專(zhuān)利名稱(chēng)：天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，屬于藥物生產(chǎn)技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，因糖尿病并發(fā)癥引起的死亡人數(shù)已排在繼心血管疾病和癌癥之 后的第三位，引起了各國(guó)的高度重視。中藥治療糖尿病具有較長(zhǎng)歷史，并
從中發(fā)現(xiàn)制備高效低毒的活性成分是新藥開(kāi)發(fā)的重要途徑。葫盧巴
(7W卵/7eL a /be/7鵬graec"/z L.)是豆科蝶形花亞科植物，其種子為著 名補(bǔ)陽(yáng)中藥，在國(guó)內(nèi)外都有較長(zhǎng)的藥用、食用歷史，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)及安全性也 進(jìn)行過(guò)研究0V"z^ri"o/7 y esearc力，1996， 7& 1495)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研 究結(jié)果表明從葫蘆巴種子中提取分離出的天然4-羥基-異亮氨酸經(jīng)動(dòng)物實(shí) 驗(yàn)證明，具有明顯的刺激胰腺分泌胰島素的功能，可降低血糖濃度，提高 血糖耐受性，緩解糖尿病患者對(duì)體外胰島素的依賴(lài)，提高,身胰腺活力G4瓜 / /%yw'W.， 1999， i77: E617)。且活性實(shí)驗(yàn)表明，最有效的促胰島素效 應(yīng)的異構(gòu)體為(2S， 3R， 4S) ( /.尸/ ar瓜，2000， 339) 。 4-羥
基-異亮氨酸由于具有三個(gè)手性碳原子，合成較為困難。葫蘆巴種子中所含 的天然4-羥基-異亮氨酸僅含兩個(gè)立體異構(gòu)體，且有效立體異構(gòu)體(2S， 3R， 4S)的比例占到90。/a。因此，從葫蘆巴種子中獲取4-羥基-異亮氨酸是最經(jīng) 濟(jì)和安全的途徑。迄今為止，國(guó)內(nèi)外有專(zhuān)利文獻(xiàn)報(bào)道從葫盧巴種子中提取 4-羥基-異亮氨酸的方法，其含量為10-70%，公開(kāi)號(hào)CN 1397545A; US 2004/0009247 Al;公開(kāi)號(hào)CN 1955160A,但其加工工藝復(fù)雜，成本高， 對(duì)環(huán)境有一定污染。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備 方法，以從葫蘆巴種子中提取制備高純度4-羥基-異亮氨酸，該方法避免了 有毒溶劑和酸堿的使用，操作步驟少，生產(chǎn)周期短，成本低，更適宜產(chǎn)業(yè) 化規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備方 法，包括以下步驟
(1) 將葫蘆巴種子粉碎后，按葫蘆巴種子粉乙醇溶液=1:3 10的質(zhì) 量比，用濃度為5 95%的乙醇水溶液，在30 9(TC溫度下提取2 3次， 每次2 3小時(shí)，過(guò)濾，合并各次濾液；
(2) 將上述濾液濃縮至無(wú)乙醇后，分離去沉淀，得溶液；
(3) 將上述溶液進(jìn)行層析后，用2 3倍水洗滌，收集含目標(biāo)成分的 水洗脫液；
(4) 將上述水洗脫液濃縮至原體積的1/4，按濃縮液:硅膠=1:2的質(zhì) 量比，拌入硅膠進(jìn)行常規(guī)干燥；
(5) 以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液為流動(dòng)相進(jìn)行硅膠柱層析，洗 脫，收集含目標(biāo)成分的洗脫液，回收溶劑后，按常規(guī)干燥得4-羥基-異亮氨 酸粗品；
(6) 將上述4-羥基-異亮氨酸粗品加熱溶解在有機(jī)溶劑中至飽和，過(guò) 濾后，濾液在-5 l(TC溫度條件下靜置至結(jié)晶完全，干燥結(jié)晶后得4-羥基-異亮氨酸產(chǎn) 叩o
所述(1)步驟的乙醇水溶液濃度最佳為30 50%。 所述(2)步驟的分離為常規(guī)的離心分離。
所述(3)步驟的層析是在現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)大孔吸附樹(shù)脂柱上完成的， 大孔吸附樹(shù)脂用乙醇清洗后還可重復(fù)使用；大孔樹(shù)脂為非極性樹(shù)脂。所述(5)步驟的流動(dòng)相即乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液的體積比為
