專利名稱：甲藻細(xì)胞壁蛋白的分離提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的提取方法，尤其是涉及一種甲藻細(xì)胞壁蛋白的分離提取 方法。
背景技術(shù)：
提取植物細(xì)胞壁較為流行的方法是化學(xué)試劑順序提取法，依次用氯化鈣，環(huán)已烷二胺四 醋酸，二硫蘇糖醇，氯化鈉(或氯化鋰)，硼酸鹽提取細(xì)胞壁蛋白，每步提取時(shí)間是30min， 其缺點(diǎn)是總時(shí)間較長，細(xì)胞容易在提取過程中破裂，所提取的細(xì)胞壁蛋白易被胞內(nèi)蛋白污染 (Duncan Robertson, Geoffrey P. Mitchell, John S. Gilroy,Differential Extraction and Protein Sequencing Reveals Major Differences in Patterns of Primary Cell Wall Proteins from Plants, /ow77fl/o/Wo/ogz'cfl/c/ e/m'幼y， 1997.272 (25) ，15841-15848);另外，移除胞內(nèi)物質(zhì)后再提取 細(xì)胞壁蛋白的方法又容易丟失很多壁蛋白。 一般方法不能防止提取過程中的雜蛋白污染和壁 蛋白丟失的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有的植物細(xì)胞壁提取方法中細(xì)胞壁蛋白既容易被非壁蛋白污 染，又容易丟失壁蛋白的不足，提供一種在提取過程中不僅能避免胞內(nèi)蛋白或其它物質(zhì)的污 染，而且能夠同時(shí)解決壁蛋白的丟失問題，能夠快速、高效、完整地得到細(xì)胞壁蛋白的甲藻 細(xì)胞壁蛋白的分離提取方法。
本發(fā)明包括以下步驟
1) 用混合化學(xué)試劑提取第一部分細(xì)胞壁蛋白；
2) 用熱震方法獲得分離得到純細(xì)胞壁；
3) 在裂解液中提取第二部分細(xì)胞壁蛋白；
4) 將第一部分細(xì)胞壁蛋白和第二部分細(xì)胞壁蛋白相加，得全部細(xì)胞壁蛋白。 所述混合化學(xué)試劑的組成及其按摩爾比的含量最好為0.2 M氯化鈣，50 mM環(huán)己烷二胺
四乙酸溶于50 mM乙酸鈉(pH 6.5)， 2 mM二硫蘇糖醇，1 M氯化鈉，0.2 M硼酸鈉(pH 7.5)。所述熱震方法最好是首先在4'C孵浴，然后在室溫靜置，使細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)分離。 所述裂解液的成分最好包括7M尿素，2M硫脲，2%w/vCHAPS， 2% v/v Triton-XlOO，1% w/v 二硫蘇糖醇，2%兩性電解質(zhì)。
本發(fā)明利用針對(duì)細(xì)胞壁蛋白提取的混合化學(xué)試劑一次性提取甲藻細(xì)胞的部分細(xì)胞壁蛋白 (第一部分蛋白)，氯化鈣用于提取細(xì)胞壁蛋白，環(huán)己烷二胺四乙酸能提取膠質(zhì)結(jié)合蛋白，二 硫蘇糖醇可以還原蛋白之間的相互作用，氯化鈉提取離子結(jié)合蛋白，硼酸鹽打破了糖蛋白側(cè)
鏈和多糖在細(xì)胞壁中引起的相互作用。此步提取的細(xì)胞壁蛋白易溶于水，且與細(xì)胞壁結(jié)合疏 松，提取時(shí)間短，防止了細(xì)胞長時(shí)間在化學(xué)試劑中造成破裂之后的污染。再用熱震方法將細(xì) 胞壁與細(xì)胞質(zhì)體分離開來，并通過低速離心使細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)在離心管中分為上下兩層，大 量收集細(xì)胞壁后，再用蛋白質(zhì)強(qiáng)提取劑提取細(xì)胞壁難溶蛋白(第二部分蛋白)。最后將第一、 第二部分混合成為全部的細(xì)胞壁蛋白，再利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定分析。
本發(fā)明的有益效果是，可以使細(xì)胞保持相對(duì)完整的情況下提取壁蛋白，沒有胞內(nèi)蛋白污 染，也幾乎沒有丟失蛋白；時(shí)間短，從開始提取至得到全部壁蛋白只需2h。


圖l是細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)在離心管中的示意圖。由圖l可以看出，細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)在離心管 中分為上下兩層，上層為細(xì)胞壁。
