專利名稱：：一種豆類植物凝集素的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬植物有用成分的提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及豆類植物凝集素的提取。
背景技術(shù)：
：凝集素PHA是一種非免疫源性的蛋白質(zhì)或糖蛋白，在動(dòng)物、植物及微生物(如細(xì)菌、病毒)中廣泛存在。豆科植物的凝集素由2個(gè)或4個(gè)單體組成，每個(gè)單體的分子量為25-30KD,有一個(gè)結(jié)合糖位點(diǎn)。在上千種已發(fā)現(xiàn)的凝集素中，屬于豆科植物的凝集素就有600多種。凝集素含量在豆類中也有很大差別。例如蕓豆的蛋白質(zhì)含量在17-23%，在蛋白質(zhì)中又含有2.4-5%的PHA，為含凝集素最高的種類之一。凝集素不僅具有凝集諸如血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、精子細(xì)胞等作用，而且參與了生物體內(nèi)的一些重要生理和藥理過程，因此是研究生物體內(nèi)細(xì)胞癌變、受精、分化及分子識(shí)別等生命過程極其有用的工具，同時(shí)在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上有著重要地位，而且是抗腫瘤藥物(如干擾素、白細(xì)胞介素-2等)生產(chǎn)所需的促有絲分裂原。近年來還報(bào)道某些凝集素對(duì)艾滋病毒等也有抑制作用，并應(yīng)用于試驗(yàn)性治療。在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，植物凝集素可以使淋巴細(xì)胞增殖；在整體實(shí)驗(yàn)中,植物凝集素可以提高機(jī)體的免疫能力。因此，無論從基礎(chǔ)研究和運(yùn)用角度來說，對(duì)植物凝集素的需求都是很大的。對(duì)于植物凝集素的提取，有采用乙醚和丙酮及乙醇的提取法，也有采用磷酸緩沖液PBS浸泡的提取法。現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是前者有較多的化學(xué)試劑成分遺留，后者需要在-l(TC到+10°(:低溫長(zhǎng)時(shí)間的浸泡、浸提和低溫冷凍離心分離、揭^又時(shí)間大于48小時(shí)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品有較多化學(xué)試劑成分遺留和提取時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，提供一種新的以豆類為原料的植物凝集素的提取方法。本發(fā)明所述的植物凝集素來源于豆類，特別是蕓豆。所提的植物凝集素為分子量約32k的糖蛋白。本發(fā)明為水提法，其特征是在4060。C溫度下提取，按以下步驟豆類種子粉碎到40~100目—加入浸泡液在4060。C溫度下提耳又60~180分鐘并打撈豆皮-粗分去除豆渣-離心分離得含植物凝集素的上清液—對(duì)上清液進(jìn)一步進(jìn)行分離純化—濃縮或干燥得植物凝集素。"加入浸泡液在406CTC溫度下提3取"的過程中加以攪拌為好。攪拌的轉(zhuǎn)數(shù)最好為60-500轉(zhuǎn)/分。所說"離心分離得含植物凝集素的上清液"、"對(duì)上清液進(jìn)一步進(jìn)行分離純化，，以及"濃縮或干燥得植物凝集素"均可以采用已有技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明完全拋棄了傳統(tǒng)的低溫浸泡低溫處理方法，實(shí)踐證明本發(fā)明是一種筒單高效和短時(shí)間的提取植物凝集素的方法。