專利名稱：幽門螺桿菌活菌載體疫苗及其專用重組菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種幽門螺桿菌活菌載體疫苗及其專用重組菌。
背景技術(shù)：
胃炎和消化性潰瘍是人類的常見(jiàn)病和多發(fā)病，胃癌也是發(fā)病率和死亡率比較高 的惡性腫瘤之一。多年來(lái)人們一直都認(rèn)為這類病是普通的內(nèi)科病，并沒(méi)有與病原體 的感染聯(lián)系在一起，醫(yī)學(xué)界曾經(jīng)一度認(rèn)為在胃內(nèi)的酸性環(huán)境下，微生物是很難定 居和繁殖致病的，胃酸是形成潰瘍的關(guān)鍵因素，臨床上也通常采用中和胃酸或抑制 胃酸分泌的方法來(lái)治療這類疾病。然而，1982年，兩位澳大利亞學(xué)者Robin Warren 和Barry Marshall從人胃組織中分離到了幽門螺桿菌(/fe"'co力acter pj^or力 "pWow')。其后，許多學(xué)者對(duì)幽門螺桿菌的感染狀況與致病性進(jìn)行了一系列的調(diào) 査與研究，研究證實(shí)幽門螺桿菌是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍的最主要病因， 同時(shí)與胃腺癌和胃黏膜相關(guān)的淋巴樣組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，世界衛(wèi)生組織國(guó) 際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將該菌列為I級(jí)致癌因子。2005年，諾貝爾生理學(xué)或 醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了澳大利亞的這兩位科學(xué)家。
大量的流行病學(xué)研究資料表明，";^7ori感染呈全球分布，感染率之高僅次 于齲齒，居第二位。在發(fā)達(dá)國(guó)家，"AF7a"的成人感染率為30-50%，在發(fā)展中國(guó) 家感染率相對(duì)更高，可達(dá)60%以上，且嬰幼兒和兒童的感染也很普遍；在中國(guó)，據(jù) 報(bào)道成人感染率約在60%，感染主要發(fā)生在兒童期，感染一經(jīng)獲得，便在人胃內(nèi)持 續(xù)數(shù)年、數(shù)十年乃至一生。在感染者中，大約有20%的人口發(fā)病，其中包括胃炎、 胃腺萎縮、胃和十二指腸潰瘍、胃腺癌及胃淋巴瘤等。兒童期感染上";^7on'已 被認(rèn)為是成年期胃癌發(fā)生的一個(gè)重要因素。
目前，臨床上主要采用抗生素療法來(lái)清除"ArA^厶但是體內(nèi)單一抗生素對(duì) "Ar7ori'的根治率不足20%，三聯(lián)療法即鉍劑加兩種抗生素治療后，"A^ori的 根治率也僅達(dá)55-95%，且存在下列問(wèn)題所需的費(fèi)用昂貴、根除率低、耐藥菌株的 不斷增加、藥物的副作用、停藥后的復(fù)發(fā)與再感染、病人的依從性差、不能用于預(yù) 防"AK^n'感染等問(wèn)題。歷史經(jīng)驗(yàn)告訴我們要想從大量人群中根除某種感染性疾 病，開發(fā)研制該種疾病的有效疫苗應(yīng)該是優(yōu)先要考慮的問(wèn)題，也是最具價(jià)值效益關(guān)系的。成功的幽門螺桿菌疫苗適用人群巨大。單從我國(guó)來(lái)看，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查表明，
我國(guó)人群中該菌的感染率在60%以上，感染者中大約有20%的人發(fā)病，因此，在我國(guó) 需要進(jìn)行幽門螺桿菌疫苗根除治療的人群大約有1億5千多萬(wàn)人。另外，在我國(guó)幽門 螺桿菌的感染主要發(fā)生在兒童期，而我國(guó)大約每年有1500余萬(wàn)左右的新生兒出生， 因此，在我國(guó)，需要進(jìn)行幽門螺桿菌疫苗預(yù)防的人群也非常巨大。
"AFhh的保護(hù)性抗原成分主要有尿素酶、熱休克蛋白、過(guò)氧化物酶、空 泡毒素和毒素相關(guān)蛋白等。研究表明，在每一種保護(hù)性抗原單獨(dú)使用時(shí)，其效果并 不理想，因而構(gòu)建多價(jià)組合保護(hù)性抗原疫苗是研制"A^ori疫苗的重要目標(biāo)。減 毒載體活菌苗具有不必純化抗原、本身有一定的佐劑作用、易于大量生產(chǎn)、服用方 便、避免抗原在胃內(nèi)降解與變性，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞、體液和黏膜免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組福氏志賀氏菌(幼./7e;meri)。
本發(fā)明所提供的重組福氏志賀氏菌(幼./7e,Mri)，是將含有幽門螺桿菌尿 素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白的編碼基因?qū)敫Ｊ现?賀氏菌/7e;raari)得到的重組菌。
本發(fā)明所提供的福氏志賀氏菌可為2aT32，也可為其它許可在人體使用的亞型。
本發(fā)明所提供的福氏志賀氏菌(幼./7ex/7eW)疫苗株是一株經(jīng)一系列傳代后 發(fā)生的自發(fā)突變減毒株，來(lái)源是中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保存中心。
本發(fā)明所提供的重組福氏志賀氏菌中，幽門螺桿菌尿素酶B亞單位 (AAD07143. 1)和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(AAD0708L 1)的融合蛋白的氨 基酸序列如序列表中序列1所示。