乙酸乙酯乙醇水=4 9:1 5:0 3。
所述(6)步驟的有機(jī)溶劑為乙醇、正丁醇或丙酮中的一種。 本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果采用上述方案制備天然4-羥基-異亮氨酸
時(shí)，無(wú)需使用酸、堿或氯仿等有毒化學(xué)試劑，制備過(guò)程對(duì)環(huán)境無(wú)污染，且
成本低廉，適宜產(chǎn)業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
取葫蘆巴種子10公斤，粉碎，加濃度為30%的乙醇水溶液60公斤，6CTC 提取3次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，濾液合并；濃縮濾液至除去乙醇后，離心 分離去沉淀，得溶液；將該溶液用常規(guī)的大孔吸附樹(shù)脂D-101吸附，用3 倍水洗滌，收集含目標(biāo)成分的水洗脫液，大孔吸附樹(shù)脂用乙醇清洗后還可重 復(fù)使用；將水洗脫液濃縮至原體積的1/4后，按濃縮液:硅膠=1:2的質(zhì)量 比，拌入100-200目的硅膠，進(jìn)行常規(guī)攪拌干燥；以乙酸乙酯、乙醇和水 的混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行硅膠柱層析，其中乙酸乙酯乙醇:水的體積比 為3:2:1，之后洗脫，收集含目標(biāo)成分的洗脫液，回收溶劑后，按常規(guī)干燥 得淡黃色的固體(即4-羥基-異亮氨酸粗品)6.24克；將淡黃色固體加熱 溶解在乙醇中至飽和，過(guò)濾后，濾液在-5'C溫度下靜置至結(jié)晶完全，按常 規(guī)干燥結(jié)晶，即得5.19克4-羥基異亮氨酸產(chǎn)品。經(jīng)高效液相法 (Phytochemistry， 1997， 44(4)， 563-566)檢測(cè)，該產(chǎn)品中(2S， 3R， 4S)-4-羥基-異亮氨酸的含量為91. 2%。 實(shí)施例2
取葫蘆巴種子10公斤，粉碎，加5%的乙醇水溶液30公斤，9(TC提取 2次，每次3小時(shí)，過(guò)濾，濾液合并；濃縮濾液，除去乙醇后離心分離去沉淀，得溶液；將該溶液用常規(guī)大孔吸附樹(shù)脂AB-8吸附，2倍水洗，收集含 目標(biāo)成分的水洗脫液，大孔吸附樹(shù)脂用乙醇清洗后還可重復(fù)使用；將水洗 脫液濃縮到原體積的1/4，按濃縮液:硅膠=1:2的質(zhì)量比，拌100-200目 硅膠，進(jìn)行常規(guī)攪拌干燥；以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液作為流動(dòng)相 進(jìn)行硅膠柱層析，其中乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液的體積比為乙酸 乙酯乙醇:水=9:5:0，之后洗脫，收集含目標(biāo)成分的洗脫液，回收溶劑后， 按常規(guī)干燥得淡黃色的固體(即4-羥基-異亮氨酸粗品)4.98克；將黃色
固體加熱溶解在正丁醇中至飽和，過(guò)濾后，濾液在crc靜置至結(jié)晶完全，按
常規(guī)干燥結(jié)晶，得3.91克4-羥基異亮氨酸產(chǎn)品。經(jīng)高效液相法檢測(cè)，該產(chǎn) 品中(2S， 3R， 4S)- 4-羥基-異亮氨酸的含量為91.4%。 實(shí)施例3
取葫蘆巴種子10公斤，粉碎，加95%的乙醇水溶液100公斤，30。C提 取2次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，濾液合并；濃縮濾液，除去乙醇后離心分離 去沉淀，得溶液；將溶液用常規(guī)大孔吸附樹(shù)脂DM-1300吸附，3倍水洗，收
集含目標(biāo)成分的水洗脫液，大孔吸附樹(shù)脂用乙醇清洗后還可重復(fù)使用；將 水洗脫液濃縮到原體積的1/4，按濃縮液:硅膠=1:2的質(zhì)量比，拌100-200