以下是對(duì)上述發(fā)明過程的進(jìn)一步優(yōu)化于所說"在4060。C溫度下提取，，的全過程或部分過程中施加超聲波進(jìn)行輔助提取，聲強(qiáng)為l~4OW/cm2;或者施加微波進(jìn)行輔助提取，微波強(qiáng)度為520W/L;或者交替施加超聲波和微波進(jìn)行輔助提取，超聲聲強(qiáng)為1~40W/cm2,微波強(qiáng)度為5~20W/L。微波是一種高頻的電磁波，微波場(chǎng)中的極性分子處于高速擺振狀態(tài)，分子運(yùn)動(dòng)的結(jié)果造成了分子間的碰撞和摩擦加劇，因而產(chǎn)生大量的熱量。微波加熱的優(yōu)勢(shì)在于介質(zhì)內(nèi)外同時(shí)加熱，即微波能夠同時(shí)將能量傳遞給介質(zhì)的所有反應(yīng)活性中心，因此比其他加熱體系有更多的活性中心，分子發(fā)生碰撞反應(yīng)在瞬間完成，故而反應(yīng)速度大大提高。且由此可推知，溶質(zhì)中含溶劑量較多的地方,易于積聚熱量，這同時(shí)解釋了試驗(yàn)過程中蛋白中水分不均勻的時(shí)候，部分蛋白變性甚至糊化的現(xiàn)象。超聲波是在彈性介質(zhì)中傳播的一種振動(dòng)頻率高于聲波(20kHz)的機(jī)械波，能產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量，給媒質(zhì)(如固體小顆?；驁F(tuán)聚體)極大的加速度。當(dāng)顆粒內(nèi)部接收的能量足以克服固體結(jié)構(gòu)的束縛能時(shí)，固體顆粒(或團(tuán)聚體)被破碎(或解聚)，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出；這種能量作用于液體，振動(dòng)處于稀疏狀態(tài)時(shí)，液體會(huì)撕裂成很小的空穴，這些空穴一瞬間即閉合，閉合時(shí)產(chǎn)生高達(dá)幾十個(gè)大氣壓的瞬間壓力，即稱為空化現(xiàn)象。這種空穴現(xiàn)象可細(xì)化各種物質(zhì)以及制造乳溶液，加速細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出。另夕卜，超聲波的次級(jí)效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速細(xì)胞內(nèi)有效成分的擴(kuò)散釋放并使其充分與溶劑混合。溫度達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，打開超聲和孩"皮的裝置。超聲和微波裝置也可以在除去豆皮后就打開。微波和超聲可以組合工作，特別是微波和超聲最好為順序工作模式，即使用微波時(shí)，超聲不工作。所以實(shí)際微波或超聲的使用時(shí)間為總的提取時(shí)間的一半。如可維持需要的溫度，那么也可不用加熱裝置而只用微波和超聲加攪拌維持溫度。所說"浸泡液"最好為0.8%~1.2%的氯化鈉水溶液或pH=6.5~7.2的磷酸緩沖液PBS,料水比例為1:4~1:10。所說"進(jìn)一步進(jìn)行分離純化"的步驟最好是將上清液用50%飽和度NH4S04攪拌后沉淀1~3小時(shí)，離心，沉淀物進(jìn)行透析處理。而沉淀物進(jìn)行透析處理的步驟又最好是沉淀物加入到透析袋中，扎緊透析袋兩端，把透析袋放入100-300目的尼龍袋中，再放入盛有蒸餾水或去離子水的帶攪拌的容器中，以60-120轉(zhuǎn)/分進(jìn)行攪拌，水溫為18~6(TC。再優(yōu)選的參凄t是透析袋體積/蒸餾水或去離子水體積=1:7~1:20，透析時(shí)間為1.0~3.0小時(shí)，透析袋的截留孔徑為8000-10000道爾頓。按進(jìn)一步優(yōu)化的工藝，提取所用容器最好用不銹鋼板制成，容器設(shè)有加熱和控溫裝置，在容器壁上設(shè)微波加熱頭，在容器底部設(shè)超聲波輸出頭，容器并設(shè)有攪拌裝置。