專利名稱：可抑制剪式g:a錯配核酸雙鏈解旋的釕配合物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及金屬配合物，具體涉及一種可抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解旋的釕配合物及 其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對于任何有機(jī)體的生存來說，維持基因信息的完整表達(dá)是非常重要的。具有G:C和A:T Watson-Crick堿基配對的DNA雙股螺旋是遺傳信息儲存、表達(dá)和穩(wěn)定傳遞的重要載體。為了 使遺傳信息準(zhǔn)確地傳給下一代，DNA復(fù)制必須具有極高的精確性。然而，人類基因大約含109 堿基對，任何對DNA物理或化學(xué)的破壞都會影響雙螺旋結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致在DNA復(fù)制過程 中的堿基錯配。如果這些錯誤不能被及時修復(fù)，其結(jié)果將導(dǎo)致子系DNA發(fā)生誘變，從而引發(fā) 致命的癌癥或基因病。在這種情況下，開發(fā)可以抑制錯配DNA復(fù)制從而抑制癌細(xì)胞繁殖的實(shí) 驗(yàn)體系具有很重要的意義。
研究表明在所有的錯配堿基配對中，剪式G:A錯配是最難識別的。它和正常配對堿基有 相似的穩(wěn)定性。到目前為止，這種錯配的特異性識別還未見報(bào)道。
DNA由兩條互補(bǔ)的單鏈通過堿基間的氫鍵維持雙螺旋構(gòu)型。由于氫鍵是次級鍵，可以通 過提高溶液的溫度使DNA的兩條鏈完全解離而發(fā)生熱變性。DNA由雙鏈解離為單鏈的過程可 以通過其在260 nm的特征吸收值的變化觀察到。隨著DNA的解旋，該處特征吸收值會逐漸 增大。
我們課題組曾經(jīng)合成了幾個具有大環(huán)平面插入配體的鈷(ni)的配合物并研究了它們與 含剪式G:A錯配DNA的作用，結(jié)果表明這些配合物以插入方式與DNA作用，隨著溫度的升高， DNA鏈發(fā)生解旋(Eur. J. Inorg. Chem., 2005， 314廣3148 ; J. Inorg. Biochem, 2009, 103. 827 832)，因而不能抑制剪式G:A錯配DNA復(fù)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種可抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解旋的釕配合物及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明提供的一種可抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解旋的釕配合物，它含有三個雙齒含N 大環(huán)平面配體，其中主配體的頭部寬度為三個苯環(huán)。該釕配合物結(jié)構(gòu)式如下
3本發(fā)明釕配合物的制備方法，包括以下步驟-
1)、 RuCl3 3仏0和鄰菲咯啉以摩爾比1:2加入到雙頸瓶中，在雙排管上抽真空-充氮?dú)?抽真空，循環(huán)三次；用注射器注入重蒸的DMF后，加熱至15(TC，攪拌反應(yīng)7_9小時，降至 室溫，加入過量丙酮，O'C放置過夜，析出墨綠色結(jié)晶，抽濾，用冰水洗滌，真空干燥得到前 體Ru(phen)2Cl2;
2) 、將Ru(phen)2Clz和鄰菲咯啉二酮以1:1. 5溶于甲醇和水的比例為2:1的混合溶劑中， 氮?dú)獗Ｗo(hù)回餾反應(yīng)5小時，冷卻，加入過量的高氯酸鈉飽和溶液，靜置過夜，產(chǎn)生桔黃色結(jié) 晶，抽濾，水、乙醚洗滌，真空干燥，得到前體[Ru(phen)2(phendione)](C104)2;
3) 、將[Ru(phen)2(phendione)] (C1(X)2溶于乙腈中，加入2-3倍摩爾量的鄰位雙氨取代的 稠環(huán)化合物，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回餾5-8小時，冷卻后過濾，濾液中加入過量乙醚，析出沉淀， 抽濾真空干燥得到釕配合物的高氯酸鹽；
4) 、將釕配合物的高氯酸鹽溶于丙酮中，加入過量的飽和氯化四丁基銨丙酮溶液，析出 沉淀，即為水溶性的釕配合物。
步驟3)中所述的鄰位雙氨取代的稠環(huán)化合物是9， IO-二氨基菲或I, 2-二氨基蒽醌。 釕配合物抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解旋的測試先將釘配合物溶于生理?xiàng)l件緩沖體系， 然后加入到含剪式G:A錯配的核酸體系中，從KTC逐漸升溫至60'C，測定體系的吸收值以及 光散射強(qiáng)度的變化。結(jié)果表明即使在60'C時DNA雙鏈也不解旋，而且溫度越高越穩(wěn)定。說 明本發(fā)明釕配合物能夠穩(wěn)定含剪式G:A錯配的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，抑制該DNA復(fù)制，可以應(yīng)用于 制備抗癌藥物。


圖1 (a)和圖1 (b)分別為配合物1和作為對照的解鏈抗癌藥物BLMAs對含剪式G:A錯配的 十聚寡核苷酸d(CCGAATGAGG)2熱變性的影響；