序列表中的序列1由702氨基酸組成，自序列1的氨基末端第1-569位為幽門 螺桿菌尿素酶B亞單位，自序列l(wèi)的氨基末端第570-584位為連接肽(G4S) 3，自 序列1的氨基末端第585-702位為幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位。
所述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白 編碼基因(w/，e^《/.^ "5^-/^a4《/zM"仍"〕的核苷酸序列具體可如序列表中 序列2所示。
所述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白 編碼基因可通過(guò)重組質(zhì)粒pTA-ureB-hspA導(dǎo)入福氏志賀氏菌(5^./7e;raen')疫苗 株。所述pTA-ureB-hspA是將所述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白編碼基因插入pTA的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒;所述pTA
為表達(dá)載體口￡1225+ (購(gòu)自Novegen公司)去掉抗性基因，加入as^基因制備，
基因序列號(hào)為GI: 153560。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種幽門螺桿菌活菌載體疫苗。 本發(fā)明所提供的幽門螺桿菌活菌載體疫苗，它的活性成分為上述重組福氏志賀氏菌。
本發(fā)明還提供了一種融合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的融合蛋白(UreB-HspA)是含有幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和 幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白，它的氨基酸序列如序列表中序列1所 示。
上述蛋白的編碼基因(w/ A-As; "的核苷酸序列，具體可如序列表中序列2 所示。
含有上述融合蛋白編碼基因的重組菌或重組質(zhì)粒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明是利用基因重組的方法，將"P/"^尿素酶B亞單位和熱休克蛋白A亞單 位進(jìn)行融合，并轉(zhuǎn)化福氏志賀氏菌疫苗株構(gòu)建的幽門螺桿菌活菌載體疫苗。試驗(yàn)證 明本發(fā)明的幽門螺桿菌活菌載體疫苗具有較高的免疫原性和免疫保護(hù)性在幽門螺 桿菌活菌載體疫苗的免疫原性試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組(免疫本發(fā)明的幽門螺桿菌活菌載體 疫苗)小鼠血清經(jīng)200倍稀釋后，血清的IgG效價(jià)OD艦平均值(0.563±0. 162)要遠(yuǎn) 高于對(duì)照組(經(jīng)100倍稀釋的對(duì)照組小鼠血清)小鼠血清測(cè)定的00492平均值 (0.083±0.016)，實(shí)驗(yàn)組小鼠腸液中抗幽門螺桿菌sIgA抗體測(cè)定的0D492值 (0.387±0. 147)也遠(yuǎn)高于對(duì)照組492 (0. 114±0.035);在免疫保護(hù)性試驗(yàn)中，對(duì) 照組20只小鼠胃內(nèi)均有幽門螺桿菌定植，實(shí)驗(yàn)組20只小鼠中有5只小鼠沒(méi)有定植， 獲得了完全保護(hù)，實(shí)驗(yàn)組小鼠比對(duì)照組小鼠胃內(nèi)"A^on'平均定植密度低近l個(gè)數(shù) 量級(jí)，二者之間具有顯著差異。


圖1為"af7ot7' ureB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。
其中，泳道1為Gibco lkb Marker,泳道2為PCR擴(kuò)增的wreB基因 圖2為"a^ow' hspA基因pcr擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜。 其中，泳道1為Gibco 100bp Marker,泳道2為PCR擴(kuò)增的Asa4基因 圖3為pET-ureB-hspA電泳圖。其中，泳道1為Gibco lkb marker,泳道2為用Ncol和Notl雙酶切的融合基 因片段，泳道3為用Ncol和Notl雙酶切的pET22b+,泳道4為ureB-hspA基因擴(kuò)增 產(chǎn)物，泳道5為ureB基因擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道6為hspA基因擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道7為Gibco 100bp marker。
圖4為"py7orj' UreB-HspA重組蛋白SDS-PAGE電泳圖譜。
其中，泳道1為marker (從上至下分別為97. 4kD， 66. 2kD， 43kD， 31kD)，
泳道2為福氏2a志賀氏菌疫苗株對(duì)照，泳道3為HP-BA疫苗菌株全菌表達(dá)樣品。 圖5為一抗為兔抗UreB抗體的重組蛋白Western blot檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。 其中，泳道l為預(yù)染蛋白marker (從上至下分別為175kD， 83kD， 62kD， 48kD，