圖2是在離心管中大量收集的鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞壁。
圖3是亞歷山大藻細(xì)胞壁SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。在圖3中，橫坐標(biāo)為/P,縱坐 標(biāo)為Kda,橫向箭頭為/￡凡縱向箭頭為SDS-PAGE;圖中標(biāo)注的是質(zhì)譜鑒定過的蛋白點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步說明。
混合試劑成分包括0.2M氯化鈣，50mM環(huán)己烷二胺四乙酸溶于50mM乙酸鈉(pH 6.5), 2mM二硫蘇糖醇，lM氯化鈉，0,2M硼酸鈉(pH7.5);裂解液成分包括7M尿素，2M硫脲， 2%w/vCHAPS， 2%v/vTriton-X100， 1。/。w/v二硫蘇糖醇，2%兩性電解質(zhì)。
收集2X 107亞歷山大藻到15ml離心管中，加入5ml混合提取化學(xué)試劑，在fC提取60min， 每10min震蕩一次，使管中的藻細(xì)胞混合均勻，4'C， 5000Xg離心收集上清(上清l);沉淀 中再加入少量海水，再于4。C孵育30min，在室溫下靜置10min，之后室溫下5000Xg離心， 離心管中細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)分為上下兩層，白色上層是細(xì)胞壁，下層是細(xì)胞質(zhì)(參見圖l和2)， 將上層細(xì)胞壁轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中，加入強(qiáng)裂解液，超聲破碎細(xì)胞壁5min，室溫18， 000 Xg離心，收集上清(上清2);上清1與上清2混合得全部細(xì)胞壁蛋白，加入20%TCA-Acetone 于-2(TC沉淀不少于45min， 20， OOOXg離心，棄上清，用100%丙酮清洗兩次，將沉淀溶于 溶漲液，用雙向凝膠電泳顯示細(xì)胞壁蛋白(見圖3)，并對(duì)蛋白做生物質(zhì)譜鑒定。
權(quán)利要求
1. 甲藻細(xì)胞壁蛋白的分離提取方法，其特征在于包括以下步驟1)用混合化學(xué)試劑提取第一部分細(xì)胞壁蛋白；2)用熱震方法獲得分離得到純細(xì)胞壁；3)在裂解液中提取第二部分細(xì)胞壁蛋白；4)將第一部分細(xì)胞壁蛋白和第二部分細(xì)胞壁蛋白相加，得全部細(xì)胞壁蛋白。
2. 如權(quán)利要求l所述的甲藻細(xì)胞壁蛋白的分離提取方法，其特征在于所述混合化學(xué)試劑 的組成及其按摩爾比的含量為0.2M氯化鈣，50mM環(huán)己烷二胺四乙酸溶于50 mM乙酸鈉， 2mM二硫蘇糖醇，1M氯化鈉，0.2M硼酸鈉。
3. 如權(quán)利要求l所述的甲藻細(xì)胞壁蛋白的分離提取方法，其特征在于所述熱震方法是首 先在4i:孵浴，然后在室溫靜置，使細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)分離。
4. 如權(quán)利要求l所述的甲藻細(xì)胞壁蛋白的分離提取方法，其特征在于所述裂解液的成分 包括7M尿素，2M硫脲，2%w/vCHAPS， 2% v/v Triton-XlOO， 1。/。w/v二硫蘇糖醇，2%兩 性電解質(zhì)。
全文摘要
甲藻細(xì)胞壁蛋白的分離提取方法，涉及一種細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的提取方法。提供一種在提取過程中不僅能避免胞內(nèi)蛋白或其它物質(zhì)的污染，而且能夠同時(shí)解決壁蛋白的丟失問題，能夠快速、高效、完整地得到細(xì)胞壁蛋白的甲藻細(xì)胞壁蛋白的分離提取方法。用混合化學(xué)試劑提取第一部分細(xì)胞壁蛋白；用熱震方法獲得分離得到純細(xì)胞壁；在裂解液中提取第二部分細(xì)胞壁蛋白；將第一部分細(xì)胞壁蛋白和第二部分細(xì)胞壁蛋白相加，得全部細(xì)胞壁蛋白。可以使細(xì)胞保持相對(duì)完整的情況下提取壁蛋白，沒有胞內(nèi)蛋白污染，也幾乎沒有丟失蛋白；時(shí)間短，從開始提取至得到全部壁蛋白只需2h。
文檔編號(hào)C07K14/405GK101503465SQ200910111198
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日
發(fā)明者成 李, 洪華生, 王大志, 荔 陳 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)