圖2配合物1、配合物1與含剪式G:A錯配DNA作用后的混合體系隨溫度變化的共振散射譜。其中，Rl為單獨(dú)配合物的共振散射譜隨溫度的變化；R2為配合物與錯配核酸混合體系 的共振散射譜隨溫度的變化。
圖3含剪式G:A錯配DNA分別與配合物1、平陽霉素作用后隨溫度變化的共振散射譜。 Rl為平陽霉素與錯配DNA作用體系的的共振散射隨溫度的變化；R2為平陽霉素與錯配DNA混
合體系中再加入配合物后體系的共振散射隨溫度的變化。
圖4配合物2對含剪式G:A錯配的十聚寡核苷酸d(CCGAATGAGG)2熱變性的影響。 圖5配合物2與含剪式G:A錯配DNA作用后的體系隨溫度變化的共振散射譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1-2為配合物制備實(shí)施例；實(shí)施例3-4為釕配合物抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解 旋的測試實(shí)施例。 實(shí)施例l
步驟一稱取RuCl3 3H20 (0. 78 g, 2. 98 mmol)和phen (1. 2 g， 6 ranol)加入到雙頸瓶 中，在雙排管上抽真空-充氮?dú)?抽真空，循環(huán)三次。用注射器注入重蒸的函F后，加熱至150°C， 攪拌反應(yīng)約8小時，降至室溫，加入150ml丙酮，Ot:放置過夜。抽濾，用冰水洗滌，真空 干燥得到墨綠色固體-(phen)2RUCl2。
步驟二稱取-(Phen)2RuCl2 0.27 g,鄰菲咯啉二酮0.21 mg溶于14 ml甲醇水 (2:1)的混合溶劑中，氮?dú)獗Ｗo(hù)回餾反應(yīng)5小時，冷卻，加入過量高氯酸鈉飽和溶液，靜 置過夜，產(chǎn)生桔黃色結(jié)晶，抽濾，水、乙醚洗滌各1次，真空干燥，得到 [(phen) 2Ru (phendione) ] C104。
步驟三稱取[(phen) 2Ru (phendione) ]C104 0. 87g溶于乙腈中，加入9， 10-二氨基菲0. 42g， 氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回餾5小時，冷卻后過濾，濾液中加入過量乙醚，析出沉淀，抽濾，真空干 燥得到釕配合物1的高氯酸鹽。
步驟四將釕配合物l的高氯酸鹽溶于丙酮中，加入過量飽和的氯化四丁基銨丙酮溶液， 得到水溶性的終產(chǎn)物釕配合物1。
'H NMR (DMSO-d6) : 9. 97 (dd' 2H) ， 9. 65 (dd, 2H), 8. 98 (dd, 2H) ， 8. 80 (dd, 4H) ， 8. 42 (S, 4 H), 8. 30(dd，2H)， 8. 23 (dd, 2H), 8. ll(dd'加，8.04(m,2H), 7. 98 (m, 4H), 7. 82~7. 78 ((m, 4 H)
實(shí)施例2:
用l， 2-二氨基蒽醌代替9， 10-二氨基菲，其余同實(shí)施例l，得到釕配合物2。 'H NMR (DMSO-d6) : 9. 69 (d， 1H) ， 9. 62 (d, 1H), 8. 83 8. 79 (m， 4H) ， 8. 42 (S, 4H) ， 8. 31 (m， 3H)， 8.28(dd,2H), 8. 25 (dd'1H), 8, 08 (m, 2H) ， 8. 04(ra, 1H)， 7.99(m,2H)，7. 94 (m, 1H) ， 7. 78~7. 84 (m, 4H) ， 7. 47 (d， 1H)' 6. 78 ((d， 1H)
實(shí)施例3:釕配合物1抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解旋的測試
一、 溶液配置
(1) 磷酸緩沖液配置
稱取0. 7 g Na2HP04, 0. 6 g NaH2P04， 1. 2 g NaCl溶于800 ml去離子水中，定容至1000 ml,測定pH值為7.0，分裝后高壓滅菌備用。
(2) 配合物溶液的配置 用緩沖溶液配制配合物溶液10—4M備用。
(3) 寡聚DNA溶液的配置
100 OD商用寡聚核苷酸用0.5ml磷酸緩沖液溶解，9(TC恒溫?cái)?shù)分鐘后緩慢降溫得到雙 鏈寡聚DNA溶液。1 H NMR上9. 7 ppm的活潑氫共振信號和31P剛R上0. 37 ppm、 0. 11 ppm處 的兩個低場信號證明了剪式G:A錯配得存在。用260 nm處的紫外吸收值計(jì)算寡核苷酸濃度。
二、 抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解旋的測試
l(T M配合物與寡聚DNA以1:1室溫反應(yīng)30 min，做下面兩種測試
(1) 紫外吸收光譜做DNA熱變性實(shí)驗(yàn)。每個溫度恒溫IO min后測試。 在pH7.0的磷酸緩沖液中，隨著溫度升高，含剪式G:A錯配的寡核苷酸d(CCGAATGAGG)2
由雙鏈解旋為單鏈，在4(TC己完全解旋。而與配合物1作用30 min后做該DNA的熱變性實(shí) 驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，DNA鏈不僅沒有解旋，而且溫度越高越穩(wěn)定，甚至在60'C時還沒 有解旋的跡象(圖la)。