33kD， 25kD， 17kD， 7kD)，泳道2為兔抗UreB疫苗菌株表達(dá)抗原蛋白。 圖6為一抗為兔抗hspA抗體的重組蛋白Western blot檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。 其中，泳道1為預(yù)染蛋白marker (從上至下分別為175kD， 83kD， 62kD， 48kD，
33kD， 25kD， 17kD， 7kD)，泳道2為兔抗hspA疫苗菌株表達(dá)抗原蛋白。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所述方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、重組福氏志賀氏菌及幽門螺桿菌活菌載體疫苗的制備及其效果 一、重組福氏志賀氏菌及幽門螺桿菌活菌載體疫苗的制備
1、 克隆幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(wj，e5)基因
根據(jù)幽門螺桿菌26695的wre^基因序列，用PCR引物設(shè)計(jì)和分析軟件設(shè)計(jì)了 引物(Pl: 5' -TGCGAGCTCAAAAAGATTAGCAGAAAA-3，；
P2: 5， -GGCTGCAGGAAAATGCTAAAGAGTTG-3，)，以幽門螺桿菌26695 (購(gòu)自中國(guó)疾 病預(yù)防控制中心)的基因組DNA為模板，采用高保真Pyrobest DNA聚合酶(購(gòu)自 Takala公司)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，獲得了 ^py7ori wreA基因，如圖1所示。
PCR擴(kuò)增的ureB基因片段經(jīng)純化后，經(jīng)SacI和PstI (購(gòu)自NEB公司)酶切連 接到載體pQE30 (購(gòu)自QIAGEN公司)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15后挑選陽(yáng)性克 隆，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切分析和PCR擴(kuò)增鑒定后進(jìn)行全自動(dòng)序列分析，將含有幽門螺 桿菌尿素酶B亞單位(ureB)基因(GI: 231353)的重組質(zhì)粒命名為pQE-ureB。
2、 克隆幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(力s;^)基因
根據(jù)幽門螺桿菌26695 hspA基因序列，用PCR引物設(shè)計(jì)和分析軟件設(shè)計(jì)了一 對(duì)引物(P3: 5， -GGAGAATTCAAGTTTCAGCCATTAGGAG-3，；P4: 5， -GTTCTGCAGTTTAGTGTTTTTTGTGATC-3，)，以幽門螺桿菌26695 (購(gòu)自中國(guó) 疾病預(yù)防控制中心)的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得約360bp的《；y^ori Asp力 擴(kuò)增帶，如圖2所示。
擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后用EcoRI和Pstl雙酶切，與此同時(shí)將 質(zhì)粒載體pUC19也用EcoRI和Pstl進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收， 在T4 DNA連接酶的作用下12t;過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后挑選陽(yáng)性克隆， 經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定后進(jìn)行全自動(dòng)序列分析，將含有幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位 (—)基因(GI:2313085)的重組質(zhì)粒命名為pUC-hspA。
3、 幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(ureB)和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(hspA) 融合蛋白編碼基因的制備
以含有尿素酶B亞單位和熱休克蛋白A亞單位全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒載體 pQE-ureB和pUC-hspA為模板，釆用如下PCR的方法將ureB和hspA兩基因融合起 來(lái)合成引物為P5: 5， -TGCCCATGGATAAAAAGATTAGCAGAAAA-3，； P6: 5' -GTTGCGGCCGCTTTAGTGTTTTTTGTGATC-3，； P7: 5' -CCGCCGCCGCCAGAGCCGCCGCCGCCGAAAATGCTAAAGAGTTG-3'; P8: 5' -GGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCTAAGTTTCAGCCATTAGGAG-3，。