豆粉加入后用手工或機(jī)械裝置通過濾網(wǎng)把漂浮的豆皮打撈收集起來，豆皮可用于提取膳食纖維。可以先開動(dòng)加熱裝置把浸泡液加熱到40~6crc之間，具體溫度視不同的原料而有所改變。加熱的同時(shí)打開攪拌裝置，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為60~500轉(zhuǎn)/分，以不起泡沫或少起泡沫為準(zhǔn)。達(dá)到提取時(shí)間后，把容器中的液體和固體物質(zhì)通過300-350目尼龍濾網(wǎng)過濾并用離心機(jī)在室溫下以4000轉(zhuǎn)/分，10~20分鐘再次離心液體，獲得上清液。將上清液用50%飽和度的NH4S04攪拌后沉淀1~3小時(shí)，同上方法離心，耳又沉淀加入到透析袋中，扎緊透析袋兩端。把透析袋放入100-300目的尼龍袋中(目的是保護(hù)透析袋在攪拌過程中不會(huì)破損)。再放如盛有蒸餾水或去離子水的帶攪拌的容器中。該容器可以是前述提取所用的容器。采用60~120轉(zhuǎn)/分進(jìn)行攪拌。水溫可以是常溫到60。C之間。透析袋體積(VI)和蒸餾水或去離子水(V2)的體積比V1/V2為1:7-1:20之間。其間視情況更換1-3次蒸餾水或去離子水。用AgN03進(jìn)行^r查，無沉淀是就可結(jié)束透析。透析時(shí)間為1.0-3.0小時(shí)。透析液中為PHA溶液?？刹捎眯D(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)PHA溶液進(jìn)行濃縮?？捎贸Ｒ?guī)方法如凱氏定氮，F(xiàn)ollin酚或Bedford等方法測(cè)定PHA的濃度。得到的PHA通過無菌過濾(孔徑為0.45jum或0.22ium的微孔濾膜過濾)后可用于配制有關(guān)實(shí)驗(yàn)和分析用的培養(yǎng)基和試劑，也可以低溫或室溫密封保存，也可以冷凍保存。上述濃縮液可用于配制有關(guān)實(shí)驗(yàn)藥劑。透析液或濃縮透析液可進(jìn)一步經(jīng)過冷凍干燥處理制成凍干粉長(zhǎng)期保存或加入防腐劑后以濃縮液的方式保存。透析液或濃縮透析液可經(jīng)過適當(dāng)稀釋采用通行的層析方法進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。通過有關(guān)檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)證明，得到的植物凝集素能滿足常規(guī)的實(shí)驗(yàn)及藥用。這為植物凝集素的廣泛運(yùn)用提供了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明的有益效果是克服了現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品有較多化學(xué)試劑成分遺留和提取時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。附圖為采用本發(fā)明制備的不同樣品PHA和其它標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的電泳圖。其中l(wèi)為l號(hào)樣品-蕓豆；2為2號(hào)樣品-蕓豆；3為3號(hào)樣品-紅豆；4為4號(hào)樣品-花紅豆；5為BSA;6為Marker;7為PHA(北星生物研發(fā)部-標(biāo)樣)；8為5號(hào)樣品-刀豆；9為6號(hào)樣品-扁豆；IO為PHA(層析)。具體實(shí)施方式見以下實(shí)例。實(shí)施例l:蕓豆植物凝集素的制備首先取干燥的蕓豆籽粒，自來水洗凈3-5分鐘，去雜物，然后低溫烘干或晾曬干。