專利名稱：一種純化艾塞那肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于HPLC技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種規(guī)?；兓请?(Exenatide)的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂，高血糖主要 由胰島素分泌或作用的缺陷引起。糖尿病可分兩種，胰島素依賴型糖尿病(I
型糖尿病)和非胰島素依賴型糖尿病(n型糖尿病)，其中n型糖尿病患者占90%
以上。WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，目前全球已經(jīng)診斷的11型糖尿病達(dá)到1.3億人，我 國己超過4000萬人，是繼印度之后的第二大糖尿病大國。
常用的II型糖尿病治療藥物包括雙胍類、磺脲類、a-葡萄糖甘酶抑制劑、
噻唑烷二酮類及胰島素等。但研究發(fā)現(xiàn)，這幾類常用藥物都有可能造成身體的
不良反應(yīng)，特別是二甲雙胍，有導(dǎo)致患者乳酸性酸中毒的危險(xiǎn)性；而胰島素治
療也常導(dǎo)致低血糖的發(fā)生。因此，迫切需要研制出新的n型糖尿病治療藥物。
1995年，美國專利(US5424286)公開了一種從南美大毒蜥Gilka monster， Hdoderma Horridum)的唾液中分離出來的一種含有39個(gè)氨基酸的多肽， Exendin-4
(H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp國Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu陽Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro畫Ser-Ser-Gly-Ala曙Pro-Pro-P ro-Ser-NH2)。其結(jié)構(gòu)與人的胰高血糖素(Glucagon)有48%的同源性，與人的GLP-1(胰高血糖素樣肽-l)有53%的同源性。
研究表明，作為GLP-1的類似物，Exendin-4能夠與GLP-1受體作用，通過 刺激胰島p細(xì)胞再生，促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放，減慢胃排空 速率，抑制食物攝入。其促胰島素分泌作用是根據(jù)血糖水平進(jìn)行的，故可降低 低血糖的發(fā)生率，且對(duì)其他促胰島素分泌劑不敏感的II型糖尿病病人仍有降糖 作用，同時(shí)GLP-1還可以減輕II型糖尿病患者的體重，是一類全新的糖尿病治 療藥物。
2005年4月，美國禮來公司和Amylin公司共同開發(fā)的糖尿病藥物倍它 (Byetta，化學(xué)名Exenatide (人工合成的Exendin-4))獲美國FDA批準(zhǔn)上市。 與此同時(shí)，國外許多制藥公司如諾和諾德制藥公司、默克制藥公司也在爭(zhēng)相研 發(fā)與倍它屬于同類型的藥物。另外，國內(nèi)外也少有對(duì)Exendin-4進(jìn)行固相直接合 成的相關(guān)文獻(xiàn)，但還沒有文獻(xiàn)具體研究Exenatide相關(guān)純化的方法，特別是規(guī)模 化純化Exenatide的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一條適于產(chǎn)業(yè)化純艾塞那肽的工藝方法，使用反相 高效液相色譜法純化純艾塞那肽，并用陰離子交換轉(zhuǎn)鹽，純度高且收率好，達(dá) 到產(chǎn)業(yè)化要求，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案
一種純化艾塞那肽的方法，包括以下步驟
1 )將固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相為四烷基硅垸鍵合硅膠、 八烷基硅垸鍵合硅膠或十八烷基硅烷鍵合硅膠的反相硅膠柱，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽 溶液；
3)將純化后的高純度肽采用陰離子交換轉(zhuǎn)成醋酸鹽。 優(yōu)選的方案是所述的步驟1)和步驟3)之間還包括步驟2)將收集目的 峰值的肽溶液減壓旋蒸濃縮。
更為優(yōu)選的方案是所述A相的磷酸鹽緩沖溶液？11為3.0至5.3之間。 更為優(yōu)選的方案是所述A相的磷酸鹽緩沖溶液pH為3.5至4.3之間。 更為優(yōu)選的方案是所述色譜純乙腈的濃度為10-65%，檢測(cè)波長為230 nm。 更為優(yōu)選的方案是所述色譜純乙腈的濃度為15-55%。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果
本發(fā)明提出的一條適于產(chǎn)業(yè)化純艾塞那肽的工藝方法，使用反相高效液相色 譜法純化純艾塞那肽，并用陰離子交換轉(zhuǎn)鹽，不僅能得到HPLC純度大于98.0^ 的精肽，而且能夠規(guī)?；a(chǎn)，達(dá)到純度高、收率高、產(chǎn)業(yè)化的要求。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
1、 樣品處理將合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為 50mg/mL，用孔徑為0.45jim濾膜過濾后收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱,柱子直徑和 長度為5 cm x25 cm 。流動(dòng)相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的磷酸 溶液調(diào)pH至3.5-4.3 ; B相:色譜純乙腈。流速50-70 ml/min。檢測(cè)波長 230 nm。梯度B%: 20% 48% 66-78 min。進(jìn)樣量為1.3-2 g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為26-40ml
5樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于不超過35"C下 減壓旋蒸濃縮至約50-100 g/ml后備用。
3、轉(zhuǎn)鹽取55 g陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93置于合適大小的砂芯 漏斗中，用超純水沖洗至中性后上樣，可上樣10-20 g，減壓抽濾并收集濾液， 濾液于不超過35 'C下減壓旋蒸濃縮至約5-8g/ml后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍 干燥后即可'得到純度大于98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達(dá)48%以上。
實(shí)施例2
1、 樣品處理將合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為 50mg/mL，用孔徑為0.45pm濾膜過濾后收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以四烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和
長度為5 cm x25 cm 。流動(dòng)相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的磷酸 溶液調(diào)pH至3.0-4.8 ; B相色譜純乙腈。流速50-70 ml/min。檢測(cè)波長 230 nm。梯度B%: 10% 35% 50-75 min。進(jìn)樣量為l.1-1.8 g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為26-40ml 樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于不超過35"C下 減壓旋蒸濃縮至約50-100 g/ml后備用。
3、 轉(zhuǎn)鹽取50 g陰離子交換樹脂Wofatit AD-41置于合適大小的砂芯漏斗 中，用超純水沖洗至中性后上樣，可上樣10-20 g，減壓抽濾并收集濾液，濾液 于不超過35 "C下減壓旋蒸濃縮至約5-8g/ml后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍干燥 后即可得到純度大于98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達(dá)45%以上。
實(shí)施例3
1、 樣品處理將合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為
50mg/mL，用孔徑為0.45pm濾膜過濾后收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑 和長度為5 cm x25 cm 。流動(dòng)相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的磷
6酸溶液調(diào)pH至3.8-5.3 ; B相色譜純乙腈。流速50-70 ml/min。檢測(cè)波長 230 nm。梯度B%: 15% 55% 60-78 min。進(jìn)樣量為1.5-2.0 g 。
純化過程將色譜柱用50°/。以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為30-35ml 樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于不超過35"C下 減壓旋蒸濃縮至約50-100 g/ml后備用。
3、轉(zhuǎn)鹽取55 g陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93置于合適大小的砂芯 漏斗中，用超純水沖洗至中性后上樣，可上樣10-20 g，減壓抽濾并收集濾液， 濾液于不超過35 'C下減壓旋蒸濃縮至約5-8 g/ml后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍 干燥后即可得到純度大于98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達(dá)52%以上。
實(shí)施例4
1、 樣品處理相合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為
50mg/mL，用孔徑為0.45pm濾膜過濾后收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基硅垸鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直 徑和長度為15 cm x25 cm 。流動(dòng)相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的 磷酸溶液調(diào)pH至3.8-5.3; B相色譜純乙腈。流速450-550 ml/min。檢測(cè)波 長- 230nm。梯度B%: 15% 65°/。