用引物Pl和P7擴(kuò)增pQE-ureB,用引物P4和P8擴(kuò)增pUC-hspA，將二者擴(kuò)增 產(chǎn)物混合，再以二者混合物為模板再用引物P5和P6進(jìn)行PCR反應(yīng)得到"rey -力SA4 融合片段。PCR反應(yīng)的條件為95。C變性5min，一循環(huán)為(94°C lmin， 56°C lmin， 72°C lmin),共做30循環(huán)，最后72。C延伸10min。融合基因片段經(jīng)純化后，用Ncol 和Notl(購(gòu)自NEB公司)進(jìn)行雙酶切，并將其連接到表達(dá)載體pET22b+(購(gòu)自Novegen 公司)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切 分析和PCR擴(kuò)增鑒定后，采用373A DNA自動(dòng)分析儀進(jìn)行全自動(dòng)序列分析，將含有 幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(ureB， GI:2313153)和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞 單位(hspA， GI2313085)的融合蛋白編碼基因wre"-力s。j的重組質(zhì)粒命名為 pET-ureB-hspA。 pET-ureB-hspA的鑒定結(jié)果如圖3所示。
4、 構(gòu)建疫苗候選株
以重組質(zhì)粒pET-ureB-hspA為模板，用引物P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增"re^-力印A PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，用Ncol和Notl(購(gòu)自NEB公司)酶切并連接到質(zhì)粒pTA(pTA 為表達(dá)載體pET22b十(購(gòu)自Novegen公司)去掉抗性基因，加入s^基因制備，基因序列號(hào)為GI: 153560)中，連接產(chǎn)物用電擊轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入福氏2a志賀氏菌 疫苗株(購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心)中，挑選重組轉(zhuǎn)化子獲得重組福氏志賀氏菌 (疫苗株)HP-BA。在LB試管中37'C過(guò)夜培養(yǎng)HP-BA菌株。按1%將過(guò)夜培養(yǎng)種子 液接種到新的一支LB試管中，37。C振蕩培養(yǎng)2-3h，使其OD600至0.4-0. 5。加入 1M IPTG使其終濃度為lmM，繼續(xù)37t:振蕩培養(yǎng)4-5h。離心收集lml液體培養(yǎng)物中 的細(xì)菌，將其重懸于0. lml裂解緩沖液中，IO(TC加熱5min。取20 u 1樣品進(jìn)行10% 的SDS-PAGE電泳。經(jīng)考馬斯亮蘭染色后，疫苗候選株HP-BA可見(jiàn)表達(dá)與預(yù)期蛋白 大小一致的相對(duì)分子質(zhì)量約為77kD的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)和幽門 螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(HspA)融合蛋白(UreB-HspA)，其結(jié)果見(jiàn)圖4。
用10%的SDS-PAGE對(duì)HP-BA菌株表達(dá)的抗原蛋白進(jìn)行電泳，同時(shí)設(shè)預(yù)染蛋白 Maker。表達(dá)樣品及預(yù)染蛋白Marker用電轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，經(jīng)封閉 后分別用兔抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)抗體和兔抗幽門螺桿菌熱休克蛋 白A亞單位(HspA)抗體，作一抗進(jìn)行Western Blot。顯色后兩者在約77KD的位 置均出現(xiàn)了特異性的棕色顯色帶(圖5和圖6)。其中，兔抗幽門螺桿菌尿素酶B 亞單位(UreB)抗體是以UreB作為免疫原免疫兔子得到的(Rokita， E et al. J， Chromatography B 2000， 737:203-212)，兔抗幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單 位(HspA)抗體是以HspA作為免疫原免疫兔子得到的(劉秀麗等，世界華人消化 雜志，2005， 13 (5) : 626 — 630)。
二、重組福氏志賀氏菌HP-BA的免疫效果
1、重組福氏志賀氏菌HP-BA外源表達(dá)抗原的免疫原性試驗(yàn) 用具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級(jí)合格證的6 — 8周齡、體重18 — 20g的雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠 共20只進(jìn)行試驗(yàn)。其中10只為實(shí)驗(yàn)組，10只為對(duì)照組。將按照上述步驟一中LB液體 培養(yǎng)的經(jīng)過(guò)lraM IPTG誘導(dǎo)的HP-BA菌株，離心收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水重懸洗滌 兩次后濃縮制成5X10Vfu/ml的細(xì)菌懸液。小鼠經(jīng)禁食4h、禁水2h后，先以飽和 NaHC03 200ul/只灌胃，半小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組小鼠用HP-BA菌株細(xì)菌懸液200 u 1/只灌胃 免疫，對(duì)照組小鼠用200!xl/只無(wú)菌生理鹽水灌胃。按此方法隔周免疫，共免疫3次。 最后一次免疫后10天取血、取腸液進(jìn)行ELISA免疫效價(jià)測(cè)定。
用幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株"/^A ri 26695 (購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心)超聲粉碎 物抗原(10ug/ml)包被酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，將采集的對(duì)照組小鼠血清進(jìn)行100倍稀 釋，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清進(jìn)行200倍稀釋后進(jìn)行免疫測(cè)定，結(jié)果對(duì)照組小鼠血清測(cè)定的0D艦值為0. 083±0. 016(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清OD鵬值為0. 563±0. 162 (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)。
用上述幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株超聲粉碎物抗原(10ug/ml)包被的酶聯(lián)免疫反應(yīng)板 測(cè)定小鼠腸液中抗幽門螺桿菌sIgA抗體，結(jié)果10只對(duì)照組小鼠測(cè)定的OD，值為 0. 114±0.035 (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，IO只實(shí)驗(yàn)組小鼠OD靴值為O. 387±0. 147 (平均
值土標(biāo)準(zhǔn)差)。
2、重組福氏志賀氏菌HP-BA免疫保護(hù)性試驗(yàn)
用具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級(jí)合格證的6-8周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠40只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為2組，每組20只。l組為實(shí)驗(yàn)組，另一組為對(duì)照組。按組分籠飼 養(yǎng)，每籠5只。動(dòng)物在免疫及攻毒實(shí)驗(yàn)期間由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心在SPF環(huán)境下詞養(yǎng)。
將按照上述步驟一中LB液體培養(yǎng)的經(jīng)過(guò)lmM IPTG誘導(dǎo)的HP-BA菌株，離心收 集菌體，用無(wú)菌生理鹽水重懸洗滌兩次后濃縮制成5X109cfu/ml的細(xì)菌懸液。動(dòng)物 經(jīng)禁食4h、禁水2h后，先以飽和NaHC03 2 00ul/只灌胃，半小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組小鼠用 HP-BA菌株菌懸液200u l/只灌胃免疫；對(duì)照組小鼠用無(wú)菌生理鹽水200y 1/只灌 胃。按此方法隔周免疫，共免疫3次。最后一次免疫兩周以后，對(duì)小鼠以"pj^ow' 5"57 (購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心)5X108 cfu/ml灌胃2次，每次每只小鼠200 ul，隔天一次。攻毒后四周，處死小鼠，開腹取胃。將胃沿大彎縱切開，在生理 鹽水中漂洗去胃內(nèi)殘留的食物殘?jiān)?，稱重。再將胃沿小彎縱切一分為二， 一半用10% 的福爾馬林緩沖液固定， 一半加入適量布氏肉湯在玻璃研磨器中研磨至肉漿，制成 1: IO倍稀釋液，繼續(xù)10X系列稀釋，取稀釋液涂布幽門螺桿菌血瓊脂平板，每個(gè) 稀釋度三塊，每塊100ul。培養(yǎng)平板含5%脫纖羊血，10 ug/ml萬(wàn)古霉素，5 ti g/ml兩性霉素B， 10U/ml多粘菌素B， 20 u g/ml桿菌肽。置于微需氧環(huán)境(5%02, 10%C02, 85% N2)下37。C培養(yǎng)72-96小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)，取同一稀釋度菌數(shù)在30-300 三塊平板菌落數(shù)的平均值，換算成CFU/g胃組織。
結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠胃內(nèi)均有幽門螺桿菌定植，實(shí)驗(yàn)組有5只小鼠沒(méi)有定植， 獲得了完全保護(hù)；實(shí)驗(yàn)組小鼠的平均定植密度為3. lX105cfu/g，而對(duì)照組為 2.81X106cfu/g;實(shí)驗(yàn)組小鼠比對(duì)照組小鼠胃內(nèi)幽門螺桿菌定植密度低近1個(gè)數(shù)量 級(jí)。統(tǒng)計(jì)分析表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠胃內(nèi)幽門螺桿菌定植密度與對(duì)照組之間具有非常顯 著的差異(p<0.01)。序列表
〈110〉中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所
<120〉幽門螺桿菌活菌載體疫苗及其專用重組菌
<160> 1
〈210〉 1 <211> 702 <212〉 PRT
〈213〉 幽門螺桿菌6^A'coZ^"er ^^ar^ <400〉 1
Met Asp Lys Lys lie Ser Arg Lys Glu Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro 15 10 15