機(jī)械粉碎，過60目篩網(wǎng)，成為豆粉。稱取50g豆粉放入聚乙烯袋中，加入250ml0.9。/o生理鹽水，封口機(jī)封口。放入微波爐，設(shè)置功率為800W。分為高、中、低三個(gè)處理強(qiáng)度組和一個(gè)對(duì)照組。高強(qiáng)度處理組第一次微波加熱時(shí)間為60sec,然后放入50-6CTC水浴，20min,期間攪動(dòng)5次，然后進(jìn)行第二次纟敬波處理30秒，放入容量為6L的]00w超聲清洗器。在4L水中加3袋處理樣，處理10min，然后進(jìn)行第3次微波處理30秒，放入100w超聲清洗器中處理10min，再進(jìn)行第四次微波處理30秒，同樣超聲處理10min，進(jìn)行第五次微波處理30秒，然后進(jìn)行超聲處理10min。共用五次微波處理，總時(shí)間為3min,超聲處理的總時(shí)間為40min。總的提取時(shí)間是60min。中等強(qiáng)度處理組也是5次微波處理，第一次為60sec，第2-5次為20sec,間隔時(shí)間同高強(qiáng)度處理組。但超聲處理時(shí)間相應(yīng)縮短為30min;低強(qiáng)度中等強(qiáng)度處理組也是5次微波處理，第一次為60sec,第2-5次為10sec，間隔時(shí)間同高強(qiáng)度處理組。但超聲處理時(shí)間相應(yīng)縮短為20min。三組處理的具體步驟見表1.表l蕓豆凝集素提取中的不同處理步驟處理組微波l(sec)水浴l(min)超聲1(min)微波2(sec)超聲2(inin)微波3(sec)超聲3微波4(sec)超聲4(min)微波5(sec)水浴2(min)高強(qiáng)度602010301030103010300中強(qiáng)度60201020102052052010低強(qiáng)度60205.1051051051020對(duì)照060000000000達(dá)到提取時(shí)間后，把容器中的液體和固體物質(zhì)通過300-350目尼龍濾網(wǎng)過濾并用離心機(jī)在室溫下以4000轉(zhuǎn)/分，10分鐘離心過濾液體，獲得上清液。將上清液用50%飽和度的1^14804攪拌均勻后低溫(4-10°C)靜置1-3小時(shí)沉淀，同上方法離心，取沉淀加入到透析袋中，扎緊透析袋兩端。把透析袋放入100-300目的大尼龍袋中(目的是保護(hù)透析袋在攪拌過程中不會(huì)破損)。再放如盛有蒸餾水或去離子水的帶攪拌的容器中。該容器可以上面步驟中所用的容器。采用60-120轉(zhuǎn)/分進(jìn)行攪拌。水溫可以是常溫到5CTC之間。透析袋體積(VI)和蒸餾水或去離子水(V2)的體積比Vl/V2為1:7-1:20之間。其間視情況更換1-3次蒸餾水或去離子水。用AgN03進(jìn)行;險(xiǎn)查，無沉淀是就可結(jié)束透析。透析時(shí)間為1.0-3.0小時(shí)。透析液中為PHA溶液。表240-60°C不同微波和超聲組合對(duì)蕓豆PHA的提取率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2:蕓豆植物凝集素的制備在本實(shí)施例中，處理量和方法同實(shí)施例2。僅改變溫度設(shè)置為30-40°C。經(jīng)測(cè)定，在30-40。C的溫度范圍內(nèi)，高中低三種微波和超聲組合的PHA提取結(jié)果見表2.表330-40。C不同微波和超聲組合對(duì)蕓豆PHA的提取率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3:扁豆植物凝集素的制備在本實(shí)施例中，采用兩種溫庋處理，即40_60。C處理2小時(shí)和4-l(TC冰箱處理12-14小時(shí)。未施加樣t波和超聲波處理。扁豆的預(yù)處理方式同實(shí)施例1。