傳統(tǒng)的抗癌試劑平陽霉素是一種使DNA解鏈的試劑，它對DNA熱變性的影響正好相反(圖 lb)，在2(TC時錯配核酸已大部分解旋。該實(shí)施例說明配合物1可以穩(wěn)定錯配DNA雙螺旋使 其不易解旋，從而抑制錯配DNA的進(jìn)一步復(fù)制以及癌細(xì)胞的分裂增值。有望用于源于該錯配 引起的疾病的治療。
(2) 共振光散射實(shí)驗(yàn)
激發(fā)狹縫寬度2.5 nm發(fā)射狹縫寬度2.5 nm掃描范圍250 nm 800 nm。 在pH 7. 0的磷酸緩沖液中，隨著溫度從l(TC升高到60°C，單獨(dú)配合物和單獨(dú)錯配DNA 的共振散射峰強(qiáng)度都很弱，基本不變，而配合物與錯配DNA的混合體系在508 nm處的共振 散射峰明顯增強(qiáng)。表明隨著溫度的升高，配合物與錯配DNA作用增強(qiáng)，生成的配合物-錯配 DNA的締合物增多，共振散射峰強(qiáng)度增大。進(jìn)一步證明了配合物可以穩(wěn)定核酸的雙鏈結(jié)構(gòu)， 抑制DNA的進(jìn)一步復(fù)制。
將解鏈試劑平陽霉素與該錯配核酸混合30 min，測試體系從10 35X:的共振散射。結(jié)果表明體系的共振散射峰強(qiáng)度很弱且基本不變，這是由于在l(TC時BLMA5已經(jīng)使得錯配核酸有 部分解旋。這時在該體系中加入配合物1，再測定此時三元混合體系的共振散射，發(fā)現(xiàn)體系 在508 nm處的共振散射峰明顯增強(qiáng)，并且隨著溫度升高，共振散射峰強(qiáng)度進(jìn)一步增大，說明 生成的配合物-錯配DNA的締合物增多。這一結(jié)果表明配合物不僅可以穩(wěn)定錯配核酸的雙鏈結(jié) 構(gòu)，還有促使兩條單鏈形成雙鏈的能力。
實(shí)施例4:釕配合物2抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解旋的測試
用釕配合物2代替實(shí)施例3中的釕配合物1。釕配合物2抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解 旋的測試結(jié)果見圖4和圖5。
權(quán)利要求
1、一種可抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解旋的釕配合物，其特征在于，它的結(jié)構(gòu)式為式中-R為 id="icf0002" file="A2009100754860002C2.tif" wi="48" he="23" top= "76" left = "51" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2、 如權(quán)利要求l所述的釕配合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1) 、用三氯化釕和鄰菲咯啉在DMF中制備Ru(phen)2Cl2;2) 、用Ru(phen)2Cl2和鄰菲咯啉二酮制備[Ru(phen)2(phendione)] (C104)2;3) 、將[Ru(phen)2(phendione)](C104)2溶于乙腈中，加入2-3倍摩爾量的鄰位雙氨取代的 稠環(huán)化合物，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回餾5-8小時，冷卻后過濾，濾液中加入過量乙醚，析出沉淀， 抽濾真空干燥得到釕配合物的高氯酸鹽；4) 、將釕配合物的高氯酸鹽溶于丙酮中，加入過量的飽和氯化四丁基銨丙酮溶液，析出 沉淀，即為水溶性的釕配合物。
3、 如權(quán)利要求2所述的釕配合物的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述的鄰位雙氨 取代的稠環(huán)化合物是9， 10-二氨基菲或l， 2-二氨基蒽醌。
4、 如權(quán)利要求1所述的釕配合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可抑制剪式G:A錯配核酸雙鏈解旋的釕配合物，它含有三個雙齒含N大環(huán)平面配體，其中主配體的頭部寬度為三個苯環(huán)。其制備步驟包括用三氯化釕和鄰菲咯啉制備Ru(phen)₂Cl₂；用Ru(phen)₂Cl₂和鄰菲咯啉二酮制備[Ru(phen)₂(phendione)](ClO₄)₂；將[Ru(phen)₂(phendione)](ClO₄)₂溶于乙腈中，加入鄰位雙氨取代的稠環(huán)化合物，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回餾，冷卻后過濾，析出沉淀，真空干燥得到釕配合物的高氯酸鹽；進(jìn)一步制得水溶性的釕配合物。本發(fā)明釕配合物能夠穩(wěn)定含剪式G:A錯配的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，抑制該DNA復(fù)制，可以應(yīng)用于制備抗癌藥物。
文檔編號C07F15/00GK101659680SQ20091007548
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者竇春嬌, 陳繪麗, 巍 高 申請人:山西大學(xué)