Thr Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu lie Ala Glu 20 25 30
Val Glu His Asp Tyr Thr lie Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly 35 40 45Gly Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gin Ser Asn Asn Pro Ser Lys 50 55 60
Glu Glu Leu Asp Leu lie lie Thr Asn Ala Leu lie Val Asp Tyr Thr 65 70 75 80
Gly lie Tyr Lys Ala Asp lie Gly lie Lys Asp Gly Lys lie Ala Gly 85 90 95
lie Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met Gin Asp Gly Val Lys Asn Asn 100 105 110
Leu Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu lie 115 120 125
Val Thr Ala Gly Gly lie Asp Thr His lie His Phe lie Ser Pro Gin 130 135 140
Gin lie Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met lie Gly Gly 145 150 155 160
Gly Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr lie Thr Pro Gly 165 170 175Arg Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met 180 185 190
Asn Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu 195 200 205
Ala Asp Gin lie Glu Ala Gly Ala lie Gly Phe Lys lie His Glu Asp 210 215 220
Trp Gly Thr Thr Pro Ser Ala lie Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp 225 230 235 240
Lys Tyr Asp Val Gin Val Ala lie His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala 245 250 255
Gly Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala lie Ala Gly Arg Thr Met His 260 265 270
Thr Phe His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp lie lie 275 280 285Lys Val Ala Gly Glu His Asn lie Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr 290 295 300
lie Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met 305 310 315 320
Val Cys His His Leu Asp Lys Ser lie Lys Glu Asp Val Gin Phe Ala 325 330 335
Asp Ser Arg lie Arg Pro Gin Thr lie Ala Ala Glu Asp Thr Leu His 340 345 350
Asp Met Gly lie Phe Ser lie Thr Ser Ser Asp Ser Gin Ala Met Gly 355 360 365
Arg Val Gly Glu Val lie Thr Arg Thr Trp Gin Thr Ala Asp Lys Asn 370 375 380
Lys Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn 385 390 395 400
Phe Arg lie Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr lie Asn Pro Ala lie 405 410 415Ala His Gly lie Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val 420 425 430
Ala Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn 435 440 445
Met lie lie Lys Gly Gly Phe lie Ala Leu Ser Gin Met Gly Asp Ala 450 455 460
Asn Ala Ser lie Pro Thr Pro Gin Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe 465 470 475 480
Ala His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn lie Thr Phe Val Ser 485 490 495