粉碎的豆粉過60目篩網(wǎng)。按加入1:5力口入同實(shí)施例1的生理鹽水或磷酸緩沖液。分別放入40-60。C保溫容器和4-10。C水箱處理。間隔15-30min攪拌一次。40-60。C保溫提取組的提取時(shí)間是2小時(shí)，4-10。C冰箱處理12-14小時(shí)。拔JF又結(jié)束后的處理同實(shí)施例1。結(jié)果見表4。表440-6(TC與4-l(TC條件下的扁豆植物凝集素的提取率提取條件溫度40-60°C溫度4-10°C'2.2—1.8小時(shí)14-12小時(shí)PHA得率約0.40約0.15(%)實(shí)施例4:綠豆植物凝集素的制備在本實(shí)施例中，采用兩種溫度處理，即40-60。C處理2小時(shí)和4-l(TC水箱處理12-14小時(shí)。未施加微波和超聲波處理。綠豆的預(yù)處理方式同實(shí)施例1。粉碎的豆粉過60目篩網(wǎng)。按加入1:5加入同實(shí)施例1的生理鹽水或磷酸緩沖液。分別放入40-60。C保溫容器或4-10。C冰箱處理。間隔15-30min攪拌一次。40-60。C保溫才是耳又組的提取時(shí)間是2小時(shí)，4-l(TC冰箱處理12-14小時(shí)。提取結(jié)束后的處理同實(shí)施例1。結(jié)果見表5?！霰?40-6(TC與4-10。C條件下的綠豆植物凝集素的提取率提取條件溫度40-60°C溫度4-l(TC2.2~1.8小時(shí)14~12小時(shí)PHA得率約0,13約0.11(%)實(shí)施例5:刀豆植物凝集素的制備在本實(shí)施例中，采用兩種溫度處理，即40-60。C處理2小時(shí)和4-10。C冰箱處理12-14小時(shí)。未施加微波和超聲波處理。刀豆的預(yù)處理方式同實(shí)施例1。粉碎的豆粉過60目篩網(wǎng)。按加入1:5加入同實(shí)施例1的生理鹽水或磷酸緩沖液。分別放入40-60。C保溫容器或4-108。C冰箱處理。間隔15-30min攪拌一次。40-60。C保溫提取組的提取時(shí)間是2小時(shí)，4-l(TC冰箱處理12-14小時(shí)。提取結(jié)束后的處理同實(shí)施例1。結(jié)果見表6。表640-60。C與4-10。C條件下的刀豆植物凝集素的提取率提取條件溫度40-60°C溫度4-10°C'2.2~1.8小時(shí)14—12小時(shí)PHA得率約0.91約0.72(%)實(shí)施例6:紅豆植物凝集素的制備在本實(shí)施例中，采用兩種溫度處理，即40-60。C處理2小時(shí)和4-10。C冰箱處理12-14小時(shí)。未施加樣吏波和超聲波處理。扁豆的預(yù)處理方式同實(shí)施例1。粉碎的豆粉過60目篩網(wǎng)。按加入1:5力口入同實(shí)施例1的生理鹽水或磷酸緩沖液。分別放入40-60。C保溫容器或4-10。C水箱處理。間隔15-30min攪拌一次。40_60。C保溫提取組的提取時(shí)間是2小時(shí)，4-l(TC水箱處理12-14小時(shí)。提取結(jié)束后的處理同實(shí)施例1。結(jié)果見表7。表740-60。C與4-10。C條件下的紅豆植物凝集素的提取率提取條件溫度40-溫度4-10°C60°C2.2~1.8小時(shí)14-12小時(shí)PHA得率約0.75約0.47(%)實(shí)施例7:紅花豆植物凝集素的制備在本實(shí)施例中，采用兩種溫度處理，即40-60。C處理2小時(shí)和4-10。C冰箱處理12-14小時(shí)。未施加微波和超聲波處理。紅花豆的預(yù)處理方式同實(shí)施例1。粉碎的豆粉過60目篩網(wǎng)。4安力口入1:5加入同實(shí)施例1的生理鹽水或磷酸緩沖液。分別放入40-60。C保溫容器或4-l(TC水箱處理。間隔15-30min攪拌一次。40-60。C保溫提取組的提取時(shí)間是2小時(shí)，4-10。