用。從畢赤酵母X-33的YPD陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取單個菌 落，接種于5ml YPD培養(yǎng)基中，250rpm，3(TC震蕩培養(yǎng)8小時，以常規(guī)制備酵母感受態(tài)細胞。然后取80 ill上述感受態(tài)菌，與10 15 iig線性化的重組表達質(zhì)?；旌?，移入 0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯內(nèi)進行電轉(zhuǎn)化。取50 100 ill轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含Zeocin (100 u g/ml) 的YPD平板上，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 3天，觀察轉(zhuǎn)化子的生長狀況。PCR方法篩選轉(zhuǎn)化酵母 菌。離心回收菌體后，提取酵母基因組DNA并進行PCR鑒定，鑒定結(jié)果如附圖1所示。實施例3 :ApoA-II多肽的表達和純化(1)重組人載脂蛋白C-I (rhApoC-I)的表達取上述鑒定結(jié)果陽性的克隆接種于10ml BMGY(pH6.0)培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng) 24小時，至0D■達到2.0 6.0時收集細胞。用等體積(10ml)BMMY(pH6. 0)重懸細胞沉淀， 30°C震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)過程中，每24小時補充一次甲醇至終濃度0.5%，同時補充 滅菌超純水，使發(fā)酵液總體積保持不變。在培養(yǎng)的第0、24、48、72、96、120、144、168小時等 時間點各取0. 5ml發(fā)酵液，離心取上清用于蛋白質(zhì)分析(SDS-PAGE分析，Western Blot分 析)。(2)rhApoC_I 的純化發(fā)酵液經(jīng)高速大容量離心機(5000r/min)連續(xù)離心分離發(fā)酵液上清。上清經(jīng) SPSepharose XL陽離子柱層析(緩沖液為20mmol L—1 HAc-NaAc緩沖液，洗脫液為含 0. 5mol .L-1 NaCl 的 20mmol .L-1 HAc-NaAc 緩沖液)以及 10kD 濾膜超濾和 Source 30 RPC 反相疏水柱層析(洗脫液為含0. 1%TFA的50%甲醇)后用升降恒溫浴鍋37°C減壓蒸餾甲 醇洗脫液，脫甲醇濃縮，獲得純化的rhApoC-I。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，如此純化的rhApoC_I至少達到電泳純，且產(chǎn)物的的收率 和純度分別達到65. 6%和95. 6% (參見附圖2)。實施例4 :ApoC-I多肽的理化性質(zhì)鑒定(l)Tricine-SDS-PAGE 分析用Tricine-SDS-PAGE進行蛋白質(zhì)分子量的測定和粗略定量分析。方法如下1)制膠按如下比例灌制分離膠和濃縮膠。①15%分離膠的配制超純水0. 34ml30% 丙烯酰胺4.7ml
3. Omol L^Tris-HCl (pH8. 45) 3. Oml甘油0. 95ml10% 過硫酸銨0.03mlTEMED0.006ml②濃縮膠的配制超純水3. 12ml30% 丙烯酰胺0.64ml3mol L^Tris-HCl (pH8. 45)1. 24ml10% 過硫酸銨0.03mlTEMED0.006ml2)分別取2處、4811、7211、9611、12011培養(yǎng)上清按4 1比例加入5XSDS樣品緩沖 液，混勻后，煮沸5min。3)取出上述樣品，冷卻至室溫后，離心(10000r/min)30S，取上清每孔加樣50 yl。4)50V電泳至濃縮膠與分離膠交界處，調(diào)整電壓到100V，恒壓電泳分離。5)考馬斯亮藍染色、脫色后，觀察分析結(jié)果。(2)表達產(chǎn)物的Western blot分析按照常規(guī)方法將發(fā)酵液上清經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干 燥30 60分鐘。將上述NC膜置于平皿中，加入20ml封閉液(含0. 2% BSA的TTBS)，室 溫輕輕振蕩2 3小時或4°C封閉過夜。封閉結(jié)束后，將NC膜放入雜交袋中按0. lml抗體 溶液/cm2膜加入小鼠抗人ApoC-I抗體，室溫振蕩1 4小時。膜用TTBS漂洗3 5次后， 用抗體稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠抗體至1 200 1 1000，加入雜交 袋中，與NC膜一起室溫振蕩2 4小時。加入lml 0.3% (W/V)NiCl或CoCl2及10
H202溶液。洗膜后，將膜移入顯色液中，室溫下輕輕搖動并觀察顯色反應(yīng)。結(jié)果如附圖3所