Gin Ala Ala Tyr Asp Lys Gly lie Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg 500 505 510
Gin Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn lie Thr Lys Lys Asp Met 515 520 525Gin Phe Asn Asp Thr Thr Ala His lie Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr 530 535 540
His Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys 545 550 555 560
Val Ser Leu Ala Gin Leu Phe Ser lie Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly 565 570 575
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Phe Gin Pro Leu Gly Glu 580 585 590
Arg Val Leu Val Glu Arg Leu Glu Glu Glu Asn Lys Thr Ser Ser Gly 595 600 605
lie lie lie Pro Asp Asn Ala Lys Glu Lys Pro Leu Met Gly Val Val 610 615 620
Lys Ala Val Ser His Lys lie Ser Glu Gly Cys Lys Cys Val Lys Glu 625 630 635 640
Gly Asp Val lie Ala Phe Gly Lys Tyr Lys Gly Ala Glu lie Val Leu 645 650 655Asp Gly Thr Glu Tyr Met Val Leu Glu Leu Glu Asp lie Leu Gly lie 660 665 670
Val Gly Ser Gly Ser Cys Cys His Thr Gly Asn His Asp His Lys His 675 680 685
Ala Lys Glu His Glu Ala Cys Cys His Asp His Lys Lys His
<210〉 2 〈211> 2109 〈212〉 腿
〈213> 幽門螺桿菌rtfeh'cofe"er pWoWj 〈400> 1
atggataaaa agattagcag aaaagaatat gtttctatgt atggccctac tacaggcgat 60 aaagtgagat tgggcgatac agacttgatc gctgaagtag aacatgacta caccattteit 120 ggcgaagagc ttaaattcgg tggcggtaaa accctgagag aaggcatgag ccaatccaac 180 肪ccctagca aagaagaatt ggatctaatc atcactaacg ctttaatcgt ggattacetcc 240 ggtatttata aagcggatat tggtattaaa gatggcaaaa tcgctggcat tggtaaaggc 300 ggtaacaaag acatgc肪ga tggcgttaaa aacaatctta gcgtaggtcc tgctactgaa 360 gccttagccg gtgaaggttt gatcgtaact gctggtggta ttgacacaca catccacttc 420 atttcacccc aacaaatccc tacagctttt gcaagcggtg taacaaccat gattggtggc 480ggaactggtc ctgctgatgg cactaatgcg actactatca ctccaggcag aagaaattta 540
aaatggatgc tcagagcggc tgaagaatat tctatgaact taggtttctt ggctaaaggt 600
aacgcttcta acgacgcgag cttagccgat caaattgaag ctggtgcgat tggctttaaa 660
atccacgaag actggggcac cactccttct gcaatcaatc atgcgttaga tgttgcagac 720
aaatacgatg tgcaagtcgc tatccacaca gacactttga atgaagccgg ttgcgtgg肌 780
gacactatgg cagctattgc cggacgcact atgcacactt tccacactga aggtgctggc 840
ggcggacacg ctcctgatat tattaaagta gctggtgaac acaacattct tcccgcttcc 900
actaacccca ctatcccttt cactgtgaat acagaagcag aacacatgga catgcttatg %0
gtgtgccacc acttggataa aagcattaaa gaagatgttc agttcgctga ttxaaggatc 1020
cgccctcaaa ccattgcggc tgaagacact ttgcatgaca tggggatttt ctcaatcacc 1080
agctctgact ctcaagctat gggtcgtgtg ggtgaagtta txactagaac ttggcaaaca 1140
gctgacaaaa ac肌aaaaga atttggccgc ttgaaagaag a^aaaggcga taacgacaac 1200
ttcaggatca aacgctactt gtctaaatac accattaacc cagcgatcgc tcatgggatt 1260