目硅膠進(jìn)行常規(guī)攪拌干燥；以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液作為流動(dòng)相 進(jìn)行硅膠柱層析，其中乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液的體積比為乙酸乙 酯乙醇:水=5:3:1，之后洗脫，收集含目標(biāo)成分的洗脫液，回收溶劑后， 按常規(guī)干燥得淡黃色的固體(即4-羥基-異亮氨酸粗品)4.13克；將黃色 固體加熱溶解在丙酮中至飽和，過(guò)濾后，在IO'C靜置至結(jié)晶完全，按常規(guī) 干燥結(jié)晶，得3.23克4-羥基異亮氨酸產(chǎn)品。經(jīng)高效液相法檢測(cè)，該產(chǎn)品中 (2S， 3R, 4S)- 4-羥基-異亮氨酸的含量為89.2%。
權(quán)利要求
1、一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征在于經(jīng)過(guò)以下步驟(1)將葫蘆巴種子粉碎后，按葫蘆巴種子粉∶乙醇溶液＝1∶3～10的質(zhì)量比，用濃度為5～95％的乙醇水溶液，在30～90℃溫度下提取2～3次，每次2～3小時(shí)，過(guò)濾，合并各次濾液；(2)將上述濾液濃縮至無(wú)乙醇后，分離去沉淀，得溶液；(3)將上述溶液進(jìn)行層析后，用2～3倍水洗滌，收集含目標(biāo)成分的水洗脫液；(4)將上述水洗脫液濃縮至原體積的1/4，按濃縮液∶硅膠＝1∶2的質(zhì)量比，拌入硅膠進(jìn)行常規(guī)干燥；(5)以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液為流動(dòng)相進(jìn)行硅膠柱層析，洗脫，收集含目標(biāo)成分的洗脫液，回收溶劑后，按常規(guī)干燥得4-羥基-異亮氨酸粗品；(6)將上述4-羥基-異亮氨酸粗品加熱溶解在有機(jī)溶劑中至飽和，過(guò)濾后，濾液在-5～10℃溫度條件下靜置至結(jié)晶完全，干燥結(jié)晶后得4-羥基-異亮氨酸產(chǎn)品。
2、 據(jù)權(quán)利要求1中所述的天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征 在于所述(1)步驟的乙醇水溶液濃度為30 50%。
3、 據(jù)權(quán)利要求1中所述的天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征 在于所述(2)步驟的分離為常規(guī)的離心分離。
4、 據(jù)權(quán)利要求1中所述的天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征 在于所述(5)步驟的流動(dòng)相即乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液的體積比為 乙酸乙酯乙醇水=4 9:1 5:0 3。
5、 據(jù)權(quán)利要求1中所述的天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征 在于所述(6)步驟的有機(jī)溶劑為乙醇、正丁醇或丙酮中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，屬于制藥領(lǐng)域。將葫蘆巴種子粉碎用乙醇提取，回收乙醇后的提取液用大孔吸附樹(shù)脂柱吸附，用水洗脫，濃縮后加入硅膠拌勻，干燥，以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液為流動(dòng)相進(jìn)行硅膠柱層析，收集含目標(biāo)成分洗脫液，回收溶劑，干燥，得4-羥基-異亮氨酸粗品，將該粗品加熱溶解在有機(jī)溶劑中至飽和，過(guò)濾后，低溫放置結(jié)晶，得4-羥基-異亮氨酸純品。本發(fā)明方法無(wú)需使用酸、堿或氯仿等有毒化學(xué)試劑，制備過(guò)程對(duì)環(huán)境無(wú)污染，且成本低廉，適宜產(chǎn)業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C07C227/00GK101544575SQ200910094440
公開(kāi)日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2009年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者劉會(huì)靈, 曹建新, 建 樊, 程桂廣, 趙天瑞 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)