C冰箱處理12-14小時(shí)。^是取結(jié)束后的處理同實(shí)施例1。結(jié)果見表8.表840-60。C與4-l(TC條件下的扁豆植物凝集素的提:取率提取條件溫度40-60°C溫度4-icrc2.2~1.8小時(shí)14~12小時(shí)PHA得率約0.76約0.68(%)實(shí)施例9:蕓豆植物凝集素制備的系列實(shí)驗(yàn)取干燥的蕓豆籽粒，自來水洗凈3-5分鐘，去雜物，然后低溫烘干或晾曬干。機(jī)械粉碎，過60目篩網(wǎng)，成為豆粉。稱取50g豆粉放入聚乙烯袋中，加入250ml0.9%生理鹽水，封口機(jī)封口。施加超聲波進(jìn)行輔助提取，聲強(qiáng)為1~40W/cm2。提取效果滿意。實(shí)施例10:蕓豆植物凝集素制備的系列實(shí)驗(yàn)取干燥的蕓豆籽粒，自來水洗凈3-5分鐘，去雜物，然后低溫烘干或晾曬干。機(jī)械粉碎，過60目篩網(wǎng)，成為豆粉。稱取50g豆粉放入聚乙烯袋中，加入250ml0.9%生理鹽水，封口機(jī)封口。施加微波進(jìn)行輔助提取，微波強(qiáng)度為520W/L。提取效果滿意。以上實(shí)施例僅為了對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而本發(fā)明的范圍不受所舉實(shí)施例的局限。一企測(cè)例1:植物凝集素的電泳測(cè)定釆用常規(guī)的SDS-Page電泳測(cè)定提取物的分子量和提純情況。經(jīng)本法制備的植物凝集素釆用Mini電泳槽，120-130V，50分鐘電泳后得到的電泳照片如說明書附圖所示。結(jié)果表明來自蕓豆，刀豆，扁豆，紅豆和紅花豆等樣品在32K處都有一個(gè)明顯的符合PHA分子量的條帶。檢測(cè)例2:植物凝集素的糖蛋白性質(zhì)測(cè)定植物凝集素是一種含糖基的蛋白，它可以和堿性磷酸酶反應(yīng)生產(chǎn)紅色物，利用這一特點(diǎn)，把同樣條件下得到的電泳條帶進(jìn)行常規(guī)的堿性磷酸酶染色，就10可在32K處顯示紅色條帶。這進(jìn)一步證明該條帶就是蕓豆的PHA。檢測(cè)例3:植物凝集檢測(cè)素活性的測(cè)定蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮或雙波長(zhǎng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。用上述實(shí)施例制備的植物凝集素經(jīng)過常規(guī)方法測(cè)定濃度后，稀釋成lmg/ml的濃度。將濃縮的植物凝集素提取液或干粉用pH=6.8-7.0的磷酸緩沖液配制成lmg/ml的濃度。采用96孔培養(yǎng)板，取100M1上述磷酸緩沖液分別加入1~8孔中，然后取100ja1濃度為lmg/ml的植物凝集素提取物加入96孔板的第一孔，充分混勻(吹吸5次)，然后吸取100jj1加入第二孔，充分混勻，再取100M1加入第三孔，充分混勻，依次加入到第八孔。得到倍比稀釋的PHA磷酸緩沖液。然后從1-8孔順序各取50y1加入9孔血凝板中，留最后一孔為對(duì)照。耳又混勻的2%新鮮或醛化的兔或人的紅細(xì)胞50m1分別加入1-9孔血凝板，再取50jul磷酸緩沖液加入血凝板的第9孔為對(duì)照組。室溫25。C放置1小時(shí)，肉眼或顯微鏡觀察凝血情況。一4殳情況下，以此技術(shù)提耳又的凝集素的效價(jià)在7.8-15.6(Jg/ml之間，即1/64-1/128。換算成國(guó)內(nèi)常用的活性為1/512-1/1024。檢測(cè)例4:植物凝集素的凍干粉和溶液冷凍保存后的活力變化(1)采用甘露醇和乳糖按1:5混合作為賦型劑，纟姿體積重量比為20%，即/、'=20%加入甘露醇和乳糖賦型劑，常規(guī)冷凍干燥。得到白色疏松的粉末。加水后易溶解。4-l(TC冰箱保存。半年后測(cè)定活性維持不變。