agcgagtatg taggttctgt agaagtgggc aaagtggctg acttggtatt gtggagtccc 1320
gcattctttg gcgtaaaacc caacatgatc atcaaaggcg ggttxattgc gttgagtcaa 1380
atgggtgacg cgaacgcttc tatccctacc ccacaaccag tttattacag agaaatgttc 1M0
gctcatcatg gtaaagccaa atacgatgca aacatcactt ttgtgtctca agcggcttat 1500
gacaaaggca ttaaagaaga attagggctt gaaagacaag tgttgccggt aaaaaattgc 1560
agaaacatca ctaaaaaaga catgcaattc aacgacacta ccgctcacat tgaagtcaat 1620
cctgaaactt accatgtgtt cgtggatggc aaagaagtaa cttctaaacc agccaataaa 1680gtgagcttgg cgcaactctt tagcattttc ggcggcggcg gctctggcgg cggcggctct 1740
ggcggcggcg gctctaagtt tcagccatta ggagaaaggg tcttagtaga aagacttgaa 1800
g犯gagaaca aaaccagttc aggcatcatc atccctgata acgctaagga肌agccttta 1860
atgggcgtag tca犯gcggt tagccat3aa atcagtgagg gttgcaaatg cgttaaagaa 1920
ggcgatgtga tcgcttttgg caaatacaaa ggcgcagaaa tcgttttaga cggcactgaa 1980
tacatggtgc tagaactaga agacattcta ggcattgtgg gctcaggct:c ttgttgtcat 2040
acaggtaatc atgaccataa acatgctaaa gagcatgaag cttgctgtca tgatcacaaa 2100
aaacact犯 2109
權(quán)利要求
1、一種重組福氏志賀氏菌，是將含有幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白的編碼基因?qū)敫Ｊ现举R氏菌得到的重組菌。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組福氏志賀氏菌，其特征在于所述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中 序列1所示。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組福氏志賀氏菌，其特征在于所述幽門螺桿菌尿 素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白編碼基因的核苷酸序列如 序列表中序列2所示。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組福氏志賀氏菌，其特征在于所述福氏志賀 氏菌疫苗株為福氏志賀氏菌2aT32。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組福氏志賀氏菌，其特征在于所述幽門螺桿菌尿 素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白編碼基因通過(guò)重組質(zhì)粒導(dǎo) 入福氏志賀氏菌疫苗株。
6、 一種幽門螺桿菌活菌載體疫苗，它的活性成分為權(quán)利要求1-5中任一所述的 重組福氏志賀氏菌。
7、 一種蛋白，它的氨基酸序列為幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休 克蛋白A亞單位的融合蛋白的氨基酸序列。
8、 權(quán)利要求7所述蛋白的編碼基因。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列為幽 門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合基因序列。
10、 含有權(quán)利要求8或9所述基因的重組菌或重組質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種幽門螺桿菌活菌載體疫苗及其專用重組菌。該專用重組菌為重組福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)，是將含有幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白的編碼基因?qū)敫Ｊ现举R氏菌(Sh.flexneri)疫苗株得到的重組菌。本發(fā)明的幽門螺桿菌活菌載體疫苗的活性成分即為重組后的福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的幽門螺桿菌疫苗菌株的免疫原性和免疫保護(hù)性良好。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101538550SQ20091008328
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者劉純杰, 展德文, 張兆山, 芃 王, 王令春, 王艷春, 袁盛凌, 陶好霞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所