專(zhuān)利名稱(chēng)：磺胺甲噻唑人工抗原及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磺胺甲噻唑人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磺胺甲噻唑(Sulfamethylthiazole)，又名甲噻磺胺，是一種人工合成的中 效磺胺藥，其性質(zhì)穩(wěn)定、抑菌譜廣、毒性小、口服吸收良好且價(jià)格低廉，對(duì)畜禽疾 病控制與治療起重要作用，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。但是由于它在體內(nèi)的作用時(shí)間和代 謝時(shí)間較長(zhǎng)，易殘留在動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)任何途徑攝入都有可能在人體中蓄積。藥物 蓄積濃度超過(guò)一定值對(duì)人體機(jī)能是有害的，長(zhǎng)期蓄積則會(huì)導(dǎo)致磺胺藥抗藥性的產(chǎn) 生，造成耐藥菌的流行性感染，從而失去了治療人類(lèi)疾病的價(jià)值，對(duì)人類(lèi)的身體健 康產(chǎn)生很大危害。所以，有必要對(duì)動(dòng)物性食品中的磺胺類(lèi)藥物殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)。我國(guó) 以及美國(guó)、歐盟等國(guó)家規(guī)定了動(dòng)物性食品中總磺胺以及單個(gè)磺胺的最高殘留限量 (MRLs)為0.1 mg/kg。
目前，獸藥殘留檢測(cè)常用的方法有氣相色譜、高效液相色譜以及氣質(zhì)聯(lián)用等理 化分析方法。雖然這些方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是樣品前處理操作步驟繁瑣， 成本較高，也不適用于大批量樣品的篩選檢測(cè)。免疫化學(xué)分析由于在抗原抗體的定 性定量方面獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和操作簡(jiǎn)便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu) 點(diǎn)彌補(bǔ)了理化分析的不足，在磺胺藥物的殘留檢測(cè)中起著越來(lái)越重要的作用。
影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質(zhì)又決定 于免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此免疫半抗原的分子設(shè)計(jì)與合成就是產(chǎn)生特異性抗體 和建立小分子獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種磺胺甲噻唑人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。 本發(fā)明所提供的磺胺甲噻唑人工抗原，是將磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白偶聯(lián) 獲得的抗原。
磺胺甲噻唑半抗原是一種化合物，其結(jié)構(gòu)為式I所示。
3式I
磺胺甲噻唑半抗原也是屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
其中，所述的化合物與所述載體蛋白以酰胺鍵偶聯(lián)。所述載體蛋白為牛血清白 蛋白或卵清蛋白。
所述磺胺甲噻唑半抗原可按如下的方法制備
在乙醇中將磺胺甲噻唑與對(duì)醛基苯甲酸反應(yīng)，獲得所述化合物。所述磺胺甲噻 唑與醛基苯甲酸的物質(zhì)的量比為1: (1-3)。
本發(fā)明的磺胺甲噻唑半抗原在磺胺甲噻唑苯環(huán)的氨基上引入一個(gè)對(duì)醛基苯甲 酸結(jié)構(gòu)，既最大程度保留了磺胺甲噻唑的特征結(jié)構(gòu)，又具有可以與載體蛋白發(fā)生活 性偶聯(lián)的基團(tuán)-C00H。磺胺甲噻唑半抗原經(jīng)活性酯法與載體蛋白偶聯(lián)可制備磺胺甲 噻唑的人工抗原?；前芳奏邕虻娜斯た乖诨前芳奏邕虬肟乖c載體蛋白間含有一 個(gè)對(duì)醛基苯甲酸間隔臂，包被原與免疫原結(jié)構(gòu)上的差異可以進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏 度和特異性。用該磺胺甲噻唑人工抗原免疫動(dòng)物，可獲得特性高的特異性抗體。該 磺胺甲噻唑人工抗原與其他已經(jīng)報(bào)道的磺胺甲噻唑人工抗原聯(lián)合應(yīng)用于免疫分析， 可提高檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。本發(fā)明的磺胺甲噻唑半抗原和磺胺甲噻唑的人 工抗原可用于磺胺藥物的殘留檢測(cè)。


圖1為磺胺甲噻唑半抗原質(zhì)譜圖。
圖2為磺胺甲噻唑人工抗原的紫外光譜圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑 獲得。
實(shí)施例l、制備磺胺甲噻唑半抗原 1.磺胺甲噻唑半抗原的制備
1) 稱(chēng)取IOO mg磺胺甲噻唑，置于10mL三角燒瓶中，滴加2mL無(wú)水乙醇， 充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙猓?br> 2) 稱(chēng)取100 mg對(duì)醛基苯甲酸，置于10mL三角燒瓶，滴加2mL無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙猓?br> 3)將磺胺甲噻唑乙醇溶液和對(duì)醛基苯甲酸乙醇溶液混合，置于室溫磁力攪拌 過(guò)夜。過(guò)夜之后，離心，棄上清液，獲得淺黃色沉淀，60° C干燥，獲得磺胺甲噻 唑半抗原121 mg，產(chǎn)率為30%。
2.磺胺甲噻唑半抗原的鑒定
取磺胺甲噻唑半抗原進(jìn)行ESI質(zhì)譜鑒定。該物質(zhì)的ESI分子離子峰為405(M-l) 和407 (M+l)，見(jiàn)圖1。
元素分析，結(jié)果(％，計(jì)算值)如下C， 50,36; H， 3.73; N， 10.36; 0， 19.73; S， 15.82。
磺胺甲噻唑半抗原的結(jié)構(gòu)式如式I所示
式I
實(shí)施例2、制備磺胺甲噻唑人工抗原
1) 磺胺甲噻唑人工抗原的制備
10 mg實(shí)施例1的磺胺甲噻唑半抗原溶解于5 mLN，N-二甲基甲酰胺中，超聲使 之完全溶解，并以冷乙醇冷卻；加入IO mg的N，N， -二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC) 和5 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)過(guò)夜；最后逐滴加入牛血清白蛋白或 卵清蛋白的PBS溶液(50 mg牛血清白蛋白或卵清蛋白溶解于5 mL 0. 01 M的pH 7. 4 的PBS中)，繼續(xù)攪拌4小時(shí)；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，在4° C用PBS溶液透析 72小時(shí)，獲得磺胺甲噻唑人工抗原(SM2-BSA)或磺胺甲噻唑包被抗原(SM2-OVA)， 分裝于安培瓶中，-20° C保存。