7J\ o實施例5 :rhApoC-I發(fā)酵最佳pH的確定畢赤酵母對培養(yǎng)基的pH適應(yīng)范圍很廣，在pH 3. 0 6. 0都能很好地生長，但是 在發(fā)酵表達外源蛋白的過程中，發(fā)酵液PH對外源蛋白的表達有很大的影響，在大規(guī)模發(fā) 酵細胞高密度培養(yǎng)時尤為明顯。因此，在進行大規(guī)模發(fā)酵前，在搖床水平進行了發(fā)酵表達 rhApoC-I的pH優(yōu)化，為rhApoC-I的大規(guī)模發(fā)酵表達提供必要參數(shù)。選取表達量高的rhApoC-I畢赤酵母工程菌接種于10ml YPD培養(yǎng)基中，30°C、 250r/min震蕩培養(yǎng)24 36h。取上述培養(yǎng)的菌液lml接種于100ml BMGY培養(yǎng)基中30°C、 250r/min震蕩培養(yǎng)24 36h。分別取上述菌液10ml置于50ml離心管中，室溫離心(3000r/ min) lOmin,棄上清。各管分別加入未加緩沖液的BMMY9ml，加入lmol L-1 Na2HP04和 0. 5mol化―1檸檬酸配制成不同pH的BMMY誘導(dǎo)表達(rhApoC_IT程菌分別在pH為3. 4、3. 8、 4. 2,4. 6,5. 0,5. 4,5. 8,6. 2 的條件下誘導(dǎo)表達，確定 rhApoC-I 發(fā)酵的最適 pH)，30°C、250r/ min震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)過程中每24h補充甲醇至終濃度為0. 5%，同時補充滅菌去離子水，使發(fā) 酵液總體積保持不變。在培養(yǎng)72、96、120、144、168小時等時間點各取0.5ml發(fā)酵液，離心 取上清進行蛋白質(zhì)定量分析(Tricine-SDS-PAGE法)。結(jié)果顯示在pH值5. 4 6. 2條件下，rhApoC-I表達量最高，確定pH 5. 8為rhApoC-I發(fā)酵的最佳pH條件(參見附圖4)。序列表<110>吉林圣元科技有限責任公司<120> 一種新的載脂蛋白C-I的制備<140><141><160>4<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴增引物。<400>1TCCAGCAAGG ATTCAGAGTG CC<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴增引物。<400>2TGGGATGTCA CCCTTCAGGT C<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計的用作構(gòu)建表達載體的PCR擴增引物。<400>3ATACTCGAGA AGAGAACCCC AGACGTCTCC A<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計的用作構(gòu)建表達載體的PCR擴增引物。<400>4GCCGAATTCT CATGAGTCAA TCTTGAGTTT CTCC
1權(quán)利要求
一種使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)重組人載脂蛋白C I多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的(1)甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子；(2)編碼人載脂蛋白C I的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和(4)可選擇標志，從而以至少80mg/L培養(yǎng)基的濃度得到重組人載脂蛋白C I多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的 甲基可誘導(dǎo)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵AOXl基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于表達重組人載脂蛋白C-I的甲基營養(yǎng)酵母能夠依靠作 為碳源和能源的甲醇生長，并且該酵母是被包括甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子、編碼人載脂蛋 白C-I的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標志的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。
4.用于在甲基營養(yǎng)酵母中表達重組人載脂蛋白C-I的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括可操 作連接的元件甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子、編碼人載脂蛋白C-I的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和 可選擇標志。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的構(gòu)建體，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且甲基 可誘導(dǎo)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。
6.純化載脂蛋白C-I的方法，特征在于依次使用陽離子交換層析、超濾和疏水層析技 術(shù)分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)、純化、鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達重組人載脂蛋白C-I(rhApoC-I)，以及優(yōu)化的高密度發(fā)酵生產(chǎn)和純化重組人載脂蛋C-I的方法。其今后的可能用途在于生產(chǎn)重組人載脂蛋白C-I，可在臨床上用于調(diào)節(jié)血脂代謝。
文檔編號C07K1/36GK101928721SQ20091006715
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者蘇曼曼, 顏煒群 申請人:吉林圣元科技有限責任公司