(2)過濾后的透明PHA水溶液用10ml西林瓶封裝。-20。C冷凍保存20-30天，然后取出，室溫存放。結(jié)果溶液保持透明。半年后測(cè)定，活性下降一個(gè)等級(jí)。即原來為1/512的活性下降為1/256。權(quán)利要求1、一種豆類植物凝集素的提取方法，為水提法，其特征是在40～60℃溫度下提取，按以下步驟豆類種子粉碎到40～100目→加入浸泡液在40～60℃溫度下提取60～180分鐘并打撈豆皮→粗分去除豆渣→離心分離得含植物凝集素的上清液→對(duì)上清液進(jìn)一步進(jìn)行分離純化→濃縮或干燥得植物凝集素。2、如權(quán)利要求1所說的提取方法，其特征是加入浸泡液在4060。C溫度下提取的過程中加以攪拌。3、如權(quán)利要求2所說的提取方法，其特征是攪拌的轉(zhuǎn)數(shù)為60~500轉(zhuǎn)/分。4、如權(quán)利要求2所說的提取方法，其特征是于所說在4060。C溫度下提取的全過程或部分過程中施加超聲波進(jìn)行輔助提取，聲強(qiáng)為1~4OW/cm2;或者施加微波進(jìn)行輔助提取，微波強(qiáng)度為5~20W/L;或者交替施加超聲波和微波進(jìn)行輔助提取，超聲聲強(qiáng)為1~40W/cm2，微波強(qiáng)度為5~20W/L。5、如權(quán)利要求2所說的提取方法，其特征是浸泡液為0.8%~1.2%的氯化鈉水溶液或pI^6.57.2的磷酸緩沖液PBS,料水比例為1:4~1:10。6、如權(quán)利要求2所說的提取方法，其特征是所說進(jìn)一步進(jìn)行分離純化的步驟是將上清液用50。/。飽和度NH4S04攪拌沉淀，離心，沉淀物進(jìn)行透析處理。而沉淀物進(jìn)行透析處理的步驟又最好是沉淀物加入到透析袋中，扎緊透析袋兩端，把透析袋放入100-300目的尼龍袋中，再放入盛有蒸餾水或去離子水的帶攪拌的容器中，以60~120轉(zhuǎn)/分進(jìn)行攪拌，水溫為18~60。C。再優(yōu)選的參數(shù)是透析袋體積/蒸餾水或去離子水體積=1:7~1:20,透析時(shí)間為1.0-3.0小時(shí)，透析袋的截留孔徑為8000-1000O道爾頓。7、如權(quán)利要求2所說的提取方法，其特征是提取所用容器為不銹鋼板制成，容器設(shè)有加熱和控溫裝置，在容器壁上設(shè)微波加熱頭，在容器底部設(shè)超聲波輸出頭，容器設(shè)有攪拌裝置。全文摘要一種豆類植物凝集素的提取方法，屬植物有用成分提取
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。為水提法，在40～60℃溫度下提取，按以下步驟豆類種子粉碎到40～100目→加入浸泡液在40～60℃溫度下提取60～180分鐘并打撈豆皮→粗分去除豆渣→離心分離得含植物凝集素的上清液→對(duì)上清液進(jìn)一步進(jìn)行分離純化→濃縮或干燥得植物凝集素。可于提取的全過程或部分過程中施加超聲波或微波，或交替施加超聲波和微波進(jìn)行輔助提取。本發(fā)明完全拋棄了傳統(tǒng)的低溫浸泡低溫處理方法，實(shí)踐證明是一種簡(jiǎn)單高效和短時(shí)間的提取植物凝集素的方法。通過有關(guān)檢測(cè)，所得植物凝集素能滿足常規(guī)的實(shí)驗(yàn)及藥用需要。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品有較多化學(xué)試劑成分遺留和提取時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。文檔編號(hào)C07K14/415GK101508730SQ20091009423公開日2009年8月19日申請(qǐng)日期2009年3月18日優(yōu)先權(quán)日2009年3月18日發(fā)明者王敏康申請(qǐng)人:王敏康