70-88 min。進(jìn)樣量為8-15g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為 160ml-300ml樣品溶液。線性梯度洗脫70-88 min，收集目的峰，將收集的目的 肽溶液于不超過37 "C下減壓旋蒸濃縮至約80-200 g/ml后備用。
3、 轉(zhuǎn)鹽取105g陰離子交換樹脂置WofatitAD-41于合適大小的砂芯漏斗 中，用超純水沖洗至中性后上樣，可上樣30-40 g，減壓抽濾并收集濾液，濾液 于不超過35 "下減壓旋蒸濃縮至約5-8 g/ml后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍干燥 后即可得到純度大于98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達(dá)55%以上。
實(shí)施例5
1、樣品處理相合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為
50mg/mL,用孔徑為0.45pm濾膜過濾后收集濾液備用。
72、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直
徑和長度為30cmx25cm 。流動(dòng)相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的磷 酸溶液調(diào)pH至3.8-5.3; B相色譜純乙腈。流速1900-2200 ml/min。檢測(cè)波 長230 nm。梯度B%: 15°/。 65% 85-100 min。進(jìn)樣量為45-65 g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為
900ml-1300ml樣品溶液。線性梯度洗脫60-80 min，收集目的峰，將收集的目的 肽溶液于不超過35"C下減壓旋蒸濃縮至約60-180 g/ml后備用。
3、 轉(zhuǎn)鹽取210g陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93置于合適大小的砂芯 漏斗中，用超純水沖洗至中性后上樣，可上樣50-60 g，減壓抽濾并收集濾液， 濾液于不超過35 。C下減壓旋蒸濃縮至約5-8 g/ml后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍 干燥后即可得到純度大于98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達(dá)57%以上。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不 能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替 換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種純化艾塞那肽的方法，包括如下步驟1)將固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相為四烷基硅烷鍵合硅膠、八烷基硅烷鍵合硅膠或十八烷基硅烷鍵合硅膠的反相硅膠柱，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶液；3)將純化后的高純度肽采用陰離子交換轉(zhuǎn)成醋酸鹽。
2、 如權(quán)利要求1所述的純化艾塞那肽的方法，其特征是所述的步驟l) 和步驟3)之間還包括步驟2)將收集目的峰值的肽溶液減壓旋蒸濃縮。
3、 如權(quán)利要求1或者2所述純化艾塞那肽的方法，其特征在于所述A相 的磷酸鹽緩沖溶液pH為3.0 5.3。
4、 如權(quán)利要求3所述純化艾塞那肽的方法，其特征在于所述A相的磷酸 鹽緩沖溶液pH為3.5 4.3。
5、 如權(quán)利1或者2所述純化艾塞那肽的方法，其特征在于所述色譜純乙 腈的濃度為10-65%，檢測(cè)波長為230nm。
6、 如權(quán)利5所述純化艾塞那肽的方法，其特征在于所述色譜純乙腈的濃 度為15-55%。
7、 如權(quán)利要求1或者2所述的純化艾塞那肽的方法，其特征在于所述的 反相硅膠柱為四烷基硅烷鍵合硅膠、八烷基硅烷鍵合硅膠或十八烷基硅烷鍵合 硅膠。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述方法，其特征在于所述的陰離子交換法為通過采用能夠提供醋酸根的陰離子交換樹脂進(jìn)行離子交換實(shí)現(xiàn)，所述的陰離子 交換樹脂是Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純化艾塞那肽的方法，包括如下步驟1)將固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相為四烷基硅烷鍵合硅膠、八烷基硅烷鍵合硅膠或十八烷基硅烷鍵合硅膠的反相硅膠柱，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶液；3)將純化后的高純度肽采用陰離子交換轉(zhuǎn)成醋酸鹽。本發(fā)明提出的一條適于產(chǎn)業(yè)化純艾塞那肽的工藝方法，使用反相高效液相色譜法純化純艾塞那肽，并用陰離子交換轉(zhuǎn)鹽，不僅能得到用PLC純度大于98.0％的精肽，而且能夠規(guī)?；a(chǎn)，達(dá)到純度高、收率高、產(chǎn)業(yè)化的要求。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101538323SQ20091010498
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者旭 康, 李紅玲, 袁建成, 覃亮政, 馬亞平 申請(qǐng)人:深圳市翰宇藥業(yè)有限公司