2) 磺胺甲噻唑人工抗原的鑒定
磺胺甲噻唑人工抗原用PBS配成溶液進(jìn)行紫外(200-400 nm)光譜掃描，以l mg/mL的BSA作為對(duì)照。
紫外(200-400 nm)光譜掃描結(jié)果見(jiàn)圖2，磺胺甲噻唑人工抗原的紫外圖譜與 BSA相比發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白BSA成功偶聯(lián)，經(jīng)計(jì) 算實(shí)施例1的磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白的結(jié)合比為11: 1。
3) 磺胺甲噻唑人工抗原免疫動(dòng)物及ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)
5新西蘭大白兔10只，隨機(jī)分成兩組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組以2)制備的磺 胺甲噻唑人工抗原進(jìn)行免疫，對(duì)照組以牛血清蛋白(BSA)進(jìn)行免疫。每只兔子每 次免疫l mg/mL (以BSA量計(jì))，每?jī)芍苊庖咭淮?，共免?次，第三次免疫之后7 天，耳緣靜脈采血，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析，具體步驟如下
1. 包被用包被緩沖液將磺胺甲噻唑包被抗原稀釋為系列濃度，每一濃度包被 一行，100uL/孔，4"C過(guò)夜；
2. 洗滌與封閉傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘；每孔加入
150 UL封閉液，37"C恒溫封閉lh，然后洗滌3次，每次3分鐘；
3. 加樣將50 PL抗血清與等體積倍比稀釋的磺胺甲噻唑標(biāo)準(zhǔn)液加到酶標(biāo)板 上反應(yīng)，每孔IOO uL， 37。C反應(yīng)l小時(shí)，洗滌同步驟2;然后每孔加入100 uLHRP-羊抗兔IgG， 37"C反應(yīng)1小時(shí)，洗滌同步驟2;
4. 顯色測(cè)定每孔加入TMB溶液100 ixL， 37X:顯色20min，然后每孔加入50 UL 2 mol L—1 H2S04以終止反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的0045。 值。
間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果表明，第6次免疫之后獲得了特異性抗體，效價(jià)高達(dá)l: 102400。
建立間接ELISA方法，在倍比稀釋的實(shí)驗(yàn)組(磺胺甲噻唑人工抗原免疫)兔血 清中加入100 ng/mL的磺胺甲噻唑標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行抑制檢測(cè)，將其獲得的OD值與未加 磺胺甲噻唑的OD值相比較。
分析結(jié)果表明，與陰性對(duì)照(未加磺胺甲噻唑標(biāo)準(zhǔn)品)相比，吸光值明顯下降， 隨著血清稀釋倍數(shù)的增加，吸光值呈明顯的遞減梯度。說(shuō)明獲得的兔血清能夠特異 性地識(shí)別磺胺甲噻唑。
權(quán)利要求
1、一種化合物，其結(jié)構(gòu)為式I所示。式I
2、 磺胺甲噻唑抗原，是將權(quán)利要求l所述的化合物與載體蛋白偶聯(lián)獲得的抗原。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的磺胺甲噻唑抗原，其特征在于權(quán)利要求l所述的化合物與所述載體蛋白以酰胺鍵偶聯(lián)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的磺胺甲噻唑抗原，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5、 權(quán)利要求1所述化合物在磺胺藥物的殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。
6、 權(quán)利要求2或3所述磺胺甲噻唑抗原在磺胺藥物的殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。
7、 制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，在乙醇中將磺胺甲噻唑與醛基苯甲酸反 應(yīng)，獲得所述化合物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述磺胺甲噻唑與對(duì)醛基苯甲酸 的物質(zhì)的量比為1:(1-3)。
9、 制備權(quán)利要求2-4中任一所述磺胺甲噻唑抗原的方法，是先制備權(quán)利要求l 所述化合物，然后將所述的化合物與載體蛋白偶聯(lián)獲得所述抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種磺胺甲噻唑人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。該磺胺甲噻唑人工抗原，是將磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白偶聯(lián)獲得的抗原。磺胺甲噻唑半抗原是一種化合物，其結(jié)構(gòu)為式I所示?；前芳奏邕虻娜斯た乖诨前芳奏邕虬肟乖c載體蛋白間含有一個(gè)對(duì)醛基苯甲酸間隔臂，包被原與免疫原結(jié)構(gòu)上的差異可以進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。用該磺胺甲噻唑人工抗原免疫動(dòng)物，可獲得特性高的特異性抗體。該磺胺甲噻唑人工抗原與其他已經(jīng)報(bào)道的磺胺甲噻唑人工抗原聯(lián)合應(yīng)用于免疫分析，可提高檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。本發(fā)明的磺胺甲噻唑的人工抗原可用于磺胺藥物的殘留檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07D277/18GK101643457SQ20091008564
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者吳小平, 靜 張, 娜 李, 江海洋, 王亞輝, 王戰(zhàn)輝, 米鐵軍 申請(qǐng)人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司